Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Immunology and Infection

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Chen, C. W., Chang, C. Y. Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope. J. Vis. Exp. (121), e55417, doi:10.3791/55417 (2017).

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Abstract

A identificação de um epítopo antigénico pelo sistema imunológico permite a compreensão do mecanismo de protecção de anticorpos que podem facilitar o desenvolvimento de vacinas e de drogas peptídicas neutralizantes. Péptido de varrimento é um método simples e eficiente, que diretamente mapeia o epitopo linear reconhecido por um anticorpo monoclonal (mAb). Aqui, os autores apresentam uma metodologia de determinação epitopo envolvendo proteínas em série truncadas recombinantes, design peptídeo sintético, e hibridação dot-blot para o reconhecimento antigênico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso usando um mAb neutralizante. Esta técnica baseia-se na hibridação dot-blot de péptidos sintéticos e os mAbs em um (PVDF) de membrana de fluoreto de polivinilideno. A região mínima antigénico de uma proteína de revestimento virai reconhecido pelo mAb M56-RG pode ser reduzida por passo-a-passo aparado mapeamento do péptido para um epitopo peptidico 6-mer. Além disso, a mutagénese de varrimento de alanina e o resíduo subtuição pode ser realizado para caracterizar a importância de ligação de cada resíduo de aminoácidos que constituem o epítopo. Os resíduos que flanqueiam o local de epitopo foram encontrados para jogar um papel crítico na regulação da conformação peptídica. O péptido epitopo identificado podem ser usadas para formar cristais de complexos de péptido-anticorpo epitopo para um estudo de difracção de raios-X e a competição funcional, ou para terapêutica.

Introduction

No sistema imunitário, a recombinação de segmentos V, D, J e permite a anticorpos para criar grandes variações de regiões determinantes de complementaridade (CDR) para se ligar a vários antigénios para proteger o hospedeiro contra a infecção patogénica. A defesa de neutralização de anticorpos contra antigénios depende da complementaridade espacial entre as CDR dos anticorpos e os epítopos de antigénios. Portanto, o conhecimento desta interacção irá ajudar molecular concepção de uma vacina profilática e desenvolvimento de fármacos péptido terapêutico. No entanto, esta interacção de neutralização pode ser influenciada tanto por vários domínios antigénicos a partir de um único antigénio e por vários CDRs de anticorpos, os quais, por conseguinte, tornam o processo de determinação epitopo mais complexo. Felizmente, o desenvolvimento da tecnologia do hibridoma, o qual funde a células produtoras de anticorpos com células de mieloma individuais, permite um lote constante dividindo de células para segrete um anticorpo específico, conhecido como um anticorpo monoclonal (mAb) 1. As células de hibridoma produzem estes puros, mAb de elevada afinidade para se ligar a um único domínio antigénico de um antigénio específico. Com a relação do anticorpo-antigénio estabelecida, várias abordagens, incluindo varrimento de péptidos, pode ser utilizado para determinar o epítopo de um antigénio usando o mAb correspondente. Desenvolvimentos recentes na tecnologia peptídeo sintético fizeram a técnica de exploração peptídeo mais acessível e mais conveniente para executar. Resumidamente, uma série de péptidos sintéticos que se sobrepõem são produzidos de acordo com uma sequência do antigénio alvo e estão associados a uma membrana em suporte sido para a hibridação de mAb. digitalização péptido não só oferece uma maneira simples para mapear a região de ligação do anticorpo, mas também facilita o aminoácido (AA) por meio de mutagénese de varrimento resíduo ou substituição para avaliar a interacção de ligação entre cada resíduo AA do péptido epítopo e as CDR do anticorpo.

2, 3, 4. O protocolo inclui mAb preparação, a construção e expressão de proteínas recombinantes em série truncadas, de criação de péptidos sintéticos sobrepostos, hibridação dot-blot, o varrimento de alanina, e mutagénese de substituição. Considerando o elevado custo da síntese de péptidos, o passo de truncagem em série das proteínas recombinantes de uma proteína alvo desejado foi modificado, e a região antigénica foi reduzida para cerca de 100 a 200 resíduos aa antes da análise dot-blot matriz peptídica sintética foi realizada.

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Protocol

1. Preparação de Anticorpos Monoclonais

  1. Cultura dos monoclonais de rato células de hibridoma RG-M56 2 em meio livre de soro em frascos de 175T a 37 ºC com 5% de suplemento de CO 2. Recolhe-se o sobrenadante quando a cor do meio torna-se amarelo após cinco dias de incubação.
    NOTA: As células de hibridoma foram cultivadas em meio isento de soro a fim de evitar a contaminação de anticorpos a partir de soro fetal de bovino.
  2. Centrifuga-se o sobrenadante a 4500 xg durante 30 min a 4 ºC e descartar o sedimento de restos de células.
  3. Adicionar 2 ml de agarose a proteína G (fornecido como uma pasta a 50%) a uma coluna de 5 mL e equilibrar-se com 10 volumes de resina (10 ml) de PBS gelado.
  4. Carga de 200 ml de sobrenadante de anticorpo (passo 1.2) para a coluna e descartar o repasse.
  5. Adicionam-se 10 mL de PBS arrefecido em gelo para a coluna de lavá-lo. Repita duas vezes.
  6. Adicionar 10 ml de glicina 50 mM, pH 2,7 à coluna para eluir o anticorpo da proteína G-associado. Colcionar 900 fracções ul num tubo de microcentrífuga contendo 100 pL de 10x tampão de neutralização (Tris 1 M, NaCl 1,5 M, e EDTA 1 mM, pH 8,0).
  7. Armazenar o anticorpo purificado em glicerol a 50% com 0,03% de NaN3 a -20 ºC.

2. Construção e Expressão da série truncadas Proteínas Recombinantes

  1. Prepara-se uma mistura reaccional de PCR: 5? L de 10x tampão Pfu, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 uM de iniciadores para a frente 3, 0,2 fiM de primer reverso 3, MgSO 2 mM de 4, 1 ng de pET20b 1A59 ADN-3 plasmídeo, e 2,5 L ( unidade) de polimerase de ADN Pfu; adicionar ddH2O para um volume final de 50 uL.
    1. amostras de execução em um termociclador automático, utilizando os seguintes parâmetros: Ciclo 1 (94 ºC por 5 min); ciclos 2-36 (94 ºC durante 30 s, 63 ° C durante 30 s, e 72 ºC durante 60 s); e ciclo de 37 (72 ºC durante 7 min).
  2. Extrai-se a reacção em cadeia da polimerase (PCR) produtos usando um kit de purificação de PCR para facilitar a 5 após a digestão com enzimas de restrição.
  3. Digerir os fragmentos de ADN amplificados por PCR com Ndel e Xhol as enzimas de restrição e ligar cada um destes fragmentos de ADN Ndel e Xhol clivado-enzima pET-20b (+) do vetor. Transformar as construções em células de Escherichia coli-DH-5a competente 6.
    1. Preparar a mistura de digestão em tampão de digestão (20 mM Tris-acetato, Mg 10 mM (CH3COO) 2, KCH 50 mM 3 COO, e DTT 1 mM, pH 7,9) com 1 ug de ADN amplificado por PCR ou pET-20b (+) DNA do vector, e 2 U de Ndel e Xhol as enzimas de restrição, num volume final de 20 uL.
    2. Misture a mistura de digestão suave e rapidamente girar para baixo. Incubar a 37 ° C durante 2 h num banho seco de corte para assegurar a completa da restrição sentares.
    3. Extrair os fragmentos de ADN digerido com enzimas de restrição, utilizando um kit de purificação de PCR 5 para facilitar a seguinte construção de plasmídeo.
    4. Preparar a mistura de ligação em tampão de ligação (Tris 66 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, e DTT 5 mM, pH 7,5) com 100 ng de ADN pré-digeridas, amplificado por PCR, 10 ng de pré-digerido pET-20b (+) ADN do vector, e 5 L de ligase de ADN de T4 num volume final de 10 uL.
    5. Misture a mistura de ligação com cuidado e rapidamente girar para baixo. Incubar a 16 ° C durante 18 h num banho de água.
    6. Coloque 10 uL das amostras de ligação em 100 ul de células DH-5α-competentes e misturar suavemente antes da colocação do tubo de microcentrífuga em gelo durante 30 min. Coloque o tubo de microcentrífuga em um banho seco a 42 ºC durante 90 s para induzir choque de calor 7. Imediatamente transferir o tubo em gelo durante 2 min.
    7. Adicionar 900 uL de meio de Luria-Bertani (LB) (1% de Bacto-triptona, 0,5% de Bacto levedura extracT, e 0,5% de NaCl, pH 7,0) ao tubo. Incubar a 37 ° C com agitação 150 rpm durante 45 min. Agregar as células por centrifugação a 4000 x g durante 10 min e desprezar o sobrenadante.
    8. Ressuspender o sedimento com 50 ul de caldo LB e espalhar cada transformação em placas pré-aquecido LB contendo 100 ug / ml de ampicilina. Incubar as placas a 37 ºC durante 16 h.
    9. Pegar uma única colónia usando uma ponta de 200 mL e colocá-lo em caldo 3 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina em um tubo de 15 frouxamente tapado mL. Incubar a 37 ° C com agitação 150 rpm durante 12 h.
    10. Extrai-se a ADN de plasmídeo a partir de 8 cada cultura e sequenciar-lo utilizando um promotor de T7 e iniciadores de terminador T7 para confirmar a sequência 9.
  4. Após confirmação da sequência, transformar 10 ng de DNA de pET-20b estes (+) plasmídeos com diferentes comprimentos de gene da proteína de revestimento YGNNV na estirpe BL-21 (DE3) de E. coli por nósing o método de choque de calor 7. Siga os passos 2.3.6-2.3.8 para realizar a transformação.
  5. Transferir uma única colónia de cada um de E. coli transformada BL-21 de células em caldo de 3 ml de LB contendo 100 ug / ml de ampicilina num tubo de 15 ml tapado frouxamente. Incubar a cultura a 37 ° C com 150 rpm tremendo.
  6. Arrefece-se a cultura a 25 ° C quando a OD600 da cultura é de cerca de 0,6 e adicionar IPTG para uma concentração final de 0,4 mM para induzir a expressão da proteína recombinante. Incubar a cultura para um extra de 4 h a 25 ºC com 200 rpm tremendo.
  7. Transferir 1 ml da cultura para um tubo de microcentrífuga. Agregar as células por centrifugação a 12000 xg durante 1 min e desprezar o sobrenadante.
  8. Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de tampão de desnaturação (ureia 8 M, fosfato de sódio 20 mM, e NaCl 0,5 M, pH 7,4) por pipetagem para cima e para baixo com uma micropipeta. Misturar em vórtice vigoroso.
    NOTA: O sol da amostradoras deve agora ser semi-transparente, um pouco pegajoso, e pronto para o ensaio de hibridação dot-blot.

3. Projeto e Síntese de péptidos sobrepostos

  1. Concepção e sintetizar 3 série peptídeos 20-meros que cada coincidem com o seu sucessor por 10 resíduos de aa da região de 195-338 aa da proteína de revestimento YGNNV para diminuir a região do epitopo de RG-M56 mAb por transferência de pontos.
  2. Concepção e sintetizar peptídeos 3 três 8-Mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, e 199 VLCRWSVR 206) com uma sobreposição de 6 resíduos aa para o próximo peptídeo sintético para diminuir a região do epitopo de 195-206 aa por transferência de pontos.
  3. Concepção e sintetizar 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 e 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, e 197 VSVLCR 202), e 5-meros péptidos (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, e 198 SVLCR 202) com uma sobreposição de 6, 5, e 4 resíduos de aa, respectivamente, Onto seus péptidos vizinhos para minimizar o região de epítopo por dot blotting.

4. Dot-blot hibridação

  1. Dissolve-se cada péptido sintetizado em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração final de 10 mg / mL.
    NOTA: Para superar a solubilidade variada de péptidos sintéticos, todos os péptidos sintéticos devem ser dissolvidos em DMSO. DMSO é um bom solvente para dissolver completamente péptidos hidrofóbicos ou hidrofílicos.
  2. Embeber a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com metanol durante 2 min.
    NOTA: membrana PVDF é até resistente a DMSO 100%; outros podem não ser assim.
  3. Equilibrar a membrana de PVDF com tampão Towbin modificado (Tris 25 mM, glicina 192 mM e SDS a 0,1%, pH 8,3) para2 minutos.
    NOTA: 10-20% (v / v) de metanol pode ser adicionado ao tampão Towbin modificados para melhorar os resultados de transferência.
  4. Lavar um pedaço de papel de cromatografia com o tampão Towbin modificado. Colocar a membrana de PVDF sobre o papel de cromatografia. Espere até que o tampão Towbin modificado tenha desaparecido da superfície da membrana de PVDF antes de continuar para a próxima etapa.
  5. Adicionar 2 mL de cada amostra de péptido para a membrana com uma ponta de 10 uL. Ar seco a membrana de PVDF sobre o papel de cromatografia durante 10 min. Adicionar a cada amostra de péptido lenta e gradualmente para a membrana para evitar o excesso de difusão.
  6. Bloquear a membrana em tampão TBST (0,05% (v / v) de Tween-20, Tris 20 mM, e NaCl 150 mM, pH 7,4) com leite magro a 5% durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  7. Adicionar RG-M56 mAb a uma diluição final de 1: 1000 em tampão TBST com 5% de leite desnatado à membrana. Incubar a membrana a 37 ° C durante 1 h com agitação suave.
  8. Remover o anticorpo assimlução. Lava-se a membrana em tampão TBST durante 5 min com agitação suave. Repita duas vezes.
  9. Adicionar o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho, Fe, conjugado com fosfatase alcalina) numa diluição final de 1: 5000 em tampão TBST com 5% de leite desnatado à membrana. Incubar a membrana a 37 ° C durante 1 h com agitação suave.
  10. Descartar a solução do anticorpo. Lava-se a membrana em tampão TBST durante 5 min com agitação suave. Repita o passo de lavagem duas vezes.
  11. Desenvolver a membrana com uma solução de substrato BCIP / NBT temperatura ambiente durante 15 min no escuro. Parar o desenvolvimento por lavagem da membrana com ddH2O quando o sinal aparece.
  12. Ar seco da membrana e capturar a imagem dot-blot utilizando um sistema de imagem.
  13. Medir a intensidade de cada dot blot usando uma imagem análise de software 3.

5. varrimento de alanina e Substituição

  1. Projetar e sintetizar 3 alanina e methipeptídeos de substituição onine. Substituir cada resíduo aa com alanina para o péptido 8-mer 195 VNVSVLCR 202 e sintetizar peptídeos 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202 e 195 VNVSVLCA 202 . Substitua resíduo aa leucina 200 a metionina para criar o péptido epitópico SJNNV genótipo 195 VNVSVMCR 202.
  2. Siga Seção 4 para realizar pesquisa de alanina e mutagénese de substituição dot blot.

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Representative Results

O objetivo deste experimento foi identificar um epitopo através Dot blot usando mAb. Para limitar rapidamente e eficientemente para baixo da região antigénica reconhecido por mAb, a todo o comprimento e proteínas de revestimento recombinante YGNNV truncados em série com uma marcação de fusão 6xHis no terminal C foram expressos a partir de um sistema de expressão de E. coli de PET 10 (Figura 1A). As proteínas recombinantes resultantes foram vistos sobre a membrana PVDF utilizando RG-M56 mAb e o anticorpo anti-6xHis para hibridação dot-blot. O dot blotting revelou sinais positivos contra 1-338 aa (full-length), 51-338 aa, e 195-338 aa, mas não 1-100 aa ou 1-200 aa proteínas recombinantes (Figura 1B). O array dot hibridado contra o anticorpo anti-6xHis e confirmou a expressão de todas as proteínas recombinantes. Estes dados indicam que o epitopo de reconhecimento RG-M56 mAb está localizado numa nea proteína recombinante 144-aaR a proteína de revestimento do terminal C de YGNNV (AA 195-338).

Posteriormente, os péptidos 20-mero de série com 10 aa-resíduos de comprimento sobrepõe sobre seu vizinho foram desenhados e sintetizados a partir da sequência da proteína recombinante 144-aa para digitalização peptídeo para diminuir a região do epitopo. Estes péptidos sintéticos foram manchados numa membrana de PVDF e submetida a hibridação dot-blot utilizando o mAb M56-RG. O resultado mostrou sinais positivos apenas no péptido 195-214 AA e o controlo positivo, proteína recombinante 195-338 AA (Figura 2A). Como o epitopo está localizado dentro do péptido 195-214 aa região, mas não o péptido de região aa 205-224, três em série péptidos 8-meros com resíduos 6-aa sobrepostos a partir de AA 195-206 resíduo (péptidos 195-202 aa, 197- 204 aa, e 199-206 aa) foram concebidos e sintetizados. Dot-blot hibridação resulta mostrou sinais positivos sobre o peptídeo 195-202 aa e o controlo positivo peptídeo 195-214 aa usandoRG-M56 mAb (Figura 2B).

Varrimento de alanina e mutagénese de substituição foram realizados para avaliar a especificidade de cada resíduo de AA do epitopo 8-mero, 195 VNVSVLCR 202. Cada resíduo AA do péptido 8-mero foi substituída individualmente por alanina. A matriz péptido mutação de alanina foi então colocada sobre uma membrana de PVDF utilizando péptido 195-202 AA como um controlo positivo. Análise dot-blot indicou que os três mutações que substituam, V197A, V199A, e C201A, aboliu a afinidade de ligação de RG-M56 mAb (Figura 3A). Embora AA resíduo 200 no epitopo SJNNV genótipo é metionina, ao contrário de uma leucina nas outras quatro epitopos genótipo Betanodavirus, a sequência SJNNV genótipo, 195 VNVSVMCR 202, mostrou uma afinidade de ligação positiva contra RG M56-mAb, como o do controlo positivo (Figura 3A). Este resultado indica que os epitopos óf Betanodavirus todos os genótipos podem ser reconhecidos por RG-M56 mAb. A afinidade de ligação de cada resíduo de aa participante para o local epitopo foi adicionalmente quantificado por medição da intensidade de sinal do dot blot de cada substituição de alanina utilizando software de análise de imagem (Figura 3B). As intensidades dos V197A, V199A, e substituições C201A foram reduzida para 10,2%, 18,6%, e 8,5%, respectivamente, quando comparados com os do controlo positivo (100%), ao passo que o V195A, S198A, L200A, R202A, e substituições L200M mostrou intensidades mais elevadas ou semelhantes como o do controlo positivo. Vale a pena notar que a força de influenciar a substituição N196A é ambígua, com uma redução de 37,4% no controlo positivo. Estes resultados indicam que a V197, V199, e C201 são resíduos essenciais para a ligação de RG-M56 mAb.

Os resultados de mutagénese de varrimento de alanina revela que os resíduos aa V195, N196, R202 e podeser substituído com alanina, o que implica que a região do epítopo pode ser ainda mais reduzida em ambos os terminais. Portanto, o passo-a-passo através de mapeamento de péptidos aparado 7-mer, 6-mer, e passo péptidos sintéticos 5-mer foi concebido para minimizar a região antigénica. O sinal positivo estava presente no péptido sintético 6 196-mer NVSVLC 201, mas não nas 7-mer e 5-meros péptidos sintéticos (Figura 4). Estes dados indicam que o epítopo mínimo de proteína de revestimento NNV reconhecido por mAb RG-M56 é o péptido 6-mero, 196 NVSVLC 201.

figura 1
Figura 1: Redução da região do epitopo utilizando proteínas recombinantes truncados em série e o anticorpo monoclonal. (A) Mapa de NNVCPs recombinantes truncados em série. NNVCP 1-338 aa é a proteína de revestimento de comprimento completo. (B) Dot-bloanálise t de NNVCPs recombinantes. Esquerda: Mapa dos YGNNV proteínas de revestimento recombinante truncado em série sobre a membrana de PVDF. Meio: A análise dot-blot foi efectuada utilizando anticorpo anti-6xHis. Direita: A análise dot-blot foi realizada utilizando RG-M56 mAb. NNVCP: a proteína de revestimento do vírus da necrose nervoso; AA: aminoácido; PVDF: fluoreto de polivinilideno; N: N-terminal; C: extremidade C-terminal; Acm: anticorpo monoclonal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Mapeamento fino do epítopo de região usando peptídeos sintéticos. (A) Esquerda: Sequências de aminoácidos dos péptidos sintéticos 20-meros foram alinhados para NNVCP AA 195-338; cada peptídeo anterior tinha um 10 aa-resíduos de comprimento sobreposição com a seguinte peptídeo. Direita: Mapa do synthetic péptidos sobre a membrana de PVDF. Recombinante NNVCP 195-338 AA foi usado como um controlo positivo. A análise dot-blot foi efectuada utilizando o mAb RG-M56. (B) Esquerda: As sequências de aminoácidos dos péptidos sintéticos de 8-mer, 195-202 aa, aa 197-204, 199-206 e aa; cada peptídeo anterior tinha um 6 aa-resíduos de comprimento sobreposição com a seguinte peptídeo. Sintético péptido 195-214 AA foi usado como um controlo positivo. Direita: A análise dot-blot foi realizada utilizando RG-M56 mAb. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: varrimento de alanina e substituição de mutagênese da 195 VNVSVLCR 202 epitopo. Sequências (A) de aminoácidos de mutagénese de substituição e de análise dot-blot. Cada aa residue da região do epitopo, 195-202 aa, foi substituídos individualmente por alanina. substituição L200M é a sequência de genótipo SJNNV na região epitopo proteína de revestimento do Betanodavirus. Sintético péptido 195-202 AA foi usado como um controlo positivo. Os resíduos aa substituído estão sublinhados. (B) A quantificação da afinidade de ligação do sinal dot blot. A intensidade do sinal do controlo positivo (AA 195-202) foi determinado como 100%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: determinação mínima epitopo. A 7-mer (A), 6-mer (B), e 5-mer (C) os péptidos sintéticos 195-202 AA foram usadas para identificar o epitopo mínimo reconhecido por mAb RG-M56. Pepti sintéticade 195-202 AA foi usado como um controlo positivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo oferece uma técnica rápida e simples para identificar um epitopo linear reconhecido-mAb. Tomando em consideração o custo da síntese de péptidos e da eficiência da produção de péptidos que sintetizam, da região antigénica da proteína de revestimento de vírus foi reduzido por expressão de proteínas recombinantes em série truncados antes da análise de varrimento de péptidos. Como tal, o sistema de expressão pET de E. coli fiável e eficiente foi usado para produzir estas proteínas recombinantes em série truncadas, como proteínas recombinantes com pesos moleculares entre 10 e 50 kDa podem ser facilmente expressas por meio desse sistema. Desta forma, o epítopo pode ser facilmente reduzida a uma região mais manejável aa 100 a 200. O vector pET-20b (+) foi especificamente escolhida, uma vez que contém uma sequência que codifica para a expressão de 6xHis-tag, permitindo que as proteínas produzidas de fusão 6xHis-tag a ser imunodetectada utilizando um anticorpo anti-6xHis para confirmar a expressão do p recombinanteroteins. As proteínas de revestimento recombinantes produzidos foram em seguida analisadas utilizando RG-M56 mAb através de um ensaio de hibridação dot-blot. Um método alternativo de determinação epitopo da proteína recombinante é para purificar as proteínas recombinantes expressas por meio de cromatografia de afinidade de iões metálicos imobilizados 10, separar as proteínas recombinantes com electroforese em gel de SDS-poliacrilamida, e realizar a análise de Western blot 3.

Para mapear adicionalmente e mais finamente a localização epitopo determinado pelos resultados de análise de hibridação dot-blot utilizando proteínas recombinantes truncados em série, os péptidos sintéticos que se sobrepõem com tamanhos diferentes foram concebidos. Entre os diferentes comprimentos possíveis de péptido sintético para sintetizar 20-mer com 10 aa-resíduos de comprimento péptidos sobrepostos foram escolhidos em primeiro lugar na digitalização péptido, tanto por sua alta pureza síntese (em cerca de 90%) e para o respectivo comprimento de péptido, suficiente para a busca para o e contínuapitope reconhecido pelo anticorpo-célula B 11. Note-se que a precisão e a pureza dos péptidos sintetizados deteriorar-se que o péptido sintetizado é mais longo. Deste modo, a região do epitopo foi rapidamente reduzida para cerca de 10 resíduos de aa de comprimento. Depois de péptidos sobrepostos 8-mer série foram pesquisados, a região epitopo linear foi definida para o péptido 195-202 aa. Subsequentemente, o varrimento de alanina deste péptido epitopo 8-mer revela a força crítica afinidade de ligação de cada resíduo de AA, o que permite a busca para o epítopo mínimo. As funções essenciais do V197, V199, e resíduos aa C201 implica que a região de epítopo linear de cobre, pelo menos 5 resíduos de AA, de 197 a 201. Além disso, os resíduos de aa V195, N196, R202 e pode ser substituído com alanina, sem perder completamente a ligação de afinidade, indicando que a região do epítopo pode ser reduzido para 7, 6, 5 ou mesmo resíduos aa de comprimento. sequências de péptidos pequenos podem ser facilmente e economicamente sintetizado para a busca de linear (COntinuous) epítopos. No entanto, esta técnica de varrimento péptido sintético não é adequado para a determinação de um epitopo descontínuo de um anticorpo, a menos que seja combinada com excisão epitopo e análise por espectrometria de massa 12.

Neste protocolo, a técnica de hibridação dot-blot foi utilizada para pesquisar o epitopo linear de um mAb. hibridação dot-blot é um método simples, mas eficaz. No início da pesquisa, quando a região de epítopo é estreitada para baixo a partir de uma paisagem em larga escala, a principal preocupação é observar quer um sinal positivo ou negativo após a hibridação do anticorpo a uma proteína ligada a membrana alvo, como a maioria dos mAbs unicamente ligar-se a um epítopo específico de uma proteína antigénica (Figuras 1 e 2). No entanto, quando se utiliza a hibridação dot-blot para explorar a disponibilidade de ligação de cada resíduo de AA na região do epitopo contra o anticorpo, tal como por mutagénese de substituição de alanina,a intensidade do sinal de cada resíduo aa substituído determinado por transferência de ponto deve ser tido em conta o significado vinculativa global. Essa intensidade do sinal pode ser quantificada com facilidade utilizando o software de análise de imagem (Figura 3B) ou um densitómetro. Alternativamente, um ensaio imuno-sorvente ligado a enzima (ELISA) pode ser realizada para quantificar o grau de afinidade de ligação e a intensidade do sinal resultante 3.

No estudo anterior, a única proteína de revestimento de non-envelope do vírus da necrose nervoso era imuno-reconhecido por 10 mAbs com um valor alto índice de neutralização entre 6,5-4,5 (log 10 NI) 2. A capacidade de reconhecimento altamente específico dos mAbs foram ainda utilizados para o desenvolvimento de um-passo, rápido kit de diagnóstico para a detecção imuno-cromatografica de peixes infectados NNV-13. O epitopo antigénico da proteína de revestimento do vírus da necrose nervosa foi reconhecido pelo RG-M18mAb como um péptido 8-mero, 195 VNVSVLCR 202 3, através do qual um novo receptor de NNV foi identificado (dados não publicados). No presente estudo, o epitopo de necrose nervoso proteína de revestimento do vírus foi ainda mais reduzida a um péptido 6-mer, 196 NVSVLC 201, por outro mAb, RG-M56.

É inesperado que dois péptidos 7-mero (196 NVSVLCR 202 e 195 201) VNVSVLC contendo péptido 6-mer 196 NVSVLC 201 não são reconhecidos por RG-M56 mAb (Figura 4A). Uma interpretação razoável é que, embora os resíduos circundantes V195 e R202 podem não contribuir directamente para a interacção de ligação entre o anticorpo e epitopo, os resíduos que flanqueiam influenciar a formação da conformação correcta péptido para o reconhecimento do anticorpo. O aparecimento de V195 ou R202 os seus terminal que flanqueiam sozinho pode contorcer o péptido sintéticoconformação de reconhecimento de anticorpos e vinculativa. A conformação de epítopo é impulsionada pela força de ambos os terminais, V195 e R202, os quais são equilibrados um contra o outro no péptido sintético 8-mero, 195 VNVSVLCR 202, e neutralizados no péptido sintético 6-mero, 196 NVSVLC 201. Os resíduos aa, V195, N196, e R202, podem ser substituídos individualmente por alanina, sem perder completamente a capacidade de ligação e, assim, os resultados de mutagénese de varrimento de alanina indicam que estes três resíduos aa podem não desempenhar um papel importante no reconhecimento e ligação de RG mAb -M56. No entanto, após o corte mais um resíduo do péptido sintético 6-mero, 196 NVSVLC 201, o peptídeo 5-mer, 197 VSVLC 201, sem o N196 na região N-terminal de flanqueamento, perde a capacidade de ser reconhecida e ligada por RG -M56 mAb (Figura 4C). Este resultado sugere que o resíduo N196 também pode pcolocar um papel importante na região flanqueadora do epitopo para estabilizar a conformação epitopo correcto, a fim de facilitar o reconhecimento e a ligação do mAb M56-RG. A importância dos resíduos que flanqueiam a região que rodeiam o epitopo também havia sido explorado por outros estudos de ligação antigénio-anticorpo. O significado de flanqueamento em torno resíduos aa região de epítopo do α-bungarotoxina para a ligação de anticorpos, foi investigada usando diferentes substituições de aa no interior da mesma subsítio colinérgica. Eles foram então avaliadas como essenciais, influente, ou não influente 14. Verificou-se também que a especificidade do epitopo reconhecido pelo anticorpo de mucinas epiteliais associada a carcinoma pode ser ainda influenciada por os resíduos de aa flanqueando. Estes efeitos podem apresentar barreiras conformacionais que podem impedir a ligação de um anticorpo para um epítopo 15.

O epitopo 6-mer, 196 NVSVLC 201 </ Sub>, tem características extremamente hidrofóbicos, com quatro resíduos hidrofóbicos, incluindo duas valinas (197 e 199), uma leucina (200), e uma cisteína (201) (forma reduzida). Resíduos V197, V199, C201 e são críticos para o reconhecimento de RG-M56 e o ​​mAb de ligação, tal como determinado por mutagénese de varrimento de alanina. A região epitopo situou-se em um dos oito anti-paralelas beta-costas do domínio shell (S-domain) da proteína de revestimento NNV 16. Curiosamente, o epitopo não aparece no domínio saliência fora, mas esconde na estrutura jelly-roll do S-domínio sob os outros beta-fios anti-paralelas. O epitopo, com a sua elevada hidrofobicidade, pode obter um microambiente mais estável neste depressão. Além disso, o 195 202 3 VNVSVLCR péptido deste epitopo foi encontrado para impedir a propagação da garoupa gigante vírus da necrose nervosa em células cerebrais garoupa. Portanto, este péptido epitopo foi sugerida para ser uma competitor envolvidos no domínio de ligação ao receptor necessária para a entrada viral 3. Supõe-se que inibidores de entrada do péptido compreendendo os resíduos hidrofóbicos e / ou anfipáticos pode alterar a conformação física e química das interfaces de membranas celulares e podem impedir a fusão das membranas virais e celulares 17. Além disso, muitos inibidores de entrada de peptídeos sintéticos demonstraram fortes propriedades inibidoras contra várias infecções por vírus 17, 18. Assim, o péptido de epitopo identificado com resíduos hidrófobos e inibição entrada forte contra a infecção NNV pode facilitar o desenvolvimento de fármacos de péptidos terapêuticos.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hybrid-SFM medium Gibco 12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) Gibco 21600-069
Pfu DNA Polymerase  Thermo Scientific  EP0502  Including buffers
T4 DNA Ligase Roche 10799009001 Including buffers
NdeI  New England Biolabs R0111S Including buffers
XhoI  New England Biolabs R0146S Including buffers
pET-20b(+) vector Novagen, Merck Millipore 69739
E. coli DH-5α competent cell RBC Bioscience RH617
E. coli BL-21(DE3) competent cell RBC Bioscience RH217
Ampicillin Amresco 0339-25G
LB broth  Invitrongen 12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) MDBio, Inc. 101-367-93-1
Methanol Merck Millipore 106009
Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) J.T.Baker X251-07
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Glycine Amresco 0167-5KG
Tris Affymetrix, USB 75825
NaCl Amresco 0241-1KG
EDTA Amresco 0105-1KG
Glycerol Amresco 0854-1L
NaN3 Sigma S2002-500G
BCIP/NBT PerkinElmer NEL937001PK
Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody Jackson ImmunoResearch 115-055-008
Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) Merck Millipore IPVH00010
Protein G Agarose Fast Flow Merck Millipore 16-266
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106
UVP BioSpectrum 600 Image System UVP n/a
VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 UVP n/a
MyCycler thermal cycler BioRad 1709713

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References

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