تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fernandez-Perez, A., Munshi, N. V. Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts. J. Vis. Exp. (121), e55456, doi:10.3791/55456 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

والقلب هو أول جهاز وظيفي لتطوير في الجنين 1 و 2. بالتزامن مع الدورة الدموية، فإنه يوفر الأوكسجين والمغذيات، وآلية التخلص من النفايات خلال التنمية. بعد ثلاثة أسابيع من الإخصاب، وقلب الإنسان يدق للمرة الأولى، ويتم الحفاظ على التنظيم الصحيح من قبل العضلية (CMS). وبالتالي فإن خسارة لا رجعة فيها هذه الخلايا المتخصصة هي القضية الأساسية الكامنة وراء فشل القلب التدريجي. في حين أن بعض الكائنات الحية مثل الزرد والقيطم لديها القدرة على التجدد القلب، الكبار قلب الثدييات أكثر محدودية 3 و 5 و 6. وهكذا، وبالنظر إلى وظيفة حرجة من القلب، فإنه ليس من المدهش أن أمراض القلب هي السبب الرئيسي للوفاة في العالم، وهو ما يمثل 600،000 حالة وفاة في الولايات المتحدة وحدها 7. الrefore، العلاجات المستندة إلى الخلايا لإصلاح أو استبدال عضلة القلب جرح بكفاءة ذات الفائدة السريرية كبيرة.

وأظهرت الدراسة المنوية من ياماناكا وزملاؤه 8 هذا التعبير القسري لأربعة عوامل النسخ غير كافية لتحويل الخلايا الليفية متباينة تماما الخلايا الجذعية المحفزة. ومع ذلك، فإن قدرة مكون للأورام من جميع الاستراتيجيات الخلايا الجذعية المحفزة مصدر قلق بالغ في استخدامها لأغراض علاجية. هذا الدافع المجال العلمي للبحث عن طرق بديلة لتحورها الخلايا مع تجنب مرحلة المحفزة. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عدة مجموعات جدوى هذه الاستراتيجية من خلال عرض التحويل المباشر من الخلايا الليفية الماوس لالناجم عن خلايا تشبه cardiomyocyte (iCLMs) مع التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ Gata4، Mef2c، Tbx5، وفي وقت لاحق، Hand2 (GMT وGHMT ، على التوالي) 10. Furthermore، نفس الاستراتيجية لا يمكن أن يؤديها في الجسم الحي وفي الأنسجة المستمدة الإنسان 9 و 11 و 12. وقد أبرزت الدراسات الحديثة عوامل إضافية أو مسارات الإشارات التي يمكن التضمين لزيادة تحسين كفاءة إعادة برمجة القلب 13 و 14 و 15. أخذت معا، هذه الدراسات توضح إمكانات transdifferentiation موجهة لعلاجات التجدد. ومع ذلك، فإن انخفاض كفاءة CM برمجة، الآليات الجزيئية غير معروفة، واستنساخ يتعارض بسبب الاختلافات المنهجية 16، وطبيعة متجانسة من iCLMs تظل دون معالجة.

من أجل تقييم مباشرة iCLM عدم التجانس، قمنا بتصميم فحص وحيدة الخلية منفصلة وقوية للتعرف على تطوير قسيم عضلي والقلب specificatio النسبالخصائص اللازمة العضلية وظيفية اثنين ن. هناك على الأقل ثلاثة أنواع رئيسية من CM في قلب كما هو محدد حسب الموقع والخصائص الكهربائية فريدة من نوعها: الأذيني (AM)، البطين (VM) وجهاز تنظيم ضربات القلب (بعد الظهر) 17، 18، 19، 20. في مزيج مدبرة، فهي تسمح ضخ السليم من الدم. أثناء إصابة القلب، قد تتأثر واحد أو كل أنواع فرعية، وسيكون نوع من العلاج بالخلايا تحتاج إلى أن تعالج على أساس كل حالة على حدة. حاليا، تركز معظم الاستراتيجيات على الجيل العام للالعضلية، في حين يجري القيام به القليل من العمل لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم مواصفات النوع الفرعي.

تفاصيل الدراسة التالية كيفية قياس صحيح ساركومير منظمة تنظيما جيدا وتحديد مجموعة متنوعة من أنواع فرعية cardiomyocyte. باستخدام جهاز تنظيم ضربات القلب (PM) -specific الماوس المراسل، ونحن قادرون على تطبيق طنهج mmunocytochemical للتمييز الناجم عن myocytes مثل الأذيني (IAM)، الناجم عن myocytes مثل البطين (IVM)، والتي يسببها myocytes PM تشبه (مراقبي الشرطة الدوليين) 21. وبناء على ملاحظاتنا، فقط الخلايا التي تظهر منظمة قسيم عضلي قادرة على الضرب من تلقاء أنفسهم. هذه المنصة إعادة برمجة فريدة من نوعها تسمح لتقييم دور بعض المعلمات في منظمة قسيم عضلي، مواصفات النوع الفرعي، وكفاءة إعادة برمجة سم في قرار وحيد الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي الممارسات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مركز ساوث ويسترن الطبي UT.

1. عزل Hcn4-GFP E12.5 الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS)

  1. إنشاء التزاوج توقيتها بين متماثل الذكور Hcn4-GFP و CD-1 الإناث.
  2. التضحية أنثى الحوامل في E12.5 من القتل الرحيم ثاني أكسيد الكربون والتفكك عنق الرحم لاحق.
    1. إزالة قرون الرحم مع ملقط تشريح كما هو موضح سابقا 22، 23، ووضعها في طبق بيتري على الجليد مع المياه المالحة الفوسفات-1X (PBS) دون الكالسيوم 2+ أو المغنيسيوم 2+.
  3. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية معقمة.
    1. إزالة الأجنة من الرحم والسلوي الكيس باستخدام مقص وملقط تشريح. إبقاء المشيمة المرفقة لمعالجة أفضل. Pregnaالإقليم الشمالي CD-1 الإناث عادة تلد ما بين 10 و 14 الجراء.
    2. باستخدام ملقط التشريح، واتخاذ الأجنة المعزولة وبسرعة شطف لهم مرتين في 70٪ (ت / ت) ETOH.
      ملاحظة: يجب أن يكون يغسل سريع للحد من موت الخلايا.
    3. إزالة الرأس والأطراف، والذيل، والأعضاء الداخلية، بما في ذلك القلب من الأجنة المعزولة.
    4. وضع الأنسجة المتبقية في صحن 10 سم مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X واللحم المفروم ناعما باستخدام شفرة حلاقة معقمة لحوالي 1 ملم 3 الحجم.
    5. نقل الأنسجة المفروم في أنبوب مخروطي 50 مل مع برنامج تلفزيوني.
    6. تدور في 300 x ج لمدة 3 دقائق. نضح بعناية زائدة برنامج تلفزيوني.
    7. إضافة 1 مل من معقم 0.25٪ التربسين-EDTA في جنين. احتضان الخلايا في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة. بلطف مزيج أنبوب كل 4 دقائق. الإفراط في هضم الأنسجة من شأنه أن يخفض بشكل كبير من العائد.
    8. خليط الخلية دوامة في سرعة قصوى (3200 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ق.
    9. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الليفية في جنين وتخلط. مرشح رhrough خلية مصفاة 100 ميكرون باستخدام ماصة للمساعدة الخلايا من خلال مصفاة. الرجوع إلى الجدول رقم 1 لصياغة جميع وسائل اللاحقة.
    10. تدور في 300 x ج لمدة 4 دقائق. نضح بعناية طاف.
    11. إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الليفية جديدة في 3 أجنة ويسحن 6-10 مرات.
    12. لوحة الخلايا في 1 15 سم صحن زراعة الأنسجة لكل 3 أجنة أعد. الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
    13. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، واستبدال وسائل الإعلام مع 30 مل جديدة من وسائل الإعلام في لوحة. وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: التحقق من وجود Hcn4-GFP + تلوث الخلية تحت المجهر الفلورسنت. وينبغي أن تكون ثقافة GFP - وتصبح فقط GFP + على إعادة برمجة.
    14. في اليوم التالي، وخلايا الحصاد مع 3 مل من جديد قبل تحسنت 0.25٪ التربسين-EDTA. العد وتجميد الخلايا. عادة، وتجميد الخلايا في 3 × 10 6 خلايا لكل مليلتر. وyie المتوقعوينبغي أن تكون دينار 3 × 10 6 خلايا في جنين.

2. الارتجاعي إنتاج وإعادة برمجة

تحذير: البروتوكول التالي يتطلب إنتاج ومعالجة الفيروسات المعدية. نفذ الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية المستوى 2 تحت BSL-2 المبادئ التوجيهية وتقنية معقمة. استخدام التبييض 10٪ للتخلص من جميع المواد المعرضة للالفيروسات القهقرية.

  1. إنتاج الفيروس الارتجاعي وإعداد MEFS
    ملاحظة: بروتوكول التالي هو لإنتاج فيروسات في 6 لوحات جيدة والعدوى MEF في 24 لوحات جيدة. لغيرها من الأشكال، يرجى الرجوع إلى الجدول 2. ومطلي MEFS في يوم -1، لذلك سوف تحتاج توقيت ليتم التنسيق على نحو ملائم لكل تجربة (راجع القسم 2.3 والشكل 2).
    1. الحفاظ على خلايا حسب توصيات الشركة الصانعة بلات-E (PE). لفترة وجيزة، والخلايا ثقافة PE في DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 1 ميكروغرام / مل puromyCIN، 10 ميكروغرام / مل blasticidin، البنسلين، والستربتومايسين. خلايا مرور 4: 1 كل يومين عندما تصل الثقافة 70-90٪ confluency.
    2. اليوم -2: قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، البذور خلايا بلات-E في 1 × 10 6 خلايا / جيد على طبق من 6 جيدا في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن. وينبغي أن تكون خلايا 70-80٪ متموجة في وقت ترنسفكأيشن.
  2. ترنسفكأيشن باستخدام عامل ترنسفكأيشن التجاري.
    ملاحظة: يجب أن يكون الكواشف التجارية في درجة حرارة الغرفة (RT) قبل ترنسفكأيشن. لترنسفكأيشن الحمض النووي، وإضافة كل فيروسات DNA البلازميد بشكل فردي (G، H، M، و T) لتشكيل كوكتيل GHMT 9.
    1. اليوم -1: في أنبوب البوليسترين 15 مل المخروطية، مزيج 60 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل مع 6 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن في رد الفعل لشكل لوحة 6-جيدا. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: منذ كاشف ترنسفكأيشن المستخدمة هنا بربط البلاستيك، لDD مباشرة إلى وسائل الإعلام المصل خفض لتجنب أي انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن.
    2. إضافة ما مجموعه 2 ميكروغرام من GHMT كوكتيل في رد الفعل والاستفادة بلطف لأنها مزيج. لا الدوامة. احتضان رد فعل لمدة 15 دقيقة في RT.
    3. يضاف خليط من الخطوة 2.2.3 لخلايا PE بطريقة حكيمة انخفاض.
    4. احتضان الخلايا بلات-E transfected بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة. تسجيل وقت ترنسفكأيشن.
  3. البذر من Hcn4-GFP الخلايا الليفية الماوس الجنينية.
    1. 1 ساعة قبل الطلاء MEFS، وإعداد لوحة 24-جيدا لمناعية.
      1. إضافة فبرونيكتين ساترة 12 ملم لكل بئر.
      2. آبار معطف مع 300 ميكرولتر من محلول الكولاجين البقري (على سبيل المثال، SureCoat) واحتضان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. نضح حل طلاء مباشرة قبل الطلاء MEF.
    2. ذوبان الجليد قارورة المجمدة من Hcn4-GFP MEFS وغسل X1 مع fibrobl قبل حرارةوسائل الإعلام أست في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
    3. تحديد بقاء الخلية باستخدام استبعاد التريبان الأزرق أو الأصباغ مماثلة. احسب عدد خلايا قابلة للحياة لكل مليلتر من الثقافة باستخدام الصيغة التالية:
      خلايا قابلة للحياة٪ = [1.00 - (عدد الخلايا الزرقاء / عدد مجموع الخلايا)] × 100
      1. حساب العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة باستخدام الصيغة التالية:
        خلايا قابلة للحياة =٪ خلايا قابلة للحياة س عامل تخفيف س س 10000 الحجم الكلي للتعليق الخلية
    4. البذور 3 × 10 4 خلايا لكل بئر على 24 لوحة جيدا مع معدة مسبقا البقري الكولاجين حل فبرونيكتين ساترة.
  4. تنبيغ وإعادة برمجة MEFS
    ملاحظة: وفقا لمذكرات الشركة المصنعة، حافظت بشكل صحيح خلايا بلات-E تنتج من عيار متوسط 1 × 10 7 وحدات عدوى / مل. على الرغم من أن لا يقاس عيار مباشرة لكل تجربة، ودائما تضمن السيطرة GFP كبديل للكفاءة العدوى.التعبير عالية GFP وكثافة (GFP +> 95٪) يرتبط عادة مع نجاح الجيل بوساطة GHMT من iCLMs.
    1. اليوم 0: 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، تصفية المتوسطة فيروسات PE من خلال 0.45 ميكرون، حجم المسام خالية من التوتر السطحي السليلوز فلتر خلات ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل. بعناية تجديد الخلايا مع 2 مل من المتوسط ​​ترنسفكأيشن جديدة.
      ملاحظة: خلايا تنفصل بسهولة من لوحة إذا تم تغيير وسائل الإعلام بسرعة كبيرة.
    2. نضح في المتوسط ​​من MEFS مثقف وإضافة المتوسطة فيروسات جمعت حديثا. يجب أن تسفر عن 1.7 مل من وسائل الاعلام في بئر من لوحة 6 جيدا. إضافة ~ 800 ميكرولتر لكل بئر من 24 لوحة جيدا. العودة لوحة MEF إلى الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.
    3. يوم 1: كرر الخطوات من 2.4.1 و 2.4.2. تجاهل الخلايا بعد جمع فيروس 2 الثانية. العودة MEFS المصاب إلى الحاضنة والسماح لهم بقية ليلة وضحاها.
    4. يوم 2: 48 ساعة بعد الاستقراء، ونضح الخلية مكيفة وسائل الإعلام وغسل X1 مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 500 ميكرولتر قبل تحسنت وسائل الإعلام iCLM لكل بئر من 24 لوحة جيدا.
    5. استبدال وسائل الإعلام iCLM كل 2-3 أيام. لوحة العملية بعد 14 يوما تحريض الفيروسي ل(ICC) تحليل مناعية من إعادة برمجة القلب.

3. المناعية من MEFS برمجتها

  1. 14 يوما بعد الاستقراء، ونضح بعناية وسائل الإعلام.
  2. شطف كل جيدا مع 300 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. نضح الحل الزائد.
  3. إصلاح الخلايا مع 250 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) حل لكل بئر من 24 لوحة جيدا. احتضان 15 دقيقة في RT.
    ملاحظة: الثابتة الخلايا يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع قبل تلطيخ.
  4. خلايا Permeabilize عن طريق غسل الآبار X3 مع 300 ميكرولتر 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-TritonX 100 (PBST). احتضان 5 دقائق على RT بين يغسل. نضح الحل الزائد بعد غسل الماضي.
  5. كتلة ل10دقيقة في RT مع 1X العازلة كتلة العالمي في 300 ميكرولتر / جيد.
  6. إعداد عازلة تلطيخ (ICC): إضافة 1: 1 من برنامج تلفزيوني 1X 1X والعالمي عازلة تمنع. تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية واحتضان الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. الرجوع إلى قسم المادي للالتخفيفات الموصى بها.
    1. وصمة عار زوج واحد من الشرائح مع الماوس α-actinin، αGFP الدجاج، والأرانب NPPA الإدارة المتكاملة للآفات وتحديد الهوية والوصول.
    2. وصمة عار زوج واحد من الشرائح مع الماوس α-actinin، αGFP الدجاج، وMyl2 أرنب الإدارة المتكاملة للآفات والإدارة المتكاملة للناقلات تحديد الهوية.
  7. في اليوم التالي، وغسل الآبار X3 مع 300 ميكرولتر 0.1٪ PBST. احتضان 5 دقائق على RT بين يغسل. نضح الحل الزائد بعد غسل الماضي.
  8. إعداد التخفيفات الأجسام المضادة الثانوية في المخزن تلطيخ للمحكمة الجنائية الدولية. الرجوع إلى قسم المادي للالتخفيفات الموصى بها. احتضان الأجسام المضادة الثانوية 1 ساعة عند RT، محمية من الضوء.
    1. وصمة عار كافة الشرائح مع antibodie الثانوية التاليةالصورة: الفأر اليكسا-555، الدجاج اليكسا-488، وأرنب اليكسا-647.
  9. غسل الآبار X3 مع 300 ميكرولتر 0.1٪ PBST. احتضان 5 دقائق على RT بين يغسل. احم من الضوء.
  10. إضافة 2.4 ميكرولتر من وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي 1.5 ميكروغرام / مل من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) إلى شريحة المجهر والزجاج. إزالة بعناية ساترة من البئر من 24 لوحة جيدا، وإزالة حل الزائد، ونقل إلى شريحة زجاجية مع وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. اضغط بلطف ساترة لإزالة حجم الزائد والهواء.
  11. الشرائح ختم بطلاء الأظافر المفضل أو تسرب من البلاستيك. متجر شنت الشرائح في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

4. تحديد الأنواع الفرعية للقلب عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

ملاحظة: للحصول على التصوير، والمجهر متحد البؤر مجهزة على الأقل 2 للكشف عن الفلورسنت قادرة على الكشف الطيفي في 405، 488، 555، و 639 نانومتر موجات هو ضروري من أجل تحديد مراقبي الشرطة الدوليين، علماء المسلمين، وIVMS. ايماجخلايا البريد باستخدام الهدف بخطة امزيغ 20X / 0.75 أو أفضل منه. باستخدام برمجيات تحليل الصور الشركة المصنعة، ومسح الصور التكبير يمكن تحقيق 40X النفط صور ذات جودة الغمر.

  1. مكتبة الصور: تأخذ الصور 8 بت مع دابي، اليكسا-488، اليكسا-555، واليكسا-647 قنوات (الفصل). بكسل يسكن الوقت من 6 ق، 1024 حجم الإطار، خطوة خط في 2، والمتوسط ​​من 2 يكفي لصور عالية الدقة.
  2. لكل شريحة، تبدأ من حافة واحدة وبدء المسح الضوئي صعودا وهبوطا في القناة الحمراء الفلورسنت (الفصل) لα-actinin + قسيم عضلي + الخلايا (راجع الشكل 3 والشكل 5A على سبيل المثال). التصدعات قسيم عضلي هي أسهل لتحديد بصريا في الطول الموجي 555 نانومتر.
    1. مرة واحدة وقد تم التعرف على-actinin α + خلية + قسيم عضلي، والتحول إلى الفصل الأخضر. والحفاظ على مذكرة إذا كانت إيجابية (IPM). التبديل إلى جهاز الكمبيوتر لتقييم بعيدة الحمراء 647 الفصل. (IAM أو IVM).
      ملاحظة: الخلايا التي هي يتم تصنيفها مراقبي الشرطة الدوليين - α-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2. سيتبين GFP التعبير في جميع أنحاء الخلية (الشكل 4A).
    2. الشرائح وصمة عار مع α-actinin (الماوس Alexa555)، Hcn4-GFP (الدجاجة Alexa488)، NPPA (أرنب Alexa647)، ودابي. الخلايا التي هي ألفا-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / + NPPA هي IAM. ستظهر NPPA تلطيخ محيط بالنواة والمنقط (الشكل 4B).
    3. الشرائح وصمة عار مع α-actinin (الماوس Alexa555)، Hcn4-GFP (الدجاجة Alexa488)، Myl2 (أرنب Alexa647). خلايا إيجابية لα-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / + Myl2 هي IVMS. سوف Myl2 تلطيخ تظهر على شكل المخططة على طول خيوط قسيم عضلي. بسبب الاختلافات في نوعية تلطيخ وZ-الطائرة، التصدعات قد لا تكون دائما مرئية بسهولة (الشكل 4C).

= "jove_title"> 5. تحديد الكميات

ملاحظة: من أجل تقييم العدد الفعلي للMEFS يحتمل برمجتها، هي المصنفة 2 الآبار من 24 لوحة جيدا بالتوازي مع الآبار التجريبية ويتم حصادها بعد يوم واحد الطلاء. ثم يتم تحديد العدد الكلي للخلايا مطلي عن طريق حساب متوسط ​​البئرين. هذا يصبح مجموع الخلايا الفعلية مطلي (aTotal).

  1. قسيم عضلي +
    1. تفقد البصر كل خلية في ساترة لالسليم α-actinin + / + قسيم عضلي (لوحات اليمين الشكل 3) وسجل (الشكل 5B-ط).
    2. جدولة عدد من α-actinin + / + قسيم عضلي على كل ساترة والقسمة على مجموع الخلايا الفعلية مطلي (aTotal) (الشكل 5B-ج). على سبيل المثال، إذا aTotal = 12500 الخلايا، و 100 خلايا تم ألفا Actinin + / + قسيم عضلي ذلك الحين، تم برمجتها 0.8٪ من MEFS مطلي. معدلسوف reprograming التجربة تسفر عن 1٪ α-Actinin + / + قسيم عضلي الخلايا (الشكل 5C).
  2. نوع فرعي +
    ملاحظة: للحصول على الخطوات التالية، انظر الشكل 5B / C لسير عمل iCLM الكمي التمثيلي. لفترة وجيزة، لكل قسيم عضلي + خلية، جدولة إذا أنها فريدة من نوعها لأي نوع فرعي (الشكل 5B-ط). احسب٪ النوع الفرعي (الشكل 5B-ج) من خلال قسمة عدد من سلالة + الخلايا على مدى متوسط قسيم عضلي + خلايا × 100 (الشكل 5B-ط). لحساب المطلقة كفاءة٪ سلالة (الشكل 5B-IV)، تقسيم فرعي + خلية عدد من الشكل 5B-ط من العدد الكلي للخلايا المصنف × 100 (الشكل 5B-ب).
    1. لكل من α-actinin خلايا + / + قسيم عضلي، وتقييم إذا كانت GFP NPPA أو Myl2
    2. جدولة عدد من α-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / NPPA وα-actinin + / قسيم عضلي + / Hnc4-GFP - / Myl2 + الخلايا (الشكل 5B-ط).
    3. لحساب النسبة المئوية من كل سلالة، وتقسيم عدد من نوع فرعي + الخلايا عن طريق عدد من α-actinin + / + قسيم عضلي الخلايا في ذلك بشكل جيد ومضاعفة 100. GHMT يولد مراقبي الشرطة الدوليين، علماء المسلمين، وIVMS نسب متساوية تقريبا (الشكل 5B-ج).
    4. لحساب العدد المطلق للسلالة + الخلايا، تقسيم العدد الإجمالي للسلالة + خلايا لحالة تجريبية من aTotal وضرب من قبل 100 (الشكل 5B-ب). على تمثيل المتوسط ​​مراقبي الشرطة الدوليين 0.3٪ من إجمالي عدد السكان الخلية المصابة، علماء المسلمين بنسبة 0.3٪، وIVMS 0.25٪ (الشكل 5B-IV).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستفادة من الفأرة مراسل PM محددة، وضعنا استراتيجية المناعية متعددة لتحديد myocytes الذاتية المتنوعة كما هو مبين في الشكل 1. باتباع الخطوات برمجة هو مبين في الشكل 2، تحريض CMS-سلالة معينة يمكن أن يتم الكشف في وقت مبكر من يوم 4 21، وإن كان بمعدل منخفض. يوم 14، وتجربة يمكن وقفها وتقييم لمنظمة قسيم عضلي (الشكل 3) والنوع الفرعي للمواصفات (الشكل 4). ويلخص الشكل 5 سير العمل من إعداد شريحة لمحكمة الجنائية الدولية (رقم 5 لوحة أ)، وتقدير حجم iCLM الخلايا سلالة معينة (الشكل 5 لوحة B / C).

شكل 1
الشكل 1: نوع فرعي تنوع الذاتيةالعضلية. (AB) سيتولوجية مناعية (ICC) تلطيخ الخلايا العضلية الأذينية حديثي الولادة من الفئران مراسل Hcn4-GFP لα-actinin (علامة قسيم عضلي والأحمر)، Hcn4-GFP (PM علامة والأخضر)، وNPPA (الأذيني علامة والبرتقالي). (C) تلطيخ سيتولوجية مناعية العضلية البطين الأطفال حديثي الولادة من الفئران مراسل Hcn4-GFP لα-actinin (علامة قسيم عضلي والأحمر)، Hcn4-GFP (PM علامة والأخضر)، وMyl2 (البطين علامة والبرتقالي). دابي (الأزرق): تلطيخ النووي. أشرطة النطاق: 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إعادة برمجة الجدول الزمني التخطيطي. التمثيل التخطيطي يسببها GHMT-MEFS Hcn4-GFP. وصفت ثلاث مراحل رئيسية.

الشكل (3)
الشكل (3): درجة من منظمة قسيم عضلي. الجنائية الدولية تلطيخ Hcn4-GFP MEFS 14 يوما بعد GHMT التنبيغ لα-actinin (قسيم عضلي علامة، أحمر) يظهر مجموعة متنوعة من منظمة قسيم عضلي. ازدياد درجة التنظيم من اليسار إلى لوحات اليمين. صور تمثيلية من كل مستوى (ن = 3). شريط الحجم: 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: نوع فرعي محددة برمجتها Cardiomyo cytes. (AC) للمحكمة الجنائية الدولية تلطيخ transduced GHMT-Hcn4-GFP MEFS لα-actinin (قسيم عضلي علامة، أحمر)، Hcn4-GFP (PM علامة والأخضر)، NPPA (علامة الأذيني والبرتقالي)، أو Myl2 (علامة البطين والبرتقالي) . دابي (الأزرق): تلطيخ النووي. أشرطة النطاق: 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الحصول على الصور وتحليل سير العمل. التمثيل التخطيطي لتحليل الصور. لوحة ويصور ترتيب الأولوية لتعيين قسيم عضلي + ونوع فرعي-التحديد إلى خلية. اللوحة ب (من الأول إلى الرابع) و C تظهر النتائج المتوقعة من متوسط التجربة GHMT-iCLM. يتم عرض النقاط الرئيسية والصيغ باللون الأخضر.ام / ملفات / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وسائل الإعلام iCLM
مكون الحجم (مل) التركيز النهائي
DMEM 270
المتوسطة 199 90
FBS 50 10٪
الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم G 2.5 0.50٪
MEM فيتامين الحل 10
MEM الأحماض الأمينية 20
الأحماض الأمينية غير الأساسية 10
المضادات الحيوية Antimycotics 10
B-27 ملحق 10
الحرارة المعطل حصان المصل 25
نا-البيروفات 2.5 1.5 ملم
وسائل الإعلام بلات-E (PE)
مكون الحجم (مل) التركيز النهائي
DMEM 450
FBS 50 10٪
البنسلين / الستربتوميسين 5
بوروميسين 0.05 1 ميكروغرام / مل
Blasticidin 0.5 10 ميكروغرام / مل
الليفية المتوسطة (FB)
مكون الحجم (مل) التركيز النهائي
DMEM 450
FBS 50 10٪
البنسلين / الستربتوميسين 5
Glutamax 5
المتوسطة ترنسفكأيشن (TXF) - تمت تصفيتها (0.45 ميكرون)
مكون الحجم (مل) التركيز النهائي
DMEM 450
FBS 50 10٪
مناعية (ICC) عازلة تلطيخ
مكون الحجم (مل) التركيز النهائي
برنامج تلفزيوني 1X 5
1X العالمي عازلة تمنع 5

الجدول 1: الثقافة المتوسطة. ملخص جدول لإعداد عدة وسائل استخدمت خلال إعادة برمجة يسببها GHMT.

أ) البذر الخلية وترنسفكأيشن
طبق لوحة المساحة بالمتر المربع (سم 2) كثافة بذر (خلايا) متوسطة النمو (مل) المبلغ الإجمالي الحمض النووي ل transfect (ميكروغرام) ترنسفكأيشن الكاشف (ميكرولتر) انخفاض المصل وسائل الإعلام (ميكرولتر)
15 سم لوحة 152 1.00E + 06 20 25 75 600
10 سم لوحة 55 5.50E + 06 10 9 27 300
6 سم لوحة 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105
6 جيدا / X1 9 1.00E + 06 2 2 6 60
12 جيد / X1 4 4.00E + 05 1 0.5 1.5 15
24 جيد / X1 2 2.00E + 05 0.5 0.3 0.9 9
48 جيد / X1 1 1.70E + 05 0.25 0.15 0.45 4.5
ب) الخلايا الليفية البذر وتحريض
طبق لوحة الليفية كثافة البذر (بالملايين) وحدات العدوى تقريبية iCLM
6 سم لوحة 0،22-0،33 5.00E + 7 (~ 5 مل)
6 جيدا / X1 ،1-0،15 3.00E + 7 (~ 3 مل)
12 جيد / X1 0،04-0،06 1.30E + 7 (~ 1 مل)
24 جيد / X1 0،02-0،03 6.50E + 6 (~ 0.8 مل)
48 جيد 0،001-0،015 3.00E + 6 (~ 0.4 مل)

الجدول 2: البذر، ترنسفكأيشن والحث تنسيقات.(أ) ملخص الجدول لتصفيح وترنسفكأيشن من الخلايا. وحدة (ب) كثافة البذر والغرس والعدوى تقريبي (أو طاف الفيروسي) اللازمة للحث على MEFS إلى خلايا تشبه cardiomyocyte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتقدم هذه الدراسة استراتيجية لإعادة برمجة مباشرة لتحويل MEFS إلى مجموعة متنوعة من أنواع فرعية في القلب عن طريق التعبير بوساطة الارتجاعي من النسخ القلب العوامل Gata4، Mef2c، Tbx5، وHand2 (GHMT). باستخدام نهج المناعية تعدد الإرسال في توليفة مع الماوس مراسل PM محددة، ونحن قادرون على تحديد IAM، IVMS، ومراقبي الشرطة الدوليين في قرار خلية واحدة. مثل هذا الفحص يسمح لالتجريبية في نظام المختبر قادرة على عزل مساهمات من عوامل النسخ الفردية نحو التنوع سلالة والتنمية قسيم عضلي. في موازاة ذلك، وهذا يمكن أن تجلب البصيرة لعوامل النسخ الجديدة أو الجزيئات الصغيرة التي تحرف iCLMs نحو نسب معينة. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة لإنجاح هذا الاختبار. أدناه، نتناول تأثير عيار الفيروسية، نوعية الخلايا الليفية، وتحليل التصوير في تجربة iCLM العامة.

في دراستنا، ونحن خطة الإدارة البيئيةلوي ecotropic-الفيروسات القهقرية لإعادة برمجة MEFS E12.5. لاحظنا عيار فيروسات يرتبط ارتباطا مباشرا على نوعية الخلايا. ارتفاع عدد مرور (> 35) وتقنيات زراعة الفقيرة تؤثر بشدة على نوعية الجزيئات فيروسات. وبالتالي، هناك عدة اعتبارات أن نأخذ في الاعتبار. خلايا بلات-E لا تنتج VSV-G فيروس pseudotyped، وغير قادرة على الصمود أمام تنبيذ فائق أو تجميد دورات 24 و 25 وهكذا. من أجل الحفاظ على إطالة عمر الخلايا، فمن الضروري للحفاظ على المخزون مع اختيار المضادات الحيوية. ومع ذلك، ينبغي الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام الحرة المضادات الحيوية خلال الانتاج الفيروسية. في تجربتنا، وكاشف ترنسفكأيشن المستخدمة هنا يوفر أعلى كفاءة ترنسفكأيشن في الخلايا. إذا طرق ترنسفكأيشن الأخرى لاستخدامها، ويقارن بين التتر الفيروسية المنتجة أمر ضروري 26. على الرغم من أن هناك توصيات من قبل الشركة المصنعة لموسم الحصادوالفيروسية طاف 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، لاحظنا أن جولتين 24 ساعة حصاد محصول الكفاءة برمجة أعلى مع تجنب الآثار السامة المرتبطة عادة مع عيار أعلى محضرات الفيروسية. وعلاوة على ذلك، على الرغم من العديد من الدراسات أظهرت جدوى تجارية تركيز طاف الفيروسية 27، ونحن لم تستخدم هذه في بروتوكول لدينا العادية من أجل الحفاظ على إنتاجية أعلى.

بالإضافة إلى ارتفاع عيار الكوكتيلات الفيروسية، نوعية الخلايا الليفية ذات أهمية حاسمة لنجاح إعادة برمجة فحص 28. إذا تم توقيته بشكل صحيح، ينبغي أن تستخدم MEFS المعزولة حديثا نظرا لزيادة الكفاءة وذلك مقارنة مع الأسهم المجمدة. يمكن أن يكون ذلك متعلقا طبيعة الفيروسات، كما أنها في حاجة الى استضافة عالية التكاثري من أجل إدماج 29. بالإضافة إلى ذلك، كثافة البذر MEF تلعب دورا حاسما. لقد قمنا بإدراج جدول مع كثافة البذر المستخدمةفي تجاربنا (الجدول 2). وعلاوة على ذلك، الركض MEFS سوف تقلل إلى حد كبير كفاءة إعادة برمجة.

مناعية (ICC) هي أسلوبنا القياسية لتحليل منظمة قسيم عضلي ومواصفات النوع الفرعي. مع مساعدة من مراسل الماوس PM-GFP، كنا قادرين على تشكيل لجنة الأجسام المضادة للكشف عن ثلاثة أنواع فرعية القلب الرئيسية (AM، VM، وم). ولكن نظرا لضيق توافر أنواع الأجسام المضادة والحد من 4 قنوات على معيار متحد البؤر المجهر انشاء، هناك حاجة إلى اثنين coverslips في النوع الفرعي لقياس انتشار كافة أنواع فرعية ثلاثة. واحدة ساترة وصمة عار لα-Actinin / GFP (Hcn4) / Myl2، واحدة لα-Actinin / GFP (Hcn4) / NPPA. وبناء على ملاحظتنا السابقة أن هيكل الساركومير هو سمة مشتركة لجميع مضادة وشرط أساسي محتمل للمواصفات النوع الفرعي 21، الخطوة الأولى في تحليلنا هو تحديد قسيم عضلي +الخلايا. ومع ذلك، ونظرا لطبيعتها الذاتية، تحديد مستوى التنظيم قسيم عضلي وربما كان أصعب جزء من هذا الاختبار. وهذا يمكن أن تكون محدودة عن طريق حساب متوسط التحديد الكمي مراقب متعددة أو من خلال تطوير الحسابية البرمجيات خلية تجزئة لأتمتة عملية 30. استخدام الخلايا الذاتية كنقطة مرجعية، اكتشفنا عتبة لمنظمة تنظيما جيدا قسيم عضلي + ويستخدم هذا ليسجل iCLMs (الشكل 3). ونظرا لهذه المعايير، فإن متوسط التجربة تؤدي إلى 20-30٪ α-Actinin + خلايا ولكن فقط 1٪ وألفا Actinin + / + قسيم عضلي. من الخلايا قسيم عضلي + 1٪، ~ 30٪ ستكون NPPA Myl2 أو Hcn4-GFP +.

وبالنظر إلى أن العضلية معقدة من الناحية الهيكلية، التعبير الجيني على أساس السكان (على سبيل المثال QRT-PCR) أو التدفق الخلوي التحليلات لا يمكن التقاط الفصل الصرفي معقدةفي نفس الفئة التي تحدث أثناء iCLM إعادة برمجة. في المقابل، والتصحيح لقط والكالسيوم التصوير عابرة والمقايسات الفنية وحيدة الخلية صارمة للغاية، ولكن يحتاج المهارات والمعدات المتخصصة لإجراء هذه التجارب. وهكذا، فإن منهجية وصفها هي فريدة من نوعها من حيث أنه يوفر نهجا واضحة لدراسة المعلمات الهيكلية والوظيفية الرئيسية iCLM إعادة برمجة دون المساس بشكل كبير الإنتاجية.

وعلى الرغم من العديد من التطورات الحديثة في إعادة برمجة مباشرة، لا يزال هناك الكثير من العمل الذي يتعين القيام به لفهم الآليات الجزيئية التي تنظم إعادة برمجة القلب، وبشكل أكثر تحديدا، مواصفات النوع الفرعي. وسوف تصبح هذه الآليات أهمية خاصة لترجمة برمجة المباشرة عن التطبيقات السريرية. على هذا النحو، في هذه الدراسة وصفنا منصة قادرة على تحوير مباشرة المعلمات منفصلة لتقييم مساهمة تنمية قسيم عضلي، مواصفات النوع الفرعي، والنضج iCLM. Moreoالنسخة، وهذا النظام يمكن تطويرها للعمل في شكل عالية الإنتاجية مما يسمح للفحص معقدة من جزيئات صغيرة أو مصفوفات خارج الخلية لاتخاذ الخطوة التالية في أمراض القلب التجديدي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma D5796 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059 Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS) Sigma F2442 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher Scientific 41400-045 Component of iCLM media
MEM vitamin solution Thermo Fisher Scientific 11120-052 Component of iCLM media
MEM amino acids Thermo Fisher Scientific 1601149 Component of iCLM media
Non-Essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050 Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics Thermo Fisher Scientific 15240062 Component of iCLM media
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum Thermo Fisher Scientific 26050-088 Component of iCLM media
NaPyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-70 Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 1514022 Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin  Thermo Fisher Scientific A11139-03 Component of Plat-E media
Blasticidin   Gemini Bio-Products 400-128P Component of Plat-E media
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700 Zeiss For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent Promega E2692 Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985-070 Transfection reagent 
Polybrene Millipore TR-1003-G Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic CellBiolabs RV-101 Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA Thermo Fisher Scientific For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) Sigma A7811 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY Thermo Fisher Scientific A10262 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA  Abgent AP8534A Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG  ProteinTech 10906-1-AP Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Vector Labs H-1500 Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides Thermo Fisher Scientific 12-550-15 25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips NeuVitro Corp GG-12-1.5 Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM Thermo Fisher Scientific 09-740-106 For virus filtration
6 mL Syringes Covidien 8881516937 For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 Abcam AB150169 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)  Thermo Fisher Scientific A31573 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 Thermo Fisher Scientific A21422 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100 Sigma 93443-100ml For cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) Sigma D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent Thermo Fisher Scientific NC9495720 Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) Electro Microscopy Sciences  15710 Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates Olympus 25-260
6-well plates Genesee Scientific 25-105
24-well plates Genesee Scientific 25-107
10 cm Tissue culture dishes Corning 4239
15 cm  Tissue culture dishes Thermo Fisher Scientific 5442
15 mL Conical tubes Corning 4308
50 mL Conical tubes Corning 4249
0.4% Trypan blue solution Sigma T8154 For viability
Ethyl Alcohol 200 proof Thermo Fisher Scientific 7005
Bleach Thermo Fisher Scientific 6009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25, (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324, (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6, (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18, (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113, (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51, (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813, (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91, (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141, (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52, (5), 923-930 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics