Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen tillater forsker å isolere og karakterisere vev-resident makrofager i ulike hallmark betent vev utvunnet fra kosthold-indusert modeller av metabolske forstyrrelser.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Allen, J. N., Dey, A., Nissly, R., Fraser, J., Yu, S., Balandaram, G., Peters, J. M., Hankey-Giblin, P. A. Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation. J. Vis. Exp. (122), e55445, doi:10.3791/55445 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fedme fremmer en kronisk inflammatorisk stat som er i stor grad formidlet av vev-resident makrofager samt monocytt-avledet makrofager. Diett-indusert fedme (DIO) er en verdifull modell studere rollen macrophage heterogenitet; tilstrekkelig macrophage isolasjoner er imidlertid vanskelig å skaffe fra betent vev. I denne protokollen skissere vi isolasjon trinnene og nødvendig retningslinjer for feilsøking avledet fra våre studier for å få en passende befolkning på vev-resident makrofager fra mus etter 18 uker høy fett (HFD) eller høy-fett/høy-kolesterol ( HFHCD) kosthold intervensjon. Denne protokollen fokuserer på tre hallmark vev i fedme og åreforkalkning inkludert leveren og hvite liggende under adipose vev (WAT) aorta. Vi markere hvor dualistiske bruk av cytometri kan oppnå en ny dimensjon av isolering og karakterisering av vev-resident makrofager. En grunnleggende del av denne protokollen adresser vanskelighetene underliggende vev-spesifikke enzymatisk digestions og macrophage isolasjon og påfølgende celle-overflate antistoff flekker for flyt cytometric analyse. Denne protokollen adresser eksisterende kompleksiteten underliggende fluorescerende-aktivert celle sortering (FACS) og presenterer avklaringer til disse kompleksiteten for bredt spekter karakterisering fra tilstrekkelig sorterte celle populasjoner. Alternative berikelse metoder er inkludert for sortering celler, for eksempel tett leveren, gir fleksibilitet og tid når du arbeider med FACS. I korthet, denne protokollen hjelpemidler forskeren evaluere macrophage heterogenitet fra en rekke betent vev i en gitt studie og tilbyr innsiktsfulle feilsøkingstips som har vært vellykket for gunstige mobilnettet isolering og karakterisering av immunceller i DIO-mediert betennelse.

Introduction

Musen modeller har blitt brukt til å studere dynamikken i menneskelig sykdommer. Riktig isolasjon av vev bosatt celler fra mus i en sykelig tilstand kan gi en plattform for å forstå den molekylære og mobilnettet bidrag til patogenesen av sykdom1. En lidelse som er av avgjørende betydning er fedme. Forekomsten av fedme fortsetter å stige over hele verden sammen med insulinresistens og type 2 diabetes mellitus, hjerte-og karsykdommer og fatty leversykdom2,3. Overdreven næringsstoffet forbruk ytterligere forvrenges av redusert fysisk aktivitet utløser endret signaler fra fettvev, som kan endre andre perifere vev som aorta og lever4mobilnettet miljøet. Slike avbrudd i metabolske homeostase resulterer i en kronisk lav karakter systemisk betennelse5.

Klassisk aktivering av makrofager bosatt aorta og leveren samt rekruttering til hvit fettvev (WAT) har vist seg å ikke bare starte feilregulering metabolske signaler, men også opprettholde betennelse6,7. Den fenotypiske og funksjonell mangfold i makrofager er sterkt assosiert med patogenesen av fedme relatert Co-morbidities7. Dynamisk plastisitet i macrophage polarisering gjør for disse cellene til å vise en rekke aktivert fenotyper som koordinerer utviklingen og oppløsning av betennelse8. Mens klassisk aktivert (M1) makrofager er innblandet i utbredelsen av betennelse, er alternativt aktivert (M2) makrofager forbundet med oppløsning og tissue reparasjon9,10.

Som kroppen gjennomgår metabolske stress, akkumuleres hvit fettvev unormalt. Utvidet fettvev tiltrekker og beholder inflammatoriske celler som dypt endre normal adipocyte funksjonen for å fremme insulinresistens, hyperglykemi og til slutt type 2 diabetes mellitus, insulinresistens eller hyperglykemi11, 12. Parallelt, hvit fettvev remodels svar på inflammatorisk signaler utgitt av infiltrert klassisk aktivert (M1) fettvev makrofager (ATMs)13,14. Denne multi-mobilnettet organ utøver en kaskade av signaler at derails normal funksjon av andre kroppens organer som aorta og leveren4.

Leveren er en metabolsk kraftpakke som tilpasser seg i respons på stimuli fra nærliggende dysregulated WAT15. Hepatic makrofager eller Kupffer celler, svar på metabolske forandringer, skiller inflammatoriske cytokiner som transformerer både parenchymal og ikke-parenchymal celle fenotypen og fremme vev remodeling. Hepatic lipid akkumulering, betennelse, overdreven ekstracellulær matrix innskudd, nekrose og eventuell funksjonen tap følger inflammatorisk fornærmelser bidra til bredt spekter av leverskader tilknyttet alkoholfrie fatty leversykdom 16,17,18.

Parallelt med kompromittert WAT og leverfunksjon akkumuleres store arterier lipider i arterieveggen som kroppen gjennomgår kronisk metabolsk stress19. Arterial lipid akkumulering utløser utskillelsen av chemokines av aktivert endotelceller og påfølgende rekruttering av monocytter20. Når rekruttert, monocytter sprer, skille, ingest lipoproteiner og bli skum celler. Atherogenesis er initiert og opprettholdes av pro-inflammatoriske aktiviteten rekruttert og vev bosatt lipid-laden makrofager. Succumbing til ekstracellulære og intracellulær stressignaler videreformidlet i denne atherogenic microenvironment, delta disse makrofager deretter i en apoptotisk signalering cascade. Som disse skum cellene dør, bidrar lipid fylt innholdet til nekrotisk kjernen av lesjonen, som så fører til plakk brudd, hjerteinfarkt og hjerneslag.

Kollektivt, orkestrerer heterogeniteten macrophage fenotyper delvis fedme indusert av inflammatoriske endringer observert i dysregulated vev som WAT, lever og aorta8,21. Karakteristikk av rekruttert og vev bosatt makrofager kan gi innsikt i potensielle molekylære mål som manipulere macrophage fenotypen1. Effektivt betegner makrofager fra fedme-indusert betent vev, kan en enkeltcelle suspensjon oppnås gjennom enzymatisk fordøyelsen. Slike dissosiasjon protokollene må være effektiv i tilstrekkelig nedverdigende bindevev samtidig minimere immun celledød og gir optimale celle avkastning. Enzym blandingen er avhengig av vev og dens strukturelle utgjør. Robust vev som aorta krever sterkere enzymatisk aktivitet, i forhold til leveren og WAT, å oppnå vev dissosiasjon. Fra enkelt celle suspensjon, kan vev bosatt makrofager utvetydig preget eller isolert for videre nedstrøms analyser som transcriptional profilering.

Her er en vev-spesifikk protokoll beskrevet som collagenase-avhengige vev fordøyelsen og polykromatisk flowcytometri til å effektivt isolere og karakterisere vev-resident makrofager fra tradisjonelt kosthold indusert fedme, aterosklerose, enkel Steatose og steatohepatitis musen modeller. Samtidige farging av cellen overflate markører med antistoffer mot leukocytter-(CD45 og/eller CD11b) og macrophage - (F4/80) bestemt antigener er ofte brukt til å identifisere macrophage bestander22. Fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) er en kraftig strategi brukes sortere populasjonene identifisert på høy renhetsgrad. Sorterte befolkningen kan deretter bli vurdert for fenotypen bestemte genet profiler som bruker nedstrøms molekylær analyse (for eksempel kvantitative sanntid polymerasekjedereaksjons)23. Selv om standard flowcytometri og flyt cytometri-baserte celle sortering er kraftige verktøy i atskillende makrofager i en svært heterogen celle suspensjon, må tidligere protokollene være optimalisert for å sikre vellykket utgang. I denne studien beskrevet som effektivt isolere og karakterisere levedyktig vev bestemt makrofager; enda viktigere, gir denne studien viktig innsikt i tekniske problemer som ofte oppstår, og proaktiv og feilsøking strategier for å hindre og/eller løses.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller (seksjoner 1, 1.2 og 1.3) ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Pennsylvania State University.

Vev Dissosiasjon buffere forberedelse Siste volum Lagring
Hvit fettvev (WAT) Dissosiasjon Buffer: 2,5% HEPES, 10 mg/mL Bovine serum albumin (BSA), 3 mg/mL (0,3%) Collagenase Type II i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 4,5 finans glukose uten L-glutamin og natrium pyruvate 500 mL minus 80° C (10 mL dele)
Leveren 25 x perfusjon Buffer konsentrat (PBC): 3.55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH i destillert deionisert H2O 500 mL minus 20° C (40 mL dele)
Bevaring Buffer (PRB): 1% BSA på 1 x perfusjon Buffer 1 L 4 ° C
Dissosiasjon Buffer: 1 x perfusjon Buffer supplert med 4,76 mM CaCl2 og 72 U/mL Collagenase Type IV 50 mL (per mus) Forberede umiddelbart før bruk
Aorta Dissosiasjon Buffer: 125 U/mL Collagenase Type XI, 60 U/mL Hyaluronidase skriver jeg, 60 U/mL DNase jeg, 450 U/mL Collagenase Type I, 20 mM HEPES i 1 x fosfat Buffered Saline (PBS) 500 mL minus 80° C (10 mL dele)

Tabell 1: Vev bestemt perfusjon buffer oppskrifter.

1. vev isolasjon og dissosiasjon

  1. WAT isolasjon og dissosiasjon
    1. Forberede vev-spesifikke bufferne per tabell 1, og lagre dem som beskrevet.
    2. Klargjør følgende reagenser.
      1. Klargjør fordøyelsen bufferen ved tining riktige volumet av WAT dissosiasjon buffer og butikk på 4 ° C før bruk. Umiddelbart før bruk, varme buffer 37 ° C. Forberede FACS bufferen ved å forberede 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder 2% fosterets bovin serum (FBS).
    3. WAT isolasjon
      1. Euthanize en mus i en karbondioksid (CO2) fylte kammer. Kontrollere effektiviteten før fortsetter å disseksjon scenen.
      2. Dypp euthanized musen kort i et beaker med 70% etanol til grundig dynket og belagt med etanol. Plasser musen ventrale overflate opp på disseksjon scenen og sy musen forgrunnen og bakben paws disseksjon styret over 21 G pinner.
      3. Bruk medium punkt tips tang for å forstå abdominal huden anterior urethral åpningen, og bruke skarp dissecting saks for å gjøre et kallenavn i grep magen huden.
      4. Lavere blad av saksen inn i små snitt mellom huden og peritoneum og foreta en lateral snitt fra magen til ribbe buret.
      5. Trekk forsiktig tilbake huden til å utsette intakt bukhulen og gjøre en lateral snitt gjennom peritoneum og enten kaste tilbake gjennomsiktig membranen eller avgiftsdirektoratet vev for å avsløre abdominal WAT.
      6. Samle perigonadal fett pads som beskrevet i Mann et al. 24
        1. Perigonadal fett pads i mannlige mus er løst bundet til bitestikkel og testiklene. Først finne testiklene medium peker tang, gripe fatt i bitestikkel hodet og trekk forsiktig.
        2. Med skarpe dissecting saks, avgiftsdirektoratet hver epididymal fett pad ved å kutte langs overflaten av bitestikkel (hode, kropp og hale) og testiklene.
        3. Med tang, trekk på fett puten mens kutte gjennom bindevevet direkte bundet til bitestikkel strukturen.
        4. Bruke pinsett, fast grep slutten av fett pad proksimale til bitestikkel og forsiktig skrelle fett puten fra gonader
        5. I kvinnelige mus er perigonadal fett pads løst bånd til livmoren kroppen og livmor horn.
        6. Bruker medium punkt tang, grep perigonadal fettvev og trekk forsiktig vev fra livmor kroppen og livmor horn.
        7. Avgiftsdirektoratet hver fett pad ved å kutte langs livmoren kroppen og livmor horn med skarpe dissecting saks.
      7. Plass fett pads i en Petriskål fylt med PBS og holde på is for å holde vev fuktig.
    4. Dissosiasjon av WAT i én celle suspensjoner
      1. Fjerne overflødig PBS fra Petriskål og bruke en enkel kant razor blad for å hakke abdominal WAT i små biter.
      2. Med den skarpe kanten av razor blad, forsiktig skrape hakket abdominal WAT til en merket 15 mL polypropylen samling rør som inneholder 2 mL WAT dissosiasjon buffer.
      3. Inkuber denne vev-fordøyelsen buffer blandingen under langsom kontinuerlig rotasjon på 37 ° C i 45 minutter.
      4. Filtrere fordøyd vev gjennom en 70 µm celle sil i en 50 mL samling rør mens du flytter gummi stempelet av en sprøytestempelet i en sirkulær bevegelse og fortsette å sil celle suspensjon gjennom filteret.
      5. Pipetter 2 mL Dulbecco er endret Eagle Medium (DMEM) slik 15 mL samling Pipetter forsiktig opp og ned og Filteren vaskes med encellede suspensjon.
      6. Filteren vaskes to ganger med kaldt DMEM og plasser enkeltcelle suspensjon på isen.
      7. Sentrifuge celle suspensjon på 300 x g på 4 ° C i 8 min.
      8. Bruke et vakuum aspirator nøye fjerne flytende adipocytter (først) og gjenværende supernatant. Sørg for ikke å forstyrre den pelleted pancreatic (sendinger).
      9. Med en 1000 µL pipette, forsiktig å avbryte pellet salmiakk-kalium (ACK) buffer lysing av erytrocytter i henhold til produsentens instruksjoner.
      10. Fortynne over cellen suspensjon med DMEM og sentrifuge celle suspensjon 300 g på 4 ° C i 8 min.
      11. Nytt suspendere celler i kalde PBS som inneholder 2% FBS (FACS Buffer) og telle celler i en Burker kammer/hemocytometer.
      12. Overføre 1 x 106 celler (for grunnleggende flowcytometri) eller hele cellen suspensjon (for FACS) til merket 5 mL runde bunn polystyren rør. Fortsette å del 2 for flowcytometri flekker protokollen.
  2. Leveren vev isolasjon og dissosiasjon
    Merk: Denne protokollen ble tilpasset fra Smedsrød25.
    1. Forberede vev-spesifikke bufferne per tabell 1 og lagre dem som beskrevet.
    2. Klargjør følgende reagenser.
      1. Forberede 1 x perfusjon Buffer (PB), ved utvannende 40 mL PBC i 960 mL ultrapure H2O. pre varme en sprøyte fylt med 50 mL av PB ved 37 ° C, like før perfusjonsmåling starter. Eliminere alle nåværende luftbobler.
        1. For å fjerne luftbobler, invertere sprøyten der leur lås spissen peker oppover. Trykk eller flick sprøyten til luftbobler er å topp pf sprøyten. Skyv på stempelet å utvise luften
      2. Klargjør fordøyelsen bufferen ved å fortynne 0,5 mL 476 mm CaCl2 løsningtil 49,5 mL 1 x perfusjon buffer. Legg 3600U Collagenase Type IV til 4,76 mM CaCl2 -PB løsning. Forvarm sprøyte fylt med 50 mL av fordøyelsen buffer ved 37 ° C like før perfusjonsmåling starter. Eliminere alle nåværende luftbobler som beskrevet i trinn 1.2.2.1.1.
      3. Klargjør bevaring Buffer (PRB) ved oppløsning 2.5 g bovin serum albumin (BSA) i 250 mL 1 x perfusjon buffer. Lagre på 4 ° C eller holde på is til bruk.
      4. Forberede FACS Buffer med 1 x PBS og 2% FBS.
    3. Leveren vev isolasjon
      1. Euthanize en mus av CO2 kvelning, mette musen med 70% etanol å hindre forurensning av intraabdominal organer med pels.
      2. Plasser musen ventral side opp på en polystyren skum dissekere styret og sikre musen fram- og bakvingen poter disseksjon styret over 21 G pinner.
      3. For å avsløre thorax veggen og bukhulen, forstå abdominal huden nær urethral åpningen ved hjelp av et medium punkt tips pinsett. Deretter Bruk en skarp dissecting saks til å opprette et lite innsnitt grep magen huden.
      4. Lavere blad av saksen inn i små snitt mellom huden og peritoneum og foreta en lateral snitt fra lyske til haken.
      5. Trekk forsiktig tilbake huden å avsløre intakt bukhulen og thoracic veggen, lage en lateral snitt gjennom peritoneum og avgiftsdirektoratet membranen.
      6. Løft sternum og nøye incise mellomgulvet, sørg for ikke å forstyrre den underlegne vena cava (IVC). Flytte gastrointestinal organer til side og Finn den subhepatic IVC. Bruk hemostatic tang for å klemme suprahepatic IVC å opprettholde lokaliserte perfusjon.
        Merk: Overdreven akkumulering av visceral hvit fettvev kan ofte maskere IVC. For bedre å visualisere fartøyet, kan et lite område av fettvev ved IVCEN kreditert. Vinduet skåret i smidig fett vevet kan deretter plasseres over IVC å avsløre fartøyet for cannulation.
      7. Feste sprøyten fylt med forvarmes PB 23 G blod samling og infusjonen settet. Skyv på stempelet til rør og p er fylt med PB.
      8. Sett inn 23 G nålen, parallell til nivået av subhepatic IVC. Sikre nålen i stedet bruker en 4 cm hemostatic klemme.
        Merk: Cannulation av subhepatic IVC er foretrukket i kosthold-matet mus i at IVCEN kan være bedre å visualisere og cannulated i hulrom fylt med fett.
      9. Skyv på stempelet å starte perfusjonsmåling, farge raskt flush fra leveren (høyre flik først) hvis nålen er riktig plassert i fartøyet. Utvidelse av lobes er også synlig hvis nålen er riktig satt inn i den subhepatic IVC.
      10. Raskt kutte portalen blodåre å tillate PB kan strømme fritt gjennom leveren.
      11. Perfuse leveren til blod er ikke lenger synlig. Noen ganger forsiktig massasje leveren lobes mellom forgrunnen-finger og tommel å lette perfusjon.
        Merk: Det er viktig å bruke ikke-taggete sløv kantet verktøy for å behandle leveren for å hindre skade på vev.
      12. Når 5 mL av PB forblir i sprøyten, endre til sprøyten fylt med forvarmes dissosiasjon buffer. Ikke forstyrr plasseringen av sikret nålen i denne perioden.
        Merk: Forstørret lever betydelig overstiger 1,5 g bør være parfyme med et større volum av forvarmes fordøyelsen buffer garantere vellykket leveren dissosiasjon.
      13. Perfuse leveren til fullt fordøyd. Forsiktig massasje leveren fliker for å lette perfusjon.
        Merk: Separasjon av Glisson's capsule fra parenchyma er en vellykket fordøyd lever. For å vurdere dette, kan du bruke sløv kanten av et par pinsett, å forsiktig trykke på den venstre lateral lobe. Inntrykk vises på overflaten og innrykket skal fylle sakte når tang er fjernet.
      14. Fjern nålen fra den subhepatic IVC. Ikke Fjern hemostatic tang clamping suprahepatic IVC.
      15. Avgiftsdirektoratet hele leveren ved å nøye klippe gjennom koble leddbånd med et kort rett blad dissekere saks og fjerne gallbladder.
      16. Plassere hele leveren i en 10 cm-Petriskål inneholder 10 mL iskald bevaring Buffer og butikk på 4 оC til klar for å frigjøre celler.
    4. Liver celle dissosiasjon
      1. Overføre leveren til en 10 cm rett som inneholder 10 mL iskalde DMEM.
      2. Grep den avkuttede suprahepatic IVC knyttet til forbrukeravgift leveren ved hjelp av en toothed pinsett. Bruk medium punkt tang til å frigi cellene fra den Glisson kapsel ved å bruke rask streke bevegelse hver lobe.
      3. De mettede DMEM passere en 70 µm celle sil knyttet til en 50 mL samling rør.
      4. Pipetter 10 mL iskalde DMEM til 10 cm Petriskål og gjenta trinn 1.2.4.1 til 1.2.4.3 til media metning ikke er observert. Plass celle suspensjon på is eller på 4 ° C.
      5. Bland forsiktig celle suspensjon ved å snu samling rør og deretter virvel 54 x g i 2 minutter på 4 ° C.
      6. Samle nedbryting i et rent 50 mL samling rør. Deretter sentrifuge celle suspensjon 54 x g i 2 minutter på 4 ° C.
      7. Gjenta trinn 1.2.4.6 to ganger før du fortsetter til trinn 1.2.4.8.
      8. Overføre nedbryting slik rent 50 mL-samling og sentrifuge celle suspensjon på 300 x g i 10 min på 4 ° C.
      9. Nytt suspendere ikke-parenchymal celle pellet FACS buffer og telle dem i en Burker kammer/hemocytometer.
      10. Overføre 1 x 106 celler (for grunnleggende flowcytometri) eller 15 x 106 - 20 x 106 celler (for FACS) til merket 5-mL runde bunn polystyren rør. Fortsette å del 2 for flowcytometri flekker protokollen.
  3. Aorta isolasjon og dissosiasjon
    Merk: Denne protokollen var tilpasset fra slakteret al.26
    1. Forberede vev-spesifikke bufferne basert på oppskrifter gitt i tabell 1 , og lagre dem som beskrevet.
    2. Klargjør følgende reagenser.
      1. Klargjør fordøyelsen bufferen ved tining riktige volumet av WAT dissosiasjon buffer og butikk på 4 ° C før bruk. Umiddelbart før bruk, varme buffer 37 ° C.
      2. Forbered en 10 x heparin-oppløsningen ved oppløsning heparin natrium salt i 1 x PBS i en konsentrasjon av 200 U/mL. Fortynne 10 x heparin lagerløsning med 1 x PBS å forberede en 1 x Heparin-oppløsningen. Lagre 10 x og 1 x Heparin løsninger på 4 ° C før bruk.
      3. Forberede FACS Buffer med 1 x PBS som inneholder 2% FBS.
    3. Aorta disseksjon
      1. Euthanize en mus i en karbondioksid fylt kammer og skyll med 70% etanol.
      2. Plasser musen ventral side opp på disseksjon scenen, spre musen forgrunnen og bakben labber og sy dem disseksjon styret over 21 G pinner.
      3. Umiddelbart etter euthanizing musen, utføre cardiac punktering. Se trinn 1.3.3.4 til 1.3.3.9, hvis nødvendig.
      4. Finn xiphoid prosessen på den nedre enden av sternum
      5. Plass en finger midtpunktet langs bredden av dyrets halsen gjør. Spor langs ventrale midtlinjen fra halsen til caudal slutten av sternum til filtypen cartilaginous merkes.
      6. Bruk medium punkt tang for å forstå cartilaginous forlengelsen, og eventuelt markere plasseringen av xiphoid prosessen ved å fjerne oppdateringen av håret eller hud på området.
      7. Delvis sett en 26 G nål under xiphoid prosessen i 20-30° vinkel.
      8. Forsiktig bruke negative trykket på sprøyten ved sakte trekker stempelet, og deretter sette inn nålen videre inn i hulrommet til blodet flyter.
      9. Hvis blodstrøm slutter, sakte rotere nålen eller flytte litt i og ut.
      10. Bruk par tang å ta tak i magen huden anterior urinrøret åpning og bruke et par skarpe dissecting saks til å kutte langs ventrale midtlinjen gjennom peritoneum fra lyske til haken.
      11. Trekke tilbake huden for å avsløre abdominal organer og rib bur med fingrene eller sløv tang flytte forsiktig abdominal organer til side.
      12. Bruk tang til å ta tak i xiphoid prosessen, løfte sternum og incise mellomgulvet.
      13. Ved hjelp av dissecting saks, skjære gjennom lateral ribbeina på begge sider. Gripende sternum, snu ribbe buret oppover og skjære gjennom koble basen. Fjerne ribbe buret utsette underliggende thorax organer.
      14. Perfuse aorta med en 26-gauge nål knyttet til en 10 mL sprøyte fylt med 1 x heparin-oppløsningen ved å injisere 1-2 mL løsningen i venstre ventrikkel (LV) av hjertet.
        Merk: Husk å perfuse med ett langsom rate med lite press for å sikre intakt aterosklerotisk aorta lesjoner.
      15. Avgiftsdirektoratet thymus, lungene og bindevev. Se trinn 1.3.3.16 og 1.3.3.17, hvis nødvendig.
        1. Fremre hjertet finner hvit bi-lobed (eller sommerfugl formet) orgel og fast Grip tak i thymus med tang. Trekk begge lobes oppover fra hulrom og kutt på basen med saksen.
        2. Fjerne lungene, klemme en lunge flik med tang, trekke vev fra bryst hulrom og kutt på basen. Gjenta for hver gjenværende lobe.
      16. Bruk disseksjon mikroskop mikro-dissekere verktøy, og samle den aorta arch (inkludert truncus brachiocephalicus, arteria carotis communis og venstre arteria subclavia), stigende, synkende, thoracic og abdominal aorta.
        1. Finn stigende aorta på venstre ventrikkel hjertet.
        2. Med et par buede 0,07 x 0.04 mm-tip forstå tang forsiktig delen av stigende aorta fremvoksende fra venstre ventrikkel.
          Merk: I forhold til den omliggende gul-farget fettvev, blir aorta en lys hvit beholder fra LV når tilstrekkelig rødmer med heparin-oppløsningen.
          1. Hvis aorta ikke var riktig fjernet av cardiac perfusjon, tømme aorta igjen mens aorta forblir tilkoblet hulrommet. Gjør kuttet nær hjertet-aorta, fjern kjernen og deretter kutte vannrett gjennom den nedre enden av abdominal aorta. Sett inn en 26 G p i åpningen av stigende aorta og forsiktig flush aorta med 1 x heparin-oppløsningen.
          2. Forsiktig rykk på stigende aorta å bedre forskjellsbehandle fettvev og innebygde aorta.
          3. Fortsatt forsiktig trekke på stigende aorta, bruk spissen av lukkede våren dissekere saks for å fjerne fettet som innkapsler den stigende aorta og aortabuen. For å gjøre så, hjerneslag fettvev med spissen av lukkede scissor blader å rive koble fettet.
            Merk: Ikke excising noen fettvev ved å klippe til stigende aorta og arch kan være tydelig visualisert. Dette er kutte aorta.
          4. Hvis den stigende aorta og arch kan være klart avgrenset fra surround fettvev, bruke våren dissekere saks for å avgiftsdirektoratet overflødig fett.
          5. Forsiktig ta tak i aortabuen med tang. Nytt med våren scissor tips, slaget ved fettet langs den synkende, thoracic og abdominal aortabuen til caudal slutten av abdominal aorta, gjør det på høyre side av ermet fett.
          6. Fortsette å forstå langs aorta når rive bort fettet. Husk å gjøre så forsiktig skadet aorta.
          7. Trekk forsiktig aorta oppover mot mikroskopet slik at fett er nå plassert bak aorta.
          8. Sette inn lukket scissor bladene mellom fett-aorta grensesnittet i den fremre delen av synkende aorta, alvorlig av fettvev vedlegg aorta's overflate ved hjelp rett ut en feiende forslag.
            Merk: Grundig fjerne overflødig fett og tilkobling vev aorta er fortsatt i hulrom anbefales.
          9. Avgiftsdirektoratet hjertet og kutt på caudal slutten av abdominal aorta tvers. Fjerne hele aorta.
          10. Plasser aorta i 35 mm parabol og erte bort noen overflødig fett på aorta over to 21-måle pinner. Plass forbrukeravgift aorta i 1,7 mL microcentrifuge tube på is.
    4. Dissosiasjon aortabuen i én celle suspensjoner
      1. Pipetter 0,2 mL aorta dissosiasjon buffer til røret som inneholder aorta. Sett inn våren scissor bladene mot konisk slutten av røret og raskt hakke aorta for å lette enzymatisk fordøyelsen.
      2. Overføre vev-løsning blandingen til en 15 mL samling rør og pipette 1,8 mL aorta dissosiasjon buffer for et totalt volum på 2 mL.
        Merk: For enkel overføring av vev suspensjon, kuttet i 1 cm av den koniske enden av en standard 1000 µL pipette tips. Bruke forkortede spissen for å overføre suspensjon med brønnene.
      3. Inkuber hakket aorta i aorta dissosiasjon bufferen for 55 min ved 37 ° C, rister på 220 rpm (0.514 x g).
      4. Pass suspensjon gjennom 50-µm celle sil i en 15 mL polypropylen samling rør. Bruke gummi stempelet av en sprøytestempelet for å forenkle filtrering.
      5. Skyll 15 mL samling røret med 1 mL FACS buffer, samle suspensjon og passerer gjennom cellen silen.
      6. Vask 50 µm celle silen to ganger med 1 mL FACS buffer.
      7. Pellets cellene med sentrifugering 300 x g i 5 min på 4 ° C. Nytt suspendere celler i kalde FACS Buffer. Tell cellene i en Burker kammer/hemocytometer.
      8. Overføre 1 x 106 (for grunnleggende flowcytometri) celler eller hele cellen suspensjon (for FACS) til en merket 5 mL runde bunn polystyren rør. Fortsette å del 2 for flowcytometri flekker protokollen.

2. strømme cytometri og FACS flekker

Fluorophore R-Phycoerythrin (PE) PE/Cyanine (Cy) 7 PE/Cyanine (Cy) 5 Pacific Blue (PB)
Laser (nm) Blå (488 nm) / gul (561-570 nm) - grønn (532 nm) Blå (488 nm) / gul (561-570 nm) - grønn (532 nm) Blå (488 nm) / gul (561-570 nm) - grønn (532 nm) Violet (405 nm)
EksitasjonMAX (nm) 496 496 496 401
UtslippMAX (nm) 578 785 667 455
Fenotypiske markør F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX Integra integrin αX kjeden, CR4, p150, ITGAX ΑM Integra Mac-1 Mo1 CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Målrettet celle Type Vev bosatt makrofager Klassisk aktivert (M1) makrofager Monocytter / makrofager Leukocytter (makrofager / monocytter, lymfocytter og granulocytter)
Delsett av dendrittiske celler Dendrittiske celler, NK celler, aktivert T celler og en undergruppe av intestinal intraepithelial lymfocytter (IEL) Granulocytter, dendrittiske celler, NK celler og delsett av T- og B-celler
Fortynningsfaktoren 1:50 1: 100 1: 100 1: 100
Isotype kontroller PE rotte IgG2a PE/Cy7 armensk Hamster IgG PE/Cy5 rotten IgG2b Pacific Blue rotte IgG2c

Tabell 2: Liste over fluorophore merket antistoffer spesifikke for kresne vev bosatt makrofager.

  1. Innhent og Forbered følgende elementer: FACS Buffer 5 mL runde bunn polystyren rør, anti-musen CD16/32 Fc reseptor blokkere antistoff, fluorophore bøyd eller unconjugated primære antistoffer, fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer (Hvis nødvendig), 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS).
    Merk: For flekker store mengder celler, antistoff konsentrasjon er mest kritiske enn celle nummer. For eksempel hvis flekker 10 x 106 celler flekker buffer volumet og antistoff konsentrasjon bør være den samme som om farging 1.0 x 10 celler6 i 100 µL buffer volum. 8 celler, øke antistoff 5-fold anbefales for farging 1.0 x 10.
  2. Legge til ekstra iskald FACS Buffer hver FACS rør om nødvendig, pellets celler med sentrifugering 751 x g i 5 min (4 ° C). Sug opp den supernatant følgende sentrifugering.
  3. Legg til anti-musen CD16/CD32 Fc reseptor blokkere mot alle prøvene i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber i 15 min 4 ° C eller is.
  4. Legge til fluorophore-konjugerte primære antistoff cocktail direkte til Fc-reseptor blokkere antistoff inneholder celle suspensjon og ruge eksempler på 4 ° C for 30 min. beskytte prøver fra lys til å minimere bleking av fluorophore-konjugerte antistoffer.
    1. I tilfelle unconjugated primære antistoffer ble brukt, Følg disse trinnene etter fullfører trinn 2.4.
    2. Vask primære antistoff farget prøver av sentrifugering 751 x g i 5 min (4 ° C).
    3. Fjern nedbryting av dekantere vin og å utsette pellets 100 µL FACS buffer.
    4. Legge til konjugert sekundære antistoff alle nødvendige prøver og ruge i 30 min på 4 ° C. Fortsett med trinn 2.5.
  5. Følgende antistoff inkubasjon legge 2 mL av is kaldt FACS buffer deretter pellets celler 751 x g i 5 minutter (4 ° C). Dekanter nedbryting og sørg for ikke å forstyrre pellets.
  6. Bland celler forsiktig og deretter re suspendere med 200-400 µL FACS bufferen, så ha dette i mørket på 4 ° C til standard flyt cytometri analyse eller cellen sortering.
  7. For kortsiktige fiksering av farget celler, kan du fortsette til trinn 2.8 til 2.10. Bruk fiksering for standard flowcytometri bare.
  8. Umiddelbart etter trinn 2.5, å suspendere celler i 0,5 mL 2-4% paraformaldehyde (PFA) i 15-30 min i 4 ° C.
    Merk: Advarsel: PFA er en kjent irriterende med kreftfremkallende og. Når du bruker PFA, håndteres med ekstrem forsiktighet. Husk å bruke riktig personlig verneutstyr og eksos ventilasjon.
  9. Følgende fiksering, vask celler ved å legge til 2 mL FACS buffer alle prøver og sentrifuge 751 x g i 4 ° C for 5 min. Fjern supernatant følgende sentrifugering.
  10. Resuspend fast celler i 200 µL av is kaldt FACS buffer og butikk på 4 ° C. Store fastsette celler opptil 1 uke på 4 ° C, ideelt utføre flyt cytometri oppkjøp innen 48 timer å minimere autofluorescence.
  11. Erverve flyt cytometri data etter flyt cytometer produsentens instruksjoner eller utføre fluorescerende aktivert celle sortering som beskrevet av Basu et al. 23

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når du bruker apolipoprotein E mangelfull (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) mus vedlikeholdes på en høy fett høyt kolesterol diett (HCHFD eller HCD) i 18 uker, 1 x 104 - 2 x 104 CD45+F4/80+ aorta makrofager kan isoleres når to prøvene samlet. Lever dissekert fra HFHCD-matet ApoE KO mus, produsert større enn 5 x 105 sortert Kupffer celler (som avhenger av tilgjengelig sortering tid). Når benytter høy fett diett (HFD) matet vill type (WT) C57BL/6 mus, kan 5 x 105 til 1 x 106 bosatt fettvev makrofager (ATMs) sorteres fra pancreatic (sendinger). Nevnte antall makrofager som kan sorteres fra en gitt vev var tilstrekkelig for gene expression analyse ved hjelp av kvantitative sanntid polymerasekjedereaksjons (qPCR). For vev der færre antall macrophage populasjoner er gjenopprettet, som aorta, anbefales det å bruke co precipitants (for eksempel glykogen) og overnatting nedbør når isolere RNA er nødvendig for disse analysene.

Her flyt effekten av diett-indusert metabolske forstyrrelser på macrophage fenotypen ved hjelp av grunnleggende cytometri, aktiveres av fluorescens celle sortering (FACS) og nedstrøms innlegget Sorter analyser vises. Disse funnene bekrefte tidligere publiserte observasjoner at mus matet en HFD eller HFHCD utstillingen økt infiltrasjon av klassisk aktivert (M1) makrofager i berørte vev som aorta (figur 1B). Dra nytte av flowcytometri, FACS og gene expression profilering (via kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) predominating fenotypen for Ron receptor tyrosine kinase-uttrykke CD45+ F4/80+ makrofager avledet fra vev isolert fra kosthold-matet mus ble observert. Ron reseptor-uttrykke aorta makrofager som viste en anti-inflammatorisk fenotypen ble redusert i HFHCD-matet mus (figur 1 c og D). Sorterte Ron reseptor-uttrykke makrofager avledet fra fordøyd aortas demonstrert økt arginase 1 (Arg1) genuttrykk, som er en veletablert M2 macrophage markør (figur 1E). Pro-inflammatoriske makrofager som ble karakterisert som CD45+ F4/80+ CD11c+ økte i aortas isolert fra HFHCD-matet mus (figur 1B og D). Karakterisere lever-resident makrofager ytterligere belyst rådende fenotypen av Ron reseptor-uttrykke subpopulasjoner (figur 2A). CD11c + pro-inflammatoriske macrophage bestander vist en nedgang uttrykket av gener som er sterkt forbundet med en anti-inflammatorisk (M2) fenotypen som Arg1 og Ron (figur 2B). Lignende trender ble observert macrophage bestander isolert fra fordøyd hvit fettvev (Figur 3). Macrophage befolkningen med pro-inflammatoriske signatur viste redusert overflaten uttrykk for Ron reseptoren (Figur 3). Kombinere tilnærminger, grunnleggende flowcytometri og FACS, resulterte i avgjørende data ytterligere validerer Ron reseptoren en regulerende alternativ (M2) aktivisering i makrofager32. Slike bias mot en anti-inflammatorisk (M2) fenotypen har vist seg å spille en beskyttende rolle i utviklingen og progresjon av fedme, åreforkalkning og steatohepatitis31.

Figure 1
Figur 1: Karakteristikk av makrofager isolert fra avstand aorta fjernet fra ApoE KO mus vedlikeholdes på en HCD i 18 uker. (A) celler var første port på CD45+ leukocytter, unntatt mobilnettet rusk. (B) CD45 flekker i forbindelse med F4/80 brukes til å avgrense dobbel positiv bestander antas å være makrofager. Ekstra gating ble brukt til å demonstrere andelen CD11c+CD45+F4/80+ (M1) og (C) Ron+CD45+F4/80+ (potensielle M2) makrofager i aortas avledet fra mus fed på enten en normal chow eller high kolesterol diet for 18 uker. (D) økte andelen CD11c+CD45+F4/80+ (M1) makrofager, samt redusert prosent av Ron+CD45+F4/80+ (potensielle M2) makrofager ble observert i aortas avledet fra mus fôret HCD forhold til mus matet en normal chow diett. (E) Gene expression analyse av sorterte Ron+CD45+F4/80+ makrofager demonstrert økt uttrykk for arginase jeg (en velkjent murine M2 markør). Verdiene ble hentet ved hjelp av Student t-test analyser utført bruker statistisk analyse software og representert som mener ± SEM. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figur har blitt endret fra Yu et al. (2016) 31. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Gene transkripsjon profilering av Kupffer celle populasjoner sortert fra fordøyd lever dissekert fra ApoE KO mus vedlikeholdes på en HCD i 18 uker. (A) generelle ordningen gating karakterisere og sortering Kupffer celle populasjoner. (B) Gene expression analyse av sorterte Ron uttrykke (Ron+) og ikke-uttrykke (Ron-) CD45+F4/80+ makrofager av kvantitative RT PCR. Student t-test analyser ble utført med statistisk programvare og verdier var representert som betyr ± SEM. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Figur har blitt endret fra Yu et al. (2016) 31 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Karakteristikk av minibanker isolert fra hvit fettvev dissekert fra WT BL6 mus matet en HFD for 18 uker. (A) generelle gating ordningen for å karakterisere og sortere fettvev avledet macrophage populasjoner (B) prosentandel av Ron + celler innenfor CD45+F4/80+CD11c- og CD45+F4/80+CD11c+ macrophage bestander sortert fra WAT. Figur har blitt endret fra Yu et al. (2016) 31 . Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diett-indusert stoffskiftesykdom modeller som etterligner Co-morbidities som åreforkalkning, enkel Steatose, steatohepatitis og type 2 diabetes er mye brukt for forstå underliggende molekylære mekanismer av sykdomsprogresjon. Collagenase avhengige fordøyelsen brukes ofte til å distansere vev å frigjøre celler fra ekstracellulær matrix (EFM)16,27. Enzymer som collagenase forstyrre kollagen som gir strukturell støtte for omkringliggende celler. Vev strukturelle komposisjon dikterer vev matrix stivhet (motstand mot deformasjon) og hvilket råolje collagenase produkt er mest effektivt å sikre vellykket ECM avbrudd28. WAT, som består av "myk matrix" er ofte fordøyd Collagenase Type II å frigjøre adipocytter og bosatt immunceller mens samtidig opprettholde integriteten til cellen overflaten insulin reseptorer29. Mikroarkitektur fibril komponentene i aorta bidrar til "stiv matrix", som effektivt aorta fordøyelsen collagenase type XI (som har høyest collagenase aktiviteten) er brukt i kombinasjon med andre enzymer. I motsetning til aorta bruker leveren fordøyelsen en collagenase med en svakere enzymatisk aktivitet, Collagenase Type IV, forstyrre matrix og frigjøre levedyktig parenchymal og ikke-parenchymal celler30. Kronisk betent vev avledet fra kosthold-matet vill-type eller apolipoprotein E mangelfull (ApoE KO) mus på en C57BL6 bakgrunn ofte gjennomgår remodeling som kan hindre riktig enzymatisk fordøyelse. Denne delen vil diskutere strategier for å redusere og/eller eliminere muligheten for feil vev dissosiasjon og lav celle utvinning.

Felles er vev fra kosthold-matet musen modeller som etterligner fedme, atherosclerosis eller alkoholfrie fatty leversykdom, unormale vevet remodeling. Hvit fettvev, den aorta og leveren endres ECM komposisjon, ofte fører til overdreven deponering av fibrillar komponenter som collagens. Wild type C57BL6 mus vedlikeholdes på en høy fett diett atten uker, oppleve vev-spesifikke unormalt som utvidet hvit fettvev og forstørret fettlever (enkelt Steatose). Ofte disse metabolske funksjoner er ikke plagsom hindringer å overvinne under vev dissosiasjon prosessen. På den annen side, i andre kosthold indusert modeller som speil mer forsterket fenotyper, kan omfattende remodeling av vev utgjøre et problem under vev fordøyelsen. HFHCD matet ApoE KO mus brukes ofte til modell åreforkalkning og steatohepatitis. En felles assosiert med avanserte steatohepatitis er overdreven avsetning av ECM i leveren (eller fibrose). Fibrotiske leveren har vist seg å være ganske problematisk under enzymatisk vev dissosiasjon og ofte produserer lav celle avkastning31. For å forbedre celle avkastning, er det avgjørende at fordøyelsen protokollene følges uten avvik. Selv om normal lever kan hakket og neddykket i fordøyelsen buffer for å oppnå dissosiasjon, maksimerer perfusjon med fordøyelsen buffer kontakt mellom den ekstracellulære matrisen i leveren og collagenase løsningen; og derfor denne tilnærmingen er sterkt anbefalt. I tillegg er 20-30 mL fordøyelsen bufferen ofte et tilstrekkelig volum for vellykket avstandtagen for normal lever; men i forhold til musen modeller som utvikler forstørret og/eller fibrotiske lever, er perfusjon med 50 mL av fordøyelsen bufferen foretrukket å sikre forsvarlig fordøyelsen samtidig minimere celledød. Lever med vekter som vesentlig overstiger 1,5 g, anbefales øke volumet av fordøyelsen buffer for å garantere vellykket fordøyelsen.

Vev Problem Mulig årsak Løsning
Hvit fettvev (WAT) Dårlig celle dissosiasjon Dårlig fordøyelse Kontroller at fordøyelsen bufferen er på 37° C
Celledød Overdreven collagenase fordøyelse Redusere tiden fordøyelsen
Redusere volumet av fordøyelsen buffer
Aorta Dårlig celle dissosiasjon Dårlig fordøyelse Kontroller at fordøyelsen bufferen er på 37 ° C
Aorta stykker i fordøyelsen bufferen var for stor Kontroller at aorta kuttes i ca 1 mm biter
Aorta stykker skalv ikke dissosiasjon buffer under inkubasjonen Pass aorta stykker skjelver i fordøyelsen løsningen
Celledød Overdreven collagenase fordøyelse Redusere tiden fordøyelsen
Redusere volumet av fordøyelsen buffer
Leveren Dårlig celle dissosiasjon Dårlig fordøyelse Kontroller at fordøyelsen bufferen er på 37 ° C
Øke volumet av fordøyelsen buffer
Feil cannulation av IVC (hevelse av vev rundt IVC oppstår) Pass på nålen er satt riktig inn i IVC
Sprukket IVC Sikre strikkes IVC før perfusjonsmåling
Redusere perfusjon hastighet
Sprukket vev Redusere perfusjon hastighet
Celledød Feil versjon av celler fra den Glisson kapsel Husk å distansere celler kapsel av tidligere diskutert stryke metode
Overdreven collagenase fordøyelse Redusere tiden fordøyelsen
Redusere volumet av fordøyelsen buffer

Tabell 3: feilsøking mislykket vev dissosiasjon. Flow cytometri basert celle sortering eller FACS er en kraftig teknikk for å isolere celle populasjoner hvor høy renhetsgrad er en nødvendighet. Når rensende celler av cellen sortering, krever oppnå høyt avkastning, men også en høy renhetsgrad sortering ved hjelp av riktig sortering strategier. I denne delen flyt metoder for å forbedre multi-fluorophore cytometri-baserte celle sortering av vev bosatt macrophage avledet fra kosthold-matet mus er beskrevet. Forskjellige vev bosatt macrophage isolering er overflate markør utvalg et kritisk punkt. Makrofager avledet fra WAT aorta og leveren er ofte kjennetegnes ved hjelp av en CD45+, CD11b+, F4/80+ gating strategi. Ekstra flyt cytometric paneler kan brukes til å identifisere vev bosatt makrofager. Disse sidene inkluderer antistoffer som etter overflate uttrykk for macrophage bestemt glykoproteiner (CD64, CD68 og CD14), store histocompatibility komplekser (MHCII) og apoptotisk celle tyrosin kinase reseptorer (MerTK)32, 33. bestemt macrophage fenotypen kan deretter bli preget av undersøkelser for selektiv overflaten uttrykk for M2 (CD163, CD209 og CD206) eller M1 markører (CD38, CD40, CD80 og CD86)34,35. Auto-fluorescens generert av lipid-laden makrofager kan presentere noen problemer ved gating populasjoner. Bruke antistoffer merket med fluorochromes som er begeistret av gul-grønn laser (for eksempel PE PE/Cy5, PE/Cy7) eller rød laser (for eksempel APC, APC Cy7) resulterer i slippes ut fluorescens som betydelig lysere enn auto-fluorescens og dermed kan forbedre resultatene36. Når du velger fluorophore conjugates med så høy flekker indeks og potensial utslipp spectra overlapping, er inkludering av egnede kontroller viktig. Når identifisere gating grenser, inkludering enkelt flekk (SS) og isotype kontroller tillate avgrensning av positive/negative bestander og måling av ikke-spesifikk bakgrunn signal forårsaket av primære antistoffer, henholdsvis 37. i tilfeller hvor cellene er knappe, anbefaler vi å bruke kompensasjon partikler for SS og isotype. Kompensasjon partikler vanligvis slipper ut lysere signaler enn biologiske kontroller og har også mindre avvik i bakgrunnen fluorescens. I tillegg fluorescens minus én (FMO) kontroller er ideelle for skildre gating grenser. Ved FMO kontroller, er den maksimale fluorescensen forventet for et flekker delsett avslørt i en angitt kanal når fluorochrome-merket antistoffer spesifikke for bestemte fluorescens kanalen er utelukket38. I vår erfaring, i tillegg til enkelt farget kompensasjon partikkel kontroller, skal en unstained kvinne biologiske sammenligning kontroll inkluderes for å angi mer presise positive/negative grenser.

Unntatt mobilnettet rusk og celle mengdefunksjoner i gating strategien er også en ekstra tilnærming brukes til å minimere auto-fluorescens. For å skille mobilnettet rusk fra befolkningen levedyktig celle, er bruker frem scatter (FSC) og siden xy (SSC) vanligste gating strategi. For isolert celler som skal brukes for innlegget Sorter analyser og krever høyere levedyktigheten til DNA/RNA utdrag, anbefales det at levedyktighet flekker ikke kan brukes med alle fiksering og/eller permeabilization prosedyrer. Formaldehyd innfesting av celler kan kompromiss nukleinsyre integritet på grunn av nukleinsyre protein crosslinking og dermed begrense isolasjon effektivitet, gjenkjenning og nøyaktig kvantifisering. Cellen aggregater som nevnt tidligere kan ikke bare bidra til slippes ut auto-fluorescerende signaler, men også i "tilfeldighet avbryter". Slik skjer for å opprettholde høy renhet i en sortering, men hvis for hyppige, det reduserer sorterte celle avkastningen. Sortering buffer (FACS buffer) supplert med DNAse og MgCl2 under cellen flekker kan minimere celle aggregering. Det anbefales å ikke bruke EDTA i kombinasjon med DNAse som det hemmer på enzymaktiviteten. Filtrering enkeltcelle suspensjon gjennom en 70 µm celle sil før sortering kan også frigjøre celler fra aggregat. Det er viktig å merke seg at for å minimere aggregering, celle suspensjoner bør være i en konsentrasjon av 5 millioner celler per mL i et minimum volum på 0,4 mL. Celler isolert fra lipid laden vev pleier å være mer utsatt for aggregering og dette kan resultere i tilfeldighet avbryter og lave slag avkastning. Det anbefales at eksempler videre er utvannet hvis aggregering vedvarer. Sorterte makrofager kan samles i polypropylen runde bunn samling rør som inneholder fosterets bovin rik medium for å maksimere celle utvinning. En innledende høy FBS konsentrasjon sikrer celle utvinning siden konsentrasjonen til slutt blir fortynnet med hver sorterte slippverktøy. Samle celler som skal brukes for DNA eller RNA analyse, kan cellene bli sortert direkte i den aktuelle utvinning reagensen (f.eks TriZol) å hindre RNAse forurensning. Når du sorterer høyt volum, anbefales sortere celler først i kultur medier med lave konsentrasjoner av FBS. Umiddelbart etter sortering celler skal deretter pelleted og lysed for DNA/RNA utvinning. Isolert genetiske materialet kan deretter bli profilert for endret genuttrykk. Pro-inflammatoriske gener inkludert TNFα, IL1-β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 og MCP1 (CCL2) er ofte upregulated i makrofager viser en klassisk aktivert (M1) fenotypen39. På den annen side, alternativt aktivert (M2) fenotypen i makrofager er ofte preget av induksjon av gener som koder Chi3l3 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 og TGFβ34,40. Nylig er CD38 Fpr2 og Gpr18 blitt godkjent som M1-spesifikke gener og c-Myc og Egr2 som M2-spesifikke gener34.

Selv om multi-farge flyt cytometri-baserte celle sortering er et verdifullt verktøy for å isolere makrofager på høy renhet, kan denne tilnærmingen være kostbart. De kraftige fordelene av FACS mediert sortering er avhengig for driftspersonell som kan manøvrere celle sortering i tillegg til de høye kostnadene for cellen sorter vedlikehold reagenser. Alternative tilnærminger kan brukes i erstatning av kostbare flyt cytometri basert celle sortering. De omfatter magnetiske aktivert celle sortering (Mac) eller tetthet gradert sentrifugering. Den første alternative cellen sorteringsmåten nevnt omfatter magnetiske og/eller microbead kolonnen isolasjon kits skille celler av interesse fra blod eller solid vev41. Den andre cellen sortering tilnærming skiller en heterogen celle suspensjon basert på tetthet og styrke på sentrifugering. Dessverre tetthet mediert sentrifugering er ikke praktisk for å isolere makrofager fra aortabuen - eller WAT-avledet enkeltcelle suspensjoner. Ofte produktet fra differensial sentrifugering er forurenset, og lav gi. Derfor er mindre vev (for eksempel aorta eller WAT) som resulterer i cellene fulgte enzymatisk fordøyelsen ikke ideelle kandidater for differensial sentrifugering. På den annen side, kan celle suspensjoner avledet fra avstand lever produsere et tilstrekkelig antall sorterte makrofager som kan brukes i innlegget Sorter eksperimenter og analyser som kultur stimulations, qPCR eller vestlige blotting analyse. Disse alternative metodene kan også brukes til å berike bestander før FACS, gir renere former. Av notatet utgjør vev bosatt makrofager en liten andel av befolkningen hele cellen i WAT, lever og aorta. Anriking av celler før FACS sortering er en metode som brukes når isolere populasjoner av cellen som er sjeldnere. Ett problem som er vanlig i små bestander å isolere er store cellen tallene må behandles for å få nok celler for påfølgende analyse. Berikelse eller pre-sortering kan brukes til å løse slike et problem. Denne metoden hjelper i å få en enklere populasjon av celler gjennom positive og negative utvalg, men det tillater bevaring av tid som FACS sortering kan være en varig prosess for tett vev kilder som leveren.

Nylige fremskritt innen betennelse biologi markere betydningen av fenotypiske og funksjonell karakteristikk av macrophage heterogenitet å fremme forståelsen av komplekse rollen disse immunceller i å regulere kronisk betennelse. I korthet, gir denne omfattende protokollen en multi-dimensjonal tilnærming til karakteriserer vev bosatt makrofager fra tre hallmark vev studerte etablerte kosthold indusert fedme og betennelse modeller. Enda viktigere denne protokollen tar hensyn problemer og nødvendige tiltak for å isolere ren enkelt celle suspensjoner fra dysregulated betent vev som WAT, aorta plaketter og fettstoffer lever. Protokollen lar forskeren gjelder flowcytometri og FACS sortering verktøy i en nyskapende dimensjon som karakteriserer vev bosatt makrofager, viktige regulatorer av betennelse i fedme. Detaljert karakterisering av macrophage populasjonsdynamikk kan gi innsikt i monocytt menneskehandel betent vev og tillater fortsatt mekanistisk evalueringer gjennom en rekke eksperimentelle tilnærminger på sorterte makrofager. Ytterligere karakteristikk av macrophage befolkninger kan gi en sentral innsikt i det biologiske grunnlaget som regulerer macrophage heterogenitet i helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Flow cytometri Core anlegget på The Pennsylvania State University Millennium Science Complex.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144, (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444, (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15, (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16, (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5, (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6, (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307, (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58, (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117, (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13, (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200, (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52, (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20, (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26, (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18, (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496, (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14, (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375, (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197, (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11, (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100, (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10, (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4, (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71, (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27, (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6, (3), 13 (2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142, (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1, (78), 1-6 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics