En enkel metod för glukosinolater Extraktion och analys med Högtrycks vätskekromatografi (HPLC)

Published 3/15/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Grosser, K., van Dam, N. M. A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC). J. Vis. Exp. (121), e55425, doi:10.3791/55425 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Det uppskattas att växter producerar över 200.000 olika typer av kemiska föreningar 1. Endast en minoritet av dessa föreningar verkar spela en roll i växternas primära metabolism, som bränslen tillväxt och reproduktion; de flesta är så kallade sekundära metaboliter. Trots sitt namn, sekundära metaboliter är ofta avgörande för växt överlevnad och fortplantning, eftersom de tjänar till att locka pollinatörer eller försvara anläggningen mot patogener och växtätare 1.

Glukosinolater är en mycket varierande klass av sekundära metaboliter som har studerats i över 150 år 2. Hittills har mer än 130 strukturellt olika glukosinolater identifierats tre. I stora drag kan glukosinolater indelas i olika klasser baserat på den aminosyra från vilken de syntetiseras. Indol glukosinolater, till exempel, syntetiseras från aminosyrantryptofan, medan fenylalanin utgör basen skelettet för syntes av aromatiska glukosinolater 4. Inom klasserna, det finns en hög nivå av strukturell mångfald, vilket åstadkommes genom sekventiella kedjan förlängningsstegen i de biosyntetiska reaktionsvägar, såsom i klassen av alifatiska glukosinolater, eller genom sidokedjan modifieringar (t.ex. hydroxylering) 4, 5. En glukosinolater växtarter kan innehålla upp till 37 olika glukosinolater tillhör olika strukturella klasser 6. Även om växtarter har typiska glukosinolater profiler är inomartsvariation för de typer av glukosinolater ofta återfinns bland individer och befolkningar 6, 7. Intakta glukosinolater lagras i vakuoler av växtceller och kan hittas i någon aboveground eller belowground organ 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Vid cell bristning (t.ex. genom herbivori) är glukosinolater frigörs och blandas med enzymet myrosinas, sätta igång en senapsolja bomb 10. På grund av aktiviteten hos myrosinas, och beroende på strukturen av glukosinolat, reaktionsbetingelserna, och närvaron av modifierande enzymer, olika stickande, giftiga eller skadliga föreningar bildas, såsom nitriler och (iso) tiocyanater 11. Reaktionsprodukterna har höga biologiska aktiviteter; till exempel, fungerar de som avskräckande medel för generalist insekts växtätare 12. Ärftlig och biosyntetiska vägarna för glukosinolater är väl studerade, främst på grund av deras betydelse för växtätare och patogener motstånd, deras värde som smakkomponenter i senap och kål, och deras negativa (progoitrin) och positiva (glukorafanin) effekter på människors hälsa 5, 13, 14.

På grund av det stora intresset för glukosinolater som biologiskt aktiva föreningar, utvinning och detektionsmetoder baserade på omvänd fas högtrycks-vätskekromatografi (HPLC) utrustad med ultraviolett (UV) eller fotodiod array (PDA) detektorer har ofta använts sedan 1980-talet 15 . Baserat på denna metod, utfärdade Europeiska gemenskapernas ett standardprotokoll som testades och validerats i flera labb för analys av glukosinolater i oljeväxter (Brassica napus, raps, Canola 16). Andra har lagt till denna metod (t.ex. genom att bestämma ytterligare responsfaktorer för glukosinolater som inte finns i raps) 17. Trots den ökade tillgängligheten av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) plattformar och hög genomströmning protokoll för glukosinolat analys 18 19, är den ursprungliga HPLC-UV / PDA-metoden fortfarande används av forskare. De främsta orsakerna är att denna metod är enkel, kostnadseffektiv och relativt tillgängliga för labb utan en omfattande kemisk-analytiska kunskapsinfrastrukturen. Att tjäna denna gemenskap, vi här i detalj protokollet för utvinning av glukosinolater från växtmaterial och analys av deras desulfo former med HPLC-PDA.

Protocol

1. Beredning av lösningar som krävs för glukosinolat Extraction

  1. Bereda 500 ml av 70% metanol (MeOH) i vatten (ultrarent) i en glasflaska. För 100 prover och 5 standarder, 420 ml 70% behövs MeOH.
  2. Förbered 20 mM natriumacetat (NaOAc) (pH = 5,5) genom att tillsätta 0,82 g NaOAc eller 1,36 g NaOAc x 3 H2O i 500 ml vatten; justera pH med väteklorid (HCl). Förvara NaOAc i kylskåp. För det krävs 100 prover och 5 standarder, 370 ml 20 mM NaOAc (pH = 5,5) i vatten.
  3. Att förbereda kolonnmaterialet, blanda 10 g av tvärbunden dextrangel (typ G-25) med 125 ml ultrarent vatten. Lagra den resulterande blandningen i kylskåp (4 ° C).
  4. Beredning av sulfatas lösning
    1. Lös 10.000 enheter av arylsulfatas (typ H-1 från Helix pomatia) i 30 ml ultrarent vatten och tillsätt 30 ml absolut etanol (EtOH). Blanda lösningen väl och överför den till en 250-ml centrifuge rör eller flera mindre rör, beroende på tillgänglighet.
    2. Centrifugera blandningen vid 2650 xg under 20 min vid rumstemperatur (RT). Överför supernatanten (er) till en bägare; lägga 90 ml EtOH och blanda det. Centrifugera blandningen i en eller flera centrifugrör vid 1030 xg under 15 min vid RT
    3. Kasta supernatanterna. Lös upp och kombinera pelletarna i en total av 25 ml ultrarent vatten. Vortex väl, fördela i 1-ml rör, och lagra i en frys vid -20 ° C; de kommer att hålla i minst ett år.
  5. Beredning av sinigrin referenslösningen
    1. Väg in ca 9 mg sinigrin monohydrat med en-ig noggrannhet (t.ex. 8,769 mg). Överföra den till en 10-ml mätkolv och lös sinigrin monohydrat i 10,0 ml ultrarent vatten.
    2. Beräkna molariteten av stamlösningen och förbereda fem sinigrin referenser mellan 50-750 iM genom utspädning av stamlösningen. Ett detaljerat exempel, se Kompletterande File S1 .
    3. Fördela de olika sinigrin referenser i 1,5-ml reaktionsrör och frysa dem vid 20 ° C. Inkludera en serie av fem sinigrin referenser i varje extraktion parti. Använd alltid rätt molaritet värdena för närvarande används sinigrin referenser vid beräkningen av koncentrationer.

2. Beredning av Extraction Setup

  1. Bered en kolonn rack för pasteurpipett kolumner (för framställning av kolonner, se steg 3.1). Märk rack eller kolonnerna för att hålla koll på de provnummer (se figur 1).
  2. Förbereda ett block som håller samma antal märkta 2-ml mikrocentrifugrör (se steg 3,3 och figur 1)

5 / 55425fig1.jpg "/>
Figur 1: Ställ för glukosinolat extraktion. Framifrån (vänster) och uppifrån (höger) av en self-made kolumn rack och blocket för glukosinolat extraktion. Höjd: 100 mm, avståndet mellan skiftade hålen (för att hålla pasteurpipett kolumner): 30 mm (x-axel) x 15 mm (y-axel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Framställning av kolonnerna och Mikrorör

  1. Förbered en kolonn per prov och fem extra kolumner för de fem sinigrin referensprov.
    1. I varje glaspipett, placera en bit glasull ca 1 cm x 1 cm. Använd ett av trä eller glas pinne för att trycka glasull ned till den punkt där pipetten smalnar. Glasull bör förhindra kolonnmaterialet från att rinna ut, men inte använda för mycket, eftersom det kommer att sakta eluering av kolonnerna. Använd handskar whsv arbeta med glasull.
  2. Placera kolonnerna på kolonnen rack (se figur 1). Placera kolonnen rack i ett labb facket (avfallstråg) för att fånga de eluenter som användes för kolonn tvättar i följd.
  3. Skära de första 5 mm från spetsen av en plast 1-ml pipettspets och pipettera 0,5 ml av det beredda kolonnmaterialet (G-25 gel i vatten, se steg 1.3) i varje kolumn. Skaka flaskan med kolonnmaterialet i god tid före pipettering. Kasta läckande kolumner (G-25 material rinner ut genom glasull skiktet) och ersätt med nya.
    1. Efter pipettering av kolonnmaterialet in i kolonnerna, tillsätt 1 ml ultrarent vatten för att spola ner materialet.
  4. Förbered en 2 ml reaktionsrör per prov och fem rör för de fem sinigrin referensprover, märka dem. Använd en dissekera nål för att göra hål i locken för senare frystorkning och placera preparerade rör i röret blocket i exakt samma mönster somkolumner (steg 2,2, se figur 1).

4. Utvinning av glukosinolater

  1. Väg frystorkas och växtmaterial finmalda (vanligtvis 50,0-100,0 mg torrvikt, och de slutliga glukosinolater koncentrationer i extraktet bör vara i området av referenskurvan) med en noggrannhet av 0,1 mg i 2-ml, märkt, runda -bottom reaktionsrör. Lägg till två små metallkulor (3 mm i diameter) som kokande flamskyddsmedel till varje rör.
    OBS: Protokollet kan även appliceras på färska, flash-fryst material, som har malts under flytande kväve och förvaras frysta tills extraktion. Öka mängden av material vägdes för extraktion och den procentuella andelen av MeOH i extraktionsvätskan till 85% för att kompensera för utspädning av vattnet i materialet 19.
  2. Pipettera 1 ml av 70% MeOH i varje rör och virvla kort stund. Stäng rören och täta dem med säkerhetslock innan du placerar dem så snabbt som möjligt i en varm water bad (90-92 ° C) för ett par minuter (~ 5 min), tills 70% MeOH bara kokar. Varning: Använd skyddsglasögon under detta steg!
  3. Placera provrören i ett ultraljudsbad under 15 min. Samtidigt tar sulfatas och fem sinigrin referensprover ur frysen att tina dem vid rumstemperatur.
  4. Efter ultra sonikering, centrifugera provrören vid 2700 xg i en bordscentrifug under 10 min vid RT; en pellet bör bildas i varje rör. Lägg supernatanterna till märkta kolumner och pipett de fem referensprover på separata kolumner.
    1. Medan pipettering supernatanterna, hålla spetsen väl över pelleten för att undvika pipettering växtmaterial. Observera att när torkade proverna används kommer supernatanten volymen vara mindre än 1,0 ml.
  5. Tillsätt 1 ml 70% MeOH till de återstående pellets i provrören och vortexblanda rören innan de placeras i ett ultraljudsbad under 15 minuter. Centrifugera rören igen, såsom i steg 4,4, och tillsätt supernanare till respektive kolumner; på grund av att egenskaperna hos kolonnmaterialet, kommer den negativt laddade sulfatgruppen av glukosinolater vara specifikt kvar i kolonnen.
  6. Tvätta kolonnerna med extrakten i tre steg.
    1. Pipettera 2 x 1 ml 70% MeOH på varje kolonn. Vänta kolonnen gå torr innan du lägger nästa 1 ml; detta kommer att ta bort fler apolära föreningar från extrakt (t.ex. klorofyll).
    2. Spola ut MeOH genom tillsats av 1 ml av ultrarent vatten till varje kolonn.
    3. Pipett 2 x 1 ml 20 mM NaOAc buffert till varje kolumn för att skapa optimala förutsättningar för sulfatas reaktionen.
  7. Ta rack med kolonnerna ut ur spillfacket och torka fötterna på kuggstången med en vävnad. Placera gallret över blocket med flaskor och märkta rör. Se till att varje kolumn spets är i den motsvarande, märkta, 2-ml rör (se figur 1).
  8. Tillsätt 20 mikroliter av sulfatas solutipå till kolumnerna. Säkerställa att sulfataset når ytan av kolonnmaterialet. Pipett 50 mikroliter av NaOAc buffert på varje kolumn att spola ner sulfatas. Täck kolonnerna med aluminiumfolie och låt stå över natten.
    OBS: På grund av verksamhet sulfatas, sulfatgruppen kommer att tas bort, släppa desulfoglucosinolates från kolumnen så att de kan eluera med vatten. För en detaljerad beskrivning, se Crocoll et al. 19.
  9. Nästa dag, eluera desulfoglucosinolates genom att pipettera 2 x 0,75 ml av ultrarent vatten på varje kolumn. När alla kolumner har sinat, lyft kolumnen rack och ta bort den från reaktionsrören.
    1. Cap rören (se till att det finns hål i locken) och frysa dem i flytande kväve eller i en -80 ° C frys under 30 min. Frystorka de prover för 12-24 timmar (beroende på antalet prover och kapaciteten hos frystorken) för att avlägsna allt vatten.
  10. <li> Efter frystorkning, re-lös återstoden i en exakt volym (vanligtvis 1,0 ml) av ultrarent vatten. Överför proverna och fem sinigrin hänvisningar till märkta HPLC flaskor. Hålla proverna i kylskåp (4 ° C) i upp till två veckor eller en frys (-20 ° C) i upp till ett år innan de analyserar dem med HPLC.
  11. Låt glaset kolumner torka under huven över natten och kasta dem när det är torrt. Återvinna metallkulor från provrören som används i steg 4,5 för återanvändning och lägga rören i avfallskorgen.

5. HPLC Mätningar av extraherade proverna

  1. Separera glukosinolater på en omvänd fas-C 18-kolonn (4,6 x 150 mm, 3 ^ m, 300 Å) med en acetonitril-vatten-gradient (se tabell 1) och ett flöde av 0,75 ml / min och en kolonntemperatur av 40 ° C . Utför detektering och kvantifiering vid 229 nm.
  2. Mät sinigrin referenser på samma kolonn men med en anpassad lutningmetod för att minska användningen av lösningsmedel (se tabell 2). Börja med att injicera de fem sinigrin referenser börjar med hänvisning med den lägsta koncentrationen. injicera då proverna, inklusive en metanolinjektion (blank) efter var tionde prov för att rengöra kolonnen och för att förhindra en överföring av toppar.
Tid [min] Flöde [ml / min] % Ett vatten % B ACN
1 0,750 98 2
35 0,750 65 35
40 0,750 98 2
Kolonntemperatur 40 ° C.

Tabell 1: Acetonitril-vatten-gradient för glukosinolater separation och analysis på omvändfas-HPLC.

Tid [min] Flöde [ml / min] % Ett vatten % B ACN
1 0,750 98 2
10 0,750 89,3 10,7
11 0,750 98 2
Kolonntemperatur 40 ° C.

Tabell 2: Förkortad acetonitril-vatten-gradient för kvantifiering av de fem sinigrin referenser som används för kvantifiering av glukosinolater.

6. glukosinolater Identifiering och kvantifiering

  1. Identifiering
    1. Jämföra UV-spektra och retentionstider hos topparna i proven med kommersiellt utnyttjakunna, rena glukosinolater referenser. Se figur 2 för exempel på UV-spektra från de olika glukosinolater klasser.
    2. Identifiera okända glukosinolater med referensstandarder eller LC-MS 18, 19, om möjligt.
    3. Identifiera okända glukosinolater med kärnmagnetisk resonans (NMR), om det är möjligt.
    4. Jämföra UV-spektra och retentionstider för topparna med de i figur 2 och tabell 3, databaser, eller litteraturreferenser.

figur 2
Figur 2. UV-spektra av de vanligaste glukosinolater klasser. UV-absorption spektra (200-350 nm) av sex desulfoglucosinolates (GSL), baserad på lösningar gjorda av kommersiellt tillgängliga referensföreningar extraherade som beskrivs här, som representerar de vanligaste strukturella klasser. Det gemensamma namnet, sSTRUKTUR namn (inom parentes), och strukturklass är givna. (A) sinigrin (2-propenyl GSL), alkenyl; (B) glucoerucin (4-metyltiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glukorafanin (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinyl; (D) glucobrassicin (indol-3-ylmetyl GSL), indol; (E) gluconasturtiin (2-fenyletyl GSL), aromatisk; (F) sinalbin (4-hydroxibensyl GSL), aromatiska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Kvantifiering
    1. Integrera arean under topparna i fem sinigrin referenser och proverna.
    2. Beräkna en kalibreringskurva av de fem uppmätta sinigrin referenser baserade på integrerat område. Använda ekvationen för regressionslinjen (se ekvation 1) för att beräkna den interpolerade mängden glukosinolater (se ekvation 2).
    3. För att beräkna koncentrationen av de olika glukosinolater, multiplicera den interpolerade mängden (x) av responsfaktorn (M) för detektering vid 229 nm från EG (1990) 16, Buchner (1987) 15, eller Brown et al. (1993) 17; Consensus responsfaktorerna för de vanligaste detekterade desulphoglucosinolates ges i tabell 3.
      OBS: Reaktionsfaktorerna kan variera mellan system detta kan vara anledningen till att det finns olika värden som anges av olika referenser (se referenser 15-17). Ändå värdena är oftast ganska nära och i ett liknande utbud med strukturella klasser. Efter konventionen, ställa in responsfaktorn för oidentifierade glukosinolater till ett, men för okända indol glukosinolater med UV-spektrum som liknar glucobrassicin och andra indol glukosinolater (Figur 2), skulle det vara lämpligt att använda 0,25 som en responsfaktor för att erhållaen realistisk uppskattning av den koncentration (Tabell 3).
    4. För att beräkna det slutliga beloppet för glukosinolater (x t) i provet, tar utspädningsfaktorn (D) och massan av provet (w) som används för analysen beaktas (se ekvation 3).
      Ekvation (1)
      Ekvation (2)
      Ekvation (3)
      y = Topparea
      m = lutning av referens 5-punkts regressionskurvan
      c = interceptet för regressionslinjen med y-axeln
      x = mängden glukosinolater i extraktet
      x t = koncentration av glukosinolater i prov anläggningen
      D = utspädningsfaktor
      M = responsfaktor för detektion vid 229 nm från Buchner (1987) eller Brown et al. (1993)
      w = massan av provet som används för utvinning

Representative Results

Denna metod möjliggör detektering och separation av vanligen återfinns desulfoglucosinolates i alla strukturklasser (Figur 3). Den skadliga 2-hydroxyglucosinolate progoitrin kommer relativt tidigt i kromatogrammet och tydligt separerade från det välgörande glukosinolat glukorafanin, den enda methylsulfinylglucosinolate i detta prov. Sinigrin, gluconapin och glucobrassicanapin bilda en eluotropic serie alkenyl glukosinolater med ökande sido kedjelängder (C3, C4 och C5, respektive). En liknande logisk serie är synlig för de två methylthioalkenyl glukosinolater, glucoiberverin (C3) och glucoerucin (C4). Topparna av tre indol glukosinolater, glucobrassicin och dess derivat 4-hydroxi- och 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), är också klart åtskilda. Det bör noteras att topparna av neoglucobrassicin och glucoerucin samt gluconasturtiin, det enda aromatiska glukosinolate i detta prov, är särskilt hög i denna Brassica extrakt på grund av tillsatsen av rot extrakt till mixen 9.

Figur 3
Figur 3: Kromatogram av glukosinolat extrakt. Detalj (1-32 min) av ett HPLC-kromatogram som härrör från analysen av kombinerade rot- och skottprov från Brassica nigra, B. rapa och B. oleracea. Topp etiketter anger uppehållstid och förkortningarna för identifierade desulfoglucosinolates (GSL). PRO = progoitrin (2-OH-3-butenyl GSL); Raph = glukorafanin (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin (2-propenyl GSL), GNA = gluconapin (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-metyltiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenyl GSL); ERU = glucoerucin (4-metyltiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmetyl GSL); NAS = gluconasturtiin (2-fenyletyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Längre kedja metylsulfinyl glukosinolater, som är vanligt förekommande i modellväxten Arabidopsis, visar också en eluotropic serie, vilket kan ses i en rot extrakt av fränen austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), och glucoarabin (C9) visas med jämna mellanrum på kromatogrammet (fig 4). Tillsammans med UV-spektra av topparna, kan en sådan eluotropic logisk serie användas för att klassificera och provisoriskt identifiera okända glukosinolater.

figur 4
Figur 4: Kromatogram (ram 9-30 min) Av de desulfoglucosinolates i en fränen austriaca rotextrakt. Topp etiketter anger uppehållstid och förkortningarna för identifierade desulfoglucosinolates (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (indol-3-ylmetyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Vanligt namn Sido kedjestruktur Rt (min) * 229 nm referens#
aliphatic glukosinolater
Glucocapparin metyl 3,5 1 Brun
sinigrin 2-propenyl 5,5 1 Brown, EC
Gluconapin 3-butenyl 9,5 1,11 EG
Glucobrassicanapin 4-pentenyl 13,5 1,15 EG
Glucoiberverin 3-metyltiopropyl 10,9 0,8 Brun
Glucoerucin 4-metyltiobutyl 14,0 0,9 Brun
Glucoiberin 3-methylsulfinylpropyl 3,7 1,2 Brun
glukorafanin 4-methylsulfinylbutyl 4,9 0,9 Brun
Glucoalyssin 5-methylsulfinylpentyl 7,6 0,9 Brun
Glucohesperin 6-methylsulfinylhexyl 10,5 1 Brun
Glucosiberin 7-methylsulfinylheptyl 13,5 1 Brun
Glucohirsutin 8-methylsulfinyloctyl 16,8 1,1 Brun
Glucoarabin 9-methylsulfinylnonyl 20,5 1
Glucocheirolin 3-methylsulfonylpropyl 4,2 0,9 Brun
Progoitrin 2 (R) -OH-3-butenyl 4,5 1,09 Buchner, EC
Gluconapoleiferin 2-OH-5-pentenyl 8,3 1 EG
indol glukosinolater
4-hydroxyglucobrassicin 4-hydroxiindol-3-ylmetyl 11,2 0,28 Buchner, EC
Glucobrassicin indol-3-ylmetyl 15,3 0,29 Buchner, EC
4-Methoxyglucobrassicin 4-metoxiindol-3-ylmetyl 18,2 0,25 Buchner, EC
Neoglucobrassicin 1-metoxiindol-3-ylmetyl 22,5 0,2 Buchner, EC
aromatiska glukosinolater
Sinalbin 4-hydroxibensyl 8,1 0,5 Buchner
Glucosibarin 2 (R) -OH-2-fenyletyl 12,1 se nästa
Glucobarbarin 2 (S) -OH-2-fenyletyl 12,7 0,95 Buchner
Glucotropaeolin bensyl 13,8 0,95 Buchner, EC
Gluconasturtiin 2-fenyletyl 18,0 0,95 Buchner, EC
okänt - alifatiska / aromatiska som UV-spektrum 1 EG
okänt - indol som spektrum 0,25 EG
* Ungefärlig retentionstid (Rt) avrundat till närmaste 0,1 min (± 0,3 min beroende på kolonnen, elueringsmedel kvalitet). Retentionstider bestäms på ThermoFisher / Dionex Ultimate HPLC-plattformar är utrustade med en kolumn C 18 (150 x 4,6 mm, 3 mikrometer partikelstorlek) plus C 18 tabell 1.
# Referenser för responsfaktorer: Buchner, R. i glukosinolater i raps (ed JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brunt, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gershenzon, J. Variation av glukosinolat ackumulation mellan olika organ och utvecklingsstadier av Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481, doi: 10,1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); EG. Oljeväxter - bestämning av glukosinolater High Performance vätskekromatografi. Officiella tidning Europeiska gemenskapernas. L 170/28. Bilaga VIII 03.07.27-34 (1990).

Tabell 3: responsfaktorerna för vanligast desulfo-glukosinolater i växtextrakt och deras ungefärliga retentionstider på C 18 kolumner. Eluenter, gradient, kolonntemperatur och flödeshastighet som i tabell 1.

Discussion

De största fördelarna med denna etablerade och allmänt använd metod är att den är robust, ganska enkelt, och relativt låg kostnad per prov. De flesta av den utrustning som behövs för utvinning och analys bör vara tillgängliga i en standard laboratorium eller kan vara hemmabyggda, med undantag av HPLC-PDA. En annan fördel är att desulfoglucosinolates lösta i vatten är kemiskt ganska stabila när de förvaras svalt och i lufttäta (HPLC) injektionsflaskor, så extrakten kunde lätt transporteras för HPLC-analys på annat håll. I motsats till LC-MS-plattformar, som kräver specialiserad utbildning och omfattande praktisk erfarenhet för att hantera programvaran och analysera data, HPLC-UV / PDA kan lätt köra efter en kort träningsperiod. Detta minskar inte bara kostnaderna för förfarandet, men också gör denna metod mer tillgängliga för ett brett spektrum av forskare, inklusive studenter.

Generellt när de förfaranden som beskrivs ovan följs carefully, bör några problem uppstå. I allmänhet anses de glukosinolater topparna mycket väl separerade i kromatogrammet. Om detta inte är fallet, kan den gradientprogram anpassas genom att minska ökningstakten av acetonitril i elueringsmedlet. Alternativt kan bygga på en ny förkolonn (200-500 injektioner) eller kolumn (1500 -2000 injektioner) lösa problemet. Ibland kan kromatogram av enstaka prov i ett parti visar mycket liten eller ingen toppar. Detta beror vanligtvis på att pipetteringsfel när du lägger till sulfatas (t.ex. en kolonn har hoppat eller sulfatas var inte korrekt sköljs i kolonnen). Alternativt kan glukosinolater koncentrationen i de experimentella material har varit lägre än förväntat och för lite material användes för utvinning. Om det senare är fallet, kan injektionsvolymen ökas till 100 mikroliter eller en exakt alikvot (t.ex., 800 mikroliter) av extraktet kunde koncentreras. Det senare skulle kunna uppnås genom frysning-torring extraktet, upplösning av återstoden i en mindre volym (t.ex. 100 mikroliter) av vatten, och återinjektera med användning av samma referenskurvan. I beräkningarna för den ursprungliga koncentrationen av extraktet, bör siffrorna multipliceras med spädningsfaktorn. Om detta inte löser problemet bör materialen extraheras igen med mer utgångsmaterial. Om detta är mer än 100 mg, bör volymen av de extraktionsmedel och storleken av rören justeras proportionellt för att bibehålla extraktionseffektivitet.

En ytterligare fördel är att denna metod har väldokumenterade. Detta beror på att det har beskrivits som en standardmetod för kvantifiering av glukosinolater i raps, för vilka förfarandena och noggrannhet bekräftades i flera laboratorier 16. Dessutom den genetiska bakgrunden, biosyntes och biologiska funktioner av glukosinolater är föremål för intensiva forskningsinsatser, i model växtarter Arabidopsis thaliana bl a 4, 6, 12. Därför är många responsfaktorer för exakt kvantifiering av desulfoglucosinolates i förhållande till sinigrin väl definierad och allmänt tillgängliga 15,17. Även om LS-MS-baserade protokoll är mer hög genomströmning, mer känsliga, och kan (preliminärt) identifiera glukosinolater för vilka inga standarder finns 18, 19, 20, bristen på universella responsfaktorer för LC-MS begränsar exakt kvantifiering av glukosinolater koncentrationer 18. Dessutom är dessa metoder vanligtvis inte innefattar en frystorkningssteget, och mängden vatten i färskt växtmaterial är försvunna i beräkningarna, vilket gör exakt kvantifiering svårt. Slutligen eftersom vår extraktionsmetod innebär en kolumnbaseradrening och koncentrationssteg, kan det också tillämpas på "smutsiga" prov med låga koncentrationer av glukosinolater, såsom jordar 21.

Jämfört med LC-MS-baserade metoder som vanligtvis extraherar nyligen frusna material, använder 96-brunnsplattor för utvinning, och inte inkluderar en sulfatas steg 18, 19, är relativt tidskrävande och arbetskraftsintensiv vår metod. Med kolumn rack som beskrivs i detta dokument, kan en enda person utvinna cirka 100-150 prov på en dag. Eluering (nästa dag), frystorkning (över natten), och återupplösning kan äga rum inom två dagar. Med en automatiserad HPLC injektor, en kör och jämviktstiden för 40-45 minuter per injektion, och inga oförutsedda händelser, skulle det ta 3-4 dagar att få data för provuppsättning. När HPLC-programvara kan automatisk kvantifiering baserad på sinigrin kurvan, en manuell kontroll av kromatogrammen och peak uppdrag för 100 prover kan endast ta ytterligare en eller två timmar innan uppgifterna kan användas för statistiska analyser.

Trots den ökade tillgängligheten av glukosinolater standarder, endast en liten del av de mer än 130 kandidater kan för närvarande inte kommersiellt köpt. Men med några referenser för var och en av de biosyntetiska klasser; tillgång till litteraturdatabaser som anger de föreningar som hittades tidigare i växter (t.ex. Fahey et al. 22); grundläggande kunskaper om kromatografiska principer, såsom logik eluotropic serie (t.ex. för att öka antalet Cs på sidokedjan i alifatiska föreningar, figurerna 3 och 4); och validering av enstaka prov på LC-MS 19 eller isolerade glukosinolater på NMR 23, kan man lätt övervinna denna begränsning. De flesta protokoll för glukosinolat analyser använda interna referenskurvor(Det vill säga, en viss koncentration för utvinning av sinigrin eller sinalbin till extraktionslösningsmedlet 16, 17, 19). Huvudsakligen interna referenskurvorna är lämpligare att korrigera för enskilda prov bearbetningsfel och därmed teoretiskt ge en högre precision. Trots denna fördel, föredrar vi att använda en femgradig yttre referenskurvan, som vi ofta analysera olika vilda arter, varav vissa innehåller höga halter av sinigrin (t.ex. Brassica nigra 24) eller sinalbin (t.ex. Sinapis alba 25), den två glukosinolater referenser som responsfaktorer finns. Dessutom lägga interna standarder för varje prov ökar kostnaderna för analyserna, som hög kvalitet glukosinolat referensnormer är oftast ganska dyra.

Sammanfattningsvis, trots tidskrävande steg, detta protokollger en enkel och lättillgänglig metod för att extrahera och kvantifiera glukosinolater i växtprover. Det är dock viktigt att tänka på att glukosinolater nivåerna själva är bara en indikation på den potentiella biologiska aktiviteten, ses som det är nödvändigt att reagera med myrosinas, och variation i reaktionsprodukterna kan uppstå från en enda glukosinolat 11. Validerings analyser måste utföras för att bekräfta den biologiska relevans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade VWR 20864.320
Sodium acetate (NaOAc) Sigma-Aldrich W302406-1KG-K
HCl VWR 1.09057.1000
Sephadex Sigma-Aldrich A25120-10G
(−)-Sinigrin hydrate
from horseradish 
Sigma-Aldrich S1647-500MG
Aryl Sulfatase Sigma-Aldrich S9626-10KU
Ethanol VWR 20816.298
Pasteur Pipette Carl Roth 4518.1
Glass Wool Carl Roth 7377.1
Glass/wooden stick VWR HERE1080766
2 mL reaction tubes VWR 211-2120
Dissecting needle Carl Roth KX93.1
Rotilabo-lab dishes Carl Roth 0772.1 Waste tray
Rotilabo-sealing clips Carl Roth N217.1
Freeze Dryer Freezone 12 L Labconco 7960030
Acetonitril super gradient grade VWR 83639.320
Water bath VWR 462-5112
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB 15061
PH Electrode Thermo Fisher Scientific STARA2115
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 Thermo Fisher Scientific 75004210
Pre-Column Thermo Fisher Scientific 69697 C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) 
Column Acclaim 300 Thermo Fisher Scientific 60266 C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) 
HPLC Ultimate 3000 Thermo Fisher Scientific with column oven and UV or PDA detector
Flask 1,000 mL VWR 215-1595
Glucosinolate reference compounds Phytoplan various http://www.phytoplan.de/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68, (22-24), 2831-2846 (2007).
  2. Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199, (1), 150-164 (1879).
  3. Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
  4. Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
  5. Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond. TIPS. 15, (5), 283-290 (2010).
  6. Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126, (2), 811-825 (2001).
  7. van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67, (12), 1214-1223 (2006).
  8. Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206, (3), 370-377 (1998).
  9. van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8, (1), 171-186 (2009).
  10. Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (17), 11223-11228 (2002).
  11. Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).
  12. Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54, (1), 57 (2009).
  13. Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. Genetics. 159, (1), 359-370 (2001).
  14. Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71, (17-18), 2074-2086 (2010).
  15. Buchner, R. Glucosinolates in rapeseed. Wathelet, J. P. Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).
  16. Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).
  17. Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62, (3), 471-481 (2003).
  18. Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23, (5), 520-528 (2012).
  19. Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. Current Protocols in Plant Biology. John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11, (4), 216-225 (2000).
  21. Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8, (1), 299-310 (2009).
  22. Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
  23. de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110, (0), 166-171 (2015).
  24. van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16, (1), 17-24 (2006).
  25. Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8, (5), 421-433 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats