Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Immunology and Infection

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Summary

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

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Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

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Abstract

La obesidad promueve un estado inflamatorio crónico que es en gran parte mediado por los macrófagos residentes de tejido como macrófagos derivados de monocitos. Obesidad inducida por dieta (DIO) es un modelo valioso en el estudio del papel de la heterogeneidad del macrófago; sin embargo, aislamientos adecuados macrófago son difíciles de adquirir los tejidos inflamados. En este protocolo, describiremos los pasos de aislamiento y pautas necesarias de solución de problemas derivadas de nuestros estudios para la obtención de una adecuada población de macrófagos residentes de tejido de los ratones tras 18 semanas de alto contenido de grasa (HFD) o () alta-grasa/colesterol Intervención de la dieta HFHCD). Este protocolo se centra en tres tejidos de sello estudiados en obesidad y aterosclerosis, incluyendo la aorta, el hígado y tejido adiposo blanco (WAT). Destacamos cómo dualista uso del flujo cytometry puede alcanzar una nueva dimensión de aislamiento y caracterización de los macrófagos residentes de tejido. Una parte fundamental de este protocolo aborda las complejidades subyacentes a digestiones enzimáticas específicas de tejido y macrófagos aislamiento y subsecuente anticuerpo de superficie de la célula de tinción para análisis cytometric del flujo. Este protocolo de direcciones existentes complejidades subyacentes célula fluorescente activada (FACS) de clasificación y presenta aclaraciones a estas complejidades con el fin de obtener la caracterización amplia gama de poblaciones celulares adecuadamente ordenados. Métodos de enriquecimiento alternativo se incluyen para la clasificación de las células, como el hígado denso, lo que permite flexibilidad y manejo de tiempos cuando se trabaja con FACS. En Resumen, este protocolo ayuda al investigador para evaluar la heterogeneidad de macrófago de una multitud de los tejidos inflamados en un determinado estudio y proporciona interesantes consejos para solucionar problemas que han tenido éxito para la caracterización y aislamiento celular favorable de células inmunes en la inflamación mediada por DIO.

Introduction

Modelos de ratón se han utilizado para estudiar la dinámica de enfermedades humanas. Correcto aislamiento de las células residentes del tejido de los ratones en un estado enfermo puede proporcionar una plataforma para la comprensión de las contribuciones moleculares y celulares en la patogenia de una enfermedad1. Un trastorno que es de vital importancia es la obesidad. La incidencia de la obesidad sigue aumentando en todo el mundo en paralelo con la resistencia a la insulina y tipo 2 mellitus de la diabetes, enfermedad cardiovascular y enfermedad del hígado graso2,3. Consumo excesivo de nutrientes es más sesgado por disminución de la actividad física provocando señales alteradas provenientes del tejido adiposo, que puede alterar el medio celular de otros tejidos periféricos como el hígado y aorta4. Tal interrupción de la homeostasis metabólica resulta en una inflamación sistémica crónica de bajo grado del5.

Activación clásica del residente a la aorta y el hígado, así como su contratación al tejido adiposo blanco (WAT) de macrófagos ha demostrado no sólo iniciar el dysregulation de señales metabólicas sino también sostener la inflamación6,7. La heterogeneidad fenotípica y funcional de los macrófagos está fuertemente asociada con la patogénesis de la obesidad relacionada con comorbilidades7. La plasticidad dinámica de polarización macrófagos permite para que estas células exhiben una variedad de fenotipos activados que coordinan la progresión y resolución de8de la inflamación. Mientras que clásico activados macrófagos (M1) están implicados en la propagación de la inflamación, macrófagos alternativamente activados (M2) se han asociado con resolución y el tejido de reparación9,10.

Como el cuerpo somete a estrés metabólico, tejido adiposo blanco se acumula anormalmente. El tejido adiposo ampliado atrae y retiene las células inflamatorias que alteran profundamente la función del adipocito normal para promover la resistencia a la insulina, hiperglucemia y diabetes mellitus tipo 2 en última instancia, resistencia a la insulina o hiperglucemia11, 12. En paralelo, remodelaciones de tejido adiposo blanco en respuesta a señales inflamatorias por infiltran clásico activado macrófagos (cajeros automáticos) de tejido adiposo (M1) de13,14. Este órgano multicelular ejerce una cascada de señales que hace descarrilar la función normal de otros órganos del cuerpo tales como la aorta y el hígado4.

El hígado es una potencia metabólica que se adapta en respuesta a estímulos procedentes de cerca dysregulated WAT15. Macrófagos hepáticos o células de Kupffer, en respuesta a cambios metabólicos, secretan citoquinas inflamatorias que transforman tanto parénquima y fenotipo de la célula no parenquimales y promoción la remodelación tisular. Acumulación de lípidos hepáticos, inflamación, depósitos de matriz extracelular excesivo, necrosis y función eventual pérdida sigue los insultos inflamatorios contribuyendo a la amplia gama de daño hepático asociados con enfermedad del hígado graso no alcohólico 1617,de,18.

En paralelo a WAT comprometido y función hepática, arterias grandes acumulan lípidos dentro de la pared arterial como el cuerpo somete a estrés metabólico crónico19. Acumulación lipídica arterial desencadena la secreción de quimioquinas por las células endoteliales activadas y posterior reclutamiento de monocitos20. Una vez reclutados, monocitos proliferan, diferencian, ingieren las lipoproteínas y se convierten en células espumosas. Aterogénesis es iniciada y sostenida por la actividad proinflamatoria de reclutados y macrófagos cargados de lípidos residente de tejido. Sucumbir a las señales de estrés extracelular e intracelular transmitidas en este microambiente aterogénico, estos macrófagos participan luego en una cascada de señalización de apoptosis. Como estas células espumosas mueren, contribuyen a su contenido de lípidos que llena a la base necrótica de la lesión, que entonces conduce a ruptura de placa, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular.

Colectivamente, la heterogeneidad de los fenotipos de macrófagos organiza en parte la obesidad inducida por cambios inflamatorios en los tejidos normales como WAT, hígado y aorta8,21. Caracterización de reclutados y macrófagos residentes pueden proporcionar la penetración en posibles dianas moleculares que manipulan macrófago fenotipo1. Para caracterizar eficazmente los macrófagos de los tejidos inflamados inducida por la obesidad, una suspensión unicelular se puede obtener a través de la digestión enzimática. Tales protocolos de disociación deben ser eficaces en degradar suficientemente tejido conectivo mientras que minimiza la muerte celular inmune y proporciona rendimiento óptimo de la célula. La mezcla de la enzima es dependiente en el tipo de tejido y su maquillaje estructural. Tejidos resistentes como la aorta requiere mayor actividad enzimática, en comparación con el hígado y el WAT, para lograr la disociación del tejido. De la suspensión de la célula, macrófagos residentes pueden ser inequívocamente caracterizados o aislados para mayores análisis aguas abajo como perfilamiento transcripcional.

Aquí se describe un protocolo específico de tejido que utiliza tejido dependiente de colagenasa digestión y citometría de flujo policromáticos efectivamente aislar y caracterizar macrófagos residentes de tejido obtenidos de la dieta tradicional inducida por obesidad, ateroesclerosis, esteatosis simple y esteatohepatitis modelos de ratón. Simultánea de marcadores de superficie celular con anticuerpos contra leucocitos (CD45 o CD11b) y macrófagos - antígenos específicos (F4/80) es de uso frecuente para identificar a las poblaciones de macrófagos22. Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación es una estrategia poderosa que se utiliza para ordenar estas poblaciones identificadas en alta pureza. La población clasificada puede evaluarse entonces perfiles de gen específico fenotipo mediante análisis molecular aguas abajo (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real)23. Aunque citometría de flujo estándar y clasificación de celda basados en citometría de flujo son herramientas poderosas en la distinción de macrófagos dentro de una suspensión sumamente heterogéneos, los protocolos anteriores deben optimizarse para asegurar la salida exitosa. En este estudio, se describen los protocolos que efectivamente aislaran y caracterizan los macrófagos específicos de tejido viable; más importante aún, este estudio proporciona penetración crucial en cuestiones técnicas que a menudo se presentan, así como de estrategias proactivas y solución de problemas para evitar o resolver.

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Protocol

Todos los protocolos experimentales (secciones 1, 1.2 y 1.3) fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) Universidad Estatal de Pensilvania.

Tejido Preparación de Buffers de disociación Volumen final Almacenamiento de información
Tejido adiposo blanco (WAT) Almacenador intermediario de la disociación: 2,5% HEPES, 10 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 3 mg/mL (0.3%) Colagenasa tipo II en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con glucosa de 4.5 g/L sin L-glutamina y sodio piruvato 500 mL menos 80° C (alícuotas de 10 mL)
Hígado 25 x perfusión Tampón concentrado (PBC): 3.55 M NaCl, KCl, de 168 mM 240 mM HEPES, 150 mM NaOH en agua destilada desionizada H2O 500 mL menos 20° C (alícuotas de 40 mL)
Solución de preservación (PRB): 1% de BSA 1 x Buffer de perfusión 1 L 4 ° C
Almacenador intermediario de la disociación: 1 x Buffer de perfusión complementado con 4,76 mM CaCl2 y 72 U/mL colagenasa tipo IV 50 mL (por ratón) Preparar inmediatamente antes de su uso
Aorta Almacenador intermediario de la disociación: 125 U/mL colagenasa tipo XI, 60 de U/mL hialuronidasa tipo I, 60 U/mL DNasa I, 450 de U/mL colagenasa tipo I, 20 mM HEPES 1 x de tampón de fosfato salino (PBS) 500 mL menos 80° C (alícuotas de 10 mL)

Tabla 1: Recetas de búfer tejido perfusión específico.

1. disociación y aislamiento de tejido

  1. Disociación y aislamiento de WAT
    1. Preparar los buffers de tejidos específicos según la tabla 1y guardarlos como se describe.
    2. Se preparan los siguientes reactivos.
      1. Preparar el buffer de digestión por descongelar el volumen adecuado de WAT disociación tampón y conservar a 4 ° C hasta su uso. Inmediatamente antes del uso, caliente la solución a 37 ° C. Preparar el tampón FACS preparando 1 x de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS).
    3. Aislamiento de WAT
      1. Eutanasia a una ratón en un dióxido de carbono (CO2) llenada de cámara. Compruebe la efectividad antes de continuar a la etapa de disección.
      2. Sumerja el ratón eutanasia brevemente en un vaso de precipitados que contiene etanol al 70% hasta completamente empapado y cubierto con el etanol. Coloque la superficie ventral del ratón arriba en la etapa de disección y sujete el ratón adelante y las patas traseras a la Junta de disección utilizando una aguja de 21 G.
      3. Use pinzas de punta de medio punto para agarrar la piel abdominal anterior a la abertura uretral, luego use tijeras disección agudas para hacer un nick en la piel del abdomen simples.
      4. Inserte la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y haga una incisión lateral del abdomen a la caja torácica.
      5. Suavemente jale hacia atrás la piel para exponer la cavidad peritoneal intacta y haga una incisión lateral a través del peritoneo y tampoco doblar la membrana transparente o suprimir el tejido para exponer el WAT abdominal.
      6. Recoger las almohadillas de grasa perigonadal como se describe en Mann et al. 24
        1. Las almohadillas de grasa perigonadal en ratones machos están ligadas al epidídimo y los testículos. En primer lugar localizar los testículos con medio punto de pinzas, sujete la mano de la cabeza del epidídimo y tire suavemente.
        2. Utilizando unas tijeras afiladas de disección, suprimir cada almohadilla grasa Epididimal por corte a lo largo de la superficie del epidídimo (cabeza, cuerpo y cola) y los testículos.
        3. Con pinzas, tire de la almohadilla de grasa mientras que corte a través del tejido conectivo ligado directamente a la estructura de epidídimo.
        4. Usando las pinzas, sujete firmemente el extremo de la almohadilla de grasa proximal al epidídimo y suavemente Retire la almohadilla de grasa de las gónadas
        5. En ratones hembra, los cojines de grasa perigonadal son libremente en el cuerpo del útero y el cuerno uterino.
        6. Con unas pinzas de punto medio, agarre el tejido de grasa perigonadal y tire suavemente el tejido del cuerpo del útero y el cuerno uterino.
        7. Suprimir cada cojín gordo cortando a lo largo del cuerpo de útero y el cuerno uterino con tijeras de disección agudas.
      7. Coloque la grasa en un plato de petri lleno de PBS y conservar en hielo para mantener el tejido húmedo.
    4. Disociación de WAT en suspensiones celulares solo
      1. Quitar exceso PBS de la caja Petri y utilice una cuchilla de filo único para finito el WAT abdominal en trozos pequeños.
      2. Con el borde afilado de la hoja de afeitar, raspar suavemente el picado WAT abdominal en un tubo de polipropileno colección etiquetada 15 mL que contiene 2 mL del tampón de disociación WAT.
      3. Incubar esta mezcla de tampón de digestión de tejido bajo lenta rotación continua a 37 ° C por 45 min.
      4. Filtrar el tejido digerido a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de 50 mL la colección mientras se mueve el pistón de goma de un émbolo en un movimiento circular y continuará la suspensión de células del tamiz a través del filtro.
      5. Pipeta 2 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) a un tubo de la colección de 15 mL, pipetee suavemente arriba y abajo y lavar el filtro con la suspensión unicelular.
      6. Lave el filtro dos veces más con DMEM frío y colocar la suspensión de células individuales en el hielo.
      7. Centrifugue la suspensión de células a 300 x g a 4 ° C durante 8 minutos.
      8. Utilice un aspirador de vacío para extraer cuidadosamente adipocitos flotantes (primero) y queda sobrenadante. Asegúrese de no perturbar la fracción vascular estromal pildorada (SVF).
      9. Con una pipeta de 1000 μl, suavemente Resuspender el pellet en buffer de cloruro de amonio y potasio (ACK) para lisar eritrocitos según las instrucciones del fabricante.
      10. Diluir la suspensión anterior con DMEM y Centrifugue la suspensión de células a 300 g a 4 ° C durante 8 minutos.
      11. Resuspenda las células en PBS frío con un 2% FBS (tampón FACS) y contar las células en una cámara de Bürker/hemocitómetro.
      12. Transferencia de 1 x 106 células (por citometría de flujo básico) o la suspensión de toda la célula (por FACS) para etiquetado 5 mL tubos de poliestireno fondo redondo. Seguir sección 2 para protocolo de tinción de citometría de flujo.
  2. Disociación y aislamiento de tejido del hígado
    Nota: Este protocolo fue adaptado de Smedsrød25.
    1. Preparar los buffers de tejidos específicos según la tabla 1 y guardarlos como se describe.
    2. Se preparan los siguientes reactivos.
      1. Preparar 1 x Buffer de perfusión (PB), diluyendo 40 ml de PBC en 960 mL ultrapura H2O. pre-caliente una jeringa llena con 50 mL de PB a 37 ° C, justo antes de la perfusión se inicia. Eliminar burbujas de aire presentes.
        1. Para eliminar las burbujas de aire, invierta la jeringa en la punta de la cerradura de leur quede apuntando hacia arriba. Toque o mueva la jeringa hasta que las burbujas de aire al pf superior la jeringa. Empuje suavemente el émbolo para expulsar el aire
      2. Preparar el buffer de digestión diluyendo 0.5 mL de solución de CaCl2 de 476 mM49,5 ml 1 x buffer de perfusión. Añadir 3600U de colagenasa tipo IV a lo 4,76 mM CaCl2 – solución de PB. Caliente previamente una jeringa llenada con 50 mL de tampón de digestión a 37 ° C antes de la perfusión se inicia. Eliminar burbujas de aire presentes como se describe en el paso 1.2.2.1.1.
      3. Preparar la preservación Buffer (PRB) disolver 2,5 g albúmina de suero bovino (BSA) en tampón de perfusión de 1 x 250 mL. Almacenar a 4 ° C o no en hielo hasta su uso.
      4. Preparar el tampón FACS con 1 x PBS y el 2% de SBF.
    3. Aislamiento de tejido del hígado
      1. Eutanasia a un ratón por CO2 asfixia, saturar ratón con etanol al 70% para prevenir la contaminación de los órganos intraabdominales con la piel.
      2. Posición el ratón ventral hacia arriba en un poliestireno espuma tablero de disección y garantizar el ratón y posteriores patas a la Junta de disección utilizando una aguja de 21 G.
      3. Para exponer la pared torácica y la cavidad peritoneal, agarre la piel abdominal cerca de la abertura uretral utilizando unas pinzas de punta de medio punto. Utilice unas tijeras de disección aguda para crear una pequeña incisión en la piel abdominal comprendida.
      4. Inserte la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y hacer una incisión lateral desde la ingle a la barbilla.
      5. Suavemente jale hacia atrás la piel para exponer la cavidad peritoneal intacta y la pared torácica, hacer una incisión lateral a través del peritoneo y suprimir la membrana.
      6. Levantar el esternón y con cuidado haga una incisión en el diafragma, asegúrese de no molestar a la vena cava inferior (IVC). Mover los órganos gastrointestinales para el lado y ubicar la vena cava inferior subhepático. Use pinzas hemostáticas para las suprahepáticas IVC mantener perfusión localizada de la abrazadera.
        Nota: La acumulación excesiva de tejido adiposo blanco visceral a menudo puede enmascarar la vena cava inferior. Para visualizar mejor esta nave, una pequeña zona de tejido adiposo junto a la vena cava inferior puede ser suprimida. La ventana Incisa en el tejido adiposo flexible se puede colocar luego sobre la vena cava inferior para exponer la nave para la canulación.
      7. Conectar la jeringa llenada de PB precalentado al conjunto colección e infusión de sangre 23 G. Empuje suavemente el émbolo hasta que el tubo y la aguja están llenos de PB.
      8. Inserte la aguja de 23 G, paralela al nivel de la vena cava inferior subhepático. Fije la aguja en su lugar utilizando una pinza hemostática de 4 cm.
        Nota: La canulación de la Subhepática que IVC es preferido en los ratones alimentados con dieta en que la vena cava inferior puede ser mejor visualizada y canulado dentro de la cavidad llena de grasa.
      9. Empuje suavemente el émbolo para iniciar la perfusión, color se lave rápidamente del hígado (lóbulo de derecho primero) si la aguja está colocada adecuadamente en el vaso. La ampliación de los lóbulos también es visible si la aguja está insertada correctamente en el IVC subhepático.
      10. Rápidamente cortar la vena porta para permitir que el PB fluya libremente a través del hígado.
      11. Perfusión del hígado hasta que la sangre no es visible. Masajes en ocasiones suavemente los lóbulos hepáticos entre fore-dedo y el pulgar para facilitar la perfusión.
        Nota: Es importante usar herramientas de filo embotados no serrado para manejar el hígado para evitar daños en los tejidos.
      12. Cuando dentro de la jeringa de 5 mL de PB, cambiar a la jeringa llenada con tampón de disociación precalentado. No perturbe la posición de la aguja asegurada durante este tiempo.
        Nota: Ampliada significativamente superior a 1,5 g debe ser inundada con un mayor volumen de buffer de digestión precalentado para garantizar éxito disociación hígada hígados.
      13. Perfusión del hígado hasta completamente digerido. Masajee suavemente los lóbulos de hígado para facilitar la perfusión.
        Nota: Separación de la cápsula de Glisson del parénquima es observable en un hígado con éxito digerido. Para evaluar esto, utilice el borde romo de un par de pinzas, presionar suavemente en el lóbulo lateral izquierdo. La impresión debe aparecer en la superficie y la muesca debe llenar lentamente una vez retirado el fórceps.
      14. Retire la aguja de la vena cava inferior subhepático. No retire las pinzas hemostáticas suprahepáticas vena cava inferior de sujeción.
      15. Suprimir el hígado entero cortando con cuidado a través de la conexión de ligamentos usando una cuchilla recta corta tijeras de disección y para extirpar la vesícula biliar.
      16. Colocar el hígado entero en un plato de petri de 10 cm conteniendo 10 mL Buffer de conservación helada y almacenar a 4 оC hasta listo para liberar a las células.
    4. Disociación de la célula del hígado
      1. El hígado la transferencia a un plato de 10 cm conteniendo 10 mL DMEM helada.
      2. Agarre la suprahepática cercenada que IVC al hígado suprimido usando un fórceps dentado. Utilice pinzas de punto medio para liberar las células de la cápsula de Glisson mediante la aplicación de rápido movimiento frotando ligeramente a cada lóbulo.
      3. Pasar el DMEM saturado a través de un tamiz de célula μm 70 conectada a un tubo de colección de 50 mL.
      4. Pipeta 10 mL de helado DMEM al plato de petri de 10 cm y repita los pasos 1.2.4.1 a 1.2.4.3 hasta que ya no se observa la saturación de los medios de comunicación. Lugar la suspensión de células en hielo o a 4 ° C.
      5. Mezclar suavemente la suspensión de células por inversión del tubo de colección y luego centrifugar a 54 x g durante 2 min a 4 ° C.
      6. Recoger el sobrenadante en un tubo de recogida limpia de 50 mL. Luego Centrifugue la suspensión de células a 54 x g durante 2 min a 4 ° C.
      7. Repita el paso 1.2.4.6 dos veces más antes de proceder al paso 1.2.4.8.
      8. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio 50 mL-colección y Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
      9. Resuspenda el precipitado de células no parenquimatosas en tampón FACS y contarlas en una cámara de Bürker/hemocitómetro.
      10. Transferencia de 1 x 106 células (por citometría de flujo básico) o 15 x 106 - 20 x 106 células (FACS) para etiquetado tubos de poliestireno de fondo redondo 5 mL. Seguir sección 2 para protocolo de tinción de citometría de flujo.
  3. Disociación y aislamiento de la aorta
    Nota: Este protocolo fue adaptado de carniceroet al.26
    1. Preparar los buffers de tejidos específicos basados en las recetas que se proporciona en la tabla 1 y guardarlos como se describe.
    2. Se preparan los siguientes reactivos.
      1. Preparar el buffer de digestión por descongelar el volumen adecuado de WAT disociación tampón y conservar a 4 ° C hasta su uso. Inmediatamente antes del uso, caliente la solución a 37 ° C.
      2. Preparar una solución de heparina 10 x disolviendo heparina sal sódica en PBS 1 x a una concentración de 200 U/mL. Diluir 10 x solución con 1 x PBS para preparar una solución 1 x heparina heparina. Almacenar el x 10 y 1 x soluciones de heparina a 4 ° C hasta su uso.
      3. Preparar el tampón FACS con PBS 1 x con un 2% FBS.
    3. Disección de aorta
      1. Eutanasia a un ratón en una cámara llenada de dióxido de carbono y enjuagar con etanol al 70%.
      2. Coloque el lado ventral del ratón arriba en la etapa de disección, extender el ratón adelante y las patas traseras y sujételos a la Junta de disección utilizando una aguja de 21 G.
      3. Inmediatamente después de euthanizing el ratón, realizar punción cardiaca. Consulte los pasos 1.3.3.4 a 1.3.3.9, si es necesario.
      4. Localizar el proceso xifoides en el extremo inferior del esternón
      5. Para ello, coloque un punto medio del dedo a lo largo de la anchura del cuello del animal. Rastro a lo largo de la línea media ventral del cuello en el extremo caudal del esternón hasta que sienta una extensión cartilaginosa.
      6. Usar pinzas de punto medio para captar la extensión cartilaginosa y si es necesario marcar el lugar del proceso del xiphoid retirando el parche de pelo o la piel en la zona.
      7. Parcialmente, introduzca una aguja de 26 G debajo del proceso xifoides en ángulo de 20-30°.
      8. Suavemente aplicar presión negativa en la jeringa, retirando lentamente el émbolo, luego insertar la aguja más en la cavidad hasta que la sangre fluye.
      9. Si el flujo sanguíneo se detiene, lentamente gire la aguja o mover ligeramente en y hacia fuera.
      10. Uso el par de pinzas para asir el asimiento de la piel abdominal anterior uretral abrir y usar un par de tijeras de disección agudas para cortar a lo largo de la línea media ventral a través del peritoneo de la ingle a la barbilla.
      11. Tire hacia atrás la piel para exponer órganos abdominales y las costillas con los dedos o pinzas embotadas suavemente mover órganos abdominales hacia el lado.
      12. Uso las pinzas para asir el asimiento del proceso del xiphoid, levantar el esternón y practique una incisión en el diafragma.
      13. Usando las tijeras de disección, corte en las nervaduras laterales en ambos lados. Agarre el esternón, tapa de la caja torácica hacia arriba y cortar a través de la conexión base. Retirar las costillas, exponiendo los órganos torácicos subyacentes.
      14. Inundar la aorta con una aguja de calibre 26 a una 10 mL-jeringa llena con solución de heparina 1 x inyectando 1-2 mL de solución en el ventrículo izquierdo (LV) del corazón.
        Nota: Asegúrese de perfusión a un ritmo lento con poca presión para lesiones aórticas ateroscleróticas intactas.
      15. Impuestos especiales, el timo, los pulmones y tejido conectivo. Consulte los pasos 1.3.3.16 y 1.3.3.17, si es necesario.
        1. Anterior el corazón Localice el blanco bi-lóbulos (o en forma de mariposa) órgano y firmemente sostenga de gancho agarrador del timo con el fórceps. Tire hacia arriba de ambos lóbulos de la cavidad y corte en la base con las tijeras.
        2. Para extraer los pulmones, pellizcar un lóbulo pulmonar con el fórceps, tire del tejido de la cavidad torácica y corte en la base. Repita para cada lóbulo restante.
      16. Usar un microscopio de disección disección micro herramientas y recoger que la aorta arco (incluyendo la arteria innominada, arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda), ascendente, descendente, aorta torácica y abdominal.
        1. Localizar la aorta ascendente en el ventrículo izquierdo del corazón.
        2. Con un par de curvas 0.07 x 0,04 m-punta Pinzas suavemente Sujete la porción de la aorta ascendente emerge del ventrículo izquierdo.
          Nota: En comparación con el tejido adiposo circundante teñida de amarillo, la aorta será un vaso blanco brillante procedentes de LV cuando suficientemente enjuagarse con la solución de heparina.
          1. Si la aorta no fue limpiada correctamente por la perfusión cardiaca, purgue la aorta otra vez cuando la aorta está conectada a la cavidad. Para ello, corte cerca de la ensambladura de corazón aorta, quitar el corazón y cortan horizontalmente a través del extremo inferior de la aorta abdominal. Introduzca una aguja de 26 G en el orificio de la aorta ascendente y lave suavemente la aorta con el 1 x solución de heparina.
          2. Jale suavemente la aorta ascendente a discriminar mejor entre el tejido graso y la aorta incrustado.
          3. Todavía suavemente tirando de la aorta ascendente, utilice la punta del resorte cerrado tijeras de disección para eliminar la grasa que encapsula la aorta ascendente y arco aórtico. Para ello, el tejido adiposo con la punta de las hojas de la tijera cerrada rasgar lejos la grasa conexión del movimiento.
            Nota: Abstenerse de suprimir cualquier tejido graso mediante la reducción de hasta la aorta ascendente y arco pueden visualizarse claramente. Esto es para evitar cortar la aorta.
          4. Si la aorta ascendente y arco pueden delinearse claramente desde el tejido adiposo envolvente, utilice el resorte de tijera de disección para suprimir el exceso de grasa.
          5. Agarra suavemente asimiento del arco aórtico con el fórceps. Otra vez usando la punta de la tijera de resorte, movimiento en la grasa a lo largo de la longitud de la aorta descendente, torácica y abdominal en el extremo caudal de la aorta abdominal, hacerlo en el lado derecho de la manga de la grasa.
          6. Seguir captar a lo largo de la aorta al rasgar lejos la grasa. Asegúrese de hacer tan suavemente para evitar dañar la aorta.
          7. Tire suavemente de la aorta ascendente hacia el microscopio para que la grasa se coloca ahora detrás de la aorta.
          8. Introduzca las hojas de la tijera cerrada entre la interfaz de grasa-aorta cerca del extremo anterior de la aorta descendente, grave accesorio del tejido graso a la superficie de la aorta sin rodeos, usando un movimiento de barrido.
            Nota: Fondo quitando exceso de grasa y tejido de conexión mientras que la aorta está todavía dentro de la cavidad se recomiendan.
          9. Suprimir el corazón y cortar transversalmente en el extremo caudal de la aorta abdominal. Retire la aorta entera.
          10. La aorta en un plato de 35 mm y fastidiar a cualquier exceso de grasa en la aorta usando dos agujas de calibre 21. Coloque la aorta suprimida en tubo de microcentrífuga de 1,7 mL de hielo.
    4. Disociación de la Aorta en suspensiones celulares solo
      1. Buffer de disociación de aorta pipeta 0.2 mL al tubo que contiene la aorta. Introduzca las hojas de la tijera de primavera hacia el extremo afilado del tubo y rápidamente pique la aorta para facilitar la digestión enzimática.
      2. Transferir la mezcla de tejido-solución a un 15 mL colección tubo y pipeta 1,8 mL aorta disociación de tampón para un volumen total de 2 mL.
        Nota: Para facilitar la transferencia de la suspensión de tejido, corte 1 cm el extremo afilado de una punta de pipeta de 1000 μl estándar. Use la extremidad acortada para transferir la suspensión con una micropipeta.
      3. Incubar la aorta picada en el búfer de disociación de la aorta durante 55 minutos a 37 ° C, agitación a 220 rpm (0.514 x g).
      4. Pasar la suspensión a través de tamiz de célula de 50 μm en un tubo de polipropileno colección de 15 mL. Usar el pistón de goma del émbolo de la jeringa para facilitar el filtrado.
      5. Enjuagar el tubo de la colección de 15 mL con buffer 1 mL FACS, recoger la suspensión y pasan por el tamiz de la célula.
      6. Lave el filtro de célula μm 50 dos veces más con 1 mL de tampón de FACS.
      7. Sedimenten las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspenda las células en frío tampón FACS. Contar las células en una cámara de Bürker/hemocitómetro.
      8. Transferencia de células 1 x 106 (por citometría de flujo básico) o la suspensión de toda la célula (por FACS) a un tubos de poliestireno etiquetados 5 mL fondo redondo. Seguir sección 2 para protocolo de tinción de citometría de flujo.

2. flujo Cytometry y la coloración de la FACS

Fluoróforo R-ficoeritrina (PE) PE/Cianina (Cy) 7 PE/Cianina (Cy) 5 Azul Pacífico (PB)
Láser (nm) Azul (488 nm) / amarillo (561-570 nm) - verde (532 nm) Azul (488 nm) / amarillo (561-570 nm) - verde (532 nm) Azul (488 nm) / amarillo (561-570 nm) - verde (532 nm) Violeta (405 nm)
Excitaciónmáxima (nm) 496 496 496 401
Emisiónmáxima (nm) 578 785 667 455
Marcador fenotípico F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX integrina, integrina αX cadena, CR4, p150, ITGAX ΑM integrina, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, ACV
Tipo de célula específica Macrófagos residentes Macrófagos activados clásico (M1) Monocitos / macrófagos Leucocitos (macrófagos / monocitos, linfocitos y granulocitos)
Subconjunto de células dendríticas Las células dendríticas, células NK, células T activadas y un subconjunto de linfocitos intestinales intraepiteliales (IEL) Granulocitos, células dendríticas, células NK y subconjuntos de células T y B
Factor de dilución 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Controles de isotipo PE rata IgG2a PE/Cy7 hámster armenio IgG PE/Cy5 Rat IgG2b IgG2c rata azul Pacífico

Tabla 2: Lista de fluoróforo etiquetado anticuerpos específicos para discriminar los macrófagos residentes.

  1. Reunir y preparar los siguientes elementos: tubos de poliestireno de FACS Buffer 5 mL fondo redondo, receptor CD16/32 Fc de anti-ratón bloqueo de anticuerpos, fluoróforo conjugada o no conjugada a anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo (if es necesario), 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    Nota: Para la tinción de grandes cantidades de células, concentración de anticuerpos es más crítico en lugar de número de celular. Por ejemplo, si el volumen de tampón de tinción de las células de la tinción 10 x 106 y concentración de anticuerpos debe ser el mismo como si coloración 1.0 x 106 células en volumen de 100 μl tampón. Para la tinción de 1.0 x 108 células, aumentando la cantidad de anticuerpo 5 veces es recomendable.
  2. Añadir tampón de FACS helado adicional a cada tubo de FACS si es necesario, de la pelotilla de las células por centrifugación a 751 x g durante 5 min (4 ° C). Aspirar el sobrenadante centrifugado siguiente.
  3. Añadir receptor CD16/CD32 Fc de anti-ratón bloqueo de anticuerpos a todas las muestras según las instrucciones del fabricante. Incubar por 15 min a 4 ° C o en hielo.
  4. Añadir el anticuerpo primario conjugados fluoróforo cóctel directamente al receptor de Fc que contiene anticuerpos bloqueo suspensión de células e incubar las muestras a 4 ° C durante 30 minutos proteger muestras de la luz para minimizar la decoloración de anticuerpos conjugados fluoróforo.
    1. En el evento se utilizaron anticuerpos primarios no conjugados, siga estos pasos después de completar el paso 2.4.
    2. Anticuerpo primario lavado teñido de muestras por centrifugación a 751 x g durante 5 minutos (4 ° C).
    3. Eliminar el sobrenadante por decantación y vuelva a suspender el sedimento en 100 μl de tampón FACS.
    4. Añadir el anticuerpo secundario conjugado a todas las muestras necesarias e incubar 30 min a 4 ° C. Proceda al paso 2.5.
  5. Siguiente incubación del anticuerpo, añadir 2 mL de tampón de FACS frío hielo luego pelotilla células 751 x g durante 5 minutos (4 ° C). Decantar el sobrenadante y asegúrese de no perturbar el pellet.
  6. Mezclar suavemente las células y luego vuelva a suspender con 200-400 μL de tampón FACS, luego mantener esto en la oscuridad a 4 ° C hasta el análisis de citometría de flujo estándar o clasificación celular.
  7. Para la fijación de células a corto plazo, proceder a pasos 2.8 a 2.10. Fijación de uso para la citometría de flujo estándar solamente.
  8. Inmediatamente después de paso 2.5, Resuspenda las células en paraformaldehido de 2-4% de 0,5 mL (PFA) durante 15-30 min a 4 ° C.
    Nota: PRECAUCIÓN: PFA es un conocido irritante con efectos cancerígenos y tóxicos. Cuando se utiliza PFA, manejar con mucho cuidado. Asegúrese de utilizar el equipo de protección personal y ventilación de escape.
  9. Fijación siguiente, lave las células mediante la adición de tampón FACS de 2 mL para todas las muestras y centrifugue a 751 x g en 4 ° C por 5 minutos eliminar sobrenadante centrifugado siguiente.
  10. Resuspender células fijas en 200 μL de tampón de FACS frío hielo y almacenar a 4 ° C. Arreglo de tienda las células hasta 1 semana a 4 º C, idealmente realizar adquisición de citometría de flujo dentro de 48 horas para minimizar la autofluorescencia.
  11. Adquirir datos de citometría de flujo según las instrucciones del fabricante de citómetro de flujo o realizar fluorescente celular activado clasificación según lo descrito por Basu et al. 23

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Representative Results

Cuando se utiliza la apolipoproteína E deficiente (KO ApoE) C57BL/6 (BL6) ratones mantenidas en una dieta de alta grasa colesterol alto (HCHFD o HCD) para 18 semanas, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrófagos aórticos pueden ser aislados cuando las dos muestras son agrupados. Hígado disecado de los ratones alimentados con HFHCD KO ApoE, produjo mayor que 5 x 105 clasificado las células de Kupffer (que depende del tiempo disponible de la clasificación). Cuando uso dieta alta en grasas (HFD) alimentados con ratones de tipo salvaje (WT) C57BL/6, 5 x 105 a 1 x 106 tejido adiposo residente macrófagos (ATMs) pueden ordenarse de la fracción vascular estromal (SVF). El mencionado número de macrófagos que pueden ordenarse de un tejido determinado era adecuado para la realización de análisis de expresión génica mediante reacción en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real (qPCR). Para los tejidos donde menor cantidad de la poblaciones de macrófagos es recuperados, como la aorta, se recomienda usar Co precipitantes (por ejemplo glucógeno) y la precipitación durante la noche cuando aislar RNA es necesaria para estos análisis.

Aquí, los efectos de trastornos metabólicos inducidos por la dieta en fenotipo de macrófago utilizando básicos fluyen cytometry, clasificación de células activado por fluorescencia (FACS) y tipo post abajo se muestran los análisis. Estos resultados corroboran observaciones previamente publicadas que ratones alimentación con una infiltración de exposición aumentó HFD o HFHCD de macrófagos (M1) clásico activados en tejidos afectados como la aorta (figura 1B). Tomando ventaja de citometría de flujo FACS y Perfil de expresión génica (mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), el fenotipo predominante de tirosina del receptor de Ron quinasa-expresar CD45+ + de F4/80 los macrófagos derivan de observó los tejidos aislados de ratones alimentados con dieta. Ron expresando receptores aórticos macrófagos que demostraron un fenotipo antiinflamatorio fueron disminuidos en ratones alimentados con HFHCD (figura 1 y D). Macrófagos expresan receptores de Ron ordenados derivan de arginasa aumento demostrado de aortas digerido 1 (Arg1) la expresión génica, que es un marcador bien establecido de macrófagos M2 (Figura 1E). Los macrófagos pro-inflamatorias que fueron caracterizados como CD45+ + CD11c de F4/80+ aumentaron en aortas aisladas de ratones alimentados con HFHCD (figura 1B y D). Caracterización reside en el hígado los macrófagos más había aclarado el fenotipo predominante de subpoblaciones de expresar receptores de Ron (figura 2A). CD11c + macrófagos pro-inflamatorias las poblaciones demostraron una disminución de la expresión de genes que están fuertemente asociadas con un fenotipo (M2) antiinflamatorio como Arg1 y Ron (figura 2B). Tendencias similares se observaron en las poblaciones de macrófagos aisladas de tejido adiposo blanco digerido (figura 3). Población de macrófagos con una firma pro-inflamatorios mostraron expresión superficial disminuida del receptor Ron (figura 3). La combinación de los enfoques, citometría de flujo básico y FACS, dio lugar a datos concluyentes que valida aún más el receptor Ron como un regulador de la activación alternativa de (M2) en macrófagos32. Tal sesgo hacia un fenotipo (M2) antiinflamatorio se ha demostrado jugar un papel protector en el desarrollo y progresión de la obesidad, la ateroesclerosis y la esteatohepatitis31.

Figure 1
Figura 1: Caracterización de macrófagos aislados de aorta disociado extraído de ratones KO ApoE mantenidas en un HCD para 18 semanas. (A) las células primero fueron gated en CD45+ leucocitos, excluyendo los desechos celulares. (B) CD45 coloración junto con F4/80 se utiliza para delimitar las poblaciones positivo doble se supone que los macrófagos. Control adicional fue utilizado para demostrar el porcentaje de CD11c+CD45+F4/80+ (M1) y (C) Ron+CD45+F4/80+ (potencial M2) macrófagos en aortas derivadas de ratones alimentaban con ya sea un chow normal o colesterol alto dieta para 18 semanas. (D) mayor porcentaje de CD11c+CD45++ (M1) de F4/80 los macrófagos, así como una disminución en el porcentaje de Ron+CD45++ (potencial M2) de F4/80 se observaron macrófagos en aortas derivados de ratones alimentados con HCD en comparación con ratones alimentados con una dieta chow normal. (E) análisis de expresión génica de Ron ordenado+CD45+macrófagos F4/80+ demostraron incremento en la expresión de la arginasa I (un marcador M2 murino bien conocido). Se obtuvieron valores del estudiante t-test análisis realizado utilizando el software de análisis estadístico y representó como promedio ± SEM. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo (* P < 0.05, *** P < 0,001). Figura ha sido modificada de Yu et al. (2016) 31. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Perfil de transcripción génica de las poblaciones de la célula de Kupffer clasificadas de hígados digeridos disecado de ratones KO ApoE mantenidas en un HCD para 18 semanas. (A) esquema General bloquea para caracterizar y clasificar las poblaciones de la célula de Kupffer. (B) análisis de expresión génica de Ron expresando (Ron+) y no-expresar (Ron) CD45 ordenada++ de F4/80 macrófagos por RT PCR cuantitativa. Análisis de prueba t de estudiante fueron realizados utilizando el software estadístico y los valores se representan como promedio ± SEM. P < 0.05 se consideró estadísticamente significativo (* P < 0.05, *** P < 0,001). Figura ha sido modificada de Yu et al. (2016) 31 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Caracterización de cajeros automáticos aislados de tejido adiposo blanco disecado de los ratones WT BL6 alimentó un HFD durante 18 semanas. Esquema General de bloquea (A), para caracterizar y clasificar el tejido adiposo derivados de poblaciones de macrófagos (B) porcentaje de Ron + células dentro de CD45++CD11c de F4/80y CD45++CD11c de F4/80+ las poblaciones de macrófagos clasificadas de WAT. Figura ha sido modificada de Yu et al. (2016) 31 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Modelos de trastorno metabólico inducido por la dieta que imitan comorbilidades tales como ateroesclerosis, esteatosis simple, esteatohepatitis y diabetes tipo 2 se utilizan extensivamente para entender mejor los mecanismos moleculares subyacentes de progresión de la enfermedad. Digestión depende de la colagenasa a menudo se utiliza para disociar los tejidos para liberar las células de la matriz extracelular (ECM)16,27. Enzimas como la colagenasa interrumpen colágeno que proporciona soporte estructural para los vecinos de las células. Composición estructural de los tejidos dicta la rigidez (resistencia a la deformación) de la matriz del tejido y que producto de colagenasa cruda es más eficiente para garantizar la exitosa interrupción de ECM28. WAT, que se compone de "matriz blanda" es a menudo digerido con colagenasa tipo II para liberar los adipocitos y las células inmunes residentes mientras que simultáneamente mantiene la integridad de la célula insulina superficie receptores29. La microarquitectura de los componentes de la fibrilla de la aorta contribuye a la "matriz dura", para que efectiva digestión aórtica tipo colagenasa XI (que tiene la mayor actividad colagenasa) se utiliza en combinación con enzimas adicionales. A diferencia de la aorta, la digestión hígada utiliza una colagenasa con una débil actividad enzimática, colagenasa tipo IV, para alterar la matriz y liberar células parenquimales y no parenquimales viables30. Los tejidos crónicamente inflamados derivan de tipo salvaje alimentados con dieta o deficiencia de apolipoproteína E (ApoE KO) ratones en un C57BL6 fondo a menudo sufren remodelación que pueden impedir la correcta digestión enzimática. Esta sección discutirá estrategias para minimizar o eliminar la posibilidad de tejido inadecuada disociación y recuperación de la baja de la célula.

Una característica común de los tejidos derivados de modelos con ratones alimentados con dieta que imitan obesidad, ateroesclerosis y enfermedad del hígado graso no alcohólico, es remodelado de tejido anormal. En tejido adiposo blanco, la aorta y el hígado, se altera la composición del ECM, a menudo dando por resultado la deposición excesiva de componentes fibrilares como colágenos. C57BL6 de tipo salvaje ratones mantenidos en una dieta alta en grasas durante dieciocho semanas, experimentar anormalidades específicas de tejido como el tejido adiposo blanco ampliado y agrandado hígado graso (esteatosis simple). Muchas veces estas características metabólicas no son molestos obstáculos a superar durante el proceso de disociación del tejido. Por el contrario, en otros modelos de dieta inducida que fenotipos más exacerbados, la amplia remodelación del tejido puede plantear un problema durante la digestión del tejido. A menudo se utilizan para HFHCD alimentó ratones KO ApoE modelo aterosclerosis y esteatohepatitis. Una característica común asociada a esteatohepatitis avanzada es la deposición excesiva de ECM en el hígado (o fibrosis). Hígado fibrótico se ha demostrado para ser bastante problemático durante la disociación enzimática de tejido y a menudo produce células bajo rendimiento31. Para mejorar el rendimiento de la célula, es crítico seguir los protocolos de la digestión sin desviación. Aunque el hígado normal puede ser picada y sumergido en buffer de digestión para lograr disociación, perfusión con tampón de digestión maximiza el contacto entre la matriz extracelular del hígado y la solución de colagenasa; y por lo tanto, este enfoque es muy recomendable. Además, 20-30 mL de tampón de digestión es a menudo un volumen adecuado de éxito disociación de hígados normales; sin embargo, en cuanto a modelos de ratón que desarrollan hígado agrandado o fibrótica, perfusión con 50 mL de tampón de digestión es preferida para una digestión apropiada reduciendo la muerte celular. Para hígados con pesos que excedan significativamente 1.5 g, aumentando el volumen de buffer de digestión se recomienda para garantizar éxito digestión.

Tejido Problema Razón posible Solución
Tejido adiposo blanco (WAT) Disociación celular pobres Mala digestión Tampón de digestión es 37° C
Muerte de la célula Digestión de colagenasa excesiva Reducir el tiempo de digestión
Reducir el volumen de buffer de digestión
Aorta Disociación celular pobres Mala digestión Tampón de digestión es 37 ° C
Piezas de aorta en buffer de digestión eran demasiado grandes Asegúrese de que la aorta se corta en trozos de aproximadamente 1 mm
Piezas de aorta no temblaban en tampón de disociación durante la incubación Asegúrese de que piezas de la aorta están sacudiendo en la solución de digestión
Muerte de la célula Digestión de colagenasa excesiva Reducir el tiempo de digestión
Reducir el volumen de buffer de digestión
Hígado Disociación celular pobres Mala digestión Tampón de digestión es 37 ° C
Aumentar el volumen de buffer de digestión
Canulación inadecuada del IVC (inflamación del tejido que circundante de la IVC se produce) Asegúrese de que la aguja se inserta correctamente en la vena cava inferior
Ruptura de vena cava inferior Fijar correctamente la aguja en la vena cava inferior antes de la perfusión
Reducir la velocidad de perfusión
Tejido roto Reducir la velocidad de perfusión
Muerte de la célula Versión incorrecta de las células de la cápsula de Glisson Asegúrese de disociar las células de la cápsula usando previamente discutido acariciando método
Digestión de colagenasa excesiva Reducir el tiempo de digestión
Reducir el volumen de buffer de digestión

Tabla 3: solución de problemas de disociación tejido. El flujo cytometry base celular clasificación o FACS es una técnica poderosa para aislar poblaciones celulares donde de alta pureza es una necesidad. Al purificar las células célula clasificando, logrando celular alto rendimiento pero también una especie de alta pureza requiere utilizando las estrategias adecuadas de clasificación. En esta sección, métodos para mejorar el fluoróforo multi fluyen celular basados en citometría de clasificación del tejido se describen residente macrófagos derivados de ratones alimentados con dieta. Para el aislamiento de macrófagos residentes de distintos tejidos, marcadores de superficie es un paso crítico. Macrófagos derivados de WAT, la aorta y el hígado son a menudo distinguen con un CD45+, CD11b+, F4/80+ estrategia que bloquean. Paneles de citometría de flujo adicional pueden utilizarse para identificar macrófagos residentes. Estos paneles incluyen anticuerpos que probe para la expresión superficial de macrófagos glicoproteínas específicas (CD64, CD68 y CD14), histocompatibilidad complejos (MHCII) y apoptosis celular tirosina cinasa receptores (MerTK)32, 33. fenotipo macrófago específica entonces puede ser delineado por sondeo para la expresión de superficie selectiva de M2 (CD163, CD209 y CD206) o M1 marcadores (CD38, CD40, CD80 y CD86)34,35. Auto-fluorescencia generada por macrófagos cargados de lípidos puede presentar algunos problemas cuando se bloquean las poblaciones. Usando los anticuerpos etiquetados con fluorocromos que son excitados por el láser de color verde amarillo (tales como PE, PE/Cy5, PE/Cy7) o láser rojo (como APC, APC Cy7) produce fluorescencia emitida que es considerablemente más brillante que la auto-fluorescencia y así puede mejorar resultados36. Cuando seleccionar fluoróforo conjuga con tal alta tinción índice y potencial superposición de espectros de emisión, inserción de controles adecuados es fundamental. Identificar límites bloquea, inclusión de tinción simple (SS) controles y controles de isotipo permiten la delineación de las poblaciones de positivo/negativo y la medición de la señal de fondo no específicas causada por anticuerpos primarios, respectivamente 37. para circunstancias donde las células son escasas, se recomienda utilizar partículas de compensación para controles de SS y el isotipo. Partículas de compensación típicamente emiten señales brillantes de controles biológicos y también tienen menos variación en la fluorescencia del fondo. Además, la fluorescencia menos uno controla (FMO) son ideales para delinear límites bloquea. Incluyendo controles FMO, la fluorescencia máxima esperada para un subconjunto de tinción se revela en un canal dado cuando el anticuerpo etiquetado fluorocromo específico para ese canal particular de la fluorescencia es excluidos38. En nuestra experiencia, además de los controles de partícula única compensación manchada, un control de comparación biológica sin manchas debe incluirse para definir límites más precisos de positivo/negativo.

Exclusión de detritos celulares y agregados de la célula en la estrategia bloquea también es un enfoque adicional utilizado para minimizar el auto fluorescencia. Para distinguir detritos celulares de la población de células viables, utilizando forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) es la estrategia más común bloquea. Para células aisladas que se utilizará para los análisis de tipo post y requieren de mayor viabilidad para las extracciones de ADN/ARN, se recomienda no utilizar manchas de viabilidad con los procedimientos de fijación y permeabilización. Formaldehído de fijación de las células puede comprometer la integridad de ácidos nucleicos debido a la reticulación de proteínas ácidos nucleicos y así limitar la eficiencia de aislamiento, detección y cuantificación precisa. Agregados de la célula como se mencionó anteriormente no solo contribuyen a señales auto-fluorescente emitidas, pero también en "coincidencia genética". Dicha acción se produce mantener la alta pureza en una especie pero si demasiado frecuente, reduce la producción ordenada de la célula. Clasificación buffer (tampón FACS) complementado con DNasa y MgCl2 durante la tinción celular puede reducir al mínimo la agregación celular. Se recomienda no utilizar EDTA en combinación con DNasa como inhibe la actividad de la enzima. Filtrado de la suspensión de la célula a través de un colador celular de 70 μm antes de la clasificación también puede liberar células de agregados. Es imprescindible tener en cuenta que para reducir la agregación, suspensiones celulares deben estar en una concentración de 5 millones de células por mL en un volumen mínimo de 0,4 mL. Células aisladas de tejidos lípidos cargados tienden a ser más propensos a la agregación y esto puede resultar en coincidencia se anule y rendimiento de clase baja. Se recomienda que las muestras se diluyen aún más si persiste la agregación. Ordenados los macrófagos pueden recogerse en tubos de fondo redondo polipropileno que contiene medio rico bovino fetal para maximizar la recuperación de la célula. Una alta concentración inicial de FBS asegura la recuperación de la célula ya que la concentración final se diluye con cada gotita ordenado. Para la recolección de las células que se utilizarán para el análisis de ADN o ARN, las células se pueden ordenar directamente en el reactivo de extracción apropiado (por ejemplo TriZol) para prevenir la contaminación de la Rnasa. Al ordenar grandes volúmenes, clasificación de las células en medios de cultivo suplementado con concentraciones más bajas de FBS, se aconseja antes. Inmediatamente después de la clasificación, las células deben ser peleteadas y lisis para la extracción de ADN/ARN. El material genético aislado puede entonces ser perfilado para expresión génica alterada. Genes Pro inflamatorios incluyendo TNFα, IL1 β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 y MCP1 (CCL2) suelen ser upregulated en macrófagos exhibiendo un clásico activado (M1) fenotipo39. Por otra parte, alternativamente activado fenotipo (M2) en macrófagos es marcado a menudo por la inducción de genes que codifican Chi3l3 (Ym1), Fizz1, 1 de arginasa, CD206, CD163, CD209 L 1-10 y TGFβ34,40. Recientemente, CD38, Fpr2 y Gpr18 han sido validados como genes específicos M1 y c-Myc y Egr2 M2 específico genes34.

Aunque la clasificación de celular basado en la citometría de flujo multicolor es una valiosa herramienta para aislar a los macrófagos de alta pureza, este enfoque puede ser costoso. Las ventajas de gran alcance de FACS mediada por clasificación dependen de personal de operaciones que puede maniobrar un clasificador de células además del alto costo mantenimiento clasificador de eritrocitos. Alternativas se pueden utilizar en sustituto del costoso flujo cytometry base celular clasificación. Incluyen magnético celular activado clasificación (MACS) o centrifugación de gradiente de densidad. La primera célula alternativa clasificación método mencionado abarca magnético o kits de aislamiento del microbead columna para separar las células de interés de la sangre o los tejidos sólidos41. La segunda célula clasificación enfoque separa una suspensión heterogénea basada en densidad y fuerza de centrifugación. Por desgracia, mediada por la densidad centrifugación no es práctica para aislar a los macrófagos de suspensiones de célula derivado de aorta o WAT. A menudo, el producto obtenido de la centrifugación diferencial es contaminado y de bajo rendimiento. En consecuencia, los tejidos más pequeñas (como la aorta o WAT) que resultan en pocas células inicialmente después de la digestión enzimática no son candidatos ideales para la centrifugación diferencial. Por otro lado, suspensiones celulares derivados de hígados disociadas pueden producir un número adecuado de macrófagos clasificados que puede ser utilizado en análisis como estímulos de la cultura, qPCR o western blot análisis y experimentos de tipo post. Estas alternativas también pueden utilizarse para enriquecer poblaciones antes de la FACS, permitiendo tipo limpiador. De nota, macrófagos residentes constituyen un pequeño porcentaje de la población de toda la célula de WAT, el hígado y la aorta. Enriquecimiento de las células antes de la clasificación de la FACS ha sido un enfoque que utiliza al aislamiento de poblaciones de células que son menos frecuentes. Un tema que es común en el aislamiento de pequeñas poblaciones es números deben ser procesados para obtener suficientes células para el análisis posterior grande de la célula. Enriquecimiento o clasificación previa puede utilizarse para resolver un tema tan. Este método ayuda en la obtención de una población más concisa de las células a través de selección positiva y negativa pero también permite la conservación de tiempo como FACS clasificación puede ser un proceso duradero para fuentes de tejido denso como el hígado.

Los avances recientes en biología de la inflamación destacan la importancia de la caracterización fenotípica y funcional de la heterogeneidad del macrófago a la comprensión de la compleja función de estas células inmunes en la regulación de la inflamación crónica. En Resumen, este protocolo integral proporciona un enfoque multidimensional para caracterizar tejido residente macrófagos de los tejidos del sello tres estudiaron en modelos de inflamación y establecido inducida por obesidad. Lo más importante es este protocolo tiene en cuenta la dificultad y las medidas necesarias para aislar limpio solo suspensiones celulares de dysregulated inflamado los tejidos como WAT, placas aórticas y hígado graso. El protocolo permite al investigador aplicar la citometría de flujo y herramientas clasificación FACS en una dimensión innovadora para caracterizar macrófagos residentes, principales reguladores de la inflamación en la obesidad. Caracterización detallada de la dinámica de la población de macrófagos puede proporcionar la penetración en monocitos trata los tejidos inflamados y permiten evaluaciones mecánicas continua a través de una multitud de aproximaciones experimentales en macrófagos ordenados. La caracterización adicional de las poblaciones de macrófagos puede proporcionar una visión fundamental de los fundamentos biológicos que regulan la heterogeneidad del macrófago en salud y enfermedad.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a las instalaciones centrales para citometría de flujo en el Pennsylvania estado Universidad Milenio ciencia compleja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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