Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

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Bioengineering

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Summary

Este estudo apresenta uma metodologia para preparar 3D, andaimes, células do tipo espuma biodegradáveis ​​à base de elastómeros biocompatíveis cristal líquido de cadeia lateral (LCES). expericias de microscopia confocal demonstram que LCEs do tipo espuma para permitir a ligação de células, proliferação, e o alinhamento espontânea de mioblastos C2C12s.

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Prévôt, M. E., Ustunel, S., Bergquist, L. E., Cukelj, R., Gao, Y., Mori, T., Pauline, L., Clements, R. J., Hegmann, E. Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (122), e55452, doi:10.3791/55452 (2017).

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Abstract

Aqui, nós apresentamos uma preparação passo-a-passo de um,, andaime célula semelhante a espuma biodegradáveis ​​3D. Estes suportes foram preparados por ligação cruzada bloco em estrela de co-polímeros caracterizam unidades de colesterol como grupos pendentes da cadeia lateral, resultando em esmética-A (SmA) elastómeros de cristais líquidos (LCES). andaimes do tipo espuma, preparados utilizando moldes de metal, apresentam microcanais interligados, tornando-as adequadas como suportes de cultura celular 3D. As propriedades combinadas da estrutura regular da espuma metica e do resultado elastómero num andaime célula 3D que promove a proliferação de células não só mais elevado em comparação com películas convencionais porosas de modelo, mas também uma melhor gestão de transporte de massa (isto é, nutrientes, gases, resíduos , etc). A natureza do molde de metal permite a manipulação fácil de formas de espuma (isto é, rolos ou películas) e para a preparação de andaimes de diferentes tamanhos de poros para diferentes estudos de células embora preservando a interconnected natureza porosa do molde. O processo de corrosão não afeta a química dos elastômeros, preservando a sua natureza biocompatível e biodegradável. Mostramos que essas LCEs esméticos, quando cultivadas por períodos de tempo extensos, permitem o estudo de construções de tecido clinicamente relevantes e complexos, promovendo o crescimento e proliferação de células.

Introduction

Existem vários exemplos de materiais sintéticos e biológicos biocompatíveis para aplicação em estudos de células e para a regeneração de tecidos com vista a fixação de células e proliferação de 1, 2, 3, 4, 5. Tem havido alguns exemplos de materiais biocompativeis, conhecidos como elastómeros de cristais líquidos (LCES), que poderiam responder aos estímulos externos com anisotrópica molecular encomendar 6, 7. LCEs são materiais estímulos-sensíveis que combinam as propriedades mecânicas e elásticas de elastómeros com a funcionalidade óptica e de ordenação molecular de cristais líquidos 8, 9. LCEs pode sofrer alterações de forma, a deformação mecânica, o comportamento elástico, e propriedades ópticas, em resposta a STIM externosuli (isto é., calor, tensão, luz, etc) 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Estudos anteriores demonstraram que os cristais líquidos (LCS) pode detectar o crescimento e a orientação de células 4, 17. É possível, então, assumir que LCEs podem ser adequados para aplicações biológica e medicamente relevantes, incluindo andaimes célula e alinhamento. Descrevemos previamente a preparação de filmes esméticos biocompatíveis, biodegradáveis, lançou-moldados, e LCES finas apresentando um "tipo Swiss-queijo" morfologia porosa 6, 18. Nós também preparado LCEs biocompatíveis nemáticos com morfologia globular como suportes para o crescimento de células 19 <sup>, 20. Nosso trabalho teve como objetivo ajustar as propriedades mecânicas dos materiais para coincidir com as do tecido de interesse 21. Além disso, estes estudos focam a compreensão das interacções célula-elastómero, assim como resposta celular em que os elastómeros são sujeitos a estímulos externos.

Os principais desafios foram, em parte, para adaptar a porosidade das LCEs para permitir a fixação das células e a permeação através da matriz de elastómero e de uma melhor transferência de massa. A porosidade destes filmes finos 6 permitido para a permeação celular através da maior parte da matriz, mas nem todos os poros eram totalmente interligado ou tinham um tamanho mais regular (homogénea) poros. Em seguida, apresentou um relatório sobre biocompatíveis elastômeros LCE nemáticos com morfologias globulares. Estes elastómeros nemáticos permitido para a adesão e proliferação de células, mas o tamanho dos poros variou somente de 10-30 um, o qual impedido ou limitado a utilização desteselastómeros com uma ampla variedade de linhas de células 19, 20.

Os trabalhos anteriores por Kung et ai. sobre a formação de espumas de grafeno usando um molde de metal "sacrificial" mostrou que a espuma grafeno obtido tinha uma morfologia porosa muito regular ditada pelo molde do metal escolhido 22. Esta metodologia oferece controle total de porosidade e poros tamanho. Ao mesmo tempo, a maleabilidade e flexibilidade do molde do metal permitir a formação de molde diferentes formas antes da preparao da espuma. Outras técnicas, tais como lixiviação de material 23, de templates de gás 24, ou fibras fiadas electrodepositadas 25, 26 também oferecer o potencial para a preparação de materiais porosos, mas eles são mais demorado e, em alguns casos, o tamanho de poro está limitado a apenas alguns micrômetros. Espuma-como LCEs 3D preparadas utilizando moldes de metal permitir uma carga maior de células; uma taxa de proliferação melhorada; co-cultura; e, por último mas não menos importante, uma melhor gestão de transporte de massa (ou seja, nutrientes, gases e resíduos) para garantir o desenvolvimento do tecido completo 27. LCEs 3D-espuma como também parece melhorar o alinhamento das células; esta é mais provável em relação aos pingentes LC detecção do crescimento celular e a orientação da célula. A presença de porções LC dentro do LCE parece aumentar o alinhamento das células no que diz respeito à localização de célula dentro do andaime LCE. Células alinhar dentro das escoras do LCE, enquanto nenhuma orientação clara é observada onde as escoras unir (cruzamentos) 27.

No geral, a plataforma de andaime célula LCE de um meio de suporte de células oferece oportunidades para afinar a morfologia elastómero e propriedades elásticas e para dirigir especificamente o alinhamento de tipos de células (individuais) para criar uma forma ordenada, o arranjos espaciaiscélulas de f semelhantes aos sistemas vivos. Para além de proporcionar uma estrutura de suporte capaz de suportar e direccionar o crescimento celular a longo prazo e a proliferação, LCEs também permitir experiências dinâmico, onde a orientação das células e as interacções podem ser modificados em tempo real.

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Protocol

NOTA: As etapas a seguir para a preparação do tipo espuma LCE 3D utilizando o copolímero em bloco em estrela 3-braço são mostrados na Figura 1. Para a caracterização de ressonância magnética nuclear (RMN), os espectros são registados em clorofórmio deuterado (CDCl3) à temperatura ambiente num instrumento Bruker DMX 400 MHz e internamente referenciadas picos residuais a 7,26. Transformação de Fourier espectro de infravermelho (FT-IV) são registados utilizando um Bruker Vector 33 FT-IR espectrómetro usando o modo de reflectância total atenuada. Para cada passo do seguinte protocolo, é importante usar roupas de proteção pessoal adequado (EPI).

1. Síntese de α-Cloro-ε-caprolactona (monómero) (de acordo com o Procedimento em Jerome et ai. 28)

  1. Antes de iniciar a síntese, purificar 27 g de ácido 3-cloroperbenzóico como se segue:
    1. Em 800 mL de água destilada, adicionar 1,28 g de sódiomono-hidrato monobásico de fosfato e 8,24 g de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado. Ajustar o pH para 7,4 (utilizando hidróxido de sódio ou ácido clorídrico) e de reserva de 30 ml desta solução; esta é a solução tampão.
    2. Utilizando um funil de separação, dissolve-se o ácido 3-cloroperbenzóico em 35 ml de éter dietílico. Lava-se a solução orgânica com 10 mL de solução tampão (preparado no passo 1.1.1.). Repetir a lavagem três vezes.
    3. Adicionar 3 g de sulfato de sódio directamente para a solução orgânica; este agente de secagem absorve a água a partir da solução orgânica.
    4. Filtra-se a solução para remover o agente de secagem. Concentra-se o filtrado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 850 mbar e 40 ° C.
  2. Solubiliza-se 18,5 g de ácido 3-cloroperbenzóico purificado em 150 mL de diclorometano seco por agitação em um banho de ultra-sons; este processo normalmente leva 20 minutos. Coloque a solução dentro de um funil de separação.
  3. Dentro de um dois-neck, balão de fundo redondo,dissolver 13,1 g de 2-chlorocyclohexanone em 15 mL de diclorometano anidro usando um agitador magnético sob azoto gasoso. Continue mexendo.
  4. Montar o funil separador contendo uma solução de ácido 3-cloroperbenzóico (a partir do passo 1.2) para o balão de duas tubuladuras no passo 1.3. Lavar o sistema com azoto gasoso. Ajustar a abertura do funil de separação de modo a que a solução de ácido cloroperbenzoico cai gota a gota à solução 2-chlorocyclohexanone (1 gota em cada dois segundos) e continuar a agitar a mistura sob atmosfera de azoto durante 96 h.
  5. Arrefece-se a mistura de reacção a -20 ° C durante 1 h para precipitar o subproduto ácido m-clorobenzóico (m -CBA).
  6. Filtra-se o ácido clorobenzóico m (m -CBA) e lava-se a solução remanescente com soluções saturadas de tiossulfato de sódio, bicarbonato de sódio, e cloreto de sódio.
  7. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 850 mbar e 40 ° C. Purifica-se o amarelo, viscoso pálido LiquID por destilação sob pressão reduzida a 2,3 Torr e 96 ° C.
  8. Monitorizar o sucesso da stese utilizando os seguintes picos de 1 H RMN. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H CLCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H 2 O), 4,18-4,05 (m, 1H , C H 2 O), e 2,06-1,58 (m, 6H, -CH 2 -) 6, 27.

2. Síntese de α-três braços da estrela de Copolímero de Bloco (SBC-αCl) por Anel A copolimerização de abertura (Sharma et al. 6 e Amsden et ai. 29)

  1. Antes de síntese, silanizar uma ampola de 20 ml, preenchendo-o com um (v / v) de solução a 2% de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane em tolueno e agitação durante cerca de 24 h. Lavar com álcool isopropílico e secá-lo, colocando-o num forno a 140 ° C durante 30 min.
  2. Adicionar 30,64 g de destilado ε-caprolactona, 0,5 g de α-cloro-ε-caprolactona, e 0,25 mL de glicerol para a ampola. Misturar utilizando um vortex durante 1 min.
  3. Adicionar 4,90 g de D, L -lactide para a ampola e purgar com azoto. Coloque a ampola num forno a 120 ° C para fundir o D, L -lactide; este processo demora tipicamente cerca de 2 h. Misturar novamente utilizando um vortex para certificar-se de que todos os conteúdos são bem misturados e adicionar 66 uL de estanho (II), 2-etil-hexanoato de (Sn (Oct) 2) para a ampola.
    NOTA: D, L -lactide vai arrefecer durante este processo e terá de ser re-aquecida no forno para derreter.
  4. Misture vigorosamente uma última vez usando o vórtice e lave com nitrogênio.
  5. Feche a ampola com uma tampa de borracha. Coloque uma agulha ligada a um tubo de vácuo (a câmara de vácuo é geralmente suficiente) através da rolha de borracha. Ligar o vácuo e, usando uma chama, derreter o pescoço longo do vidro, torcendo-se lentamente até que o gmoça entra em colapso sobre si mesmo. Tenha cuidado para não derreter a tampa de borracha. Uma vez que a ampola é chama-selado, colocá-lo em um banho de areia, um forno, ou apropriado elemento de aquecimento a 140 ° C durante 48 h.
  6. Retire a ampola e deixe esfriar à temperatura ambiente.
  7. Quebrar a ampola na marca selado e dissolve-se o líquido altamente viscoso através da adição de 10 mL de diclorometano. Transferir a solução para um funil de separação.
  8. Preparar um frasco contendo 100 mL de metanol frio (arrefecido utilizando um banho de gelo / acetona seco a uma temperatura de cerca de -78 ° C). Corrigir o funil de separação (passo 2.7) na parte superior do frasco. Ajustar a abertura do funil de separação de modo a que cerca de duas gotas cair cada segundo (gota a gota).
  9. Recolhe-se o precipitado branco por filtração (através de um filtro de papel) e secá-lo numa estufa de vácuo entre 50 e 60 ° C.
  10. Monitorizar o sucesso da stese utilizando as seguintes 1 H RMN e FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COCH C CH3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24-4,12 (m, C H 2 O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, C H 2 O), 3,80-3,68 (m, C H C H 2), 3,09-2,64 (largo, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-), e 1,77-1,25 (m, C H 2, C H 3); FT-IV (1 / λ [cm-1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, e 735 (m), 6, 27.
    Nota: Para preparar um LCE 3D mais hidrófilo, preparar um copolímero de bloco linear (LBC) em vez de um SBC, seguindo o procedimento de abertura de anel de copolimerização (ROP) descrito acima.
    1. Adicionar 0,3 g de polietileno glicol (PEG), 3,15 g ε-caprolactona, 1,0 g de α-cloro-ε-caprolactona, e 5,0 g de D, L-lactido à mistura frasquinho silanizado.

    3. A modificação sintética de α-Cl-Três Braço SBC para αN 3 -três Braço SBC (SBC-αN 3) (de acordo com Silva et ai. 6)

    1. Em um balão de fundo redondo e sob atmosfera de azoto, dissolve-se 5 g de SBC-αCl em 30 ml de N, N-dimetilformamida'.
    2. Adicionar 0,22 g de azida de sódio e deixa-se reagir durante a noite à temperatura ambiente.
      Cuidado: A azida de sódio é tóxico; usar roupas de proteção pessoal adequado (EPI).
    3. Remover o N, N-dimetilformamida' sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 11 mbar e 40 ° C. Dissolve-se a mistura em 30 mL de tolueno. Centrifugar a solução três vezes a 2800 xg durante 15 min para remover o sal formado. Evapora-se o tolueno sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 77 mbar e 40 ° C.
    4. Monitorizar o sucesso da substituição de azida usando 1 H NMR e de FT-IR picos.
      NOTA: [cm-1]): 2928, 2108 (s, azida), 1754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), e 696 (m).

    4. Síntese de Colesterilo 5-hexinoato (LC Moiety) (De acordo com Sharma et al. 6 e Donaldson et al. 30)

    1. Em um balão de fundo redondo, mistura de 3 g de ácido 5-hexinóico e 130 mL de diclorometano. Arrefece-se até 0 ° C utilizando um banho de gelo.
    2. Num outro balão de fundo redondo, misturar 8,28 g de N, N-diciclohexilcarbodiimida', 10,3 g de colesterol e 0,2 g de 4-dimetilaminopiridina.
    3. Transferir o 5-hexinóico gota a gota uma solução de ácido para o frasco contendo a mistura de colesterol e manter a mistura final, a 0 ° C durante 1 h.
    4. Deixar a mistura aquecer até à temperatura ambiente durante a noite. Remover o precipitado resultante diciclohexilureia por filtração, utilizando um filtro de papel de grau 415 e descartá-lo.
    5. Concentra-se o filtrado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 850 mbar e 40 ° C. Dissolve-se o resíduo recolhido em 150 ml de hexano.
    6. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 335 mbar e 40 ° C. Adicionar 350 ml de etanol ao resíduo oleoso para recolher o produto final. Lavar o sólido esbranquiçado formado com etanol e secar o produto sólido sob vácuo a 50 ° C.
    7. Monitorizar a síntese utilizando os seguintes 1 H RMN e FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H C = C), 4,70-4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H 2 CO), 2,34 (m, 2H, CH2-C = H), 2,31 (m, 2H, C H 2 C H 2 -COO-), 2,28 (s, 1H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H 2), 2,07-1,06 (m, 2H, C H 2, C H), 0,94 (s, 3H, C-CH 3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H 3 C H), e 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H 3 C H), 0,67 (s, 3H, C H 3). FT-IV (1 / λ [cm-1]): 2,830-2,990 (largo e pico forte), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s), e 667 (s).

    5. modificação sintética de α-N 3 -três Braço SBC para ácido a-colesterilico-Três Braço SBC (SBC-αCLC) através de uma reacção Azida-alcino Huisgen Ciclo-adição ( "clique" Reaction) para obter SBC-Chol (Segundo Sharma et al. 6)

    1. Em um balão de fundo redondo, dissolvem 1 equivalente molar de SBC-αN 3 (1,5 g) em 100 mL de tetra-hidrofurano acabado de destilar (THF). Adicionar 1,2 equivalen molarest de colesterilo 5-hexinoato (1,94 g), 0,1 equivalentes molar de cobre (I) iodeto (0,06 g), e 0,1 equivalente molar de trietilamina (0,03 g). Agita-se a mistura durante a noite a 35 ° C sob azoto.
    2. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 357 mbar e 40 ° C.
    3. Dissolve-se a mistura residual em 80 mL de diclorometano e centrifuga-se durante 5 min a 2800 xg à temperatura ambiente para remover os materiais que não reagiram e os produtos secundários.
    4. Monitorizar a síntese utilizando os seguintes 1 H RMN e FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazole), 5,43-5,34 (m, C = CH colesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH 3), 4,68 -4,55 (m, O-CH colesterol), 4,24-4,19 (m, CH 2 O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH2O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH 2 O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH2), 2,31-2,25 (m, COCH2), 2,07-1,02 (m, CH 2 CH3), 1,05-1,03 (s, CH 2, CH 3), 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH 2, CH 3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH 3), e 0,71-0,68 (s, CH3). FT-IV (1 / λ [cm-1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s), e 668 (s).

    6. Síntese de 2,2-bis (1-caprolactona-4-il) propano (Reticulador, BCP) (de acordo com Gao et al. 27 e Albertsson et ai. 31)

    1. Em um balão de fundo redondo, preparar uma solução contendo 10,8 g de 2-bis (4-hidroxi-ciclo-hexil) propano e 52 mL de ácido acético.
    2. Prepara-se uma solução contendo 11 g de trióxido de crómio em 50 ml de ácido acético e 8 mL de água destilada. Adicionar esta solução gota a gota, à solução preparada no passo 6.1, mantendo a temperatura da mistura entre 17 e 20 ° C (por exemplo, numabanho d'água); este processo leva gota a gota 2 h. Uma vez que o processo é completa, deixar a solução a agitar durante cerca de 30 min.
    3. Adicionar 50 ml de 2-propanol. Agita-se a solução durante a noite à temperatura ambiente.
    4. Concentra-se a solução de cor púrpura escura sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 137 mbar e 40 ° C. Adicionar 300 mL de água destilada para precipitar; O precipitado deve ser leve roxo.
    5. Filtrado o produto em bruto utilizando um filtro de papel de grau 415. Lavar o material sólido com ~ 250 mL de água destilada ou até o sólido se torna branco.
    6. Dissolve-se o material sólido em 15 mL de benzeno a 40 ° C e deixá-lo recristalizar a 25 ° C.
    7. Adicionar 8,34 g de dicetona seco dissolvido em diclorometano seco e uma solução contendo 6,0 g de ácido 3-cloroperbenzóico em 75 mL de diclorometano para o balão.
    8. Refluxo a solução a 40 ° C durante 24 h.
    9. Arrefece-se a mistura de reacção a -20 ° C durante 10 min para precipitar a m
    10. Remover o ácido m-clorobenzóico por filtração (através de um filtro de papel) e concentra-se a solução sob pressão reduzida.
    11. Lavar o produto em bruto de viscose com 200 mL de 2-heptanona e secar o precipitado sob vácuo a 50 ° C durante a noite.
    12. Monitorizar a síntese utilizando os seguintes 1 H RMN e FT-IR picos. 1 H RMN (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H 2 OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H 2 OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H 2 COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -CH 2 CH 2 OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -CH 2 C H 2 COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C (CH3) 2), e 0,84 (s, 6H, C H 3 C).
    13. 7. Criação de Poroso 3D Elastomer andaime Usando qualquer diisocianato de hexametileno (HDI) ou 2,2-bis (1-caprolactona-4-il) propano (BCP) 27 como Reticuladores (De acordo com Gao et ai. 27)

      1. Prepare de três braços mistura de elastómero usando 0,75 g de SBC-αCLC por adição de 0,25 mL de HDI (ou 0,45 mL de BCP) e 0,24 mL de água destilada monómero ε-caprolactona. Adicionar 60? L de Sn (Oct) 2. Se usando BCP em vez de HDI, misturar SBC-αCLC e BCP usando um vórtice e colocá-los num forno a 140 ° C até que o BCP funde e se dissolve totalmente (este passo pode levar até 2 h). Uma vez que o BCP foi dissolvido, levá-la para fora do forno e, a Sn (Oct) 2, e vortex.
      2. Preparar um molde de espuma de níquel "sacrificial" cortando um pedaço de metal cm 1 x 4. Enrolá-lo a partir de uma das extremidades curtas de modo a que o rolo final é, aproximadamente, um pedaço de metal 1 x 1 cm (ver Figura 4).
      3. <li> Coloque a espuma de níquel em um frasco de vidro ou de alumínio pacote de folha e verter a mistura preparada no passo 7.1 para cobrir totalmente a espuma durante 2 min. Remover o excesso de mistura com uma pipeta de Pasteur. Deixá-lo em um dia para o outro forno a 80 ° C.
      4. Descascar a folha de alumínio ou quebrar o vidro. Usando uma lâmina de barbear, barbear o elastómero em torno da espuma metica para expor o metal de níquel.
      5. Prepare M de ferro (III), cloreto de 1 (FeCl3) solução em 100 mL de água. Coloque a espuma num frasco e adicionar 70 ml de solução de FeCl3. Agita-se durante três dias à temperatura ambiente e mudar a solução de FeCl 3 todos os dias. Antes de cada mudança, agita-se a espuma com água de ionizada durante 0,5 h.
        NOTA: O processo de corrosão é normalmente concluído após três dias. Para assegurar que o processo de corrosão, efectue a testes de compressão tácteis até que as espumas se sentir suave. resistência espuma para ensaios de compressão tácteis indica a presença de um molde de metal residual.
      6. Lavar o elastomer espuma com etanol e colocar num forno de vácuo durante a noite a 40 ° C.
      7. Caracterizar os materiais por meio de microscopia electrónica de varrimento (SEM), calorimetria de varrimento diferencial (DSC), ensaios de compressão mecânicas, e a análise gravimétrica térmica (TGA) 27.
        NOTA: Para a preparação de um LCE 3D mais hidrófilo, substituir o SBC com LBC (certificando-se de que o LBC também contém uma porção LC) seguindo as etapas descritas no passo 7.5.

      8. Sementeira de Elastómero andaime com culas SH-SY5Y neuroblastoma e de cultura usando técnicas estéreis

      1. Esteriliza-se o elastómero, lavando-o duas vezes com 1 mL de etanol a 70%. Realizar a irradiação UV durante 10 min e lava-se com 1 mL de etanol a 70%. Lave-o duas vezes com 1 mL de água estéril e 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Colocar os elastómeros em placas de cultura de 24 poços.
      2. Preparar o meio de crescimento de células para SH-SY5Y contendo 90% Dulbecco Modified Eagle Médium Supplem (DMEM)ented com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep).
      3. Após a contagem das culas utilizando um hematocytometer, preparar 1,5 x 10 5 culas SH-SY5Y em suspensão em 100 uL de meio de crescimento (solução semente). Adicionar a solução em cima dos elastômeros, certificando-se para formar uma gota.
      4. Incubar os elastómeros semeadas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 2 h para promover a adesão celular. Adicionar 0,5 ml de meio de crescimento. Incubar outra vez a 37 ° C com 5% de CO 2.
      5. Mudar o meio todos os outros dias após a lavagem com 1 mL de PBS.

      9. imagem microscópica de Elastómero Construto

      1. Fixar as células cultivadas em elastómeros com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS durante 15 min. Lavar com 3 ml de PBS três vezes durante 5 min cada e colocar o elastómero com as células fixadas em uma placa de cultura com uma lamela em anexo.
        Cuidado: PFA é tóxico. Usar vestuário de protecção pessoal adequado (EPI).
      2. Stanas amostras fixadas com 0,1% de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 500 ul de PBS durante 10 minutos e lavar duas vezes com 1 ml de PBS durante 5 min.
      3. Imediatamente imagem os elastómeros utilizando microscopia confocal de fluorescência com DAPI, a aquisição de pilhas de imagens que se estendem a amostra.
        NOTA: Aqui, pilhas de imagens foram adquiridas usando uma objetiva de 20X e um objetivo 60X.
      4. Analisar as pilhas de imagem confocal óptica utilizando o ImageJ 32.

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Representative Results

Este relatório mostra o método de preparação de um LCE 3D poroso como um andaime para cultura de células utilizando um molde de metal de níquel. O 3D LCE obtido demonstra um complexa rede interligada canal que permite a infiltração de células fácil, bem como o transporte de massa mais adequado 27. Verificou-se que as células são capazes de penetrar completamente a rede de canais interligados e também é capaz de alinhar dentro do LCE. Aqui, uma espuma de metal de níquel (99% de Ni, densidade de 860 g / cm 2) foi seleccionada depois de uma abordagem similar para a preparação de espuma grafeno anteriormente relatado por Kung et ai. 22. A espuma de metal foi polímero fundido, com todos os suportes de metal totalmente cobertos. A selecção do tamanho e densidade de espuma de metal é importante, uma vez que confere a morfologia final do LCE e pode ajudar na imitando o ambiente de tecido de interesse.

D, L- lactido (Figura 2). O produto final é um hidrófobo SBC 3-braço. SBC com 4 e 6 braços, feitos por substituição do nó de glicerol com pentaeritritol e dipentaeritritol, respectivamente, tenham sido anteriormente relatadas 18. Para um SBC mais hidrofílico, o nó central foi substituído com óxido de oligoetileno (ver as notas de protocolo). No entanto, a substituição de glicerol com resultados de óxido de oligoetileno em um copolímero de bloco linear 27. Utilizou-se uma síntese modificada de Younes et al. 29. A versão modificada permite o uso de um ε-ca modificadaprolactone com um grupo halogéneo em duas posições diferentes, alfa e gama para a carbonil 6. Uma vez que o SBC é formado, o bloco ε-caprolactona modificado sofre um deslocamento do átomo de halogénio com um grupo azida. O deslocamento do grupo de halogéneo pelo grupo azida é confirmado pelo aparecimento da 2,100 cm - uma banda utilizando reflectância total atenuada (ATR) FT-IR (Figura 3). O grupo azida é depois utilizado para ligar covalentemente a porção LC (colesterilo hexinoato) para o copolímero em bloco em estrela utilizando o alcino-azida reacção de cicloadição de Huisgen (também conhecido como uma "reacção clique"), obtendo-se o copolímero em bloco em estrela final com um lado unidade pingente colesterol cadeia (SBC-Chol). A formação do anel de triazol é confirmada pelo desaparecimento de a-2100 cm - uma banda e a aparência de um singuleto a 7,30 ppm observados no espectro de 1 H RMN (ver Figura3). Nós relataram recentemente sobre o efeito da colocação de um grupo de halogéneo, quer alfa -Br) ou gama (γ-Cl) em relação ao carbonilo na funcionalizado ε -CL 6. Deve notar-se que a substituição do nó central nos co-polímeros de SBC com 4-braço e 6-braço núcleos centrais tem um efeito sobre as propriedades mecânicas dos LCEs obtidos porque os nós centrais servir como ambos os iniciadores e reticuladores intrínsecas 18 .

Uma vez que o SBC-Chol foi preparado e completamente caracterizado, o processo de reticulação usando um molde de metal é o último passo para a preparação de espuma. O SBC-Chol foi misturada com di-isocianato de hexametileno (HDI, reticulador), ε-caprolactona, e Sn (outubro) 2 (ROP catalisador, ver passo 7.1). O bis-caprolactona (BCP) reticulador foi substituído com HDI, como reportado anteriormente. A espuma metálica é cortada e moldada para a f o desejarorm (Figura 4). Dois caminhos para a preparação de espuma, ou seja, a porosidade primário (LCEF PP) e porosidade primário / secundário (LCEF P + SP), ter sido previamente relatado. Aqui, o LCEF P + SP, ou "imersão", método, é apresentado, em que o modelo de níquel é rapidamente embebido na mistura de polímero. A espuma de metal é colocada dentro de um recipiente feito de uma folha de alumínio ou um frasco de cintilação contendo a mistura de polímeros, com todos os suportes de metal totalmente imersos na mistura de polímero. A mistura de polímero em excesso é cuidadosamente removido. Este modelo de níquel coberta de polímero é colocado durante a noite, ainda no interior do recipiente, num forno a 80 ° C. A reticulação é levada a cabo na presença do catalisador durante cerca de 2 h. Após o processo de reticulação, o molde coberto de níquel-polímero é removido do seu recipiente descolando a folha de alumínio ou quebra do recipiente de vidro. O polímero em excesso é cuidadosamente raspado do templ níquel coberto-polímeroComeram a expor os bordos do molde de níquel e colocado dentro de um recipiente com uma solução saturada de FeCl 3 (Figura 5). Após algumas horas, o níquel é quase completamente removido, e somente a espuma LCE é enxaguado com água desionizada (DI) de água para eliminar a solução de níquel / FeCl3. A espuma LCE é novamente colocado dentro de um recipiente com uma solução saturada de FeCl 3 e enxaguado com ua DI mais duas vezes. Após o processo de gravação está completa e todo o molde de níquel é totalmente eliminado, a espuma LCE mostra uma rede de canais interligados com escoras ocos (Figura 6). A Figura 6 mostra a morfologia espuma LCE interna observada usando microscopia electrónica de varrimento (MEV). As escoras de espuma LCE são ocos, e a morfologia global normal está dependente do modelo de espuma de níquel.

Anteriormente, o uso do BCP necessários vários passos para mantê-lo em solução (isto é, fundida), porque BCP começa a recristalizar, logo que a solução arrefeça de alguns graus (desde 140 ° C até à temperatura ambiente para adicionar o Sn (Oct) 2; ver passo 7.1). Isso faz com que a manipulação da mistura de espuma de metal e polímero desafiando antes da reticulação. O uso de HDI como um agente de reticulação permitido para um tempo mais rápido de reticulação do que quando se utiliza BCP. BCP é um sólido à temperatura ambiente, com um ponto de fusão de 140 ° C, enquanto que HDI é um líquido à temperatura ambiente. A escolha dos agentes de ligação cruzada afecta directamente o tempo de preparação e, como no nosso caso, reduziu a temperatura de reticulação 140-80 ° C, reduzindo também a preparação de elastómero.

As espumas LCE foram testados usando compressão-deformação (Filme 1). Uma redução de 70% no tamanho do LCE é observado, com nenhum efeito sobre as dimensões totais. Após a libertação da compressão do LCE, que recupera completamente a sua s originaishape e tamanho. Acredita-se que a presença das porções de cristais líquidos no material LCE é crítico, como elastómeros preparados sob as mesmas condições sem o bloco -caprolactona ε colesterol não recuperam a sua forma original e recolhidas em si mesmos.

Uma vez que as espumas LCE foram obtidos, eles estavam prontos para ser semeada com neuroblastomas (SH-SY5Y), utilizando técnicas de cultura de células padrão. espumas LCE foram lavadas duas vezes em etanol a 70% e lavadas três vezes com PBS antes da sementeira celular. Dentro de 2-3 dias de sementeira de células, as células foram observadas para prender às paredes do LCE rede 3D. Para estudar completamente a ligação de células e expansão no interior da rede de LCE, as células foram fixadas após 30 dias (Figura 7). As células foram fixadas, coradas com DAPI, e visualizada utilizando microscopia confocal. As células foram encontrados a ter proliferado, em anexo, e expandida para cobrir amplamente a rede andaime LCE 3D. Mais distantemais análise, detalhada revelou alongamento núcleos de células, que na maioria dos casos não foi afectada pelas secções curvas da rede andaime LCE 3D. alongamento das células também pode ser correlacionada com o alinhamento das células e é muito provavelmente o resultado de o-A esmética característica de fase do LCE apresentada. Isto foi anteriormente observado em células C2C12 cultivadas após 14 dias 27. Neste estudo, mostramos que as células continuam a proliferar por mais de 14 dias; este não é restrita a células C2C12 sozinho. O uso das espumas LCE pode ser expandido para quase qualquer linha celular. As células que crescem em LCE 3D andaimes do tipo espuma beneficiar de uma maior eficiência de transporte de massa em comparação com andaimes 2D. Em andaimes 2D, as células normalmente crescem em camadas, no topo de um outro. As células que crescem nas camadas superiores são os únicos que têm acesso total a todos os nutrientes, gás e remoção de resíduos (transporte de massa). As células no interior das camadas mais baixas não são capazes de aceder nutrientes, e há um grau mais elevado de célula death neste caso. Dentro de suportes 3D, as células têm uma mais eficiente (em comparação com andaimes 2D) o acesso a nutrientes, factores de crescimento, e os gases, permitindo estudos celulares e de regeneração de tecido a longo prazo. a gestão de resíduos de células (remoção de resíduos) usando os LCE 3D andaimes do tipo espuma também é mais eficaz do que nos andaimes 2D. A porosidade (e / ou outras propriedades estruturais) dos LCEs permite o transporte de massa e rápido aumento da carga de células em comparação com menos porosas (ou outros), matrizes de meios que permitam o acesso e celular para as regiões centrais da matriz. Esta plataforma LCE é sintonizável para apoiar o crescimento de diversos tipos de linhas de culas primias e imortalizadas, incluindo músculo, nervo, e a pele, entre outros, bem como sistemas de cultura de multi-celulares. Essencialmente, este é um dos benefícios da plataforma, uma vez que pode ser usado para crescer muitos tipos e sistemas diferentes de células por longos períodos. Além disso, a capacidade de crescer várias camadas de células na construo mais estreitamente emulates ambientes naturais.

figura 1
Figura 1: Processo geral descrevendo a preparação passo a passo e a caracterização das espumas LCE. Consulte a seção de protocolo para detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: A reticulação esquema de SBC 3-braço. O esquema de reticulação do SBC 3-braço usando biscaprolactone ou HDI como agentes de reticulação na presença de um molde de metal de níquel para a preparação de espuma de LCEs como é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré.

Figura 3
Figura 3: Esquema de 1,2,3-triazol formação (bem sucedida "clique" reacção) seguido por 1 H RMN e FT-IV. O deslocamento do grupo de halogéneo pelo grupo azida é confirmado pelo aparecimento da 2,100 cm - uma banda utilizando reflectância total atenuada (ATR) FT-IR. A formação do anel de triazol é confirmada pelo desaparecimento de a-2100 cm - uma banda e a aparência de um singuleto, observada a 7,30 ppm no espectro de 1 H RMN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: imagens ópticasde diversas formas de espuma antes da reticulação. A espuma metálica é cortada e moldada para a forma desejável, tal como mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: espuma de níquel antes (A) e depois (B) reticulação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: morfologia espuma LCE observada usando microscopia electrónica de varrimento (MEV). Imagens representativas de SEM de espumas baseado no LCE-SBC (a e b) e à base de LBC (c d) utilizando Ni-860 como o modelo de metal são mostrados. As setas indicam suportes ocos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7: confocal micrografias exibindo núcleos DAPI-corados de culas SH-SY5Y em anexo para a espuma de elastómero 30 dias após a semeadura. Imagens 2D foram empilhadas na z -Direção, e imagens de secção transversal na xz - e -planes yz foram criados. As imagens mostram que as células SH-SY5Y (pontos brilhantes) ligados e expandidos dentro das paredes dos canais ocos na espuma de elastómero. As células espacialmente expandidos em várias camadas e estendido ao longo de 100 um, através da construção de (como mostrado na xz - e imagem -Plane yz seg transversalções). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

filme 1
Filme 1: As imagens de vídeo da deformação e recuperação de um rolo LCE. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Direito-clique para baixar).

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Discussion

elastómeros líquidos cristalinos têm sido recentemente estudada como andaimes de células biocompatíveis, devido à sua capacidade de resposta estímulos. Eles têm provado ser plataformas ideais como andaimes celulares. No entanto, um factor importante a ter em mente quando preparar e projetar um novo andaime LCE é a porosidade. A incorporação de sólidos lixiviáveis 23 ou gases nem sempre resultar em porosidade homogénea ou poros totalmente interconectados. O uso de um modelo de metal que pode ser gravado fora não só oferece a oportunidade de ter uma estrutura interna mais organizada e regular, mas também permite a seleção de tamanho de poros e densidade. Isto está directamente relacionado com o molde de metal previamente usado para a preparação de espumas de grafeno 22. modelos de metal também oferecem a oportunidade de formar formas antes de reticulação LCE, permitindo uma vasta gama de possibilidades para criar arquiteturas sofisticadas e complexas com regulares porosidade deassinado para se assemelham ambientes endógenos. LCEs espuma preparados utilizando esta metodologia permite o estudo melhorada do material da célula e, mais importante ainda, as interacções célula-célula espaciais, um feito não é possível dentro de ambientes bidimensionais (2D). andaimes celulares 2D não permitir que as células para interagir livremente com as células vizinhas. Além disso, as células normalmente crescem em monocamadas (ou directamente em cima uns dos outros), sem acesso completo para o espaço para o crescimento e, mais importante, para a interacção. tipos de células que interagem espacialmente específicas, tais como neurónios e células gliais, são de importância primordial na concepção de construções como potenciais implantes ou plataformas experimentais a longo prazo concebidas para espelhar sistemas vivos.

A nossa modular, síntese LCE livre de solvente usando um molde do metal, aqui apresentada, ajuda a ajustar a adesão celular por meio do ajuste do equilíbrio hidrofóbico / hidrofílico, escolhendo o nó central adequada e proporção de monómeros 7 27. Isto é relevante para a sementeira de células, a fim de evitar um passo extra que inclui a adição de uma camada de Matrigel, realiza para promover a fixação das células. A quantidade e tamanho de nó central, bem como o agente de reticulação, desempenham papéis críticos no LCE final, uma vez que afectam as propriedades térmicas e mecânicas dos elastómeros LC. Além disso, este também permite o ajuste das taxas de biodegradação, tal como apresentado antes, para se ajustar a regeneração completa do tecido como o LCE degrada 6. Actualmente, temos em curso experiências focando investigar como o tipo de agente de reticulação, do núcleo central, e a substituição de D, L -lactide para L -lactide afecta as propriedades elásticas, a adesão celular, proliferação, e o alinhamento das células.

As limitações deste protocolo são: (1) A variedade limitada de espumas de metal comercialmente disponível (níquel) e a sua gama limitada em dimensões suporte, (2) oexigência de que o LCE ou qualquer outro material polímero / elastómero deve quimicamente resistir às condições da corrosão de metal (aqui, uma etch FeCl3), e (3) o facto de que o alinhamento das células parece estar limitada aos elastómeros de cristal modificado líquidos aqui relatados (os elastómeros não-LCE-mãe não mostraram qualquer alinhamento celular significativa).

Em conclusão, demonstrou-se anteriormente que LCEs SmA pode ser preparado usando o nosso procedimento de síntese modular. LC porções biocompatíveis adicionais podem ser incorporados para explorar as suas propriedades mecânicas e novos efeitos liquidas cristalinas sobre a proliferação celular e, particularmente, o alinhamento das células. Sabe-se que as propriedades mecânicas, em especial valores de módulos de Young, são críticos para a adesão celular, proliferação, e o alinhamento das células. Os resultados aqui mostram que a porosidade de LCEs SmA pode ser ajustado através do uso de um molde de metal para proporcionar um meio eficaz para controlar o tamanho dos poros e para adaptar o LCEforma (morfologia ou seja, em geral). Imergindo o molde Ni na mistura de polímero SCB, seguido de condicionamento do molde Ni oferece uma abordagem simples para novas morfologias LCE. Os LCEs do tipo espuma aqui descritas proporcionam células (aqui, SH-SY5Y, um modelo padrão de células para o estudo da função neuronal) com um ambiente mais realista, 3D para o crescimento e interacção. Permitindo que vários tipos de células a crescer em múltiplas camadas dispersos por todo o elastômero imita ambientes neurais endógenas e oferece a possibilidade intrigante de mais sofisticadas experiências de cultura de tecidos em 3D. O uso de LCEs sintonizáveis ​​e dinâmicos para imitar arquitecturas nativas abre o caminho para os modelos celulares da próxima geração de estudos celulares longitudinais e clinicamente relevantes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer Kent State University (bolsa de pesquisa colaborativa e apoio à Iniciativa Medicina Regenerativa na Universidade Estadual Kent - ReMedIKS) pelo apoio financeiro deste projecto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane Alfa Aesar L16606 Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane TCI B0928 Reagent
2-chlorohexanone  Alfa Aesar A18613 Reagent
2-heptanone  Sigma Aldrich W254401 Solvent
2-propanol  Sigma Aldrich 278475 Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA Sigma Aldrich 273031 Reagent
4-dimethylaminopyridine Alfa Aesar A13016 Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI  Invitrogen D1306 Nuclear Stain
5-hexynoic acid  Alfa Aesar B25132-06 Reagent
Acetic acid VWR 36289 Solvent
Acetone Sigma Aldrich 34850 Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade  VWR 71001-866 Reagent
Benzene Alfa Aesar AA33290 Solvent
ε-caprolactone  Alfa Aesar A10299-0E Reagent
Chloroform VWR BDH1109 Solvent
Cholesterol Sigma Aldrich C8503 Reagent
Chromium(VI) oxide Sigma Aldrich 232653 Reagent
Copper(I) iodide Strem Chemicals 100211-060 Reagent
D,L-Lactide  Alfa Aesar L09026 Reagent
Dichloromethane Sigma Aldrich 320269 Solvent
Diethyl ether  Emd Millipore EX0190 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME  CORNING Cellgo 10-013 Cell Media
Ethanol Alfa Aesar 33361 Solvent
Formaldehyde  SIGMA Life Science F8775 Fixative
Fetal bovine serum, FBS  HyClone SH30071.01 Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe VWR 28320 Filtration
Glycerol Sigma Aldrich G5516 Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI Sigma Aldrich 52649 Crosslinker
Iron(III) chloride  Alfa Aesar 12357 Etching agent
Isopropyl alcohol VWR BDH1133 Solvent
Methanol Alfa Aesar L13255 Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide Aldrich D80002 Solvent
N,N-Dimethylformamide Sigma Aldrich 270547 Solvent
Nickel metal template American Elements Ni-860 Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y) ATCC CRL-2266 Cell line
Penicillin streptomycin  Thermo SCIENTIFIC 15140122 Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG Alfa Aesar B22181 Reagent
Sodium azide  VWR 97064-646 Reagent
Sodium bicarbonate AMRESCO 865 Drying salt
Sodium chloride BDH BDH9286 Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S-374 Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma Aldrich S9638 Drying salt
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313 Drying salt
Tetrahydrofuran Alfa Aesar 41819 Solvent
Thiosulfate de sodium AMRESCO 393 Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate Aldrich S3252 Reagent
Toluene Alfa Aesar 22903 Solvent
Triethylamine Sigma Aldrich 471283 Reagent
Trypsin HyClone SH30042.01 Cell Detachment
Olympus FV1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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