Eine einfache Methode zur Glucosinolate Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Published 3/15/2017
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Grosser, K., van Dam, N. M. A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC). J. Vis. Exp. (121), e55425, doi:10.3791/55425 (2017).

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Abstract

Introduction

Es wird geschätzt , dass die Pflanzen mehr als 200.000 verschiedene Arten von chemischen Verbindungen 1 erzeugen. Nur die Minderheit dieser Verbindung scheint eine Rolle in der Pflanzen primären Stoffwechsel, die Brennstoffe Wachstum und Reproduktion zu spielen; die meisten sind so genannte Sekundärmetaboliten. Trotz ihres Namens sind sekundäre Stoffwechsel oft entscheidend für das Überleben der Pflanze und Reproduktion, wie sie dienen Bestäuber anzulocken oder die Pflanze gegen Krankheitserreger und Pflanzenfressern 1 zu verteidigen.

Glucosinolate sind eine sehr heterogene Gruppe von sekundären Metaboliten, die 2 für mehr als 150 Jahren untersucht worden. Bis heute wurden mehr als 130 strukturell verschiedenen Glucosinolate wurden 3 identifiziert. Im Großen und Ganzen können Glucosinolate in verschiedene Klassen auf der Aminosäurebasis unterteilt werden, aus denen sie synthetisiert werden. Indolglucosinolaten, sind beispielsweise aus der Aminosäure synthetisiertTryptophan, Phenylalanin während liefert das Grundgerüst für die Synthese von aromatischen Glucosinolaten 4. Innerhalb von Klassen, gibt es eine hohe strukturelle Vielfalt, die um etwa sequentielle Kettenverlängerungsschritte in den Biosynthesewegen, wie in der Klasse der aliphatischen Glucosinolaten, oder durch Seitenkettenmodifikationen (zB Hydroxylierung) 4, 5 gebracht wird. Eine Glukosinolat Pflanzenarten können bis zu 37 verschiedene Glucosinolate aus unterschiedlichen Strukturklassen 6. Auch wenn Pflanzenarten typisch Glucosinolatprofile haben, wird innerartliche Variation für die Typen von Glucosinolaten häufig zwischen den Individuen und Populationen 6 gefunden, 7. Intact Glucosinolate sind in den Vakuolen von Pflanzenzellen gespeichert und kann in jeder der oberirdischen oder unterirdischen organ 7, finden <sup class = "xref"> 8, 9. Bei der Zellbruch (zB durch Herbivorie) werden Glucosinolate freigesetzt und mit dem Enzym Myrosinase gemischt, das Setzen einer Senfölbombe 10 ab. Aufgrund der Aktivität von Myrosinase, und auf der Struktur der Glucosinolat abhängig, den Reaktionsbedingungen und der Anwesenheit von modifizierenden Enzymen, verschiedenen scharf, giftig oder gesundheitsschädliche Verbindungen gebildet werden , wie Nitrile und (iso) Thiocyanate 11. Die Reaktionsprodukte haben eine hohe biologische Aktivitäten; beispielsweise dienen sie als Abschreckungsmittel von Generalisten Insektenpflanzenfressern 12. Die Erblichkeit und Biosynthesewege von Glucosinolaten sind gut untersucht, vor allem wegen ihrer Bedeutung für die Pflanzenfresser und Pathogen - Resistenz, ihren Wert als Aromakomponenten in mustards und Kohl, und ihre negativen (Progoitrin) und positive (glucoraphanin) Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit 5, 13, 14.

Wegen des großen Interesses an Glucosinolaten als biologisch aktive Verbindungen, Extraktion und Detektionsverfahren basierend auf Umkehrphasen - Hochdruck - Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , ausgerüstet mit ultraviolettem (UV) oder Photodiodenarray (PDA) Detektoren sind seit den 1980er Jahren 15 allgemein verwendet worden . Auf der Grundlage dieser Methode, erteilt die Europäischen Gemeinschaften ein Standardprotokoll , das für die Analyse von Glucosinolaten in Ölsaaten (Brassica napus, Raps, Canola 16) in mehreren Labors getestet und validiert wurde. Andere aufgenommen zu dieser Methode (zB durch zusätzliche Responsefaktoren für Glucosinolate Bestimmung , die nicht in Raps sind) 17. Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Plattformen und Hochdurchsatz - Protokolle für Glucosinolatanalyse 18 19, die ursprüngliche HPLC-UV / PDA - Methode ist immer noch weit von den Wissenschaftlern verwendet. Die Hauptgründe dafür sind, dass diese Methode einfach ist, kostengünstig, und relativ leicht zugänglich zu den Labors ohne eine umfangreiche chemisch-analytischen Wissensinfrastruktur. Um zu dienen, diese Gemeinschaft, die wir hier ausführlich das Protokoll für die Extraktion von Glucosinolaten aus Pflanzenmaterialien und die Analyse ihrer Desulfo-Formen mit HPLC-PDA.

Protocol

1. Herstellung von Lösungen für die Glucosinolate Extraktion benötigt

  1. Bereiten Sie 500 ml 70% Methanol (MeOH) in Wasser (Reinst-) in einer Glasflasche. Für 100 Proben und 5-Norm, 420 ml 70% MeOH benötigt.
  2. Es werden 20 mM Natriumacetat (NaOAc) (pH = 5,5) durch Zugabe von 0,82 g NaOAc oder 1,36 g NaOAc · 3 H 2 O in 500 ml Wasser; der pH-Wert mit Chlorwasserstoff (HCl). Bewahren Sie die NaOAc in den Kühlschrank stellen. Für 100 Proben und 5-Norm, 370 ml 20 mM NaOAc (pH = 5,5) in Wasser benötigt wird.
  3. Um das Säulenmaterial vorbereiten, mischen 10 g vernetztes Dextran-Gel (Typ G-25) mit 125 ml Reinstwasser. Speichern das erhaltene Gemisch in einem Kühlschrank (4 ° C).
  4. Herstellung der Sulfatase-Lösung
    1. Löse 10.000 Einheiten Arylsulfatase (Typ H-1 von Helix pomatia) in 30 ml Reinstwasser und 30 ml absolutem Ethanol (EtOH). Mischen Sie die Lösung gut und überträgt es auf ein 250-ml-centrifuge Rohr oder mehrere kleinere Rohre, je nach Verfügbarkeit.
    2. Zentrifugieren der Mischung bei 2650 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Den Überstand (s) in einen Becher; 90 ml EtOH und es mischen. Zentrifugieren der Mischung in einer oder mehreren Zentrifugenröhrchen bei 1.030 xg für 15 min bei RT
    3. Die Überstände verwerfen. Auflösen und die Pellets in insgesamt 25 ml Reinstwasser kombinieren. Vortex gut, verzichtet werden in 1-ml-Röhrchen und lagern in einem Gefrierschrank bei -20 ° C; sie werden für mindestens ein Jahr halten.
  5. Vorbereitung der sinigrin Referenzlösung
    1. Wiegen in etwa 9 mg sinigrin Monohydrat mit 1 ug - Genauigkeit (zB 8,769 mg). Bringen Sie es in einen 10-mL-Messkolben und löst den sinigrin Monohydrat in 10,0 ml Reinstwasser.
    2. Berechnen Sie die Molarität der Stammlösung und bereiten fünf sinigrin Referenzen zwischen 50-750 & mgr; M von der Stammlösung verdünnt wird. Ein ausführliches Beispiel finden Ergänzende Datei - S1 .
    3. Dispense die verschiedenen sinigrin Referenzen in 1,5 ml-Reaktionsgefäße und frieren sie bei 20 ° C. Umfassen eine Reihe von fünf sinigrin Referenzen in jedem Extraktions Charge. Verwenden Sie immer die richtigen Molarität Werte für die aktuell sinigrin Referenzen verwendet, wenn die Konzentrationen zu berechnen.

2. Herstellung des Extraktionseinrichtungs

  1. Bereiten Sie eine Spalte Gestell für die Pipette Säulen Pasteur (zur Herstellung von Säulen, siehe Schritt 3.1). Beschriften Sie die Rack oder die Spalten Spur der Probennummern zu halten (siehe Abbildung 1).
  2. Bereiten Sie einen Block hält die gleiche Anzahl von markierten 2-ml - Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Schritt 3.3 und Abbildung 1)

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Abbildung 1: Rack für Glucosinolat Extraktion. Frontansicht (links) und Draufsicht (rechts) einer selbstgemachten Spalte Rack und Block für die Glucosinolat Extraktion. Höhe: 100 mm, Abstand zwischen den verschobenen Bohrungen (die Pasteurpipette Spalten zu halten): 30 mm (x-Achse) x 15 mm (y-Achse). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Vorbereitung der Säulen und Reaktionsgefäße

  1. Bereiten Sie eine Spalte pro Probe und fünf zusätzliche Spalten für die fünf sinigrin Referenzproben.
    1. In jedem Glaspipette, legen Sie ein Stück Glaswolle ca. 1 cm x 1 cm. Verwenden Sie einen Holz- oder Glasstab die Glaswolle bis zu dem Punkt zu schieben, wo die Pipette verengt. Die Glaswolle sollte das Säulenmaterial vor knapp, verhindern aber auch nicht viel nutzen, da sie die Elution der Säulen verlangsamen wird. Handschuhe tragen when mit der Glaswolle arbeiten.
  2. Legen Sie die Spalten auf der Säule Rack (siehe Abbildung 1). Die Säule Rack in einem Laborschale (Abfallbehälter) Eluenten für die aufeinanderfolgenden Spalte Waschungen verwendet zu fangen.
  3. Schneiden Sie die ersten 5 mm von der Spitze eines Kunststoff-1-ml-Pipettenspitze und Pipette 0,5 ml der vorbereiteten Säulenmaterial (G-25-Gel in Wasser, siehe Schritt 1.3) in jeder Spalte. Schütteln Sie die Flasche mit dem Säulenmaterial gut vor dem Pipettieren enthält. Entsorgen Sie undichte Spalten (G-25 Material durch die Glaswollschicht läuft aus) und durch neue ersetzen.
    1. Nach dem Pipettieren der Säulenmaterial in die Spalten, 1 mL Reinstwasser, um das Material hinunterspülen.
  4. Bereiten Sie eine 2-ml-Reaktionsröhrchen pro Probe und fünf Röhrchen für die fünf sinigrin Proben; beschriften. Verwenden, um eine Dissektion Nadellöcher in den Kappen für die spätere Gefriertrocknung zu machen und die vorbereiteten Rohre in den Rohrblock in der exakt gleichen Muster wie der OrtSpalten (Schritt 2.2, siehe Abbildung 1).

4. Extraktion von Glucosinolaten

  1. Wiegen gefriergetrocknet und fein gemahlenes Pflanzenmaterial (in der Regel 50,0 bis 100,0 mg Trockengewicht, die endgültigen Glucosinolat Konzentrationen im Extrakt im Bereich der Referenzkurve sein sollte) auf die nächsten 0,1 mg in 2 ml, etikettiert, rund -bottom Reaktionsrohre. Fügen zwei kleine Metallkugeln (3 mm Durchmesser) als Schutzmittel zu jedem Röhrchen Sieden.
    HINWEIS: Das Protokoll kann auch an die frische, schockgefroren Materialien angewendet werden, die unter flüssigem Stickstoff gemahlen wurde und gehalten bis zur Extraktion eingefroren. Erhöhen , um die Menge an Material für die Extraktion und den Prozentsatz an MeOH in der Extraktionsflüssigkeit auf 85% abgewogen zur Verdünnung durch das Wasser in den Materialien 19 zu kompensieren.
  2. Pipette 1 ml 70% MeOH in jedes Röhrchen und Wirbel kurz. Schließen Sie die Rohre und versiegeln sie mit Schutzkappen, bevor sie so schnell wie möglich in eine heiße Platzierung water Bad (90-92 ° C) für ein paar Minuten (~ 5 min), bis 70% MeOH kocht einfach. Achtung: Schutzbrille tragen bei diesem Schritt!
  3. Platzieren Sie die Probenröhrchen in einem Ultraschallbad für 15 min. Unterdessen nehmen die Sulfatasen und die fünf sinigrin Referenzproben aus dem Gefrierfach sie bei RT auftauen.
  4. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei 2700 × g in einer Tischzentrifuge Nach Ultraschallbehandlung, 10 min bei RT; ein Pellet sollte in jedem Rohr zu bilden. Fügen Sie die Überstände an die markierten Spalten und Pipette die fünf Referenzproben auf separaten Spalten.
    1. Während der Überstände Pipettieren, halten Sie die Spitze weit über dem Pellet Pipettieren Pflanzenmaterialien zu vermeiden. Beachten Sie, dass bei getrockneten Proben verwendet werden, wird der Überstand Volumen weniger als 1,0 ml betragen.
  5. 1 ml 70% MeOH auf die verbleibenden Pellets in den Probenröhrchen und die Röhrchen verwirbeln, bevor sie in einem Ultraschallbad für 15 min platziert. Zentrifugieren Sie die Röhrchen wieder, wie in Schritt 4.4, und fügen Sie den supernanern zu den entsprechenden Spalten; aufgrund der Eigenschaften des Säulenmaterials, wird der negativ geladene Sulfatgruppe der Glucosinolate spezifisch auf der Säule zurückgehalten werden.
  6. Waschen der Säulen mit den Extrakten in drei aufeinanderfolgenden Schritten.
    1. Pipette 2 x 1 ml 70% MeOH auf jede Säule. Warten Sie auf die Spalte trocken laufen, bevor die nächsten 1 ml Zugabe; Dies wird mehr unpolare Verbindungen , die aus den Extrakten (zB Chlorophyll) entfernen.
    2. Spülen Sie die MeOH durch Zugabe von 1 ml Reinstwasser auf jede Säule.
    3. Pipette 2 x 1 ml 20 mM NaOAc-Puffer zu jeder Spalte, die optimalen Bedingungen für die Reaktions Sulfatase zu schaffen.
  7. Nehmen Sie das Rack mit den Säulen aus dem Abfallbehälter und trocknen Sie die Füße des Gestells mit einem Gewebe. Legen Sie das Rack über den Block mit Fläschchen und markierten Röhrchen. Stellen Sie sicher , dass jede Spalte Spitze in der entsprechenden, beschriftet, 2-ml - Röhrchen (siehe Abbildung 1).
  8. In 20 ul Sulfatsulfatase solutiauf den Säulen. Sicherzustellen, dass das Sulfatase die Oberfläche des Säulenmaterials erreicht. Je 50 ul NaOAc auf jede Säule puffern die Sulfatase zu spülen nach unten. Decken Sie die Spalten mit Aluminiumfolie und über Nacht stehen gelassen.
    Hinweis: Durch die Tätigkeit der Sulfatase, wird die Sulfatgruppe entfernt werden, die Freigabe der desulfoglucosinolates aus der Säule, so dass sie mit dem Wasser zu eluieren kann. Eine ausführliche Beschreibung finden Sie Crocoll et al. 19.
  9. Am nächsten Tag eluieren desulfoglucosinolates durch Pipettieren von 2 x 0,75 ml Reinstwasser auf jede Säule. Wenn alle Spalten trocken laufen haben, heben Sie den Säulengestell und entfernen Sie sie aus den Reaktionsrohren.
    1. Verschließen Sie die Rohre (stellen Sie sicher, dass es Löcher in den Kappen) und frieren sie in flüssigem Stickstoff oder in einem -80 ° C Gefrierschrank für 30 min. Gefriertrocknungs die Proben für 12-24 h (in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben und die Kapazität des Gefriertrockners) das gesamte Wasser zu entfernen.
  10. <li> Nach dem Gefriertrocknen wieder löse den Rückstand in einem exakten Volumen (in der Regel 1,0 ml) von Reinstwasser. Übertragen Sie die Proben und die fünf sinigrin Verweise auf markierten HPLC-Ampullen. Halten Sie die Proben in einem Kühlschrank (4 ° C) für bis zu zwei Wochen oder einen Gefrierschrank (-20 ° C) für bis zu einem Jahr vor ihnen mit HPLC zu analysieren.
  11. Lassen Sie die Glassäulen unter der Haube über Nacht trocknen und entsorgen sie trocken, wenn. Recover die Metallkugeln aus den Probenröhrchen, die in Schritt 4.5 für die Wiederverwendung und setzen die Rohre in der Entsorgungsbehälter.

5. HPLC-Messungen von Proben Heraus

  1. Trenne die Glucosinolate auf einer Umkehrphasen - C 18 -Säule (4,6 x 150 mm, 3 & mgr; m, 300 Å) mit einem Acetonitril-Wasser - Gradienten (siehe Tabelle 1) und einen Fluß von 0,75 ml / min und einer Säulentemperatur von 40 ° C . Führen Nachweis und die Quantifizierung bei 229 nm.
  2. Messen Sie die Sinigrin Verweise auf derselben Spalte, jedoch mit einem angepaßten GradientenVerfahren der Verwendung von Lösungsmitteln zu reduzieren (siehe Tabelle 2). Starten Sie die fünf sinigrin Referenzen mit Injektion, mit der niedrigsten Konzentration mit dem Referenz beginnen. Dann injizieren die Proben, einschließlich einer Methanolinjektion (leer) nach jeder zehnten Probe die Säule zu reinigen und die Verschleppung von Spitzen zu verhindern.
Zeit [min] Durchfluss [ml / min] % Ein Wasser % B ACN
1 0,750 98 2
35 0,750 65 35
40 0,750 98 2
Säulentemperatur 40 ° C.

Tabelle 1: Acetonitril-Wasser - Gradienten für Glukosinolat Trennung und analysis auf Umkehrphasen-HPLC.

Zeit [min] Durchfluss [ml / min] % Ein Wasser % B ACN
1 0,750 98 2
10 0,750 89.3 10.7
11 0,750 98 2
Säulentemperatur 40 ° C.

Tabelle 2: Verkürzte Acetonitril-Wasser - Gradienten zur Quantifizierung der fünf sinigrin Referenzen für die Quantifizierung von Glucosinolaten verwendet.

6. Glucosinolate Identifizierung und Quantifizierung

  1. Identifizierung
    1. Vergleichen Sie die UV-Spektren und Retentionszeiten der Peaks in den Proben mit handels availder Lage, reine Glukosinolat Referenzen. Siehe Abbildung 2 für Beispiele von UV - Spektren von den verschiedenen Glukosinolat Klassen.
    2. Identifizieren Sie unbekannte Glucosinolate mit Referenzstandards oder auf LC-MS 18, 19, wenn möglich.
    3. Identifizieren Sie unbekannte Glucosinolate mit Kernspinresonanz (NMR), wenn möglich.
    4. Vergleichen Sie die UV - Spektren und Retentionszeiten der Peaks mit denen in Figur 2 und Tabelle 3, Datenbanken oder Literaturverweise.

Figur 2
Abbildung 2. UV - Spektren der häufigsten Glukosinolat Klassen. UV-Absorptionsspektren (200-350 nm) von sechs desulfoglucosinolates (GSL), bezogen auf Lösungen von handelsüblichen Referenzverbindungen hergestellt extrahiert, wie hier beschrieben, die die häufigste Strukturklassen. Der gemeinsame Name, structural Namen (in Klammern) und Strukturklasse gegeben. (A) Sinigrin (2-propenyl GSL) -Alkenyl; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL) sulfinyl; (D) Glucobrassicin (indol-3-ylmethyl GSL) indol; (E) Gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL), aromatisch; (F) Sinalbin (4-hydroxybenzyl GSL), aromatisch. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Quantifizierung
    1. Integrieren Sie die Fläche unter den Spitzen der fünf sinigrin Referenzen und den Proben.
    2. Berechnen einer Eichkurve der fünf gemessenen sinigrin Referenzen auf der Basis der integrierten Fläche. Verwenden Sie die Gleichung der Regressionsgeraden (siehe Gleichung 1), um die interpoliert Menge an Glucosinolaten zu berechnen (siehe Gleichung 2).
    3. Um die Konzentration der verschiedenen Glucosinolate berechnen, multiplizieren die interpolierte Menge (x) von der Reaktionsfaktor (M) für die Detektion bei 229 nm von EC (1990) 16, Buchner (1987) 15 oder Brown et al. (1993) 17; die Konsensus - Responsefaktoren der am häufigsten festgestellt desulphoglucosinolates sind in Tabelle 3 angegeben.
      HINWEIS: Die Responsefaktoren durch verschiedene Referenzen bei unterschiedlichen Werten zwischen system dies mag der Grund sein, dass es (siehe Referenzen 15-17) variieren. Dennoch sind die Werte meist ganz in der Nähe und in einem ähnlichen Bereich mit Strukturklassen. Im Anschluss an die Konvention, stellen Sie den Responsefaktor von nicht identifizierten Glucosinolate zu 1, obwohl für unbekannte Indolglucosinolaten mit einem UV - Spektrum ähnlich dem von Glucobrassicin und andere Indolglucosinolaten (Abbildung 2), wäre es ratsam, 0,25 als Responsefaktor zu verwenden , zu erhalteneine realistische Schätzung der Konzentration (Tabelle 3).
    4. Um die endgültige Menge an Glucosinolaten (x t) in der Probe, nehmen Sie den Verdünnungsfaktor (D) und die Masse der Probe (w) berechnet für die Analyse berücksichtigt (siehe Gleichung 3).
      Gleichung (1)
      Gleichung (2)
      Gleichung (3)
      y = Peakfläche
      m = Steigung der Referenz 5-Punkt-Regressionskurve
      c = der Schnittpunkt der Regressionsgeraden mit der y-Achse
      x = Menge an Glucosinolaten im Extrakt
      x t = Konzentration an Glucosinolaten in der Pflanzenprobe
      D = Verdünnungsfaktor
      M = Responsefaktor für die Detektion bei 229 nm von Buchner (1987) oder Brown et al. (1993)
      w = Masse der Probe für die Extraktion verwendet

Representative Results

Dieses Verfahren ermöglicht die Detektion und Trennung von allgemein gefunden desulfoglucosinolates in allen Strukturklassen (Abbildung 3). Die schädlichen 2-hydroxyglucosinolate Progoitrin kommt relativ früh im Chromatogramm und ist deutlich von dem nützlichen Glukosinolat glucoraphanin, die einzige methylsulfinylglucosinolate in dieser Probe getrennt. Sinigrin, gluconapin und Glucobrassicanapin mit zunehmender Seitenkettenlängen (C3, C4 und C5, bzw.) eine eluotropische Reihe von alkenyl Glucosinolate bilden. Eine ähnliche logische Serie sichtbar ist für die beiden methylthioalkenyl Glucosinolaten, glucoiberverin (C3) und glucoerucin (C4). Die Spitzen der drei Indolglucosinolaten, Glucobrassicin und seine Derivate 4-Hydroxy- und 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin) werden auch klar getrennt. Es sollte beachtet werden, dass die Spitzen der neoglucobrassicin und glucoerucin sowie Gluconasturtiin, die nur aromatische glucosinolate in diesem Beispiel besonders hoch in diesem Brassica Extrakt durch Zusatz von Wurzelextrakte der Mischung 9.

Figur 3
Abbildung 3: Chromatogramm eines Glucosinolat - Extrakt. Detail (1-32 min) eines HPLC - Chromatogramm aus der Analyse der kombinierten Wurzel- und Sprossproben aus Brassica nigra führt, B. rapa und B. oleracea. Die Peak-Etiketten zeigen die Retentionszeit und die Abkürzungen für identifizierte desulfoglucosinolates (GSL). PRO = Progoitrin (2-OH-3-butenyl GSL); RAPH = glucoraphanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-Methylthiopropyl GSL); GBN = Glucobrassicanapin (4-Pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = Glucobrassicin (Indol-3-ylmethyl GSL); NAS = Gluconasturtiin (2-phenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-Glucobrassicin). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Längere Kette Methylsulfinyl Glucosinolate, die in der Modellpflanze Arabidopsis zu finden sind, zeigen auch eine Elutrope Reihe, wie in einem Wurzelextrakt von Rorippa austriaca gesehen. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) und glucoarabin (C9) erscheinen in regelmäßigen Abständen auf dem Chromatogramm (Figur 4). Zusammen mit der UV-Spektren der Peaks, wie eluotropische logische Reihe kann zur Klassifizierung verwendet werden, und vorläufig zu identifizieren, unbekannt Glucosinolaten.

Abbildung 4
Abbildung 4: Chromatogramm (Rahmen 9-30 min) Der desulfoglucosinolates in einem austriaca Wurzelextrakt Rorippa. Die Peak-Etiketten zeigen die Retentionszeit und die Abkürzungen für identifizierte desulfoglucosinolates (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = Glucobrassicin (Indol-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-Glucobrassicin). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Gemeinsamen Namen Side - Chain - Struktur Rt (min) * 229 nm Referenz#
aliphatic Glucosinolate
Glucocapparin Methyl 3.5 1 Braun
Sinigrin 2-propenyl 5.5 1 Brown, EG
Gluconapin 3-butenyl 9.5 1.11 EG
Glucobrassicanapin 4-Pentenyl 13.5 1.15 EG
Glucoiberverin 3-Methylthiopropyl 10.9 0,8 Braun
Glucoerucin 4-methylthiobutyl 14.0 0,9 Braun
Glucoiberin 3-Methylsulfinylpropylglucosinolaten 3.7 1.2 Braun
Glucoraphanin 4-Methylsulfinylbutyl 4.9 0,9 Braun
Glucoalyssin 5-methylsulfinylpentyl 7.6 0,9 Braun
Glucohesperin 6-methylsulfinylhexyl 10.5 1 Braun
Glucosiberin 7-methylsulfinylheptyl 13.5 1 Braun
Glucohirsutin 8-methylsulfinyloctyl 16.8 1.1 Braun
Glucoarabin 9-methylsulfinylnonyl 20.5 1
Glucocheirolin 3-methylsulfonylpropyl 4.2 0,9 Braun
Progoitrin 2 (R) -OH-3-butenyl 4.5 1,09 Buchner, EG
Gluconapoleiferin 2-OH-5-pentenyl 8.3 1 EG
Indolglucosinolaten
4-hydroxyglucobrassicin 4-Hydroxyindol-3-ylmethyl 11.2 0,28 Buchner, EG
Glucobrassicin indol-3-ylmethyl 15.3 0,29 Buchner, EG
4-Methoxyglucobrassicin 4-Methoxy-indol-3-ylmethyl 18.2 0,25 Buchner, EG
Neoglucobrassicin 1-Methoxy-indol-3-ylmethyl 22.5 0,2 Buchner, EG
aromatischen Glucosinolate
Sinalbin 4-hydroxybenzyl 8.1 0,5 Buchner
Glucosibarin 2 (R) -OH-2-phenylethyl 12.1 siehe nächste
Glucobarbarin 2 (S) -OH-2-phenylethyl 12.7 0,95 Buchner
Glucotropaeolin Benzyl 13.8 0,95 Buchner, EG
Gluconasturtiin 2-phenylethyl 18.0 0,95 Buchner, EG
unbekannt - aliphatische / aromatische wie UV - Spektrum 1 EG
unbekannt - Indol wie Spektrum 0,25 EG
* Ungefähre Retentionszeit (Rt) gerundet auf die nächste 0,1 min (± 0,3 min in Abhängigkeit von der Säule, Eluent Qualität). Die Retentionszeiten sind auf Thermofischer / Dionex ultimative HPLC - Plattformen ausgestattet mit einer C 18 - Säule bestimmt (150 x 4,6 mm, 3 Mikrometer Teilchengröße) plus 18 C Tabelle 1.
# Referenzen für Responsefaktoren: Buchner, R. in Glucosinolate in Raps (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gerschenson, J. Variation von Glucosinolat Akkumulation zwischen den verschiedenen Organen und Entwicklungsstadien von Arabidopsis thaliana. Phytochemie. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); EG. Ölsamen - Bestimmung von Glucosinolaten High Performance Liquid Chromatography. Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften. L 170/28. Anhang VIII 03.07.27-34 (1990).

Tabelle 3: Die Responsefaktoren der am häufigsten Desulfo-Glucosinolate in Pflanzenextrakten und ihre ungefähren Retentionszeiten auf C 18 Spalten gefunden. Eluenten, gradient, Säulentemperatur und Durchflussmenge , wie in Tabelle 1.

Discussion

Die größten Vorteile dieser etablierten und am häufigsten verwendeten Verfahren sind, dass sie robust ist, ziemlich einfach und relativ niedriger Kosten pro Probe. Der größte Teil der Ausrüstung für die Extraktion und Analyse erforderlich sind, sollte in einem Standard-Labor zur Verfügung oder können mit Ausnahme der HPLC-PDA selbst gebauten, sein. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass desulfoglucosinolates in Wasser gelöst sind chemisch recht stabil, wenn sie kühl und luftdicht (HPLC) Fläschchen gehalten, so dass die Extrakte könnten leicht an anderer Stelle für die HPLC-Analyse versendet werden. Im Gegensatz zu LC-MS-Plattformen, die die Software für die Verwaltung und Analyse der Trainingsdaten und umfangreiche praktische Erfahrung erfordern spezielle, HPLC-UV / PDAs können problemlos nach einer kurzen Einarbeitungszeit ausgeführt werden. Dies reduziert nicht nur die Kosten des Verfahrens, sondern macht auch dieses Verfahren für ein breites Spektrum von Wissenschaftlern, darunter Studenten.

Im Allgemeinen, wenn die vorstehend geschilderten Verfahren befolgt werden beschrieben carefully, sollten einige Probleme auftreten. In der Regel werden die Glucosinolat Spitzen sehr gut in dem Chromatogramm getrennt. Ist dies nicht der Fall ist, könnte das Gradientenprogramm durch Verringern der Steigerungsrate von Acetonitril in dem Eluenten angepasst werden. Alternativ kann das Problem lösen Gebäude in einem neuen Vorsäule (200-500 Injektionen) oder Spalte (1500 -2000 Injektionen). Gelegentlich Chromatogramme einzelner Proben in einer Charge zeigen können sehr kleine oder keine Spitzen. Dies ist in der Regel aufgrund Pipettierfehler wenn die Sulfatasen Zugabe (zB eine Spalte übersprungen wurde oder der Sulfatase nicht richtig nach unten in die Säule gewaschen). Alternativ kann der Glucosinolat-Konzentration in den experimentellen Materialien niedriger als erwartet und zu wenig Material wurde für die Extraktion verwendet. Wenn letzteres der Fall ist, kann das Injektionsvolumen auf 100 & mgr; l erhöht werden, oder eine genaue Aliquot (beispielsweise 800 & mgr; l) der Extrakt konzentriert werden konnte. Letzteres könnte durch Gefriertrocknungs erreicht werdening des Extrakts, der Rückstand in einem kleineren Volumen (beispielsweise 100 & mgr; l) Wasser löst und Reinjezierung die gleichen Bezugskurve. In den Berechnungen für die ursprüngliche Konzentration des Extrakts, sollten die Zahlen mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Wenn dies das Problem nicht lösen, sollten die Materialien wieder mehr Ausgangsmaterial verwendet werden, extrahiert. Wenn diese mehr als 100 mg ist, sollte das Volumen der Extraktionslösungsmittel und die Größe der Röhren proportional die Extraktionseffizienz aufrechtzuerhalten eingestellt werden.

Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass diese Methode gut validiert wurde. Dies ist , weil es als Standardverfahren zur Quantifizierung von Glucosinolaten in Raps beschrieben worden ist , bei denen die Verfahren und Genauigkeit wurden 16 in mehreren Labors bestätigt. Darüber hinaus sind die genetischen Hintergrund, Biosynthese und biologischen Funktionen von Glucosinolaten Gegenstand intensiver Forschungsanstrengungen, die in model Pflanze Arabidopsis thaliana unter anderem 4, 6, 12. Daher sind viele Reaktionsfaktoren für die genaue Quantifizierung von desulfoglucosinolates in Bezug auf sinigrin gut definiert und öffentlich verfügbar 15,17. Auch wenn LS-MS-basierte Protokolle mehr mit hohem Durchsatz sind, empfindlicher, und sind in der Lage (vorläufig) identifizieren Glucosinolate , für die keine Standards verfügbar sind 18, 19, 20, das Fehlen von Universal-Response - Faktoren für die LC-MS begrenzt die exakte Quantifizierung von Glucosinolat Konzentrationen 18. Hinzu kommt, dass diese Verfahren in der Regel kein Gefriertrocknungsschritt umfassen, und die Wassermenge in dem Frischpflanzenmaterial nachgewiesenes in den Berechnungen exakte Quantifizierung schwierig macht. Schließlich, weil unser Extraktionsverfahren eine spaltenbasierte beinhaltetReinigungs- und Konzentrationsschritt kann es auch 21 mit geringen Konzentrationen an Glucosinolaten, wie Böden zu "schmutzigen" Proben angewendet werden.

Im Vergleich zu LC-MS-basierte Methoden , die in der Regel frisch gefrorene Materialien zu extrahieren, verwenden 96-Well - Platten für die Extraktion, und beinhalten keine Sulfatsulfatase Schritt 18, 19, ist unser Verfahren relativ zeitaufwendig und arbeits intensiv. Mit den Säulengestelle in diesem Papier beschrieben, kann eine einzelne Person etwa 100-150 Proben an einem Tag zu extrahieren. Elution (am nächsten Tag), Gefriertrocknen (über Nacht), und wieder Auflösen kann innerhalb der nächsten zwei Tage stattfinden. Mit einem automatisierten HPLC-Injektor, einem Lauf und Ausgleichszeit von 40-45 min pro Injektion und keine unvorhergesehenen Ereignisse, würde es 3-4 Tage, um die Daten für dieses Beispiel Set zu erwerben. Wenn die HPLC-Software ermöglicht die automatische Quantifizierung basierend auf der sinigrin Kurve, eine manuelle Überprüfung der Chromatogramme und peak-Zuweisungen für 100 Proben können nur eine weitere 1 oder 2 h, bevor die Daten für statistische Analysen verwendet werden können.

Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von Glucosinolat Standards, nur ein kleiner Bruchteil der mehr als 130 Kandidaten derzeit im Handel gekauft werden können. Doch mit ein paar Referenzen für jede der Biosynthese Klassen; Zugang zu Literatur - Datenbanken gefunden , die die Verbindungen vorher in den Pflanzenarten spezifiziert (zB Fahey et al . 22); Grundkenntnisse der chromatographischen Prinzipien wie die Logik der Elutrope Reihe (beispielsweise für Zahlen von Cs an der Seitenkette in aliphatischen Verbindungen zunimmt, 3 und 4); und die Validierung einzelner Proben auf LC-MS 19 oder isoliert Glucosinolaten auf NMR 23, kann man leicht diese Einschränkung zu überwinden. Die meisten Protokolle für Glukosinolat analysiert interne Referenzkurven verwenden(Dh eine bestimmte Konzentration für die Gewinnung von Sinigrin oder Sinalbin zu dem Extraktionslösungsmittel 16, 17, 19). Grundsätzlich sind interne Referenzkurven besser geeignet für einzelne Probenverarbeitungsfehler zu korrigieren und damit theoretisch eine höhere Genauigkeit erzielen. Trotz dieses Vorteils bevorzugen wir einen Fünf-Punkte externe Referenzkurve zu verwenden, wie oft wir verschiedene Wildarten zu analysieren, von denen einige ein hohes Maß an sinigrin enthalten (zB Brassica nigra 24) oder Sinalbin (zB Sinapis alba 25), die zwei Glukosinolat Referenzen für die Responsefaktoren zur Verfügung stehen. Außerdem jeder Probe interne Standards Zugabe erhöht die Kosten der Analysen, als hochwertige Standards Glucosinolat Referenz sind in der Regel ziemlich teuer.

Abschließend trotz der zeitraubenden Schritte, dieses Protokollbietet eine einfache und zugängliche Methode Glucosinolate in Pflanzenproben zu extrahieren und zu quantifizieren. Jedoch ist es wichtig zu berücksichtigen , dass die Glucosinolatgehalte selbst sind nur einen Hinweis auf die mögliche biologische Aktivität, wie die Notwendigkeit mit Myrosinase zu reagieren zu sehen ist , und die Variation in den Reaktionsprodukten aus einem einzigen Glucosinolat 11 entstehen können. Validierungstests müssen durchgeführt werden, um die biologische Relevanz zu bestätigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade VWR 20864.320
Sodium acetate (NaOAc) Sigma-Aldrich W302406-1KG-K
HCl VWR 1.09057.1000
Sephadex Sigma-Aldrich A25120-10G
(−)-Sinigrin hydrate
from horseradish 
Sigma-Aldrich S1647-500MG
Aryl Sulfatase Sigma-Aldrich S9626-10KU
Ethanol VWR 20816.298
Pasteur Pipette Carl Roth 4518.1
Glass Wool Carl Roth 7377.1
Glass/wooden stick VWR HERE1080766
2 mL reaction tubes VWR 211-2120
Dissecting needle Carl Roth KX93.1
Rotilabo-lab dishes Carl Roth 0772.1 Waste tray
Rotilabo-sealing clips Carl Roth N217.1
Freeze Dryer Freezone 12 L Labconco 7960030
Acetonitril super gradient grade VWR 83639.320
Water bath VWR 462-5112
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB 15061
PH Electrode Thermo Fisher Scientific STARA2115
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 Thermo Fisher Scientific 75004210
Pre-Column Thermo Fisher Scientific 69697 C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) 
Column Acclaim 300 Thermo Fisher Scientific 60266 C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) 
HPLC Ultimate 3000 Thermo Fisher Scientific with column oven and UV or PDA detector
Flask 1,000 mL VWR 215-1595
Glucosinolate reference compounds Phytoplan various http://www.phytoplan.de/

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References

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