Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Developmental Biology

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Fernandez-Perez, A., Munshi, N. V. Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts. J. Vis. Exp. (121), e55456, doi:10.3791/55456 (2017).

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Abstract

Introduction

Das Herz ist das erste funktionelle Organ im Embryo 1, 2 zu entwickeln. In Verbindung mit dem Kreislaufsystem, liefert sie Sauerstoff, Nährstoffe und einen Entsorgungsmechanismus bei der Entwicklung. Drei Wochen nach der Befruchtung, schlägt das menschliche Herz zum ersten Mal und seine angemessene Regelung wird gepflegt von Kardiomyozyten (CMs). Der irreversible Verlust dieser spezialisierten Zellen ist daher die grundlegende Frage progressive Herzinsuffizienz zugrunde liegen. Während einige Organismen wie Zebrafisch und Xenopus das Potential für kardiale Regeneration haben, ist der erwachsenen Säugetier - Herzen begrenzteren 3, 5, 6. Somit ist die kritische Funktion des Herzens gegeben, ist es nicht erstaunlich , dass Herzkrankheit die häufigste Todesursache in der Welt ist, für 600.000 Todesfälle in den Staaten 7 allein Vereinigten Buchhaltung. Dasrefore, zellbasierte Therapien effizient zu reparieren oder den verletzten Myokard sind von großem klinischem Interesse zu ersetzen.

Die bahnbrechenden Studie von Yamanaka und Kollegen 8 zeigte , dass erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren ausreichend ist vollständig differenzierten Fibroblasten - Zellen zu pluripotenten Stammzellen zu konvertieren. Allerdings hat die tumorigenen Kapazität aller pluripotenten Stammzellen Strategien war ein kritisches Problem bei der Verwendung für therapeutische Zwecke. Dies motivierte die wissenschaftlichen Bereich für alternative Methoden zu suchen, Zellen zu transdifferentiate während eine pluripotente Stadium vermieden werden. Kürzlich haben mehrere Gruppen die Durchführbarkeit dieser Strategie dargestellt durch direkte Umwandlung von Maus-Fibroblasten induzierten Kardiomyozyten-ähnliche Zellen (iCLMs) mit der ektopischen Expression des Transkriptionsanzeigefaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5, und später, Hand2 (GMT und GHMT bezeichnet) 9, 10. Furthermore kann dieselbe Strategie in vivo durchgeführt werden und in menschlichen Geweben 9, 11, 12. Jüngste Studien haben zusätzliche Faktoren oder Signalwege aufgezeigt , die weiter moduliert werden kann , um Herz Umprogrammierung Effizienz 13, 14, 15 zu verbessern. Zusammengenommen zeigen diese Studien das Potenzial gerichtet transdifferentiation für regenerative Therapien. Allerdings bleiben die geringe Effizienz der CM Umprogrammierung, die unbekannten molekularen Mechanismen, inkonsistente Reproduzierbarkeit aufgrund methodischer Unterschiede 16 und die Heterogenität der iCLMs unadressierte.

Um icLm Heterogenität direkt zu bewerten, haben wir eine diskrete und robuste Single-Cell-Test für die Identifizierung von Sarkomers Entwicklung und Herz-Linie specification-zwei notwendigen Eigenschaften von funktionellen Kardiomyozyten. Es gibt mindestens drei Haupttypen von CM im Herzen , wie durch ihre Lage und einzigartige elektrische Eigenschaften definiert: atrial (AM), ventrikuläre (VM) und Schrittmacher (PM) 17, 18, 19, 20. In einer konzertierten Kombination ermöglichen sie die richtige Pumpen von Blut. Während Herzverletzung, eine oder alle Subtypen betroffen sein könnten, und die Art der Zelltherapie müssten auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Derzeit konzentrieren sich die meisten Strategien auf die gesamte Generation von Kardiomyozyten, während wenig Arbeit, die molekularen Mechanismen zu studieren getan wird, um die Subtyp Spezifikation regelt.

Die folgende Studie beschreibt, wie man richtig gut organisierten Sarkomere zu quantifizieren und eine vielfältige Reihe von Kardiomyozyten Subtypen identifizieren. Mit Hilfe eines Schrittmachers (PM) -spezifische Reporter Maus, wir sind in der Lage ein i anwendenmmunocytochemical Ansatz zur Unterscheidung induzierte atriale artigen Myozyten (IAM), induzierte ventrikuläre artigen Myozyten (iVM) und induzierte PM-wie Myozyten (IPMS) 21. Basierend auf unseren Beobachtungen nur Zellen, die Sarkomers Organisation zeigen in der Lage sind spontan zu schlagen. Diese einzigartige Umprogrammierung Plattform ermöglicht es, die Rolle für die Beurteilung der bestimmter Parameter in Sarkomers Organisation, Subtyp-Spezifikation, und die Effizienz der CM Neuprogrammierung bei Einzelzellauflösung.

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Protocol

Alle experimentellen Verfahren Tier Praktiken beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am UT Southwestern Medical Center genehmigt.

1. Isolierung von HCN4-GFP E12,5 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)

  1. Richten Sie zeitlich Paarungen zwischen homozygot HCN4-GFP Männchen und CD-1-Weibchen.
  2. Sacrifice schwangere Frau bei E12,5 von Kohlendioxid Euthanasie und anschließende Zervikaldislokation.
    1. Entfernen Sie Gebärmutterhörner mit Pinzette als 22 zuvor beschrieben, 23, und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ oder Mg 2+.
  3. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Gewebekultur Haube steril Technik.
    1. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase Schere und Pinzette. Halten Sie die Plazenta für eine bessere Handhabung angebracht. pregnant CD-1 Weibchen normalerweise Geburt zwischen 10 und 14 Welpen geben.
    2. Mit einer Pinzette zu sezieren, nehmen die isolierten Embryonen und sie schnell zweimal in 70% spülen (v / v) EtOH.
      HINWEIS: Die Wäschen sollte schnell sein Zelltod zu minimieren.
    3. Entfernen Sie den Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und innere Organe, darunter das Herz aus den isolierten Embryonen.
    4. Legen Sie das verbleibende Gewebe in einem 10-cm - Schale mit 1 ml 1x PBS und fein zerkleinern und eine sterile Rasierklinge auf etwa 1 mm 3 in der Größe verwendet wird .
    5. Übertragen zerkleinerte Gewebe in ein 50 ml konisches Röhrchen mit PBS.
    6. Spin bei 300 g für 3 min. aspirieren vorsichtig überschüssige PBS.
    7. 1 mL steriler 0,25% Trypsin-EDTA pro Embryo. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig mischen das Rohr alle 4 Minuten. Über Verdauung des Gewebes wird die Ausbeute deutlich niedriger.
    8. Vortex Zellmischung bei maximaler Geschwindigkeit (3200 rpm) für 4 s.
    9. In 2 ml Fibroblasten-Medien pro Embryo und mischen. Filter turch einen 100 um Zellsieb mit einer Pipette die Zellen durch das Sieb zu unterstützen. Siehe Tabelle 1 für die Formulierung alle nachfolgenden Medien.
    10. Spin bei 300 g für 4 min. Sorgfältig absaugen Überstand.
    11. In 10 ml frischem Fibroblasten-Medien pro 3 Embryonen und verreiben 6-10 mal.
    12. Platte, die die Zellen in 1 15 cm Gewebekulturschale für alle 3 Embryonen hergestellt. Kultur über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
    13. Nach der Inkubation über Nacht ersetzen Sie die Medien mit frischen 30 ml Medium pro Platte. Legen Zellen wieder in den Inkubator über Nacht.
      HINWEIS: Überprüfen Sie für HCN4-GFP + Zellkontamination unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Kultur sollte GFP sein - und nur werden GFP + auf Neuprogrammierung.
    14. Am nächsten Tag Ernte Zellen mit 3 ml frischem vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA. Graf und Gefrierzellen. Typischerweise gefrier Zellen bei 3 x 10 6 Zellen pro mL. Die erwartete yield sollte 3 x 10 6 Zellen pro Embryo sein.

2. Retrovirus Produktion und Reprogrammierung

Achtung: Das folgende Protokoll erfordert die Herstellung und Handhabung von infektiösen Retroviren. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosafety Level 2 Schrank unter BSL-2-Richtlinien und sterile Technik. Verwenden Sie 10% Bleiche aller Materialien zu entsorgen ausgesetzt Retroviren.

  1. Retrovirus - Produktion und MEF Vorbereitung
    HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für die retrovirale Produktion in 6-Well-Platten und MEF-Infektion in 24-Well-Platten. Für andere Formate finden Sie in Tabelle 2. MEFs sind an Tag -1 überzogen, so dass das Timing abgestimmt für jedes Experiment in geeigneter Weise werden müssen (siehe Abschnitt 2.3 und Abbildung 2).
    1. Pflegen Plat-E (PE) Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In Kürze, Kultur PE-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt, 1 & mgr; g / mL puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, Penicillin und Streptomycin. Passage Zellen 1: 4 alle zwei Tage, wenn die Kultur 70-90% Konfluenz erreicht.
    2. Tag -2: Am Tag vor der Transfektion Samen Plat-E - Zellen bei 1 × 10 6 Zellen / Vertiefung auf einer 6-Well - Platte in Transfektionsmedien. Zellen sollten 70-80% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden.
  2. Transfektion Kommerzielle Transfektionsagens verwenden.
    HINWEIS: Die kommerziellen Reagenzien bei Raumtemperatur (RT) vor der Transfektion sein sollte. Für die DNA - Transfektion, für jede retrovirale Plasmid - DNA einzeln (G, H, M und T) 9 einen GHMT Cocktail zu bilden.
    1. Tag -1: In einem 15 ml konischen Polystyrolröhrchen, mischen 60 ul reduziert Serum - Medien mit 6 ul Transfektionsreagenz pro Reaktion für eine 6-Well - Plattenformat. Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Da das Transfektionsreagenz hier bindet an Kunststoffen, eindirekt mit dem reduzierten Serummedien dd jede Abnahme der Transfektionseffizienz zu vermeiden.
    2. In insgesamt 2 ug GHMT Cocktail pro Reaktion und klopfen Sie leicht zu mischen. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren der Reaktion für 15 min bei RT.
    3. In der Mischung aus Schritt 2.2.3 an die PE-Zellen in einer tropfenweise Art und Weise.
    4. Inkubieren der transfizierten Plat-E - Zellen über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Notieren Sie sich die Zeit der Transfektion.
  3. Seeding von HCN4-GFP embryonalen Maus - Fibroblasten.
    1. 1 h vor MEFs Plattierung, eine 24-Well-Platte für Immunzytochemie vorzubereiten.
      1. Fügen Sie eine 12 mm Fibronektin Deckglas pro Vertiefung.
      2. Coat Vertiefungen mit 300 & mgr; l Rinderkollagenlösung (zB surecoat) und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator für 1 h.
      3. Absaugen Beschichtungslösung unmittelbar vor der MEF-Beschichtung.
    2. Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen HCN4-GFP MEFs und waschen x1 mit vorgewärmten fibroblast Medien bei 500 xg für 5 min.
    3. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Trypanblau-Ausschluss oder ähnliche Farbstoffe verwendet. Berechne die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur mit der folgenden Formel:
      % Lebenden Zellen = [1,00 - (Anzahl der blauen Zellen / Anzahl der gesamten Zellen)] x 100
      1. Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung der folgenden Formel:
        Lebensfähige Zellen =% lebende Zellen x Verdünnungsfaktor x 10.000 x Gesamtvolumen der Zellsuspension
    4. Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 24 Vertiefungen mit zuvor hergestellten Rinder - Kollagen - Lösung-Fibronektin Deckglas.
  4. Transduction und Reprogrammierung von MEFs
    HINWEIS: Nach den Notizen des Herstellers richtig gepflegt Plat-E - Zellen produzieren einen durchschnittlichen Titer von 1 x 10 7 Infektion Einheiten / ml. Obwohl die Titer nicht direkt für jedes Experiment gemessen wird, wird ein GFP Steuerung immer als Surrogat für Infektionseffizienz enthalten.Hohe GFP - Expression und Intensität (GFP +> 95%) korreliert typischerweise mit erfolgreichen GHMT-vermittelte Erzeugung von iCLMs.
    1. Tag 0: 24 h nach der Transfektion, filtern das PE Medium retroviralen durch einen 0,45 & mgr; m Porengröße Tensid freie Celluloseacetat - Filter und in ein 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL. Sorgfältig Zellen mit 2 ml frischem Transfektionsmediums aufzufüllen.
      Hinweis: Zellen leicht von der Platte lösen, wenn Medien zu schnell geändert wird.
    2. Saugen Sie das Medium der kultivierten MEFs und fügen Sie den frisch retroviralen Medium gesammelt; es sollte 1,7 ml Medium pro Well einer 6-Well-Platte ergeben. In ~ 800 & mgr; l pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Zurück MEF Platte in den Inkubator und über Nacht inkubiert.
    3. Tag 1: Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 und 2.4.2. Entsorgen Sie Zellen nach der 2. Virussammlung. Zurück infizierten MEFs in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ruhen.
    4. Tag 2: 48 h nach der Induktion, aspirieren die Zelle konditionierten Medien und Wasch x1 mit 1x PBS. In 500 ul vorgewärmt icLm Medien pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.
    5. Ersetzen icLm Medien alle 2 - 3 Tage. Prozessplatte 14 Tage nach der viralen Induktion für Immunzytochemie (ICC) Analyse der kardialen Neuprogrammierung.

3. Immunfärbung von Reprogrammed MEFs

  1. 14-Tage nach der Induktion, aspirieren sorgfältig die Medien.
  2. Spülen Sie jede Vertiefung mit 300 & mgr; l eiskaltem 1x PBS. Absaugen überschüssige Lösung.
  3. Fix-Zellen mit 250 & mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubiere 15 Minuten bei RT.
    HINWEIS: - 2 Wochen vor Anfärbung Fixierte Zellen können 1 in PBS bei 4 ° C gelagert werden.
  4. Permeabilisierung Zellen durch Waschen Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBS-Triton X 100 (PBST). Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen.
  5. Block 10min bei RT mit 1x Universal-Block-Puffer bei 300 & mgr; l / Vertiefung.
  6. Bereiten Sie (ICC) Färbepuffers: 1: 1 von 1x PBS und 1x Universal-Blocking-Puffer. Verdünnen primäre Antikörper in ICC Färbepuffers und Inkubation Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen.
    1. Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen NPPA für iPM und iAM Identifikation.
    2. Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen Myl2 für iPM und iVM Identifikation.
  7. Am folgenden Tag waschen Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen.
  8. Bereiten Sie die sekundären Antikörper-Verdünnungen in ICC Färbepuffers. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. Inkubieren Sekundärantikörper 1 h bei RT, vor Licht geschützt.
    1. Stain alle Folien mit den folgenden sekundären antibodies: Maus Alexa-555, Huhn Alexa-488, und Kaninchen Alexa-647.
  9. Waschen Sie Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. Vor Licht schützen.
  10. Fügen 2,4 ul Eindeckmedien enthaltend 1,5 & mgr; g / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in ein Glasobjektträger. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Brunnen der 24-Well-Platte, entfernen Sie überschüssige Lösung und Transfer zum Glasträger mit Montage Medien. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas überschüssiges Volumen und Luft zu entfernen.
  11. Seal Folien mit bevorzugten Nagellack oder Kunststoff Versiegelung. Shop gerahmte Dias bei 4 ° C vor Licht geschützt.

4. Identifizierung von Cardiac-Formationsglieder mittels konfokaler Mikroskopie

HINWEIS: Für die Bildgebung, ein konfokales Mikroskop mit mindestens zwei Fluoreszenzdetektoren der Lage spektralen Detektion bei 405, 488, 555 und 639 nm Wellenlängen erforderlich ist, um IPMS, IAMS und IVMS zu identifizieren. Image-Zellen ein Plan-Apochromat 20x / 0,75 Ziel oder besser verwenden. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software des Herstellers, Scannen Zoom-Bilder 40X-Ölkapselung Bildqualität erreichen können.

  1. Bildarchiv: Nehmen Sie 8-Bit-Bilder mit DAPI, Alexa-488, Alexa-555 und Alexa-647-Kanäle (ch.). Pixel Verweilzeit von 6 s, 1024 Rahmengröße, Zeilen Schritt bei 2, und Mitteln von 2 reicht für hochauflösende Bilder.
  2. Für jede Folie, die von einem Rand beginnen und Scannen nach oben und unten in der roten Fluoreszenzkanal (ch.) Zur α-Actinin + Sarkomer + Zellen (Siehe 3 und 5A Beispiele Abbildung). Sarkomers Riefen sind leichter zu visuell in der 555 nm Wellenlänge zu identifizieren.
    1. Sobald ein α-Actinin + Sarkomer + Zelle identifiziert wurde, wechseln Sie in den grünen ch. und merken, wenn es positiv ist (ipm). Wechseln Sie auf dem Computer mit dem fernen Rot 647 ch zu beurteilen. (IAM oder iVM).
      HINWEIS: Die Zellen, dieα-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - als IPMS bezeichnet. GFP - Expression wird in der gesamten Zelle (4A) gesehen werden.
    2. Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), NPPA (Kaninchen-Alexa647) und DAPI. Zellen , die α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP sind - / NPPA + sind iAM. NPPA Färbung erscheint perinukleäre und punctata (4B).
    3. Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), Myl2 (Kaninchen-Alexa647). Zellen , die positiv für α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sind IVMS. Myl2 Färbung wird ein gestreiftes Form entlang der Sarkomers Filament aufweisen. Aufgrund von Schwankungen in der Qualität der Färbung und der Z-Ebene, Streifungen nicht immer leicht sichtbar (4C) liegen.

HINWEIS: Um die tatsächliche Anzahl der potenziell umprogrammiert MEFs, 2 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu bewerten sind parallel zu den experimentellen Vertiefungen ausgesät und 1 Tag geerntet nach der Plattierung. Die Gesamtzahl der plattierten Zellen wird dann durch Mittelung der zwei Vertiefungen bestimmt. Dies wird die tatsächliche Gesamt Zellen plattiert (Ages).

  1. Sarkomers +
    1. Sichtprüfung jede Zelle auf einem Deckglas für die richtige α-Actinin + / Sarkomer + (rechte Felder Abbildung 3) und Aufzeichnung (5B-i).
    2. Tabellieren die Gesamtzahl der α-Actinin + / + Sarkomer auf jedem Deckglas und dividieren durch die tatsächliche Gesamt Zellen ausplattiert (ATOTAL) (5B-iii). Wenn beispielsweise ATOTAL = 12.500 Zellen und 100 - Zellen wurden a-Actinin + / + Sarkomer dann 0,8% der plattierten MEFs wurden umprogrammiert. Ein Durchschnittreprograming Experiment Ausbeute 1% α-Actinin + / Sarkomer + Zellen (5C).
  2. Subtype +
    HINWEIS: Für die folgenden Schritte siehe 5B / C für eine repräsentative icLm Quantifizierung Workflow - Abbildung. Kurz gesagt, für jede Sarkomers + Zelle, tabellarisch , wenn es für beide Subtyp (5B-i) ist einzigartig. Berechnen% Subtype (5B-iii) , indem die Anzahl der Subtyp + Zellen über die durchschnittliche Sarkomers Dividieren + Zellen x 100 (5B-i). Um die absolute% Subtyps Wirkungsgrad (5B-iv) zu berechnen, unterteilen den Subtyp + Zellzahl von 5B-i durch die Gesamtzahl von Zellen ausgesät x 100 (5B-ii).
    1. Für jede der α-Actinin + / Sarkomer + Zellen, zu bewerten , ob sie GFP + sind, NPPA + oder Myl2
    2. Tabellieren Gesamtanzahl von α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / NPPA + und α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + Zellen (5B-i).
    3. Um den Prozentsatz von jedem Subtyp berechnen, teilen die Anzahl der Subtype + Zellen durch die Gesamtzahl von α-Actinin + / Sarkomer + -Zellen in das gut und multiplizieren mit 100. GHMT erzeugt IPMS, IAMS und IVMS in etwa gleichen Verhältnissen (Fig 5B-iii).
    4. Um die absolute Anzahl von Subtyp + Zellen zu berechnen, unterteilen die Gesamtzahl der Subtyp + Zellen für die experimentellen Bedingungen durch ATOTAL und multipliziere mit 100 (5B-ii). Im Durchschnitt IPMS 0,3% der gesamten infizierten Zellpopulation darstellen, Iams 0,3% undIVMS 0,25% (5B-iv).

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Representative Results

Unter Ausnutzung der PM-spezifischen Reporter - Maus, entwickelten wir eine multiplex Immunofärbung Strategie diverse endogene Myozyten zu identifizieren , wie in Abbildung 1 dargestellt. Im Anschluss können die Umprogrammierung Schritte in 2 gezeigt ist , die Induktion von Subtyp-spezifischen CMs so früh wie Tag nachgewiesen werden 4 21, wenn auch mit niedriger Rate. Bis zum Tag 14 kann das Experiment gestoppt und für Sarkomers Organisation (Abbildung 3) und Untertyp-Spezifikation (Abbildung 4) beurteilt werden. Abbildung 5 fasst den Workflow von Dia Vorbereitung auf die ICC (Abbildung 5 Panel A) und die Quantifizierung der icLm Subtyp-spezifischen Zellen (Abbildung 5 Feld B / C).

Abbildung 1
Abbildung 1: Subtype Vielfalt von EndogeneKardiomyozyten. (AB) Immunzytochemie (ICC) Färbung von Neugeborenen Vorhof Kardiomyozyten aus HCN4-GFP - Reporter - Mäuse für α-Actinin (Sarkomers Marker, rot), HCN4-GFP (PM Marker, grün) und NPPA (atrial Marker, orange). (C) Immunhistochemie - Färbung der Neugeborenen - Kardiomyozyten aus HCN4-GFP - Reporter - Mäuse für α-Actinin (Sarkomers Marker, rot), HCN4-GFP (PM Marker, grün) und Myl2 (ventrikuläre Marker, orange). DAPI (blau): Kernfärbung. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Schematische Schnitt Neuprogrammierung. Schematische Darstellung der GHMT-induzierten HCN4-GFP MEFs. Die drei Hauptstufen dargestellt.

Figur 3
Abbildung 3: Grad der Sarkomer Organisation. ICC-Färbung von HCN4-GFP MEF 14 Tage nach der GHMT Übertragung für α-Actinin (Sarkomers Marker, rot) zeigt eine breite Palette von Sarkomers Organisation. Der Organisationsgrad erhöht sich von links nach rechts Panels. Repräsentative Bilder eines jeden Levels (n = 3). Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Subtype spezifische Reprogrammed Cardiomyo zyten. (AC) ICC - Färbung von GHMT-transduzierten HCN4-GFP MEFs für α-Actinin (Sarkomers Marker, rot), HCN4-GFP (PM Marker, grün), NPPA (atrial Marker, orange) oder Myl2 (ventrikuläre Marker, orange) . DAPI (blau): Kernfärbung. Maßstabsbalken: 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Bildaufnahme und Analyse - Workflow. Schematische Darstellung für die Bildanalyse. Panel A zeigt die Prioritätsreihenfolge Sarkomers + und Subtyp-Spezifität zu einer Zelle zuzuweisen. Feld B (i-iv) und C zeigen die erwarteten Ergebnisse von durchschnittlich GHMT-icLm Experiment. Kernpunkte und Formeln sind in grün dargestellt.om / files / ftp_upload / 55456 / 55456fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

icLm Medien
Komponente Volumen (ml) Die Endkonzentration
DMEM 270
Medium 199 90
FBS 50 10%
Insulin-Transferrin-Selen G 2.5 0,50%
MEM Vitaminlösung 10 2%
MEM Amino Acids 20 4%
Nicht-essentielle Aminosäuren 10 2%
Antibiotika-Antimykotika 10 2%
B-27 Ergänzung 10 2%
Hitzeinaktiviertem Pferdeserum 25 5%
Na-Pyruvat 2.5 1,5 mM
Plat-E Medium (PE)
Komponente Volumen (ml) Die Endkonzentration
DMEM 450
FBS 50 10%
Penicillin / Streptomycin 5 1%
Puromycin 0,05 1 & mgr; g / mL
Blasticidin 0,5 10 ug / ml
Fibroblast Medium (FB)
Komponente0; Volumen (ml) Die Endkonzentration
DMEM 450
FBS 50 10%
Penicillin / Streptomycin 5 1%
Glutamax 5 1%
Transfektionsmediums (TxF) - Gefiltert (0,45 & mgr; m)
Komponente Volumen (ml) Die Endkonzentration
DMEM 450
FBS 50 10%
Immunzytochemie (ICC) Färbepuffers
Komponente Volumen (ml) Die Endkonzentration
1x PBS 5
1x Universal-Blocking-Puffer 5

Tabelle 1: Kulturmedium. Tabelle Zusammenfassung für die Herstellung der verschiedenen Medien verwendet, um während der GHMT-induzierte Reprogrammierung.

A) Cell Seeding und Transfektion
Platte / Teller Fläche (cm 2) Seeding Dichte (Zellen) Wachstumsmedium (ml) Die Gesamt - DNA Menge zu transfizieren (ug) Transfektionsreagenz (ul) Reduzierte Serum Medien (ul)
15 cm Platte 152 1,00E + 06 20 25 75 600
10 cm Platte 55 5.50E + 06 10 9 27 300
6 cm Platte 21 2.20E + 06 4 3.5 10.5 105
6 gut / x1 9 1,00E + 06 2 2 6 60
12 gut / x1 4 4.00E + 05 1 0,5 1.5 15
24 gut / x1 2 2.00E + 05 0,5 0,3 0,9 9
48 gut / x1 1 1.70E + 05 0,25 0,15 0,45 4.5
B) Fibroblast Säen und Induktion
Platte / Teller Fibroblast Aussaatdichte ( in Millionen) Ungefähre Infektion Einheiten für icLm
6 cm Platte 0,22-0,33 5.00E + 7 (~ 5 ml)
6 gut / x1 0,1-0,15 3.00E + 7 (~ 3 ml)
12 gut / x1 0,04-0,06 1.30E + 7 (~ 1 ml)
24 gut / x1 0,02-0,03 6.50E + 6 (~ 0,8 ml)
48 gut 0,001-0,015 3.00E + 6 (~ 0,4 ml)

Tabelle 2: Säen, Transfektion und Induktions - Formate.(A) Tabelle Zusammenfassung für die Beschichtung und die Transfektion von Zellen. (B) Säen Dichte und die ungefähre Infektion Einheiten (oder viralen Überstand) benötigt MEFs in Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen zu induzieren.

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Discussion

Die vorliegende Studie bietet einen Direkt Umprogrammierung Strategie zur Umwandlung von MEF in eine vielfältige Reihe von Herz-Subtypen durch Retrovirus-vermittelte Expression des kardialen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5 und Hand2 (GHMT). Unter Verwendung eines Multiplex-Immunfärbung Ansatz in Kombination mit einem PM-spezifischen Reporter Maus, sind wir in der Lage iAM zu identifizieren, IVMS und IPMS auf Einzelzellauflösung. Ein solcher Test ermöglicht eine experimentelle in vitro System in der Lage , die Beiträge der einzelnen Transkriptionsfaktoren zu Subtyp Vielfalt und Sarkomers Entwicklung zu isolieren. Parallel dazu könnte diese Erkenntnis bringen, um neue Transkriptionsfaktoren oder kleine Moleküle, die iCLMs zu einer bestimmten Linie vorspannen. Dennoch gibt es mehrere wichtige Schritte zur erfolgreichen Durchführung dieses Assays. Im Folgenden befassen wir uns mit den Auswirkungen der viralen Titer, Fibroblasten-Qualität und Bildanalyse in einem allgemeinen icLm Experiment.

In unserer Studie haben wir employ ekotropischen-Retroviren E12,5 MEFs neu zu programmieren. Wir bemerkten, der retrovirale Titer direkt auf die Qualität der Zellen in Zusammenhang steht. Hochpassagezahl (> 35) und schlechte Kultivierungstechniken beeinträchtigen stark die Qualität der retroviralen Partikeln; Daher gibt es verschiedene Überlegungen im Auge zu behalten. Plat-E - Zellen nicht VSV-G - pseudotypisierten Virus produzieren, und sind somit nicht in der Lage Ultrazentrifugation zu widerstehen oder Gefrierzyklen 24, 25. Um die Langlebigkeit der Zellen zu erhalten, ist es unerlässlich, den Bestand mit Antibiotika-Selektion zu halten. Allerdings sollten sie in der Antibiotika-freien Medien während der viralen Produktion aufrecht erhalten werden. In unserer Erfahrung verwendete Transfektionsreagenz hier bietet die höchste Transfektionseffizienz in Zellen. Wenn andere Transfektionsverfahren verwendet werden sollen, um die Virus - Titer erzeugt Vergleich ist wichtig , 26. Zwar gibt es Empfehlungen vom Hersteller sind zu erntender virale Überstand 48 h nach der Transfektion beobachtet, dass zwei 24-h Ernte Runden höhere Wirkungsgrade Umprogrammierung ergeben, während toxische Wirkungen vermieden werden üblicherweise mit höherer Titer viraler preps verbunden. Des Weiteren, obwohl mehrere Studien die Machbarkeit der kommerziellen viralen Überstand Konzentratoren 27 gezeigt haben, haben wir nicht diese in unseren regelmäßigen Protokoll, um einen höheren Durchsatz zu halten beschäftigt.

Neben der hohen Titer viraler Cocktails, ist Fibroblasten - Qualität von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Reprogrammierung Test 28. Wenn er richtig abgestimmt sind, frisch isolierten MEFs sollten aufgrund ihrer höheren Effizienz im Vergleich zu gefrorenem Bestände genutzt werden. Dies könnte auf die Art von Retroviren in Beziehung gesetzt werden, da sie eine hoch-proliferative Wirt benötigen , um 29 zu integrieren. Zusätzlich spielt MEF Einsaatdichte eine kritische Rolle. Wir haben eine Tabelle mit den Dichten verwendet Impfen enthaltenIn unseren Experimenten (Tabelle 2). Darüber hinaus wird die MEFs Passagierung deutlich Umprogrammierung Effizienz verringern.

Immunzytochemie (ICC) ist unser Standardverfahren zur Analyse von Sarkomers Organisation und Subtyp-Spezifikation. Mit Hilfe eines Reporter-Maus-PM-GFP, waren wir in der Lage, einen Antikörper-Panel für den Nachweis von drei großen Herz Subtypen (AM, VM und PM) zu bilden. Jedoch wegen Beschränkungen der Antikörperspezies, die Verfügbarkeit und die Begrenzung von 4-Kanälen auf einem Standard-Konfokalmikroskop Aufbau, zwei Deckgläser je Subtyp benötigt, um die Prävalenz der allen drei Subtypen zu quantifizieren. Einem Deckglas wird Fleck für α-Actinin / GFP (HCN4) / Myl2 und einer für α-Actinin / GFP (HCN4) / NPPA. Aufgrund unserer bisherigen Beobachtung , dass sarcomeric Struktur ein gemeinsames Merkmal aller CMs ist und eine mögliche Voraussetzung für den Subtyp Spezifikation 21, ist der erste Schritt in unserer Analyse die Bestimmung Sarkomers +Zellen. Doch aufgrund seiner subjektiven Natur, das Niveau der Sarkomers Organisation Gründung ist vielleicht der schwierigste Teil dieses Tests; dies kann durch Mittelung mehrerer Beobachter Quantifizierungen oder durch die Entwicklung von Rechenzelle Segmentierung Software zu automatisieren den Prozess 30 begrenzt werden. Unter Verwendung körpereigenen Zellen als Bezugspunkt, entdeckten wir eine Schwelle für die gut organisierten Sarkomers + und genutzt werden, dass iCLMs (Abbildung 3) zu erzielen. Aufgrund dieser Parameter wird ein durchschnittlicher Experiment geben Anlass zu 20 - 30% α-Actinin + Zellen , aber nur 1% sind a-Actinin + / Sarkomer +. Der 1% Sarkomers + Zellen werden ~ 30% NPPA +, Myl2 + oder HCN4-GFP + sein.

Da Kardiomyozyten sind strukturell komplexen, populationsbasierten Genexpression (zB qRT-PCR) oder Durchflusszytometrie können Analysen nicht die komplizierten morphologischen ch erfassenanges, die während der icLm Umprogrammierung auftreten. Im Gegensatz dazu Patch-Clamping und Calcium-Transienten-Bildgebung sind sehr strenge Einzelzellen-funktionelle Assays, aber spezielle Fähigkeiten und Ausrüstung sind diese Experimente durchzuführen, erforderlich. Somit ist die beschriebene Methode einzigartig, da es einen einfachen Ansatz bietet, ohne wesentlich zu beeinträchtigen Durchsatz wichtigsten strukturellen und funktionellen Parameter von icLm Umprogrammierung zu studieren.

Trotz der vielen jüngsten Fortschritte in der direkten Reprogrammierung, bleibt noch viel zu tun, um besser auf die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Herz-Umprogrammierung regelt, und genauer gesagt, Subtyp-Spezifikation. Diese Mechanismen werden sich besonders wichtig, direkte Umprogrammierung für klinische Anwendungen zu übersetzen. Als solche in dieser Studie beschreiben wir eine Plattform, die diskreten Parameter direkt Modulieren der Beitrag zur Sarkomers Entwicklung Subtyp-Spezifikation und ICLM Reife zu beurteilen. Moreover kann dieses System ferner in einem High-Throughput-Format zu arbeiten, entwickelt werden, so dass für komplexe Screening von kleinen Molekülen oder extrazelluläre Matrizes für den nächsten Schritt in der regenerativen Kardiologie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma D5796 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199 Thermo Fisher Scientific 11150059 Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS) Sigma F2442 Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher Scientific 41400-045 Component of iCLM media
MEM vitamin solution Thermo Fisher Scientific 11120-052 Component of iCLM media
MEM amino acids Thermo Fisher Scientific 1601149 Component of iCLM media
Non-Essential amino acids Thermo Fisher Scientific 11140-050 Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics Thermo Fisher Scientific 15240062 Component of iCLM media
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum Thermo Fisher Scientific 26050-088 Component of iCLM media
NaPyruvate Thermo Fisher Scientific 11360-70 Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 1514022 Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin  Thermo Fisher Scientific A11139-03 Component of Plat-E media
Blasticidin   Gemini Bio-Products 400-128P Component of Plat-E media
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700 Zeiss For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent Promega E2692 Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985-070 Transfection reagent 
Polybrene Millipore TR-1003-G Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic CellBiolabs RV-101 Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA Thermo Fisher Scientific For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53) Sigma A7811 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY Thermo Fisher Scientific A10262 Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA  Abgent AP8534A Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG  ProteinTech 10906-1-AP Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Vector Labs H-1500 Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides Thermo Fisher Scientific 12-550-15 25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips NeuVitro Corp GG-12-1.5 Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer Thermo Fisher Scientific 08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM Thermo Fisher Scientific 09-740-106 For virus filtration
6 mL Syringes Covidien 8881516937 For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488 Abcam AB150169 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)  Thermo Fisher Scientific A31573 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555 Thermo Fisher Scientific A21422 Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100 Sigma 93443-100ml For cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS) Sigma D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent Thermo Fisher Scientific NC9495720 Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) Electro Microscopy Sciences  15710 Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates Olympus 25-260
6-well plates Genesee Scientific 25-105
24-well plates Genesee Scientific 25-107
10 cm Tissue culture dishes Corning 4239
15 cm  Tissue culture dishes Thermo Fisher Scientific 5442
15 mL Conical tubes Corning 4308
50 mL Conical tubes Corning 4249
0.4% Trypan blue solution Sigma T8154 For viability
Ethyl Alcohol 200 proof Thermo Fisher Scientific 7005
Bleach Thermo Fisher Scientific 6009

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References

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