Isolering, karakterisering och rening av makrofager från vävnader som påverkas av fetma-relaterade Inflammation

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Detta protokoll tillåter forskare att isolera och karakterisera vävnad bosatta makrofager i olika hallmark inflammerade vävnader utvinns ur kosten-inducerad modeller av metabola sjukdomar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fetma främjar ett kroniska inflammatoriska tillstånd som medieras huvudsakligen av vävnad bosatta makrofager samt monocyt-derived makrofager. Kost-inducerad fetma (DIO) är en värdefull modell i studerar roll för makrofag heterogenitet; adekvat makrofag isoleringar är emellertid svårt att förvärva från inflammerade vävnader. I detta protokoll beskriva vi de åtgärder för isolering och nödvändiga felsökningsriktlinjer som härrör från våra studier för att erhålla en lämplig population av vävnad bosatta makrofager från möss efter 18 veckor av hög fetthalt (HFD) eller high-fat/hög-kolesterol ( HFHCD) kost intervention. Detta protokoll fokuserar på tre hallmark vävnader studerade i fetma och åderförkalkning inklusive levern, vit fettvävnad (WAT) och aorta. Belyser vi hur dualistiska användning av flödet flödescytometri kan uppnå en ny dimension av isolering och karakterisering av vävnad bosatta makrofager. En grundläggande del av detta protokoll adresser krångligheter underliggande vävnad-specifik enzymatisk tumörheterogenitet och makrofag isolering och efterföljande cellytan antikropp färgning för flöde flödescytometrisk analys. Detta protokoll adresser befintliga komplexiteten bakomliggande lysrör-aktiverad cell sortering (FACS) och presenterar förtydliganden till dessa komplexiteten för att erhålla brett spektrum karakterisering från adekvat sorterade cellpopulationer. Alternativa anrikningsmetoder ingår för sortering celler, såsom tät levern, vilket möjliggör flexibilitet och tid när du arbetar med FACS. I korthet, detta protokoll hjälper forskaren att utvärdera makrofag heterogenitet från en mängd inflammerade vävnader i en studie och ger insiktsfulla Felsökning tips som har varit framgångsrika för gynnsamma cellulära isolering och karakterisering av immunceller i DIO-medierad inflammation.

Introduction

Musmodeller har använts i stor utsträckning att studera dynamiken i mänskliga sjukdomar. Ordentlig isolering av vävnad bosatt celler från möss i en sjuka tillstånd kan utgöra en plattform för att förstå de molekylära och cellulära bidragen till patogenesen av sjukdomen1. En sjukdom som är av avgörande betydelse är fetma. Förekomsten av fetma fortsätter att stiga i hela världen parallellt med insulinresistens och typ 2 diabetes mellitus, hjärt-kärlsjukdom och fettlever2,3. Överdriven näringsämnen konsumtion är ytterligare skev av minskad fysisk aktivitet som utlöser förändrad signaler från fettvävnad, som kan förändra den cellulära miljön i andra perifera vävnader såsom aorta och levern4. Sådana störningar av metabolisk homeostas resultat i en kronisk låggradig systemisk inflammation5.

Klassiskt aktivering av makrofager bosatt till aorta och levern samt deras rekrytering till vit fettväv (WAT) har visat sig inte bara inleda dysreglering av metabola signaler men också upprätthålla inflammation6,7. Fenotypiska och funktionella heterogenitet av makrofager är starkt förknippad med patogenesen av fetma relaterade komorbiditeter7. Dynamiska plasticitet i makrofag polarisering möjliggör dessa celler att uppvisa en rad aktiveras fenotyper som samordnar progression och upplösning av inflammation8. Medan klassisk aktiverat (M1) makrofager är inblandade i förökningen av inflammation, har alternativt aktiverat (M2) makrofager associerats med upplösning och vävnad reparera9,10.

Då kroppen genomgår metabol stress, ansamlas onormalt vit fettväv. Utökad fettvävnaden lockar och behåller inflammatoriska celler som djupt påverkar normala fettceller funktion för att främja insulinresistens, hyperglykemi och slutligen typ 2-diabetes, insulinresistens eller hyperglykemi11, 12. Parallellt infiltrerat vit fettvävnad remodels svar på inflammatoriska signaler släpptes av klassiskt aktiverat (M1) adipose vävnad makrofager (bankomater)13,14. Detta flercelliga organ utövar en kaskad av signaler som urspårningar den normala funktionen av andra organ organ såsom aorta och lever4.

Levern är en metabolisk kraftpaket som anpassar sig som svar på stimuli med ursprung från närliggande dysreglerad WAT15. Nedsatt makrofager eller Kupffers celler, som svar på metaboliska förändringar, utsöndrar inflammatoriska cytokiner som förvandla både parenkymal och icke-parenkymal cell fenotyp och främja vävnad remodeling. Nedsatt lipid ackumulering, inflammation, överdriven extracellulärmatrix insättningar, nekros och eventuell funktion förlust följer de inflammatoriska förolämpningar som bidrar till det breda spektrumet av leverskador är associerad med alkoholfria fettlever 16,17,18.

Parallellt komprometterad WAT och leverfunktionen ackumulerar stora artärer lipider i kärlväggen då kroppen genomgår kronisk metabol stress19. Arteriell lipid ackumulering utlöser utsöndringen av kemokinerna av aktiverade endotelceller och efterföljande rekrytering av monocyter20. När rekryteras monocyter föröka, skilja, äter lipoproteiner och bli skumceller. Aterogenes är initieras och upprätthållas av pro-inflammatoriska aktiviteten av rekryterade och vävnad bosatt lipid-lastad makrofager. Dessa makrofager är duka under till de extracellulära och intracellulära stress signaler förmedlas i detta aterogena mikromiljö, bedriver sedan ett apoptotiska signalering kaskad. Som dessa skumceller dör, bidrar de deras lipid fylld innehåll till nekrotisk kärnan i lesionen, vilket sedan leder till plack bristning, hjärtinfarkt och stroke.

Sammantaget orkestrerar heterogenitet makrofag fenotyper delvis den fetma som induceras av inflammatoriska förändringar som observerats i dysreglerad vävnader såsom WAT, levern och aorta8,21. Karakterisering av rekryterade och vävnad bosatta makrofager kan ge insikt i potentiella molekylära mål som manipulera makrofag fenotyp1. För att effektivt karakterisera makrofager från fetma-inducerad inflammerade vävnader, kan en encellig suspension erhållas genom enzymatisk nedbrytning. Dessa dissociation protokoll måste vara effektiv i tillräckligt förnedrande bindväv samtidigt minimera immun celldöd och ger optimal cell avkastning. Enzymet blandningen är beroende av vilken typ av vävnad och dess strukturella gör upp. Motståndskraftiga vävnader såsom aorta kräver starkare enzymatisk aktivitet, jämfört med levern och WAT, att uppnå vävnad dissociation. Från den enda cellsuspensionen, kan vävnad bosatta makrofager vara otvetydigt kännetecknas eller isolerade för ytterligare nedströms analyser såsom transkriptionell profilering.

Här beskrivs ett vävnadsspecifika protokoll som använder kollagenas-beroende vävnad matsmältningen och polykromatiska flödescytometri att effektivt isolera och karakterisera vävnad bosatta makrofager som erhållits från traditionella kost inducerad fetma, åderförkalkning, enkel steatos och steatohepatit musmodeller. Samtidiga färgning av cell yta markörer med antikroppar mot leukocyt-(CD45 eller CD11b) och makrofag - (F4/80) specifika antigener används ofta för att identifiera makrofag populationer22. Fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) är en kraftfull strategi som används för att sortera dessa identifierade populationer med hög renhet. Den sorterade befolkningen kan sedan utvärderas för fenotyp specifik gen profiler med nedströms molekylär analys (såsom kvantitativa realtid polymeraskedjereaktion)23. Även om standard flödescytometri och flöde flödescytometri-baserade cell sortering är kraftfulla verktyg i särskilja makrofager inom en oerhört heterogen cellsuspension, måste de tidigare protokollen optimeras för att säkerställa framgångsrika utgång. I denna studie beskrivs protokoll som effektivt isolera och karakterisera livskraftig vävnad specifika makrofager; viktigare, ger denna studie avgörande inblick i tekniska frågor som ofta uppstår, samt proaktiv och garantiprocessen strategier för att förebygga eller lösa dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experimentella protokoll (avsnitt 1, 1.2 och 1.3) godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Pennsylvania State University.

Vävnad Dissociation buffertar förberedelse Slutlig volym Förvaring
Vit fettväv (WAT) Dissociation buffert: 2,5% HEPES, 10 mg/mL bovint serumalbumin (BSA), 3 mg/mL (0.3%) Kollagenas typ II i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med 4,5 g/L glukos utan L-glutamin och natrium pyruvat 500 mL minus 80° C (10 mL portioner)
Lever 25 x Perfusion buffert koncentrat (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH i destillerat avjoniserat H2O 500 mL minus 20° C (40 mL portioner)
Bevarande buffert (PRB): 1% BSA 1 x Perfusion buffert 1 L 4 ° C
Dissociation buffert: 1 x Perfusion buffert kompletteras med 4,76 mM CaCl2 och 72 U/mL kollagenas typ IV 50 mL (per mus) Förbereda omedelbart före användning
Aorta Dissociation buffert: 125 U/mL kollagenas typ XI, 60 U/mL hyaluronidas typ I, 60 U/mL DNase, 450 U/mL kollagenas typ I, 20 mM HEPES 1 x fosfat fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 500 mL minus 80° C (10 mL portioner)

Tabell 1: Vävnad specifika perfusion buffert recept.

1. vävnad isolering och Dissociation

  1. WAT isolering och Dissociation
    1. Förbereda vävnadsspecifika buffertar enligt tabell 1, och lagra dem som beskrivs.
    2. Förbered följande reagenser.
      1. Förbereda matsmältningen bufferten genom upptining lämplig volym av WAT dissociation buffert och förvaras vid 4 ° C fram till användning. Omedelbart före användning, värma buffert till 37 ° C. Förbereda FACS bufferten genom att förbereda 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 2% fetalt bovint serum (FBS).
    3. WAT isolering
      1. Avliva en mus i en koldioxid (CO2) fylld kammare. Kontrollera effektivitet före fortsätter till dissektion scenen.
      2. Doppa euthanized musen kort i en bägare som innehåller 70% etanol tills ordentligt blöt och belagd med ethanol. Placera musen ventrala ytan upp på scenen för dissektion och fäst musen fore och hind tassar till dissekering styrelsen med 21 G nålar.
      3. Använda medium punkt tip pincett för att förstå bukhuden anterior urinrörets och sedan använda vass dissekera sax för att göra en nick i grasped bukhuden.
      4. Infoga lägre bladet av saxen i små snittet mellan hud och bukhinnan och gör en laterala snitt från buken till bröstkorgen.
      5. Dra försiktigt tillbaka huden för att avslöja den intakt bukhålan och göra en laterala snitt genom bukhinnan och antingen vik tillbaka den genomskinliga membranen eller punktskatt vävnaden för att exponera den buk WAT.
      6. Samla de perigonadal fett kuddar som beskrivs i Mann et al. 24
        1. De perigonadal fett kuddar hos hanmöss är löst bundna till bitestiklarna och testiklarna. Först lokalisera testiklarna med medium pekar pincett, greppa tag i bitestiklarna huvudet och dra försiktigt.
        2. Med skarpa dissekera sax, punktskatt varje epididymal fett pad genom att skära längs ytan av bitestiklarna (huvud, kropp och svans) och testiklarna.
        3. Med hjälp av tången, dra försiktigt fettet pad medan skära genom bindväv direkt bunden till bitestiklarna struktur.
        4. Använda tången, fast grepp i slutet av fett pad proximalt bitestiklarna och dra försiktigt den fett pad från könskörtlarna
        5. Hos honmöss är de perigonadal fettfria kuddar löst bond livmodern kroppen och livmoderns horn.
        6. Använda medium punkt pincett, grepp perigonadal fettvävnad och dra försiktigt vävnaden från livmodern kroppen och livmoderns horn.
        7. Punktskatt varje fett pad genom att skära längs livmodern kroppen och livmoderns horn med skarpa dissekera sax.
      7. Placera det fett kuddar i en petriskål fylld med PBS och hålla på isen att hålla vävnad fuktiga.
    4. Dissociation av WAT in enda cellsuspensioner
      1. Avlägsna överflödigt PBS från petriskål och Använd ett enda kant rakblad skräda buk WAT i små bitar.
      2. Med den skarpa kanten av rakbladet, försiktigt skrapa malet buk WAT till en märkt 15 mL polypropylen samling rör innehållande 2 mL WAT dissociation buffert.
      3. Inkubera denna vävnad-matsmältningen buffert blandning under långsam kontinuerlig rotation vid 37 ° C i 45 min.
      4. Filtrera smält vävnaden genom en sil med 70 µm i cellen till en 50 mL samling tub medan du flyttar gummi pistongen av en kolv i en cirkulär rörelse och fortsätta att sikten cellsuspensionen genom filtret.
      5. Överför med pipett 2 mL av Dulbecco's modifierade Eagle Medium (DMEM) till en 15 mL collection tube, försiktigt Pipettera upp och ner och tvätta filtret med encelliga suspensionen.
      6. Tvätta filtret två ytterligare gånger med kallt DMEM och placera den enda cellsuspensionen på is.
      7. Centrifugera cellsuspension vid 300 x g vid 4 ° C i 8 min.
      8. Använda en vakuum hygienfilter att noggrant ta bort flytande adipocyter (först) och resterande supernatant. Se till att inte störa den pelleterat stromal vaskulära fraktionen (SVF).
      9. Med pipett 1000 µL försiktigt åter centrifugerade i ammoniumklorid-kalium (ACK) buffert att lysera erytrocyter enligt tillverkarens anvisningar.
      10. Späd den ovan cellsuspensionen med DMEM och centrifugera cellsuspension på 300 g vid 4 ° C i 8 min.
      11. Resuspendera cellerna i kalla PBS som innehåller 2% FBS (FACS buffert) och räkna cellerna i en Burker kammare/hemocytometer.
      12. Överföra till märkt 5 mL runda-botten polystyren rör antingen 1 x 106 celler (för grundläggande flödescytometri) eller hela cellsuspensionen (för FACS). Fortsätt till avsnitt 2 för flödescytometri färgning protokoll.
  2. Levervävnad isolering och Dissociation
    Obs: Detta protokoll var anpassad från Smedsrød25.
    1. Förbereda vävnadsspecifika buffertar enligt tabell 1 och lagra dem som beskrivs.
    2. Förbered följande reagenser.
      1. Bered 1 x Perfusion buffert (PB), genom att späda 40 mL av PBC till 960 mL ultrarena H2O. före varm en spruta fylld med 50 mL av PB vid 37 ° C, precis innan perfusion börjar. Eliminera eventuella närvarande luftbubblor.
        1. För att eliminera luftbubblor, Invertera sprutan var de leur lock spetsen pekar uppåt. Tryck eller flick sprutan tills luftbubblor är att den översta pf sprutan. Tryck försiktigt på kolven att utvisa luften
      2. Förbereda matsmältningen bufferten genom att späda ut 0,5 mL av 476 mM CaCl2 lösningtill 49,5 mL 1 x Perfusion buffert. Lägg till 3600U av kollagenas typ IV till 4.76 mM CaCl2 – PB lösning. Pre varm en spruta fylld med 50 mL av matsmältningen buffert vid 37 ° C precis innan perfusion börjar. Eliminera eventuella närvarande luftbubblor som beskrivs i steg 1.2.2.1.1.
      3. Förbereda bevarande buffert (PRB) genom upplösning 2,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 250 mL 1 x perfusion buffert. Förvaras vid 4 ° C eller hålla på is fram till användning.
      4. Förbereda FACS buffert med 1 x PBS och 2% FBS.
    3. Levervävnad isolering
      1. Avliva en mus av CO2 kvävning, mätta mus med 70% etanol att förhindra kontaminering av intraabdominal organ med päls.
      2. Ställning den mus ventrala sidan uppåt på en polystyren skum dissekera styrelsen och säkra musen fore och hind tassar till dissekering styrelsen med 21 G nålar.
      3. För att exponera bröstkorgens vägg och bukhålan, förstå bukhuden nära urinrörets använder en medellång punkt tip pincett. Använd sedan en vass dissekera sax för att skapa ett litet snitt för att grasped bukhuden.
      4. Infoga lägre bladet av saxen i små snittet mellan hud och bukhinnan och gör en laterala snitt från ljumsken till hakan.
      5. Dra försiktigt tillbaka huden för att avslöja den intakt bukhålan och bröstkorgens vägg, gör en laterala snitt genom bukhinnan och punktskatter membranet.
      6. Lyft bröstbenet och noggrant incisionsfilm membranet, vara säker på att inte störa de sämre hålvenen (IVC). Flytta de gastrointestinala organ till sida och leta upp den subhepatic IVC. Använd hemostatiska pincett för att klämma suprahepatic IVC att upprätthålla lokaliserade perfusion.
        Obs: Kraftig ackumulering av visceral vit fettvävnad kan ofta dölja IVC. För att bättre visualisera detta fartyg, kan ett litet område av fettvävnad bredvid IVC vara censurerade. Fönstret anskäras inom följsamma fettvävnad kan sedan placeras över IVC att exponera fartyget för kanylering.
      7. Bifoga den sprutan som är fylld med pre värmde PB till 23 G blod insamling och infusion set. Tryck försiktigt på kolven tills den slangen och nålen är fyllda med PB.
      8. Nålen 23 G, parallell till nivån för den subhepatic IVC. Fäst nålen på plats med en 4 cm hemostatiska klämma.
        Obs: Kanylering av den subhepatic IVC föredras i diet-matade möss däri IVC kan vara bättre visualiseras och kanylerade i fett-fyllde hålrummet.
      9. Tryck försiktigt på kolven att börja perfusion, färg kommer snabbt spola från levern (höger lob först) om nålen är korrekt placerad i fartyget. Utvidgningen av loberna är också synlig om nålen är ordentligt isatt i den subhepatic IVC.
      10. Omgående skär portalen ven för att tillåta PB att flöda fritt genom levern.
      11. BEGJUTA levern tills blodet inte längre synliga. Ibland massera lever lober mellan fore-tummen och pekfingret att underlätta perfusion.
        Obs: Det är viktigt att använda icke-serrated trubbiga kanter verktyg för att hantera levern för att förhindra vävnadsskada.
      12. När PB 5 mL kvar i sprutan, ändra på sprutan som är fylld med pre värmde dissociation buffert. Stör inte positionen för säkra nålen under denna tid.
        Obs: Förstorad lever avsevärt överstiger 1,5 g bör vara perfusion med en större mängd pre värmde matsmältningen buffert att garantera framgångsrik lever dissociation.
      13. BEGJUTA levern tills helt rötas. Massera varsamt lever lober för att underlätta perfusion.
        Obs: Separation av Glissons kapsel från parenkymet är observerbara i en framgångsrikt smält lever. För att bedöma detta, Använd ett par pincett, trubbiga kant att försiktigt trycka på den vänstra laterala loben. Ett intryck ska visas på ytan och indraget bör Fyll långsamt när tången tas bort.
      14. Ta bort nålen från den subhepatic IVC. Ta inte bort hemostatiska tången fastspänning i suprahepatic IVC.
      15. Punktskatt hela levern genom att noggrant skära genom ansluta ligament använder en kort rak klinga dissekera sax och ta bort gallblåsan.
      16. Placera hela levern i en 10-cm-petriskål innehållande 10 mL iskallt bevarande buffert och butiken på 4 оC tills redo för att befria celler.
    4. Leverceller Dissociation
      1. Överföra levern till en 10 cm maträtt innehållande 10 mL iskallt DMEM.
      2. Greppa den avhuggna suprahepatic IVC bifogas exciderad levern med en tandad tång. Använda medium punkt tången för att släppa cellerna från de Glisson kapseln genom att tillämpa snabb strök rörelse på varje lob.
      3. Passera den mättade DMEM genom en 70 µm cell SIL kopplad till en 50 mL samling tub.
      4. Pipettera 10 mL iskallt DMEM till 10 cm petriskål och upprepa steg 1.2.4.1 till 1.2.4.3 tills media mättnad observeras längre. Placera cellsuspension på is eller vid 4 ° C.
      5. Blanda försiktigt cellsuspensionen genom att invertera samling röret och sedan Centrifugera vid 54 x g under 2 minuter vid 4 ° C.
      6. Samla in supernatanten i en ren 50 mL samling tub. Sedan Centrifugera cellsuspension på 54 x g under 2 minuter vid 4 ° C.
      7. Upprepa steg 1.2.4.6 två extra gånger innan du fortsätter till steg 1.2.4.8.
      8. Överför supernatanten till en ren 50 mL-samling rör och centrifugera cellsuspension vid 300 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
      9. Återsuspendering icke-parenkymal cellpelleten i FACS buffert och räkna dem i en Burker kammare/hemocytometer.
      10. Överföra 1 x 106 celler (för grundläggande flödescytometri) eller 15 x 106 - 20 x 106 celler (för FACS) till märkt 5-mL runda-botten polystyren rör. Fortsätt till avsnitt 2 för flödescytometri färgning protokoll.
  3. Aorta isolering och Dissociation
    Obs: Detta protokoll var anpassad från slaktarenet al.26
    1. Förbereda vävnadsspecifika buffertar utifrån de recept som anges i tabell 1 och lagra dem som beskrivs.
    2. Förbered följande reagenser.
      1. Förbereda matsmältningen bufferten genom upptining lämplig volym av WAT dissociation buffert och förvaras vid 4 ° C fram till användning. Omedelbart före användning, värma buffert till 37 ° C.
      2. Bered en 10 x heparin genom upplösning heparin natriumsalt i 1 x PBS vid en koncentration på 200 U/mL. Späd 10 x heparin stamlösning med 1 x PBS att förbereda en 1 x Heparin lösning. Lagra 10 x och 1 x Heparin lösningar vid 4 ° C fram till användning.
      3. Förbereda FACS bufferten med 1 x PBS som innehåller 2% FBS.
    3. Aorta dissektion
      1. Avliva en mus i ett koldioxid fylld kammare och skölj med 70% etanol.
      2. Placera musen ventrala Sidan upp på scenen för dissektion, sprida musen fore och hind tassar och fästa dem i dissekering styrelsen med 21 G nålar.
      3. Omedelbart efter euthanizing musen, utföra hjärt punktering. Se steg 1.3.3.4 till 1.3.3.9, om nödvändigt.
      4. Leta upp den xiphoid processen på den nedre delen av bröstbenet
      5. För att göra detta, placera en finger mittpunkt längs bredden av djurets hals. Spåra längs ventrala mittlinjen från hals till stjärtfenan slutet av bröstbenet tills ett benigt förlängning är klädde med filt.
      6. Använda medium punkt pincett till brosk förlängningen, och eventuellt markera platsen för den xiphoid processen genom att ta bort plåstret i hår eller hud på området.
      7. Delvis infoga en 26 G nål under processen xiphoid 20-30° vinkel.
      8. Försiktigt applicera undertryck i sprutan genom att långsamt dra tillbaka kolven, sedan in nålen ytterligare i hålrummet tills blodet rinner.
      9. Om blodflödet slutar, långsamt rotera nålen eller flytta något i och ut.
      10. Användning para av pincett att greppa tag i bukhuden anterior urinrörets öppning och använda ett par vassa dissekera sax för att klippa längs ventrala mittlinjen genom bukhinnan från ljumsken till hakan.
      11. Dra tillbaka huden för att exponera bukorganen och bröstkorg med fingrar eller trubbig pincett flytta försiktigt bukorganen till sida.
      12. Använd tången att greppa tag i den xiphoid processen, lyft bröstbenet och incisionsfilm membranet.
      13. Använda dissekera saxen, skära genom laterala revbenen på båda sidor. Gripande bröstbenet, flip bröstkorgen uppåt och skär genom anslutande basen. Ta bort revbenen utsätta de underliggande bröstkorgens organ.
      14. BEGJUTA aorta med en 26-gauge injektionsnål till en 10 mL-spruta fylld med 1 x heparin lösning genom att injicera 1-2 mL lösning i vänster kammare (LV) av hjärtat.
        Obs: Glöm inte att BEGJUTA långsamt med lite tryck att säkerställa intakt aterosklerotiska aorta lesioner.
      15. Punktskatt bräss, lungor och bindväv. Se steg 1.3.3.16 och 1.3.3.17, om nödvändigt.
        1. Anterior hjärtat hitta vita bi-flikiga (eller fjäril formade) orgel och ordentligt hugg tag i tymus med tången. Dra båda loberna uppåt bort från kaviteten och skär vid basen med saxen.
        2. Ta bort lungorna, nypa en lunglob med tången, dra vävnaden bort från brösthålan och skär vid basen. Upprepa för varje återstående LOB.
      16. Använda en dissektion mikroskopet och mikro-dissekera verktyg och samla den aortic arch (inklusive innominate artär, vänster gemensamma halspulsådern och vänster subclavia), den stigande, fallande, bröst- och bukhåla aorta.
        1. Leta upp aorta ascendens på vänster kammare i hjärtat.
        2. Med ett par böjda 0,07 x 0,04 mm-tip greppa pincetten försiktigt del av aorta ascendens framväxande från vänster kammare.
          Obs: Jämfört med omgivande gul-färgat fettvävnad, blir aorta ljusa vita fartyg med ursprung från LV när tillräckligt spolas med heparin lösningen.
          1. Om aorta inte var ordentligt spolas av hjärt perfusion, spola aorta igen medan aorta förblir ansluten till hålrummet. Till gör så, skära nära hjärtat-aorta korsningen, ta bort hjärtat och sedan skär horisontellt genom den nedre änden av bukaorta. Infoga en 26 G nål i öppnandet av aorta ascendens och försiktigt spola aorta med 1 x heparin lösning.
          2. Försiktigt ryck på aorta ascendens bättre diskriminera mellan fettvävnad och inbäddade aorta.
          3. Fortfarande försiktigt dra på aorta ascendens, använda spetsen på stängda våren dissekera saxen för att rensa det fett som förankrar den ascending aorta och aortabågen. Till gör så, stroke fettvävnad med spetsen på stängda scissor blad att slita bort det anslutande fettet.
            Obs: Avstå från excising någon fett vävnad genom att skära tills den ascending aorta och arch kan visualiseras tydligt. Detta är att förhindra kapning aorta.
          4. Om den ascending aorta och båge kan vara tydligt avgränsad från surround fettvävnad, använda våren dissekera saxen för att punktskatt överflödigt fett.
          5. Ta försiktigt tag i aortabågen med tången. Igen med den våren scissor spets, stroke på fettet längs längden av fallande bröstkorg och buk aorta till stjärtfenan slutet av bukaorta, gör det på höger sida av ärmen av fett.
          6. Fortsätta att greppa längs aorta när riva bort fettet. Glöm inte att göra så försiktigt för att förhindra skada aorta.
          7. Dra försiktigt aorta uppåt mot mikroskopet så att fettet är nu placerad bakom aorta.
          8. Sätt slutna scissor bladen mellan fett-aorta gränssnittet nära den främre änden av fallande aorta, svår fettvävnads tillbehör till aorta's ytan rakt på sak med svepande rörelser.
            Obs: Grundligt att avlägsna överflödigt fett och ansluta vävnad medan aorta är fortfarande i hålrummet rekommenderas.
          9. Punktskatt hjärtat och skär i kaudala slutet av bukaorta tvären. Ta bort hela aorta.
          10. Placera aorta i en 35 mm maträtt och retas bort något överflödigt fett på aorta med två 21-gauge nålar. Placera exciderad aorta i 1,7 mL mikrocentrifug rör på is.
    4. Dissociation av Aorta till enda cellsuspensioner
      1. Pipettera 0.2 mL aorta dissociation buffert röret som innehåller aorta. Infoga våren scissor bladen mot den avsmalnande änden av röret och snabbt finhacka aorta för att underlätta enzymatisk nedbrytning.
      2. Överföra vävnad-lösning blandningen till en 15 mL collection tube och pipett 1,8 mL aorta dissociation buffert för en total volym på 2 mL.
        Obs: För enkel överföring av vävnad upphängning, skär i 1 cm av den avsmalnande änden av en standard 1000 µL pipettspetsen. Använd den förkortade spetsen för att överföra fjädringen med en mikropipett.
      3. Inkubera malet aorta i aorta dissociation bufferten för 55 min vid 37 ° C, skaka på 220 rpm (0.514 x g).
      4. Passera 50 µm cell SIL suspensionen i en 15 mL polypropylen samling röret. Använda gummi pistongen av en sprutkolven för att underlätta filtrering.
      5. Skölj 15 mL samling röret med 1 mL FACS buffert, samla in fjädringen och passera genom cell Silen.
      6. Tvätta 50 µm cell silen två ytterligare gånger med 1 mL FACS buffert.
      7. Pellet cellerna genom centrifugering vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i kalla FACS buffert. Räkna cellerna i en Burker kammare/hemocytometer.
      8. Överföra antingen 1 x 106 (för grundläggande flödescytometri) celler eller hela cellsuspensionen (för FACS) till en märkt 5 mL runda-botten polystyren rören. Fortsätt till avsnitt 2 för flödescytometri färgning protokoll.

2. flöde flödescytometri och FACS färgning

Fluorophore R-fykoerytrin (PE) PE/cyanin (Cy) 7 PE/cyanin (Cy) 5 Pacific Blue (PB)
Laser (nm) Blå (488 nm) / gult (561-570 nm) - grön (532 nm) Blå (488 nm) / gult (561-570 nm) - grön (532 nm) Blå (488 nm) / gult (561-570 nm) - grön (532 nm) Violet (405 nm)
MagnetiseringenMAX (nm) 496 496 496 401
UtsläppMAX (nm) 578 785 667 455
Fenotypiska markör F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX-integrin, integrin αX kedja, CR4, p150, ITGAX ΑM-integrin, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Riktade celltyp Vävnaden bosatta makrofager Klassiskt aktiverat (M1) makrofager Monocyter / makrofager Leukocyter (makrofager / monocyter och lymfocyter granulocyter)
Delmängd av dendritiska celler Dendritiska celler, NK-celler, aktiverade T-celler och en delmängd av tarmen intraepitelial (IEL) Granulocyter, dendritiska celler, NK-celler och delmängder av T och B celler
Utspädningsfaktor 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Isotypen kontroller PE råtta IgG2a PE/Cy7 armeniska Hamster IgG PE/Cy5 råtta IgG2b Pacific blå Rat IgG2c

Tabell 2: Lista av fluorophore taggade antikroppar specifika för diskriminerande vävnad bosatta makrofager.

  1. Samla in och förbereda följande: FACS buffert 5 mL runda-botten polystyren-rör antimus CD16/32 Fc-receptorn blockera antikropp, fluorophore konjugerat eller okonjugerat primära antikroppar, fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar (om (nödvändigt), 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    Obs: För färgning stora mängder celler, antikroppskoncentrationen är mest kritiska snarare än antalet celler. Till exempel om färgning 10 x 106 celler färgning buffert volymen och antikroppskoncentrationen bör vara densamma som om färgning 1,0 x 10 celler6 i 100 µL buffert volym. För färgning 1,0 x 108 celler, öka mängden antikroppar 5 gånger rekommenderas.
  2. Tillsätt ytterligare iskall FACS buffert till varje FACS röret om det behövs, pellet celler genom centrifugering vid 751 x g för 5 min (4 ° C). Aspirera supernatanten efter centrifugering.
  3. Lägg till antimus CD16/CD32 Fc-receptorn blockera antikroppar mot alla prover enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C eller på is.
  4. Lägg till fluorophore-konjugerad primär antikropp cocktail direkt till Fc-receptorn blockera antikropp som innehåller cell fjädring och inkubera prover vid 4 ° C i 30 min. skydda prover från ljus att minimera blekning av fluorophore-konjugerade antikroppar.
    1. I händelse av okonjugerat primära antikroppar användes, Följ dessa steg efter att slutföra steg 2,4.
    2. Tvätta primär antikropp målat prover genom centrifugering vid 751 x g för 5 min (4 ° C).
    3. Ta bort supernatanten genom dekantering och resuspendera pelleten i 100 µL FACS buffert.
    4. Lägg till konjugerad sekundär antikropp till alla nödvändiga prov och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C. Fortsätt till steg 2.5.
  5. Följande antikropp inkubation, tillsätt 2 mL av is kallt FACS buffert sedan pellet celler vid 751 x g i 5 minuter (4 ° C). Dekantera supernatanten och glöm inte att störa pelleten.
  6. Blanda celler försiktigt och resuspendera med 200-400 µL av FACS buffert och sedan hålla detta i mörker vid 4 ° C tills standard Flödesanalys flödescytometri eller cellen sortera.
  7. För kort sikt fixering av färgade celler, Fortsätt till steg 2,8 till 2.10. Använd fixering för standard flödescytometri endast.
  8. Omedelbart efter steg 2.5, resuspendera cellerna i 0,5 mL 2-4% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 15-30 min i 4 ° C.
    Obs: Varning: PFA är kända irriterande med cancerframkallande och giftiga effekter. När du använder PFA, hantera med extrem försiktighet. Ska du använda lämplig personlig skyddsutrustning och frånluftsventilation.
  9. Följande fixering, tvätta cellerna genom att lägga till 2 mL FACS buffert alla prover och centrifugera 751 x g i 4 ° C i 5 min. ta bort supernatanten efter centrifugering.
  10. Återsuspendera fast celler i 200 µL av is kallt FACS buffert och förvaras vid 4 ° C. Store fix celler upp till 1 vecka vid 4 ° C, helst utföra flöde flödescytometri förvärv inom 48 timmar för att minimera autofluorescens.
  11. Förvärva flödescytometri flödesdata enligt flöde cytometer tillverkarens anvisningar eller utföra fluorescerande aktiverad cell sortering som beskrivs av Basu et al. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När du använder apolipoprotein E bristfällig (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) möss bibehålls på en hög fett högt kolesterol diet (HCHFD eller HCD) för 18 veckor, 1 x 104 - 2 x 104 CD45+F4/80+ aorta makrofager kan isoleras när två samplingar poolade. Lever dissekeras från HFHCD matad ApoE KO möss, producerade större än 5 x 105 sorterade Kupffers celler (som beror på tillgänglig tid för sortering). När använda hög fett diet (HFD) matas vildtyp (WT) C57BL/6 möss, kan 5 x 105 till 1 x 106 bosatta adipose vävnad makrofager (bankomater) sorteras från den stromal vaskulära fraktionen (SVF). Nämnda antalet makrofager som kan sorteras från en viss vävnad var tillräcklig för att utföra gen uttryck analys med hjälp av kvantitativa realtid polymeras-kedjereaktion (qPCR). För vävnader där färre antal makrofag populationer återvinns, till exempel stora kroppspulsådern, är det rekommenderat att använda samtidig precipitants (exempelvis glykogen) och över natten nederbörd när isolera RNA behövs för dessa analyser.

Effekterna av kost-inducerad metabola sjukdomar på makrofag fenotyp med hjälp av grundläggande flöde här, flödescytometri, fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och nedströms post sortera analyser visas. Dessa fynd bekräfta tidigare publicerade observationer att möss matas en HFD eller HFHCD uppvisar ökad infiltration av klassiskt aktiverat (M1) makrofager i drabbade vävnader såsom aorta (figur 1B). Dra nytta av flödescytometri, FACS och profilering av gen-uttryck (via kvantitativa polymeraskedjereaktion (qPCR), den dominerande fenotypen för Ron receptor tyrosin Kinas-uttryckande CD45+ F4/80+ makrofager härrör från vävnader som isolerats från kost-matade möss observerades. Ron receptor-uttryckande aorta makrofager som visade en antiinflammatorisk fenotyp minskade i HFHCD-matade möss (figur 1 c och D). Sorterade Ron receptor-uttryckande makrofager som härrör från smält artärer påvisat ökad arginas 1 (Arg1) genuttryck, som är en väletablerad M2 makrofag markör (figur 1E). Pro-inflammatoriska makrofager som karakteriserades som CD45+ F4/80+ CD11c+ ökades i artärer isolerade från HFHCD-matade möss (figur 1B och D). Karaktärisera levern bosatta makrofager ytterligare belysas rådande fenotypen av Ron receptor-uttryckande subpopulationer (figur 2A). CD11c + pro-inflammatoriska makrofag populationer visat ett minskat uttryck av gener som är starkt förknippad med en anti-inflammatorisk (M2) fenotyp som Arg1 och Ron (figur 2B). Liknande trender observerades i makrofag populationer isoleras från smält vit fettväv (figur 3). Makrofag befolkningen med en pro-inflammatoriska signatur visade minskad yta uttryck av Ron receptorn (figur 3). Att kombinera metoder, grundläggande flödescytometri och FACS, resulterade i entydiga data som ytterligare bekräftar Ron receptorn som en regulator av alternativa (M2) aktivering i makrofager32. Sådan bias mot en antiinflammatorisk (M2) fenotyp har visat en skyddande roll i utvecklingen och utvecklingen av fetma, åderförkalkning och steatohepatit31.

Figure 1
Figur 1: Karakterisering av makrofager som isolerats från dissocierade aorta bort från ApoE KO möss som underhålls på en HCD för 18 veckor. (A) celler var först gated på CD45+ leukocyter, exklusive cellulära skräp. (B) CD45 färgning i samband med F4/80 används för att avgränsa dubbel positiv populationer presumeras vara makrofager. Ytterligare gating användes för att Visa procentandelen av CD11c+CD45+F4/80+ (M1) och (C) Ron+CD45+F4/80+ (potentiella M2) makrofager i artärer härstammar från möss som utfodrats med antingen en normala chow eller högt kolesterol diet för 18 veckor. (D) ökade andelen CD11c+CD45+F4/80+ (M1) makrofager, liksom en minskad procentandel av Ron+CD45+F4/80+ (potentiella M2) makrofager observerades i artärer härrör från möss som utfodrats HCD jämfört med möss ges en normal chow kost. (E) gen uttryck analys av sorterade Ron+CD45+F4/80+ makrofager visat ökat uttryck av arginas jag (en välkänd murina M2 markör). Värden erhölls med Student's t-test analyser utförs med hjälp av statistisk analysprogramvara och representerade som menar ± SEM. P < 0.05 ansågs statistiskt signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figur har ändrats från Yu et al. (2016) 31. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: gen avskrift profilering av Kupffers cellpopulationer sorteras från smält lever dissekeras från ApoE KO möss som underhålls på en HCD för 18 veckor. (A) Usenets systematiken för karaktärisering och sortering Kupffers cellpopulationer. (B) gen uttryck analys av sorterade Ron uttrycker (Ron+) och icke-uttryckande (Ron) CD45+F4/80+ makrofager med kvantitativ RT-PCR. Student's t-test-analyser utfördes med hjälp av statistisk programvara och värdena var representerade som menar ± SEM. P < 0.05 ansågs statistiskt signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figur har ändrats från Yu et al. (2016) 31 . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering av uttagsautomater isolerade från vit fettvävnad dissekeras från WT BL6 möss matas en HFD i 18 veckor. (A) Usenets systematiken för karaktärisering och sortering fettvävnad härrör makrofag populationer (B) andel av Ron + celler inom CD45+F4/80+CD11coch CD45+F4/80+CD11c+ makrofag populationer sorteras från WAT. Figur har ändrats från Yu et al. (2016) 31 . Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kost-inducerad ämnesomsättningssjukdom modeller som efterliknar komorbiditet såsom åderförkalkning, enkel steatos, steatohepatit och typ 2-diabetes används i stor utsträckning att bättre förstå de molekylära mekanismer bakom sjukdomsprogression. Kollagenas beroende matsmältningen används ofta för att separera vävnader för att befria celler från extracellulär matrix (ECM)16,27. Enzymer såsom kollagenas störa kollagen som ger strukturellt stöd för angränsande celler. Vävnaderna strukturella sammansättning dikterar vävnad matris styvheten (motstånd mot deformation) och vilken rå kollagenas produkt är mest effektivt att säkerställa framgångsrika ECM störningar28. WAT, som består av ”mjuk matrix” är ofta smälta med kollagenas typ II att befria adipocyter och bosatt immunceller bibehållen integritet cell surface insulin receptorer29samtidigt. Mikroarkitekturen fibrill komponenter av aorta bidrar till ”stel matrix”, som effektivt aorta matsmältningen med kollagenas typ XI (som har den högsta kollagenas aktiviteten) används i kombination med ytterligare enzymer. Till skillnad från aorta använder levern matsmältningen en kollagenas med en svagare enzymaktivitet, kollagenas typ IV, att störa matrisen och befria livskraftiga parenkymal och icke-parenkymal celler30. Kroniskt inflammerade vävnader härstammar från kost-matade vilda typ eller apolipoprotein E deficient (ApoE KO) möss på ett C57BL6 bakgrunden genomgår ofta remodeling som kan förhindra korrekt enzymatisk nedbrytning. Detta avsnitt kommer att diskutera strategier för att minimera eller eliminera möjligheten av felaktig vävnad dissociation och lågt återhämtning.

Gemensamt för vävnader som härrör från kost matad musmodeller som efterliknar fetma, åderförkalkning eller alkoholfria fettlever, är onormal vävnad remodeling. I vit fettvävnad, aorta och levern ändras ECM sammansättning, ofta resulterar i alltför stort nedfall av fibrillar komponenter såsom kollagen. Vildtyp C57BL6 möss bibehålls på en hög fett diet för arton veckor, uppleva vävnadsspecifika avvikelser såsom utökad vit fettvävnad och utvidgade fettlever (enkel steatos). Ofta gånger dessa metaboliska funktioner är inte besvärande hinder att övervinna under processen vävnad dissociation. Däremot, i andra kost inducerad modeller som speglar mer förvärras fenotyper, kan omfattande ombyggnaden av vävnaden utgöra ett problem under vävnad matsmältningen. HFHCD matas ApoE KO möss används ofta för att modellen åderförkalkning och steatohepatit. Ett gemensamt drag som förknippas med avancerade steatohepatit är överdriven nedfall av ECM i levern (eller fibros). Fibrotiska levern har visat sig vara ganska problematiskt under enzymatisk vävnad dissociation och ger ofta lågt yield31. För att förbättra cell avkastning, är det viktigt att protokollen matsmältningen följas utan avvikelse. Även om normal lever kan malet och nedsänkt i matsmältningen buffert att uppnå dissociation, maximerar perfusion med matsmältningen buffert kontakten mellan den extracellular matrisen i levern och kollagenas lösningen; och därför är denna strategi rekommenderas starkt. 20-30 mL av matsmältningen buffert är dessutom ofta en tillräcklig volym för framgångsrika dissociation av normal lever; När det gäller musmodeller som utvecklar förstorade och/eller fibrotisk lever, föredras dock perfusion med 50 mL av matsmältningen buffert att säkerställa god uppslutning samtidigt minimera celldöd. För lever med vikter som betydligt överstiger 1,5 g, rekommenderas öka volymen av matsmältningen buffert att garantera lyckade matsmältningen.

Vävnad Problemet Möjlig orsak Lösning
Vit fettväv (WAT) Dålig cell dissociation Dålig matsmältning Kontrollera att matsmältningen buffert är på 37° C
Celldöd Överdriven kollagenas matsmältningen Minska tiden för matsmältningen
Minska volymen av matsmältningen buffert
Aorta Dålig cell dissociation Dålig matsmältning Kontrollera att matsmältningen buffert är vid 37 ° C
Aorta bitar i matsmältningen buffert var för stor Kontrollera att aorta är skuren i ca 1 mm bitar
Aorta bitar inte skakar i dissociation buffert under inkubation Vara säker på aorta bitar skakar i matsmältningen lösningen
Celldöd Överdriven kollagenas matsmältningen Minska tiden för matsmältningen
Minska volymen av matsmältningen buffert
Lever Dålig cell dissociation Dålig matsmältning Kontrollera att matsmältningen buffert är vid 37 ° C
Öka volymen av matsmältningen buffert
Felaktig kanylering av IVC (svullnad av vävnad omgivande IVC uppstår) Var noga med nål är ordentligt isatt i IVC
Brusten IVC Korrekt säkert nål i IVC före perfusion
Minska perfusion hastighet
Brusten vävnad Minska perfusion hastighet
Celldöd Felaktig utsättning av celler från den Glissons kapsel Tänk på att separera celler från kapsel med tidigare diskuterat strök metod
Överdriven kollagenas matsmältningen Minska tiden för matsmältningen
Minska volymen av matsmältningen buffert

Tabell 3: Felsöka misslyckade vävnad dissociation. Vattenflödet flödescytometri baserat cell sortering eller FACS är en kraftfull teknik för att isolera cellpopulationer där hög renhet är en nödvändighet. När renande celler genom att cellen sortera, kräver att uppnå hög cell avkastning men också en hög renhet sortera med hjälp av korrekt sortering strategier. I det här avsnittet flöde metoder för att förbättra multi-fluorophore flödescytometri-baserade cell sortering av vävnad bosatt makrofag härrör från kost-matade möss beskrivs. För distinkta vävnad bosatt makrofag isolering är surface markör urval ett kritiskt steg. Makrofager som härrör från WAT, aorta och levern är ofta distingerad med en CD45+, CD11b+, F4/80+ gating strategi. Ytterligare flöde flödescytometrisk paneler kan användas för att identifiera vävnad bosatta makrofager. Dessa paneler inkluderar antikroppar som sond av ytan uttryck för makrofag specifika glykoproteiner (CD64, CD68 och CD14), stora histocompatibility komplex (MHCII) och apoptotiska cell tyrosin Kinas receptorer (MerTK)32, 33. specifika makrofag fenotyp kan sedan avgränsas av sondering av selektiv yta uttryck för M2 (CD163, CD209 och CD206) eller M1 markörer (CD38, CD40, CD80 och CD86)34,35. Auto-fluorescens genereras av lipid-lastad makrofager kan presentera några frågor när gating populationer. Med hjälp av antikroppar märkta med fluorokromer som exciteras av gul-grön laser (till exempel PE, PE/Cy5, PE/Cy7) eller röd laser (såsom APC, APC Cy7) resulterar i utsända fluorescens som är betydligt ljusare än den auto-fluorescensen och därmed kan förbättra resultat36. När du väljer fluorophore konjugat med sådana höga färgning index och potential utsläpp spectra överlappning, är införandet av lämpliga kontroller kritisk. När identifiera Usenets gränser, införande av enstaka fläck (SS) kontroller och isotypen kontroller möjliggöra avgränsningen av positiva/negativa populationer och mätning av icke-specifika bakgrund signal orsakas av primära antikroppar, respektive 37. för omständigheter där cellerna är knappa, vi rekommenderar att du använder ersättning partiklar för SS och isotypen kontroller. Ersättning partiklar normalt avger ljusare signaler än biologiska kontroller och även har mindre varians i bakgrunden fluorescens. Fluorescens minus en (FMO) kontroller är dessutom idealiska för avgränsar Usenets gränser. Genom att inkludera FMO kontroller, avslöjas den maximala fluorescens som förväntat för en färgning delmängd i en viss kanal när den fluorokrom-taggade antikroppen som är specifik för särskilda fluorescens kanaliserar är uteslutna38. Vår erfarenhet, förutom enstaka färgade ersättning partikel kontroller, internkontrollbör en ofärgade biologisk jämförelse ingå för att ange mer exakt positiva/negativa gränser.

Exklusive cellulära skräp och cell aggregat i Usenets strategi är också en ytterligare metod som används för att minimera auto-fluorescens. För att skilja cellulära skräp från livskraftiga cell befolkningen, är använda framåt scatter (FSC) och side scatter (SSC) den vanligaste Usenets strategin. För isolerade celler som används för post sortera analyser och kräver högre lönsamhet för DNA/RNA extraktioner, rekommenderas det att livskraft fläckar inte användas med någon fixering och/eller permeabilisering förfaranden. Formaldehyd fastställande av celler kan äventyra nukleinsyra integritet på grund av nukleinsyra-protein crosslinking och därigenom begränsa isolering effektivitet, upptäcka och korrekt kvantifiering. Cell aggregat som tidigare nämnts kan inte bara bidra till utsända auto-fluorescerande signaler, men också resultera i ”tillfällighet aborterar”. Sådana åtgärder sker för att upprätthålla hög renhet i en sorts men om alltför frekventa, det minskar sorterade cell avkastningen. Sortering buffert (FACS buffert) kompletterad med DNAS och MgCl2 under cell färgning kan minimera cell aggregering. Det rekommenderas att inte använda EDTA i kombination med DNAS eftersom det hämmar enzymets verksamhet. Filtrering enda cellsuspensionen genom en 70 µm cell SIL före sortering kan även befria celler från aggregat. Det är viktigt att notera att cellsuspensioner för att minimera aggregering, bör vara i en koncentration av 5 miljoner celler per mL i en minsta volym på 0,4 mL. Celler som isolerats från lipid lastad vävnader tenderar att vara mer benägna att aggregering och detta kan resultera i slump aborterar och låg sortera avkastning. Det rekommenderas att proverna späds ytterligare om aggregering kvarstår. Sorterade makrofager kan samlas i polypropylen runda-botten samling rör som innehåller fostrets nötkreatur rikt medium för att maximera cell återhämtning. En initial hög FBS koncentration garanterar cell återhämtning eftersom koncentrationen så småningom blir utspädd med varje sorterad droplet. För insamling av celler som kommer att användas för DNA eller RNA analys, kan cellerna sorteras direkt i lämpliga utvinning reagens (t.ex. TriZol) att förhindra RNAse kontaminering. När sortering höga volymer, rekommenderas sortering celler först in kultur media kompletteras med lägre koncentrationer av FBS. Omedelbart efter sortering, celler bör sedan pelleterat och lyserat för DNA/RNA-extraktion. Det isolerade genetiskt materialet kan sedan vara profilerade för förändrad genexpression. Proinflammatoriska gener inklusive TNFα, IL1-β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 och MCP1 (CCL2) är ofta uppreglerad i makrofager uppvisar ett klassiskt aktiverat (M1) fenotyp39. Däremot, alternativt aktiverat (M2) fenotyp i makrofager markeras ofta genom induktion av gener som kodar för Chi3l3 (Ym1), Fizz1, arginas 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 och TGFβ34,40. Nyligen, CD38, Fpr2 och Gpr18 har validerats som M1-specifika gener och c-Myc och Egr2 som M2-specifika gener34.

Även flerfärgade flöde flödescytometri-baserade cell sortering är ett värdefullt verktyg för att isolera makrofager på hög renhet, kan detta tillvägagångssätt vara kostsamt. Kraftfulla fördelarna med FACS medierad sortering är beroende av operations personal som kan manövrera en cell sorter förutom de höga kostnaderna för cell sorterare underhåll reagenser. Alternativa metoder kan användas i stället för kostsamma flöde flödescytometri baserat cell sortering. De inkluderar magnetisk aktiverad cell sortering (Mac) eller täthet lutning centrifugering. Den första alternativa cellen sorteringsmetod som nämnts omfattar magnetiska eller microbead kolumn isolering kit att separera celler av intresse från blod eller fasta vävnader41. Den andra cellen sortera synsätt separerar en heterogen cellsuspension baserat på densitet och styrka av centrifugering. Tyvärr, densitet medierad centrifugering är inte praktiska för att isolera makrofager från aorta - eller WAT-härledda enda cellsuspensioner. Ofta, den produkt som erhålls från differentiell centrifugering är förorenat, och av låg avkastning. Mindre vävnader (såsom aorta eller WAT) som resulterar i några celler initialt efter enzymatisk nedbrytning är följaktligen inte perfekta kandidater för differentiell centrifugering. Däremot, kan cellsuspensioner härrör från dissocierade lever producera ett tillräckligt antal sorterade makrofager som kan användas i inlägget sortera experiment och analyser såsom kultur stimuli, qPCR eller western blotting analys. Dessa alternativa metoder kan också användas för att berika populationer före FACS, möjliggör renare sorterar. Notera utgör vävnad bosatta makrofager en liten andel av hela cellen befolkningen i WAT-, lever- och aorta. Anrikning av celler före FACS sortering har varit en strategi som används när isolera populationerna av cellen som är mindre vanliga. En fråga som är vanligt i isolera populationerna är små är att stora cell nummer måste bearbetas för att få tillräckligt med celler för efterföljande analys. Berikning eller försortering kan användas för att lösa en sådan fråga. Denna metod hjälper till att få en mer kortfattad population av celler genom positiva och negativa urval men det gör också bevarandet av tid som FACS sortering kan vara en varaktig process för tät vävnad källor såsom levern.

Senaste framstegen inom inflammation biologi belysa vikten av fenotypiska och funktionell karakterisering av makrofag heterogenitet att främja förståelsen av komplexa roll av dessa immunceller i reglering av kronisk inflammation. I korthet, ger detta omfattande protokoll ett flerdimensionellt synsätt att karaktärisera vävnad bosatta makrofager från tre hallmark vävnader studerade i etablerade diet inducerad fetma och inflammation modeller. Ännu viktigare detta protokoll tar hänsyn till svårigheten och åtgärder för att isolera ren enda cellsuspensioner från dysreglerad inflammerade vävnader såsom WAT, aorta plack och fet lever. Protokollet gör det möjligt för forskaren att tillämpa flödescytometri och FACS sortering verktyg i en innovativ dimension att karakterisera vävnad bosatta makrofager, viktig regulatorer av inflammation i fetma. Djupgående karakterisering av makrofag populationsdynamik kan ge insikt i monocyt människohandel inflammerade vävnader och möjliggöra fortsatt mekanistiska utvärderingar genom en mängd experimentella metoder på sorterade makrofager. Ytterligare karakterisering av makrofag populationer kan ge en avgörande inblick i den biologiska underbyggnaden som reglerar makrofag heterogenitet i hälsa och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka de Flow flödescytometri Core Facility på The Pennsylvania State University Millennium vetenskap Complex.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144, (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444, (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15, (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16, (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5, (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6, (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307, (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58, (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117, (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13, (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200, (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52, (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20, (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26, (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18, (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14, (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375, (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197, (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11, (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100, (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10, (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4, (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71, (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27, (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6, (3), 13 (2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142, (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1, (78), 1-6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics