肽扫描辅助一个单克隆抗体识别的线性B细胞表位的鉴定

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

抗原表位的免疫系统的识别允许用于中和可便于疫苗和肽类药物的发展抗体的保护机制的理解。肽扫描是直截了当映射由单克隆抗体(mAb)识别的线性表位的简单而有效的方法。在这里,作者提出了涉及连续截断重组蛋白,合成肽设计和斑点杂交使用中和单克隆抗体神经坏死病毒外壳蛋白的抗原识别表位确定方法。此技术依赖于合成肽和单克隆抗体上的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜的斑点杂交。由RG-M56单克隆抗体识别的病毒外壳蛋白的最小抗原区可以通过一步一步的收窄修整肽作图到6聚体的肽表位。此外,丙氨酸扫描诱变和残余物分可以进行stitution来表征每个氨基酸残基组成的表位的结合的意义。发现侧翼表位的现场残留发挥肽结构调控关键作用。所识别的表位肽可被用来形成用于X射线衍射研究和功能的竞争,或用于治疗的表位肽 - 抗体复合物的晶体。

Introduction

在免疫系统中,V,DJ片段的重组允许抗体结合至各种抗原,以保护从病原体感染的主机创建互补决定区(CDR)的巨大变化。针对抗原的抗体的中和防御依赖于抗体的CDR和抗原的抗原决定簇之间的空间互补性。因此,这种分子相互作用的理解将有助于预防性疫苗的设计和治疗肽的药物开发。然而,这种中和的相互作用可以都通过从一个单一的抗原多抗原结构域和由抗体的多个的CDR,其结果使表位判定处理更复杂的影响。幸运的是,杂交瘤技术的发展,该熔断器个体抗体产生细胞与骨髓瘤细胞,允许细胞不断地分裂批次秒RETE一个特定抗体称为单克隆抗体(mAb)1。杂交瘤细胞生产这些纯,高亲和力的单克隆抗体绑定到特定抗原的单一抗原域。既定的抗原 - 抗体,几种方法,包括肽扫描的关系,可用于确定使用其相应的单克隆抗体的抗原的表位。在合成肽技术的最新发展使得肽扫描技术更容易,更方便进行。简单地说,一组重叠的合成肽的根据靶抗原序列产生和关联到用于单抗杂交的固体支持膜。肽扫描不仅提供了一种简单的方式来映射抗体结合区,但也有利于氨基酸(AA)的诱变通过残扫描或取代来评估表位肽的每个氨基酸残基和抗体的CDR之间的结合相互作用。

2,3,4中的黄色石斑鱼神经坏死病毒(YGNNV)外壳蛋白的线性表位的有效识别的协议。该协议包括单克隆抗体制备,结构和串联截短重组蛋白的表达,合成的重叠肽的设计,斑点杂交,丙氨酸扫描,和​​替代诱变。考虑肽合成的高成本,的串行截断所需靶蛋白的重组蛋白的步骤被修改,进行合成肽阵列斑点印迹分析前的抗原区被缩小到约100至200个氨基酸残基。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.单克隆抗体的制备

  1. 培养的RG-M56小鼠单克隆杂交瘤细胞2在175T瓶中的无血清培养基在37ºC用5%的CO 2补充。收集上清液当介质的颜色变成后孵育五天黄色。
    注:杂交瘤细胞细胞在无血清培养基中培养,以避免从胎牛血清抗体污染。
  2. 离心上清在4ºC4500 xg离心30分钟,弃去细胞碎片沉淀。
  3. 加入2毫升的G蛋白琼脂糖(作为50%的浆液提供)到5毫升柱,并用冰冷的PBS的10树脂体积(10毫升)中平衡。
  4. 负载200毫升的抗体上清液(步骤1.2)到柱上并丢弃直通。
  5. 添加10毫升冰冷的PBS到柱中来清洗。重复两次。
  6. 加入10 mL的50mM甘氨酸,pH值2.7的到柱中来洗脱G蛋白相关的抗体。关口LECT 900微升馏分中含有100微升10X中和缓冲液(1摩尔Tris,1.5M NaCl和1mM EDTA的,pH值8.0)微量离心管中。
  7. 在-20 C含0.03%NaN 3的存储在50%甘油的纯化的抗体。

(二)建设和串行截断重组蛋白的表达

  1. 制备PCR反应混合物:5微升10X 的Pfu缓冲液,0.2mM的每种dNTP,0.2μM的正向引物3,0.2μM反向引物3,2硫酸镁 ,pET20b-1A59 3质粒DNA 1ng的,和2.5 U(单元) 的Pfu DNA聚合酶;添加的DDH 2 O至50微升的最终体积。
    1. 使用下列参数中的自动热循环运行的样品:循环1(94ºC5分钟);周期2-36(94ºC30秒,63ºC30秒,72ºC60秒);和循环37(72ºC7分钟)。
  2. 提取聚合酶链反应(PCR)产物通过使用PCR纯化试剂盒5,以方便下面的限制性内切酶消化。
  3. 消化用NdeI I和Xho I限制性内切酶的PCR扩增的DNA片段和每个这些DNA片段的结扎成的Nde I和Xho I酶裂解的pET-20b中(+)载体。变换构建到大肠杆菌 DH-5α感受态细胞6。
    1. 准备在消化缓冲液中消化混合物(20毫摩尔Tris乙酸盐,10毫镁(CH 3 COO)2,50毫KCH 3 COO,和1mM DTT,pH值7.9)与1 PCR扩增的DNA或PET-20b的微克的Nde I和Xho I限制性的(+)载体DNA和2 U酶在20微升的最终体积。
    2. 轻轻地混合消化混合物并迅速降速。在37ºC2小时,在干燥浴,以确保限制的完全切割坐上课。
    3. 提取使用PCR纯化试剂盒5,以方便下面的质粒构建有关的限制性酶消化的DNA片段。
    4. 准备在连接缓冲液中连接混合物(66毫摩尔Tris,5mM的MgCl 2的,1毫摩尔ATP,和5mM DTT,pH值7.5)用100ng简化的,PCR扩增的DNA的,预消化的pET-20b的10毫微克(+)载体DNA,并在10微升的最终体积5单位的T4 DNA连接酶。
    5. 轻轻混合连接混合物并迅速降速。孵育16ºC用于在水浴18小时。
    6. 把结扎样品入100微升在DH-5α感受态细胞的10微升和放置微量离心管在冰上进行30分钟,然后轻轻地混合。把离心管在干浴在42ºC为90秒诱导热休克7。紧接在管转移到冰上2分钟。
    7. 添加900μL的Luria-BERTANI(LB)肉汤(1%Bacto胰蛋白胨,0.5%细菌酵母为Extract和0.5%的NaCl,pH 7.0)中到管。在37ºC孵育150 rpm振摇45分钟。沉淀通过离心将细胞在10分钟4000×g下,弃上清。
    8. 重悬的LB肉汤的50微升沉淀和每个变换涂布在含有100μg/ mL氨苄青霉素预热LB平板上。在37ºC16小时孵育所述板。
    9. 用200微升尖端拿起单个菌落并将其放入含有一个松散皑皑的15毫升管100微克/毫升氨苄青霉素3毫升的LB肉汤。在37ºC孵育150 rpm振摇12小时。
    10. 提取来自每个培养物的质粒DNA 8和使用T7启动子和T7终止子引物,以确认序列9测序它。
  4. 序列确认后,将10纳克这些PET-20B的DNA(+)与美国YGNNV外壳蛋白基因的长度变化到大肠杆菌的BL-21(DE3)菌株质粒ING热休克法7。按照步骤2.3.6-2.3.8执行转换。
  5. 从每个转化的大肠杆菌 BL-21细胞传输单个菌落到含有在一个松松地盖上瓶盖15毫升管100微克/毫升氨苄青霉素的3毫升的LB肉汤。孵育文化在37ºC以150rpm下振荡。
  6. 冷却该培养至25ºC当培养物的OD 600为约0.6,并添加IPTG至0.4mM的最终浓度来诱导重组蛋白的表达。孵育一个额外的4小时培养在25ºC以200rpm振荡。
  7. 传送1毫升培养成一个离心管中。沉淀通过离心将细胞在12,000×g离心1分钟,弃上清。
  8. 通过上下吹打用微量重悬在100微升变性缓冲液(8M脲,20mM磷酸钠,和0.5 M氯化钠,pH 7.4)中的细胞沉淀。剧烈震荡混合。
    注:该样品溶胶以及英现在应该是半透明的,有点粘,并准备好了斑点杂交检测。

重叠肽的3设计与合成

  1. 设计并合成3串行20聚体的肽,每个具有其后继通过从YGNNV外壳蛋白的195-338氨基酸区域10氨基酸残基通过斑点印迹法来缩小的RG-M56单克隆抗体的表位区重叠。
  2. 设计并合成3三个8聚体肽(195 VNVSVLCR 202,197 VSVLCRWS 204199 VLCRWSVR 206)与6节AA残留到下一个合成肽重叠斑点杂交缩小195-206 AA的表位区。
  3. 设计并合成3 7聚体(196 NVSVLCR 202195 VNVSVLC 201),6聚体(195 VNVSVL 200,196 NVSVLC 201,1个97 VSVLCR 202),和5-mer肽(195 VNVSV 199,196 NVSVL 200,197 VSVLC 201,198 SVLCR 202)分别与6,5重叠,和4个氨基酸残基,到它们相邻的肽,以尽量减少斑点杂交表位区。

4.斑点杂交

  1. 溶解在二甲基亚砜(DMSO)各合成肽的10毫克/毫升的最终浓度。
    注意:要克服的合成肽的不同的溶解度,所有合成肽应溶解在DMSO中。 DMSO是良好的溶剂,以完全溶解疏水性或亲水性的肽。
  2. 泡用甲醇聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2分钟。
    注:PVDF膜是高达100%的DMSO抗性;其他人可能并非如此。
  3. 改性Towbin缓冲液(25mM的Tris,192毫甘氨酸,和0.1%SDS,pH值8.3),用于平衡的PVDF膜2分钟。
    注:10〜20%(V / V)的甲醇可以加入到改性Towbin缓冲改善传输结果。
  4. 冲洗修改Towbin缓冲一张色谱纸。 PVDF膜放置到层析纸上。等到改性Towbin缓冲已经从PVDF膜表面在继续下一步骤之前消失。
  5. 加入2微升每种肽样品在膜上,用10微升小费。风干的色谱纸PVDF膜10分钟。缓慢和逐渐加入各肽样品在膜上,以避免过多的扩散。
  6. 在室温下温和振荡30分钟,阻断在TBST缓冲液中的5%脱脂牛奶的膜(0.05%(体积/体积)吐温20,20毫摩尔Tris,150 mM氯化钠,pH 7.4)中。
  7. 添加RG-M56单克隆抗体以1:1的最终稀释度:1,000在TBST缓冲液,用5%脱脂牛奶的膜。在37ºC膜上轻轻摇动1小时。
  8. 取出抗体等等(分辨率)。洗在TBST缓冲液将膜5分钟,轻轻摇动。重复两次。
  9. 5000在TBST缓冲液中的5%脱脂牛奶的膜:以1:1的最终稀释度加入二级抗体(山羊抗小鼠IgG,Fc的,共轭的碱性磷酸酶)。在37ºC膜上轻轻摇动1小时。
  10. 弃去抗体溶液。洗在TBST缓冲液将膜5分钟,轻轻摇动。重复洗涤步骤两次。
  11. 开发在室温BCIP / NBT底物溶液在黑暗中15分钟的膜。通过与DDH 2 O的洗膜出现信号时,停止发展。
  12. 风干的膜和使用图像系统捕获斑点印迹图像。
  13. 测量通过图像分析软件3每个斑点的强度。

5.丙氨酸扫描和替代

  1. 设计并合成3丙氨酸和methionine替代肽。用丙氨酸替换每个氨基酸残基的8聚体肽195 VNVSVLCR 202和合成肽195 ANVSVLCR 202,195 VAVSVLCR 202,195 VNASVLCR 202,195 VNVAVLCR 202,195 VNVSALCR 202,195 VNVSVACR 202,195 VNVSVLAR 202195 VNVSVLCA 202 。更换AA残留亮氨酸200蛋氨酸创建SJNNV基因型表位肽195 VNVSVMCR 202。
  2. 按照第4节进行丙氨酸扫描和替代诱变斑点印迹。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

该实验的目的是通过点来识别的表位使用单克隆抗体印迹。以快速和有效地缩小由单克隆抗体识别的抗原区,全长和串联截断YGNNV重组外壳蛋白与在C末端带有6xHis融合标记是从大肠杆菌 pET表达系统10( 图1A)来表示。所得重组蛋白点样到用的RG-M56单克隆抗体和抗的6xHis抗体进行斑点杂交的PVDF膜。在斑点印迹显示抗1-338氨基酸(全长),51-338个氨基酸,和195-338个氨基酸,但不能1-100氨基酸或1-200个氨基酸的重组蛋白质( 图1B)阳性信号。点阵列杂交对抗的6xHis抗体,并确认所有的重组蛋白的表达。这些数据表明,RG-M56单克隆抗体识别的抗原表位位于144-AA重组蛋白NEAr中YGNNV C端的外壳蛋白(195-338 AA)。

接着,用10个氨基酸残基长的串行20-mer肽重叠到其邻居设计并从144个氨基酸的重组蛋白质的序列合成肽扫描来缩小表位区。这些合成肽点样在PVDF膜上,并使用RG-M56单克隆抗体进行斑点杂交。结果显示仅在肽195-214 aa和阳性对照,195-338个氨基酸的重组蛋白质( 图2A)阳性信号。作为表位位于所述肽195-214氨基酸区域,但不是肽205-224氨基酸区域,三个串行的8聚体肽具有6个氨基酸残基内从氨基酸残基195-206(肽195-202氨基酸重叠,197- 204 AA和AA 199-206),设计并合成。点印迹杂交结果表明在肽195-202 aa和正对照肽195-214氨基酸阳性信号使用RG-M56单克隆抗体( 图2B)。

进行丙氨酸扫描和替代诱变来评估8聚体的表位的各氨基酸残基,195 VNVSVLCR 202的特异性。 8聚体肽的每个氨基酸残基被单独地与丙氨酸取代。然后丙氨酸突变肽阵列放置在使用的肽195-202氨基酸作为阳性对照PVDF膜上。点印迹分析表明,三个取代突变,V197A,V199A和C201A,废除RG-M56单克隆抗体( 图3A)的结合亲和力。虽然在SJNNV基因型表位氨基酸残基200是甲硫氨酸,如在其它四个Betanodavirus基因型表位相对的亮氨酸,所述SJNNV基因型序列,195 VNVSVMCR 202,表现出抗RG-M56单克隆抗体阳性的结合亲和力,象阳性对照的( 图3A)。这一结果表明,该表位Ò女不限Betanodavirus基因型可以通过RG-M56单克隆抗体识别。每个氨基酸残基参与与表位位点的结合亲和性通过测量使用图像分析软件( 图3B)各丙氨酸取代的斑点印迹的信号强度进一步定量。在V197A,V199A和C201A取代的强度减少到10.2%,18.6%和8.5%,分别当与阳性对照(100%)的比较,而V195A,S198A,L200A,R202A,和L200M取代显示出较高的或相似的强度作为阳性对照的。值得注意的是,N196A替代的影响强度是不明确的,与在阳性对照一个37.4%的降低。这些结果表明,V197,V199,和C201是RG-M56单克隆抗体的结合至关重要的残基。

在丙氨酸扫描诱变结果表明,该氨基酸残基V195,N196,和R202可以可以用丙氨酸,这意味着该表位的区域可在两个末端被进一步缩小取代。因此,一步一步通过7聚体,6聚体,和5聚体的合成肽步骤修整肽作图的目的是要尽量减少抗原区。阳性信号是本上的6聚体的合成肽196 NVSVLC 201,但不能在7聚体和5聚体的合成肽( 图4)。这些数据表明,由RG-M56单克隆抗体识别NNV外壳蛋白的最小表位是6聚体肽,196 NVSVLC 201。

图1
图1:采用连续截断重组蛋白和单克隆抗体的抗原表位区域的减少。连续截断重组NNVCPs的(A)地图。 NNVCP 1-338 aa是全长外壳蛋白。 ( )点,一个BLO重组NNVCPs效应的T型分析。左:地图上的PVDF膜串联截断YGNNV重组外壳蛋白。中间:使用抗的6xHis抗体进行点印迹分析。右:使用RG-M56单克隆抗体进行的斑点印迹分析。 NNVCP:神经坏死病毒外壳蛋白; AA:氨基酸; PVDF:聚偏二氟乙烯; N:N端; C:C端;单克隆抗体:单克隆抗体。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:使用合成肽的抗原表位区域的精细定位。 (A)左图:在20聚体的合成肽的氨基酸序列进行比对,以NNVCP 195-338氨基酸;前面每个肽具有与以下肽的10个氨基酸残基长的重叠。右:的Map在PVDF膜ynthetic肽。重组NNVCP 195-338氨基酸被用作阳性对照。使用RG-M56单克隆抗体进行的斑点印迹分析。 (B)的左:8聚体的合成肽,195-202个氨基酸,197-204个氨基酸,和199-206个氨基酸的氨基酸序列;前面每个肽具有与以下肽的6个氨基酸残基长的重叠。合成肽195-214氨基酸被用作阳性对照。右:使用RG-M56单克隆抗体进行的斑点印迹分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
3:195 VNVSVLCR 202的表位的丙氨酸扫描和替代诱变。替代诱变和点印迹分析(A)的氨基酸序列。每个AA - [R表位区域,195-202 AA的esidue,与丙氨酸单独更换。 L200M取代是在Betanodavirus外壳蛋白的表位区域中的SJNNV基因型序列。合成肽195-202氨基酸被用作阳性对照。被替换的氨基酸残下划线。斑点印迹信号结合亲和性的(B)的定量。阳性对照(195-202氨基酸)的信号强度被确定为100%。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:最小表位的决心。 7聚体(A),6聚体(B)和5聚体(C)的合成肽由195-202个氨基酸被用来确定由RG-M56单克隆抗体识别的最小表位。合成pepti德195-202氨基酸被用作阳性对照。 请点击此处查看该图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

该协议提供了一个快速,简单的技术来识别单抗公认的线性表位。考虑到肽合成和合成肽的生产效率的成本,病毒外壳蛋白的抗原区由前肽扫描分析表达串联截短重组蛋白减少。因此,使用可靠的和有效的大肠杆菌 pET表达系统产生这些串联截短的重组蛋白,与50 10之间的分子量的重组蛋白质kDa的可以容易地通过该系统中表达。在这种方式中,表位可以容易地缩小到一个更容易管理的100到200个氨基酸的区域。所述的pET-20b中(+)载体被专门选择,因为它包含的序列对的6xHis-标记的表达,使产生的6xHis标签融合蛋白码使用抗的6xHis抗体来确认的表达来免疫检测重组proteins。所产生的重组外壳蛋白均然后经由点印迹杂交测定中使用的RG-M56单克隆抗体进行分析。重组蛋白的表位测定的另一种方法是净化通过固定的金属离子亲和层析10所表达的重组蛋白,分离用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的重组蛋白,并进行Western印迹分析3。

进一步和更精细地映射通过斑点印迹杂交分析的使用串联截短的重组蛋白的结果确定的表位的位置,用不同尺寸的重叠的合成肽而设计的。之间的合成肽的不同的可能长度合成,20聚体,10个氨基酸残基长的重叠肽在肽扫描第一选择,既为它们的高合成纯度(大约90%)和对它们的肽的长度,足够对于搜索的连续型Epitope由B细胞抗体11的认可。需要注意的是合成的肽的准确度和纯度恶化作为合成肽是长。在这种方式中,表位区域被迅速降低至在长度约10个氨基酸残基。连续8聚体重叠肽进行了调查后,线性表位区域被定义为195-202肽AA。随后,将该8聚体的表位肽的丙氨酸扫描显示各个氨基酸残基的临界结合亲和性强度,从而允许最小表位的搜索。的V197,V199,和C201氨基酸残基的重要作用意味着线性表位区域覆盖至少5个氨基酸残基,从197到201。此外,氨基酸残基V195,N196,和R202可以用丙氨酸替换而不完全失去约束力亲和力,表明该表位区可减至7,6,或甚至5个氨基酸长度的残基。小肽序列可以用于搜索线性的(共容易地和经济地合成ntinuous)表位。然而,这种合成肽扫描技术是不适合的抗体的连续表位的确定,除非它与表位切除结合和质谱分析12。

在这个协议中,使用了斑点杂交技术来搜索一个单克隆抗体的线性表位。斑点杂交是一种简单而有效的方法。在搜索中,当表位区是从大型景观缩小的开始时,主要关心的是该抗体的杂交到靶膜结合蛋白后,观察或正或负的信号,因为大多数单克隆抗体只结合抗原蛋白的特异性表位( 图12)。然而,使用点印迹杂交时,探讨对抗体,表位区域内的每个氨基酸残基的结合的可用性,例如通过丙氨酸取代诱变通过斑点印迹测定各取代的氨基酸残基的信号强度应计入整体结合的意义。该信号强度可以很容易地利用图像分析软件( 图3B)或密度计进行定量。可替代地,酶联免疫吸附测定(ELISA)可以进行量化的结合亲和性的程度和所得到的信号强度3。

在以往的研究中,无包膜神经坏死病毒的唯一外壳蛋白是免疫识别10单克隆抗体与6.5之间的高和指数值4.5(日志10 NI)2。进一步用于一步法,快速免疫诊断试剂盒的开发用于检测NNV感染鱼13的单克隆抗体的高度特异性识别能力。神经坏死病毒外壳蛋白的抗原性表位是由RG-M18识别单克隆抗体作为8聚体肽,195 VNVSVLCR 202 3,通过它的新颖NNV受体被确定(未公布的数据)。在本研究中,神经坏死病毒外壳蛋白的表位的进一步缩小到6聚体肽,196 NVSVLC 201 由其他的mAb,RG-M56。

含有6聚体肽196 NVSVLC 201两个7 mer肽(196 NVSVLCR 202195 VNVSVLC 201)不被RG-M56单克隆抗体( 图4A)承认它是出乎意料的。一个合理的解释是,虽然周围残基V195和R202可以不直接向表位和抗体之间的结合相互作用,侧翼残基影响对于抗体识别的正确的肽的构象的形成。 V195或R202在他们的侧翼总站的外观可以单独扭曲合成肽构象抗体识别和结合。所述表位的构象是由两末端,V195和R202,它们是在8聚体合成肽互相均衡的强度驱动,195 VNVSVLCR 202 和抵消在6聚体的合成肽,196 NVSVLC 201。的氨基酸残基,V195,N196,和R202,可以用丙氨酸单独更换而不完全失去结合能力,并且因此,丙氨酸扫描诱变结果表明,在识别这三种氨基酸残基可能不发挥显著作用和RG的结合-M56单克隆抗体。不过,从6聚体的合成肽微调多一个残基后,196 NVSVLC 201,5聚体肽,197 VSVLC 201,而不N196中的N-末端侧翼区,失去由RG被识别和结合的能力-M56单克隆抗体( 图4C)。这一结果表明,在N196残基可能也p躺在所述表位的侧翼区中起重要作用,以稳定正确的表位的构象,以便于识别和RG-M56的mAb的结合。周围的抗原表位区域的侧翼残基的重要性也已被​​其它抗原 - 抗体结合研究探讨。同一胆碱子网站内使用不同的氨基酸取代的侧翼包围α银环蛇毒素的表位区域的结合的抗体的氨基酸残基的重要性进行了研究。然后,他们被评为要么必不可少的,有影响力的,还是没有有影响力的14。它也发现,癌相关的上皮粘蛋白的抗体识别的表位的特异性可以通过侧翼氨基酸残基来进一步影响。这些效应可能存在可阻碍抗体结合的表位15构象的障碍。

在6聚物表位,196 NVSVLC 201 </子>,具有极高的疏水性特征,具有四个疏水性残基,其中包括两个缬氨酸(197和199),一个亮氨酸(200),和一个半胱氨酸(201)(还原形式)。 V197残留,V199,C201和对于RG-M56单克隆抗体识别和结合的关键,如丙氨酸扫描诱变确定。表位区域是位于的NNV外壳蛋白16的外壳域(S域)八反平行β链之一。有趣的是,该表位不出现于外突起域,但在其他的反平行β链中的S域的果冻卷结构隐藏。表位,其高疏水性,就可以得到这个抑郁症更加稳定的微环境。此外,该表位的195 VNVSVLCR 202 3肽被认为阻碍鞍带石斑鱼神经坏死病毒的石斑鱼脑细胞的繁殖。因此,这种表位肽被认为是一个共mpetitor参与对病毒进入3所需的受体结合结构域。据推测,肽进入抑制剂包含疏水和/或两亲性残基可以改变的细胞膜接口的物理构造和化学和可阻碍细胞和病毒膜17的融合。此外,许多合成肽进入抑制剂已经证明对各种病毒感染17,18强的抑制性。因此,具有疏水性残基和针对NNV感染强条目抑制所识别的表位肽可促进治疗性肽类药物的发展。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68, (50), 3453 (1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24, (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10, (5), 0126121 (2015).
  4. Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24, (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40, (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11, (8), e0160509 (2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15, (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24, (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145, (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30, (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29, (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11, (10), e1005203 (2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4, (6), 553-558 (1990).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics