マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性

Immunology and Infection

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Schaaf, K., Smith, S. R., Hayley, V., Kutsch, O., Sun, J. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (121), e55453, doi:10.3791/55453 (2017).

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Abstract

Introduction

結核(TB)は、40年以上にわたって1用の抗結核化学療法レジメンの利用可能性にもかかわらず、世界的に深刻な健康への脅威のまま。これは、非準拠2を患者につながる複数の薬剤の組み合わせを使用して6ヶ月以上の長い治療期間の要件に一部起因します。近年の薬剤耐性結核の出現は、さらに臨床的に承認された医薬品の開発に成功が事実上存在しない3分野で問題を配合しました。確かに、徹底的な抗結核薬の開発にもかかわらず、唯一の単一の薬物は、FDAは、過去40年4臨床使用が承認されました。したがって、抗結核薬の新しい世代が緊急にこの問題に対処するために必要とされます。

結核治療薬の発見において重要な問題は、臨床設定における有効性へのin vitroでの活性を有する化合物からの転送成功の欠如であります= "外部参照"> 5、6、7。最初に、ターゲットベースのアプローチは、細菌細胞全体に変換することができなかった抗Mtbの薬剤 5をスクリーニングするために使用されました。 Mtbの細胞を用いた場合でも、それは多くの場合正確にインビボ 8,9 において薬効を予測していないブロス増殖させた培養物を用いて行われます。これらの問題は認識されているとのMtbを含むマクロファージまたは潜在性のMtbに対する薬物スクリーニングアッセイは、正常8に確立された、10、11、12。しかし、これらのより高度なアッセイは、薬は、非血管新生した肺病変における、および感染部位に壊死巣で遭遇する浸透障壁に十分な配慮を与えることはありません。確かにでも最初の行の結核治療薬のリファンピシンのため、次善の投与は、 生体組織や脳脊髄液(CSF) 不十分なに疑問視されている13、14、15だけでなく、細胞内のMtb 8、9に対して有効性を減少を浸透。このように、初期のリード開発プロセスの間に考慮に入れ、これらのパラメータを取る新モデルおよびアッセイは間違いなく結核治療薬の発見の努力を改善するであろう。

このニーズに応えるために、我々は最近、安価で迅速、かつMtbの薬効試験の16のためのBSL-2互換の代替感染モデルを確立しました。生理学的に関連する細胞透過障壁を再現し大マクロファージの結合構造体、および生成されたマクロファージ継代以内に密集したMtbの生産この感染モデルマウンテンバイクに似いる、変化した生理状態を持つメートル>マウンテンバイク。この感染モデルから派生したMtbは、他の細胞内感染モデルと一貫性のある結果を生成した薬効を評価するためにレサズリンマイクロタイターアッセイ(REMA)と合わせ、血清濃度に比べて高いCSF濃度を達成するための一般的な結核治療薬の報告能力とよく相関していました16。

ここでは、 マウンテンバイク /マクロファージの結合構造体の生成は、REMAを使用して、薬剤感受性試験に適したマクロファージ継代のMtbを生成するために、詳細に説明します。特に、我々は、この感染系を候補の抗結核薬のスループットスクリーニングとの互換性のために96ウェル形式に適合させることができる方法を示します。

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Protocol

:2 6206は、非病原性株17、18である結核菌の MCとしては、このプロトコルですべての作業は、バイオセーフティレベル2の施設(BSL-2)で行うことができます。

結核菌 MC 2を発現する緑色蛍光タンパク質1.培養条件6206( マウンテンバイク -GFP)

注: ヒト結核菌H37RvはpMN437がこのプロトコル16全体で使用されるプラスミドを発現するGFPで形質転換された栄養要求株MC 2 6206(ΔpanCD、ΔleuCD)由来しました。研究者のための歪みを簡単にアクセシビリティを有効にするには、野生型株を発現する非GFPのMtb -GFP株を代用することが可能です。しかし、GFP発現は、食作用とのMtb /マクロファージの凝集体の形成の視覚的確認を可能にすることが望ましいです。経度のためのGの長期保存、Mtbの -GFPを、20%グリセロールを補充し(ステップ1.1参照)完全7H9培地中で-80℃で凍結しました。

  1. 10%ミドルOADC、0.02%チロキサポール、24μgの/ mLのD-パントテン酸、を50μg/ mLのL-ロイシンおよび50μg/ mLのハイグロマイシンBで7H9培地を補充することによって、完全なマウンテンバイク -GFPメディア(7H9-C)を準備
  2. マウンテンバイク -GFPの1つのバイアルを解凍し、30 mLの正方形の底PETGフラスコ中の7H9-Cの10 mLに追加します。
  3. ロータリーシェーカー(50回転)に37℃でインキュベートします。 OD 600が 1.0に達するまで(約5-8日)数日おきに光学密度測定(OD 600)を取ります。
  4. 0.2〜1.0の間のOD 600を維持するために必要に応じて希釈して継代培養。
  5. 感染のために、対数増殖期(OD 0.6から1の600)のMtb -GFPの確立された文化を使用します。塊状の文化を避けるために、水浴中のMtb培養フラスコを超音波処理(130 W; 3×5秒パルス)ONCeまたは週二回

2.培養条件 THP-1細胞

  1. 10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、および10mM HEPESを含むRPMI 1640培地を補充することによって、完全なTHP-1細胞培地(RPMI-C)を調製します。
  2. 5%CO 2の加湿雰囲気中37℃でT-75フラスコ中で細胞をインキュベートします。
  3. 血球計数器を用いて細胞数をカウントしたり、一日おきにフローサイトメトリーおよび0.1 mLの100万〜0.6の間の濃度でTHP-1細胞を維持します。

3.感染プロトコルのMtb /マクロファージ集計構造を生成するために、

  1. THP-1細胞調製物(96ウェルプレートあたり)
    1. 5分間250×gで遠心分離し、7×10 6 THP-1細胞。 7 mLのRPMI-Cでの再懸濁。
  2. MTB -GFP準備
    1. 遠心分離2.8×10 8 のMtb -GFPスイングバケット遠心分離機で3200×gで5分間のuOD 600 1.0 = 3×10 8個の細菌/ mLでの変換を歌います。
    2. ステップ3.2.1のようにRPMI-Cと遠心機で一回洗浄します。
    3. 10秒のための7 mLのRPMI-Cで再懸濁し、ボルテックス。
  3. 感染
    注:テンプレートについては、 図1を参照してください。
    1. 培地の蒸発を防ぐために、水のリムの行AとHと、列1および12に滅菌水200μLを加えることにより、96ウェルプレートを準備します。
    2. バックグラウンドコントロール(ブランク)用カラム2(G2へのB2)に200μLのRPMI-Cを追加します。
    3. 感染させるために、THP-1細胞懸濁液(ステップ3.1)へのMtb -GFP懸濁液(ステップ3.2)を追加し、ピペットでよく混ぜます。最終的なTHP-1細胞密度は、mL当たり5×10 5であり、感染の対応する多重度は40です。
    4. 25 mLのリザーバにTHP-1 / マウンテンバイク -GFP懸濁液を注ぎます。
    5. usin残りのすべての96ウェル(G11を通じてB3)にTHP-1 / マウンテンバイク -GFP懸濁液200μLを追加GAマルチチャンネルピペット。
      注:複数の96ウェルプレートで作業する場合は、定期的にさえ混合物を各ウェルに添加されていることを確認するために、リザーバ内の残りのTHP-1 / MTBサスペンションを再懸濁します。
    6. 7〜10日間、5%CO 2で37℃でインキュベートします。
    7. ゆっくりと100μLを除去することにより、2日おきにメディアを変更し、マルチチャンネルピペットを用いて100μLに予め温めたRPMI-Cを追加するだけでなく、静かにそれぞれの最上部からメディアを過ごしました。井戸を再懸濁し、ウェルの底にマウンテンバイク /マクロファージの凝集体を邪魔しないでください。
    8. 視覚のMtb /マクロファージの凝集体の大きさに着目し、毎日の蛍光顕微鏡(4-10X目的)によってウェルを調べます。日7-10では、 マウンテンバイク /マクロファージの凝集体は、薬物の効力試験(第4節)のために進行する(参考のために図2を参照)を十分に大きくなければなりません。
    9. 所望であれば、自動細胞イメージングシステムを用いて96ウェルのキャプチャー画像が嵌め込ま明視野およびGFPフィルターでマウンテンバイク /マクロファージ凝集体形成を文書化するために設定します。
      注:ユーザーが自動化されたイメージングシステムへのアクセスを持っていない場合は、代表ウェルの画像をGFPと明視野能力を有する任意の適切な顕微鏡を用いて撮影することができます。

マウンテンバイク /マクロファージ集約由来医薬品に対する効力のMtbを評価する4.成長阻害アッセイ

  1. 薬剤の準備(2薬剤のための三重の条件)
    注:テンプレートについては、 図1Aを参照てください。
    1. 独立した96ウェルプレートでは、G10までB2に7H9-Cメディアの125μLを追加します。
    2. ステップ4.2.4での希釈を考慮するために、7H9-Cの1mLに二重最高所望の最終濃度で、二つの薬剤を準備します。
    3. それぞれ三連の治療のために、ウェルB11-C11-D11とE11-F11-G11に各薬剤の250μLを追加します。
    4. マルチチャンネルピペットを使用して、連続希UTE試験薬物B10-G10にB11-G11から125μLを移動することで2倍。各ステップで5回ピペッティングすることによって混合します。
    5. プレートを横切って(右から左)の列に列から125μLを移動させ、カラム4の後に停止し続けます。
    6. カラム4を混合した後、廃棄物容器に125μLを捨てます。列2と3は、バックグラウンド(ブランク)とプラス成長コントロールなどの使用を可能にするために、任意の薬を含めることはできません。
      注:また、テスト薬剤のライブラリについては、図1(b)のテンプレートに従ってください。各96ウェルプレートは、単一の濃度で58の薬物を収容することができます。また、ステップ4.2.4で半分に希釈されるので、倍の所望の最終濃度を使用して、この薬物プレートを準備します。
  2. 薬物治療:
    1. Mtbを含む96ウェルプレートを取り出し、マクロファージ( のMtb /マクロファージ凝集体)-infected。
    2. 慎重にマルチチャンネルピペットを用いて、関連するすべてのウェル(G11を介してB2)をデカント。2段階の方法でこれを実行します。第一プレートを傾けることなく、150μLを削除してから、プレートを傾けるとウェルの底縁にピペットチップを挿入することにより、残りのメディア(〜50μL)を取り外します。 マウンテンバイク /マクロファージの凝集体がウェルの底に付着しているように、何の材料が失われてはなりません。
    3. 静かマウンテンバイク /マクロファージの凝集体を含むプレートに関連するすべてのウェル(G11を通じてB2)に7H9-Cメディアの100μLを追加します。
    4. マルチチャンネルピペットを用いて、感染プレートの対応するウェルに96ウェルプレート(ステップ4.1)を含む薬剤から100μLを移します。
    5. 密封された袋に入れて、37℃で3日間インキュベートします。

レサズリンマイクロタイターアッセイを使用して5薬効の定量

  1. H 2 O中の0.8mg / mLの最終濃度でレサズリン原液を準備し滅菌のため0.22μmの細孔径のPVDF膜を通して濾過。
  2. 1:1の比率で2レサズリンストック溶液、H 2 OおよびTween-80(H 2 O中20%溶液)を混合して溶液を作動レサズリン準備します。最終濃度は0.4 mg / mlでのレサズリン及び5%のTween-80です。
  3. 37℃で24時間、530 nm励起および590 nmの発光で30分毎に蛍光を読み取るためのプログラムは、プレートリーダーを使用してセットアップ。 37°Cにプリ暖かいプレートリーダー。
  4. マルチチャンネルピペットを用いて薬剤処理プレート(ステップ4.11)に関連するすべてのウェル(G11を通じてB2)にレサズリン作業溶液20μLを追加します。
  5. プレートリーダーでプレートを置き、ステップ5.3で設定プログラムを起動します。
    注:アッセイプレートの大量の処理を容易にするために、37℃のインキュベーター中でアッセイを開発し、単一の蛍光は24時間毎に読み出し実行するのに十分です。これはまた、運動やインキュベーション機能を備えたプレートリーダーへのアクセス権を持たないユーザーにも適用可能です。

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Representative Results

96ウェルプレートフォーマットにこの感染モデルを適合させるの頑健性を確認するために、ここでは、図に示したテンプレートに従ってリファンピシン(RIF)及びモキシフロキサシン(MOXI)に当社の96ウェル適応感染モデル由来のMtbの薬剤感受性を調べました1A。我々は、このアッセイの鍵のMtb /マクロファージ集合構造の発生を確実にスループットの互換性( 図1B)を可能にする、96ウェルプレートフォーマット( 図2)で生成することができることを実証します。マクロファージのMtb直接十分に特徴付けレサズリンマイクロタイターアッセイ( 図3)を使用して薬効試験のために使用することができ、このようにして製造継代。

レサズリンアッセイは、フッ素に青レサズリンを変換するために、代謝活性のMtbによって生成される酸化性の種に依存しているようにピンクレゾルフィンをescent、色、蛍光の変化は、細菌の増殖の量を決定するための代用マーカーとして使用することができます。 図3Aに、我々は、確実に、インキュベーションのわずか3日後に薬剤の非存在下で複製することができる生存のMtb細菌を検出するためのレサズリンアッセイ内の十分な感度があることを示しています。エンドポイントの色の変化を視覚的に確認が成長の唯一のおおよその評価であるが、我々は正確に動力学的にプレートリーダー( 図3B)を使用してレゾルフィンの蛍光代謝産物へレサズリン変換を測定することによって、これを定量化することができます。プラス成長制御(薬の不在)に正規化し、これらのデータを使用すると、マクロファージ継代のMtbに対する薬効を可視化するための感受性殺害曲線の計算( 図4)を可能にします。

ここで、 代表的な結果3 4は、90%の増殖阻害が観察された抗生物質の最低濃度として定義される最小発育阻止濃度(MIC)は、私たちの感染モデルに由来するのMtbに対する両方リファンピシンおよびモキシフロキサシンのためにより大きいを2μg/ mLであることを示しています。これは、私たちの感染モデルは、細胞内のMtb 8に対して決定MIC値に沿って複数のある抗Mtbの薬剤の有効性を予測し、これにより培養液成長した細菌細胞を使用して、ほとんどのMtbの薬剤感受性アッセイでは無視された拡散バリア特性を反映していることを示しています。

重要なことには、96ウェル形式で記載されたアッセイを用いて得られたデータは、我々が以前にマクロファージ継代のMtb 16に対するリファンピシンおよびモキシフロキサシンについて決定していたものに非常に匹敵する結果を示しました。


図1:薬物プレートレイアウト。ステップ4で使用される薬剤の挑戦板の(A)の例テンプレートこれは、8定義された濃度での三連のウェル中の二つの薬剤の並列テストを行うことができます。代表的な実験として、我々はそれぞれ、2μMおよび2.5μMで始まるリファンピシン(RIF)及びモキシフロキサシン(MOXI)を使用しました。 (B)スループットスクリーニングのための別のテンプレートは、単一濃度での58の化合物の試験の可能性を示すために提供されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:96ウェルプレート中のMtb /マクロファージの結合構造体の生成フォーマット。 (A)代表明視野およびGFPは、9日目、感染後にマウンテンバイク -macrophage凝集体の画像を統合しました。画像は3個別に撮影した画像によって3のモンタージュを縫合することにより、ウェル全体を文書化し、自動細胞イメージングプログラムを使用して、4倍の対物レンズで撮影しました。 (B)(A)に示す視野から個々の非ステッチ画像。 (C)代表は、明視野と10倍の対物レンズで撮影したMtb /マクロファージ凝集構造のGFPの画像を統合しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3 のMtbの生存率を測定するためにレサズリンマイクロタイターアッセイを使用して。 (A)viablの存在E のMtb細胞は単にピンク、還元型の青レサズリン色素を変換することによって決定することができます。代表的な結果を図1Aのテンプレートに従ってリファンピシン(RIF)及びモキシフロキサシン(MOXI)を使用して、ここに示されています。 5.代表的なミニグラフは時間(Xに対する相対蛍光単位(y軸)を示す工程で説明したように定量レサズリン変換を測定するために(B)は 、個々のウェル( 図3Aに対応する)の蛍光を24時間動力学的にモニターしました-軸)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:REMAデータから曲線を殺す薬剤感受性を決定します。最大resaz時の相対蛍光単位(A)リファンピシンと( 図3B)から(B)モキシフロキサシン処理したウェル中urin信号は、100%の生存率などの薬物なしのコントロール(最大のMtb成長)に標準化しました。バックグラウンドコントロールは、(空白)の信号は、すべてのサンプルウェルから差し引きました。生存率は殺傷曲線を生成するための薬物治療のそれぞれの個々の濃度に対してプロットしました。この図のデータは、3つの独立した実験の平均±SDを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、詳細に薬効試験に適した代替のMtb感染モデルを説明してきました。このモデルは、アカウント初期の結核治療薬の開発プロセスの間に、より配慮を与えられるべき二つの重要な要因を考慮に入れる:薬剤浸透と感染時のMtbの代謝変化に生理学的に関連の障壁の存在。我々は以前に私たちの感染モデルの利点を示し、スループットの互換性16のために感染を拡大する可能性を提案しているが、ここでは、これは、96ウェルプレートフォーマットに直接システムを適応させることによって、実際に達成可能であることを示しています。それがピペットに対して要件が削除され、凝集体のサイズがサイズに達することができるように本質的に困難であり、個々のウェルに大きな培養フラスコから凝集体を分散としてのMtb /マクロファージを生成する能力は、96ウェルプレート中で直接凝集有利です> 500ミクロン。感染したマクロファージの凝集体の大きなサイズは、それがヒントを詰まらせることになるのいずれか、または大規模なピペッティングは、凝集体をばらばらになるようスループットアッセイのために必要であるP200マルチチャンネルピペットの使用を防止するであろう。 96ウェルプレートにこの感染系の改変は必要と操作手順の量を低減したMtb /マクロファージの凝集物の同量を有する均一な井戸を生成します。このように、このアッセイ系は、in vivoでのリード候補化合物の有効性を予測するだけでなく、開発プロセスの初期段階において特に有益であるが、薬剤ライブラリのスループットスクリーニングです。

説明感染モデルの重要な利点は、BSL-2互換のMtb株の利用です。 BSL-2の条件で動作する能力は、非常に費用対効果のあるプロトコルの処理を高速化し、そして最も重要な実行するためにBSL-3施設へのアクセスを持っていない研究室を可能にしますSEは、薬物スクリーニングアッセイを進めました。利用栄養要求性のMtb MC 2 6206株は、薬剤抵抗性または耐性16には影響与えません4遺伝子、panCDleuCDが、すべてを保持菌H37Rv 17、18の誘導体です。このようなM.ボビス BCGおよびM.はsmegmatisのような他の一般的に使用されるのMtbサロゲートと比較すると、Mtbの MC 2 6206は、最も密接にマウンテンバイク菌H37Rv、病因研究のための参照株を病原性に関係します。重要なことは、BCGには存在しないとのMtb毒性および肉芽腫形成を19に主要な役割を果たしているRD-1遺伝子座を維持します。比較的、 マウンテンバイクの MC 2 6206はまた、 マウンテンバイクからゲノム異なり、急成長している種であり、異なる抗生物質耐性プロファイルを持つM.スメグマチス 、よりTB-薬剤開発アッセイのためのより適切です。

ここに記載のアッセイはまた、柔軟性の高いレベルに貴重なものです。我々は( 図3)だけでなく、全体の薬物ライブラリ( 図1B)のスクリーニングのために示されているようのMtb /マクロファージの凝集体を含有する96ウェルプレートに限らず三連での薬物治療の滴定のために使用することができます。単一の濃度で、各96ウェルプレートは、58の化合物をスクリーニングすることができます。感染システムは、我々は唯一の細菌が3日間複製することを可能にした後、強いレサズリン信号を得るという事実ことに基づいて完全に実現可能である384ウェルプレートに適合されている場合は、この数は大幅に> 300の化合物に増加するであろう。実際には、384ウェルプレートフォーマットに、このシステムを適応させることは比較的簡単であろう、より小さいウェル形式に適合するように比例的にボリュームをダウンスケーリング以外のものとして、プロトコルの大部分は不変のままです。レサズリンアッセイのための適切な信号を有効にするには、それがあってもよいです十分な細菌複製を可能にするために、7日にステップ4.2.5でのインキュベーションを拡張するために必要。

マウンテンバイクの生存率のための読み出しとしてレサズリンアッセイと、この感染モデルを結合することは多くの利点、すなわち、その費用対効果で迅速なアッセイプロトコルなどBACTEC 460 20などの他のゴールドスタンダードシステムに匹敵する結果を得ながら、を有しているが、それにもかかわらず、いくつかの制限があります。それが唯一の代謝活性を測定するため、レサズリンアッセイは、静菌及び殺菌薬とを区別することはできません。これは、代謝活性が潜在Mtbの中で本質的に低いので、心に留めておくべき重要な制約です。しかし、このアッセイの重要なコンポーネントは、レサズリンアッセイ以外のMtb薬剤感受性に対するリードアウトと互換性を持つことができる感染モデル、です。例えば、薬物治療の後、ウェルを直接金スタン、コロニーユニット形成(CFU)計数のためにプレーティングすることができ(これはスループットスクリーニングとの互換性はありませんが)の化合物の殺菌活性を試験するための準の。あるいは、このシステムは、21のカウントCFUと密接に相関することが示されているのMtbを 、ルシフェラーゼを発現するように結合することができます。薬剤感受性を測定するためのルシフェラーゼシステムを利用するには、プロトコルへの唯一の2つの変更が必要とされるであろう: のMtb -ルシフェラーゼおよびステップ5でのレサズリンの代わりに明るい-グロルシフェリン試薬のii)の使用とのMtb -GFPのⅰ)交換。かなり384ウェルプレートフォーマットに容易に適合することになるレベルまでアッセイ感度を増加させながらのMtbを 30分にアッセイの開発を短縮するであろう発現ルシフェラーゼの使用。

要約すると、我々は、この感染の比較的少ない操作工程を有する96ウェルプレートフォーマットにモデル、高い再現性、および出発の無限の量を生産する能力を正常に移行しました材料、スループットの互換性のすべてのキーファクター。このアッセイはまた、多くの異なるフォーマットに容易に適合可能であるとアウトを読んで、それ早期のMtb創薬プロセスへの貴重な資産となっています。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
7H9 BD Difco 271310 Follow manufacturer's recommendations
Middlebrook OADC BD Biosciences 212351
Tyloxapol Sigma T8761 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma P5710 Prepare 24 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
L-leucine MP Biomedicals 194694 Prepare 50 mg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Hygromycin B EMD Millipore 400051 Prepare 200 mg/mL stock solution in H2O
Nalgene Square PETG media bottle Thermo Fisher 2019-0030
RPMI 1640 media Hyclone SH30027.01
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S12450H
L-glutamine Corning MT25005CI
HEPES Hyclone SH30237.01
Cytation 3 plate reader Biotek Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope
Gen5 Software Biotek Recording and analysis of rezasurin coversion
Rifampicin  Fisher Scientific BP2679250 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Moxifloxacin Hydrochloride Acros Organics 457960010 Prepare 10 mg/mL stock solution in H2O
Resazurin Sodium Salt Sigma R7017 Prepare 800 μg/mL stock solution in H2O; filter sterilize
Tween-80 Fisher Scientific T164500 Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize

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References

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