السلوك الغازية من خلايا سرطان الثدي البشرية في الجنينية الزرد

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، نحن تصف نماذج الزرد طعم أجنبي باستخدام اثنين من مواقع الحقن المختلفة، أي الفضاء المحيط بالمح والقناة كوفييه، للتحقيق في السلوك العدواني وتقييم دخول الوعاء والتسرب إمكانات خلايا سرطان الثدي البشرية، على التوالي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ren, J., Liu, S., Cui, C., ten Dijke, P. Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55459, doi:10.3791/55459 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

في كثير من الحالات، ومرضى السرطان لا يموت من الورم الرئيسي، وإنما بسبب ورم خبيث. وعلى الرغم من العديد من نماذج القوارض المتاحة لدراسة سرطان خبيث في الجسم الحي، وهناك حاجة موثوق بها، ونماذج أخرى فعالة ومنخفضة التكلفة بسرعة للوصول إلى الآثار المحتملة ل(برنامج التحصين الموسع) التغيرات الجينية أو المركبات الدوائية. على هذا النحو، نحن لتوضيح وشرح جدوى نماذج طعم أجنبي باستخدام خلايا سرطان الثدي البشرية تحقن الأجنة الزرد لدعم هذا الهدف. تحت المجهر، وزرع البروتينات الفلورية أو المسمى كيميائيا خلايا سرطان الثدي البشري في الأجنة الزرد المعدلة وراثيا، تيراغرام (FLI: EGFP)، على مساحة محيط بالمح أو القناة كوفييه (الوثيقة) 48 ساعة بعد الإخصاب. بعد ذلك بوقت قصير، هو تصور عملية الزمانية والمكانية من غزو الخلايا السرطانية، ونشر، والانبثاث في الجسم الأسماك التي تعيش تحت المجهر الفلورسنت. النماذج باستخدام مواقع الحقن المختلفة، أي فيمساحة ivitelline أو الوثيقة مكملة لبعضها البعض، الأمر الذي يعكس مرحلة مبكرة (خطوة دخول الوعاء) والمرحلة المتأخرة (التسرب خطوة) من سلسلة النقيلي متعددة الخطوات للأحداث. وعلاوة على ذلك، الأوعية الدموية peritumoral وintratumoral يمكن ملاحظة مع الحقن في الفضاء محيط بالمح. الفترة التجريبية كلها لا يزيد عن 8 أيام. هذين النموذجين الجمع بين العلامات الخلية، وزرع الصغير، وتقنيات التصوير مضان، مما يتيح للتقييم السريع لالانبثاث سرطان ردا على التلاعب الجيني والدوائية.

Introduction

ويضم العلني الانبثاث سرطان في العيادة سلسلة من الأحداث المعقدة ومتعددة الخطوات المعروفة باسم "سلسلة النقيلي". وقد استعرضت شلال على نطاق واسع، ويمكن تشريح في خطوات متتالية: غزو المحلي، دخول الوعاء، ونشر واعتقال والتسرب، والاستعمار 1 و 2. فهم أفضل من التسبب في الانبثاث السرطان وتطوير استراتيجيات علاجية محتملة في الجسم الحي تتطلب نماذج المضيف قوية من انتشار الخلايا السرطانية. يتم وضع نماذج القوارض جيدا وتستخدم على نطاق واسع لتقييم الانبثاث ولكن هذه الأساليب يكون انخفاض كفاءة والقيود الأخلاقية ومكلفة كنموذج طليعة لتحديد ما إذا كان التلاعب معين يمكن أن تؤثر على النمط الظاهري النقيلي. وهناك حاجة إلى نماذج أخرى موثوق بها منخفضة التكلفة الفعالة وبسرعة للوصول إلى الآثار المحتملة ل(برنامج التحصين الموسع) التغيرات الجينية أو pharmacologمركبات كال. ظهرت بسبب التماثل الجيني عالية على البشر وشفافية من الأجنة الزرد (دانيو rerio) نموذجا الفقاريات المهم ويجري تطبيقها على نحو متزايد لدراسة العمليات التنموية، والتفاعلات الميكروب المضيف، الأمراض التي تصيب الإنسان، وفحص المخدرات وغيرها 4. نماذج سرطان خبيث أنشئت في الزرد قد توفر إجابة على أوجه القصور في نماذج القوارض 6.

على الرغم من أن الأورام عفوية ويعتبر نادرا في الزرد البرية وهناك العديد من التقنيات التي طال أمدها للحث على السرطان المطلوب في الزرد. الطفرات الجينية الناجمة عن مادة مسرطنة أو يشير تفعيل مسار يمكن تشريحيا وجزيئيا التسرطن النموذج، ومحاكاة الأمراض التي تصيب البشر في الزرد 7 و 8 و 9. بواسطة تاكجي الاستفادة من التنوع إلى الأمام وعكس التلاعب الجيني من الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم، (وراثيا) الزرد مكنت أيضا دراسات المحتملة لتشكيل السرطان وصيانة 6 و 10. نماذج السرطان يتسبب في الزرد تغطي طائفة واسعة، بما في ذلك الجهاز الهضمي، التناسلي، والدم، والجهاز العصبي، والظهارية 6.

وسعت الاستفادة من الزرد في أبحاث السرطان في الآونة الأخيرة نظرا لإنشاء نماذج الخلايا السرطانية طعم أجنبي الإنسان في هذا الحي. جاء ذلك أولا مع خلايا سرطان الجلد المنتشر الإنسان التي المغروسة بنجاح في الأجنة الزرد في مرحلة الأريمة في عام 2005 (11). والتحقق من صحة عدة مختبرات مستقلة جدوى هذا العمل الرائد من خلال تقديم مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا السرطانية الثديية في الزرد في مواقع مختلفة ومراحل نمو 5 </ سوب>. على سبيل المثال، والحقن بالقرب من blastodisc والكيسة المرحلة الأريمة. الحقن في الكيس المحي، الفضاء المحيط بالمح، قناة كوفييه (الوثيقة)، والخلفي الوريد الكاردينال 6-ح- إلى الأجنة القديمة لمدة 5 أيام؛ وحقن في التجويف البريتوني اليرقات كبت المناعة عمرها 30 يوما، وقد تم تنفيذ 12. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن زرع الورم خيفي أيضا في الزرد 12 و 13. واحدة من مزايا كبيرة لاستخدام xenografts هو أن الخلايا السرطانية المغروسة يمكن أن يكون بسهولة fluorescently المسمى ومميز من الخلايا الطبيعية. وبالتالي، تحقيقات في سلوك دينامية من تشكيل microtumor 14، غزو الخلايا والانبثاث 15، 16، 17، الناجم عن ورم الأوعية الدموية 15، 1 8، والتفاعلات بين الخلايا السرطانية والمضيف عوامل 17 يمكن تصور بوضوح في جسم السمكة الحية، وخاصة عندما يتم تطبيق خطوط الزرد المعدلة وراثيا 5.

مستوحاة من إمكانات عالية من النماذج طعم أجنبي الزرد لتقييم ورم خبيث، أثبتنا خصائص التسرب transvascular من مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي في منطقة tailfin تيراغرام (FLI: EGFP) الأجنة الزرد عن طريق الحقن الوثيقة 16. دور عامل النمو المحول-β (TGF-β) بروتين 16 و العظام مخلق (BMP) وتم التحقيق 19 مسارات إشارات في غزو الخلايا السرطانية الموالية / مكافحة سرطان الثدي وورم خبيث أيضا في هذا النموذج. وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا لخص القدرة دخول الوعاء مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي في التداول باستخدام نماذج الزرد طعم أجنبي مع حقن الفضاء المحيط بالمح.

SS = "jove_content"> تقدم هذه المقالة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لنماذج طعم أجنبي الزرد استنادا إلى حقن خلايا سرطان الثدي البشرية في الفضاء محيط بالمح أو الوثيقة. باستخدام عالية الدقة التصوير مضان، وتبين لنا عملية تمثيلية للدخول الوعاء في الأوعية الدموية والسلوك العدواني من مختلف خلايا سرطان الثدي البشرية، والتي تتحرك من الأوعية الدموية في منطقة tailfin اوعائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الأبحاث باستخدام المعدلة وراثيا الفلورسنت الزرد تيراغرام (FLI: EGFP) سلالة، مما عزز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) -labeled الأوعية الدموية 20، بما في ذلك السكن والتجارب، أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية وتمت الموافقة من قبل اللجنة المؤسسية المحلية للرفق بالحيوان (دير Ethische Commissie (DEC) من المركز الطبي لجامعة لايدن.

ملاحظة: كما هو مذكور في الشكل 1، هو كسر البروتوكول تقريبا إلى أربع خطوات: جمع الأجنة (الشكل 1A)، حقن مكروي (الشكل 1B)، وفحص (الشكل 1C)، والتحليل (1D الشكل).

1. إعداد إبر الحقن

  1. إعداد إبر الحقن مع microcapillaries البورسليكات الزجاج. وضع microcapillary في جهاز micropipette مجتذب مع الإعدادات التالية: ضغط الهواء، 500. حرارة، 650؛ سحب، 100. سرعة، 200. زمن،40. الحفاظ على إبر الحقن في لوحة حامل الإبرة حتى أنها تستخدم للحقن.

2. إعداد الفلورسنت، وصفت وراثيا خلايا سرطان الثدي للحقن

  1. ثقافة سرطان الثدي البشرية MDA-MB-231 الخلايا عند 37 درجة مئوية في المتوسط ​​الجلوكوز DMEM عالية تحتوي على L-الجلوتامين، و 10٪ الجنين المصل البقري، و 1: 100 البنسلين ستربتومايسين (القلم بكتيريا).
  2. ثقافة خطوط الثدي الظهارية خلية، MCF10A (M1) وMCF10A الراس (M2)، عند 37 درجة مئوية في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على L-الجلوتامين مع مصل الحصان 5٪، 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة، 10 ملغ / مل الأنسولين، و 100 نانوغرام / مل الكوليرا المعوي، و 0.5 ملغ / مل الهيدروكورتيزون، و 1: 100 القلم بكتيريا.
  3. إنتاج mCherry الفيروسة البطيئة عن طريق المشاركة في transfecting PLV-mCherry، pCMV-VSVG 21، pMDLg-RRE (هفوة / بول) 22، وpRSV-REV 22 البلازميد في الخلايا HEK293T. حصاد supernatants خلية 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن ومخزن في -80 ° C.
  4. أناnfect الخلايا MDA-MB-231، M1، M2، وبنسبة 30٪ التقاء لمدة 24 ساعة مع supernatants lentiviral المخفف 1: 1 مع مستنبت طبيعي في ظل وجود 5 نانوغرام / مل polybrene.
  5. اختيار الحيوانات المستنسخة وحيدة الخلية عن طريق تمييع الخلايا في لوحة 96-جيدا، والذي يسمح ثمرة من الحيوانات المستنسخة زنزانة انفرادية، حتى الحصول على خطوط الخلايا مستقرة، معربا عن mCherry.
  6. ثقافة T75 واحد قارورة من الخلايا للحقن. حصاد الخلايا بنسبة 80٪ التقاء مع 0.5٪ في العلاج التربسين-EDTA. غسل الخلايا مع أوقات برنامج تلفزيوني 1X 2-3.
  7. إعادة تعليق الخلايا في حوالي 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. متجر عليهم 4 ° C لمدة تقل عن 5 ساعات قبل الحقن.

3. إعداد الزرد الأجنة للحقن

  1. إعداد الزرد أزواج تربية وجمع الأجنة، كما هو مبين في المادة إن الرب السابقة التي روزن وآخرون. 23.
  2. اختيار الأجنة التي هي في 0-4 HPF عن طريق إزالة أجنة غير مخصبة وغير طبيعية. الحفاظ على الأجنة في ديس بيتريح مليئة بالماء البيض (60 ميكروغرام / مل أملاح البحر؛ ~ 60 الأجنة / طبق) واحتضان عند 28 درجة مئوية.
  3. Dechorionate الأجنة مع ملاقط غرامة في 48 HPF.
  4. تخدير الأجنة عن طريق تحويلها إلى 40 ميكروغرام / مل تريكين (حمض 3-أمينو) التي تحتوي على الماء البيض حوالي 2 دقيقة قبل الحقن، ولكن لم يعد من 2 ساعة قبل الحقن.
    ملاحظة: تريكين حل سهم (4 ملغ / مل، 100X) مستعدة إلى 400 ملغ من مسحوق تريكين في 97.9 مل من الماء المقطر المزدوج و 2.1 مل من 1 M تريس قاعدة (الرقم الهيدروجيني 9)، مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.4. مخزن في الثلاجة -20 درجة مئوية.

4. خلايا سرطان الثدي حقن الإنسان في الفضاء المحيط بالمح

  1. تحميل 15 ميكرولتر من تعليق خلية في إبرة الحقن. جبل الإبرة على micromanipulator وقطع رأس إبرة مع ملاقط غرامة للحصول على قطر افتتاح غيض من 5-10 ميكرون.
  2. استخدام picopump الهوائية ومناور لأداء حقن مكروي. Adjuالحادي وpicopump لحقن 400 خلايا في كل مرة. قبل الحقن، والاعتماد على أرقام الهواتف المحمولة يدويا عن طريق حقن الخلايا في الجزء العلوي من طبق بتري تحتوي على 1٪ الاغاروز.
  3. حتى خط تخدير الأجنة (2-3 أيام بعد الإخصاب (DPF)) على، 1٪ الاغاروز عن طريق الحقن لوحة مسطحة، حوالي 10 الأجنة في كل مرة.
  4. توجيه لوحة حقن باليد أثناء الحقن لوضع الأجنة في موقف المفضل لإدخال الإبرة (أي قطريا).
  5. تشير طرف الإبرة في موقع الحقن وإدراج بلطف طرف الإبرة في الفضاء محيط بالمح بين الكيس المحي ومحيط بالأدمة الجنين الزرد (الشكل 2A).
  6. ضخ ما يقرب من 400 الخلايا السرطانية التي تحمل علامات mCherry. تأكد من أن الكيس المحي لا تمزق لتجنب زرع في الكيس المحي.

5. حقن خلايا سرطان الثدي البشرية إلى دوك

  1. إعداد إبرة الحقن والأجنة الزرد كما هو موضح ط بروتوكول ن الخطوات من 1 و 2 و 3.
  2. استخدام زاوية 45 درجة إبرة بحيث يمكن اقترب من الوثيقة من الجانب الظهري للجنين.
  3. ادخال الإبرة في نقطة الانطلاق من دوك (الشكل 3A)، فقط الظهرية إلى حيث يبدأ القناة توسيع مدى الكيس المحي، وحقن ما يقرب من 400 خلايا. الحقن هو الصحيح إذا كان حجم داخل قناة يوسع مباشرة بعد نبض والكيس المحي.
    ملاحظة: عدة حقن متتالية لا يمكن أن يؤديها دون استخراج الإبرة.
  4. نقل الأجنة الزرد لحقن المياه البيض.
    موجود وكبيرة الاختلاف بين الأجنة الزرد الفردية، وكما وفاة الأجنة بعد الحقن يمكن أن يحدث، ينبغي حقن عدد كبير نسبيا من الأجنة الزرد (حوالي 100) مع الخلايا السرطانية: ملاحظة.
  5. الحفاظ على الأجنة الزرد في 33 ° C لاستيعاب متطلبات درجة الحرارة المثلى للأسماك وخلايا الثدييات.
_title "> 6. شاشة الأجنة المصبوبة

  1. شاشة كل الأسماك تحت مجهر تشريحي مضان في 2 ساعة بعد الحقن (HPI) لحقن مساحة محيط بالمح (الشكل 2) أو في 24/02 الفقر البشري لحقن دوك (الشكل 2) للتأكد من أن جميع الأجنة يتم حقنها مع عدد مماثل من الخلايا السرطانية. إزالة الأجنة مع أخطاء الحقن، مثل تمزق (الشكل 2B) أو الحقن (الشكل 3B) من الكيس المحي، وانتقاء الأجنة مع حقن الخلايا أدناه (أرقام 2C و 3B) أو أعلى (أرقام 2D و 3B) العتبة. تبقي فقط على الأجنة مع ما يقرب من 400 الخلايا في الثقافة.
  2. يستبعد إمكانية أن يتم إدخال الخلايا مباشرة في الدورة الدموية خلال عملية الحقن عن طريق إزالة الأجنة مع الخلايا بالفعل في الدورة الدموية. أيضا، إزالة أي الجنين مع خلية وثيقة جماعية لدوك (الشكل 2D

7. صورة وتحليل عملية الإنتقالية

  1. جمع عدة أجنة تخدير مع نطاق طرف ماصة باستير ونقلها إلى أسفل الزجاج من صحن البوليسترين.
  2. إزالة المياه الزائدة والحفاظ على كمية محدودة من المياه البيض. التلاعب في الجنين في الموقف مع أداة حلقة الشعر ووضع غطاء على رأس الزجاج.
  3. استخدام المجهر متحد البؤر مقلوب في تركيبة مع الغمر بالمياه أو أهداف الجافة لمسافات طويلة. وضع الجنين مثل أن المنطقة ذات الاهتمام هو أقرب إلى الهدف ممكن.
  4. أداء التصوير مباشرة بعد التخدير للحد من خطر الموت بسبب التبخر السائل.
    1. إشارات من القبض على الأوعية الدموية المسمى EGFP والخلايا السرطانية وصفت mCherry-في نفس الموضع على الأجنة للمشاركة في تسجيل الخلايا مع الأوعية الدموية حقن عن طريق دمج القنوات التصوير اثنين.
    2. لكل الجنين الزرد، وجمع مجموعتين مختلفتين من الصورمن منطقة الرأس ومنطقة الذيل.
  5. تحديد عدد الخلايا نشرها.
    1. لحقن الفضاء المحيط بالمح، حساب عدد الخلايا في كل الأسماك التي نشرها من الكتلة الخلوية نحو جسم السمكة الجنينية داخل مناطق الرأس والذيل 15؛ المناطق هي خارج حدود تجويف القلب أماميا، وعلى رأس من المثانة ظهريا السباحة، وراء افتتاح البولي التناسلي caudally.
    2. لحقن الوثيقة، حساب عدد الخلايا الفردية التي غزت ألياف الكولاجين من tailfin من التداول (MDA-MB-231) أو عدد الكتل التي شكلتها خلايا جماعي (M2) في الأنسجة المكونة للدم الذيلية (CHT) من كل الزرد 19.
  6. دراسة الغزو والانبثاث في مزيد من التفاصيل باستخدام متحد البؤر المجهري (يوصي).
    1. استخدام التكبير المنخفض (الهدف 4X) لصورة كلهاالجسم والحصول على لمحة عامة عن نمط نشر الخلايا السرطانية.
      ملاحظة: ارتفاع التكبير (20X 40X والأهداف) مناسبة للدراسة داخل الجزيئات وشبه الورم الوعائي والتعريب الدقيق للخلايا نشرها في الجسم الجنين.
    2. استخدام الليزر 488 نانومتر لفحص الأوعية الدموية الجنين الزرد والليزر 543 نانومتر لفحص الخلايا السرطانية المزروعة المسمى مع مضان أحمر. الحصول على صورة عالية الجودة عن طريق مسح كل جنين في ثماني إلى عشر خطوات. مسح ويبلغ متوسط ​​كل خطوة ست مرات.
  7. وضع بعناية الجنين مرة أخرى إلى المياه بيضة إذا كان ذلك مطلوبا لمزيد من التجارب.

8. تنفيذ التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين الأحادي (ANOVA) تلاه تحليل الموضوع المخصص

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في نموذج الزرد طعم أجنبي الجنينية مع حقن مساحة محيط بالمح، يعتبر نشر الدموي للخلايا السرطانية وصفت في الجسم الأسماك كما الهجرة النشطة. يمكن الكشف عن هذه العملية وكميا تحت المجهر الفلورسنت، كما هو موضح في الأساليب المذكورة أعلاه. لتوضيح هذا النموذج طعم أجنبي، تابعنا عملية نشر مختلف خطوط خلايا سرطان الثدي مع معروف (أو بدون) الغزو / ورم خبيث المحتمل فقا لفي التجارب المختبرية والدراسات الماوس الجسم الحي، بما في ذلك خلايا M1 حميدة العادي الثدي الظهارية، ما قبل سرطان تحولت يواجه المالح، خلايا M2، والمنتشر إلى حد كبير الخلايا MDA-MB-231، 1 يوم حقن آخر (نقطة في البوصة) فصاعدا. وأظهرت عالية الدقة مبائر صورة مجهرية أن MDA-MB-231 الخلايا (الأحمر) يحمل النمط الظاهري العدوانية، وذات حدود غير منتظمة في الفضاء محيط بالمح. كانت نتوءات تشبه أقدام كاذبة والجبهات الغازية موجودة أيضا في كثير من الأحيان (الشكل 4A، يسار). هناك عدد قليل من خلايا نشرها في الدورة الدموية في وقت مبكر من 1 نقطة في البوصة (الشكل 4A، يمين). في 2 نقطة في البوصة، لوحظ نشر واضحا في الأجزاء البعيدة من الأسماك (الشكل 4A، يمين). زيادة عدد الخلايا نشرها مرة أخرى في 3 نقطة في البوصة (الشكل 4A و 4D). في المقابل، عندما طعن في خلايا M2 في الزرد، وأنها عرضت انتشار متواضع في جسم السمكة بعد 2 نقطة في البوصة (الشكل 4B). كما اظهرت زيادة نشر بعد مرور الوقت (الشكل 4F). كما هو مبين في الشكل 4C و 4G، وخلايا M1 نشرها بشكل غير منتظم في التداول الزرد، وكان حتى الهجرة المحلية النشطة في الفضاء المحيط بالمح نادرة خلال فترة المراقبة. اعتقل الكتلة الخلوية M1 تقريبا في موقع الحقن الأصلي. إذا تعريف نشر إيجابية أو ورم خبيث كما> 5 الخلايا في جسم السمكة> 4، لوحظ SS = "XREF" MDA-MB-231 و M2 خلية ورم خبيث في 92٪ و 57٪ من الأسماك، على التوالي، في 3 نقطة في البوصة (الشكل 4G). في المقابل، لم يلاحظ أي نشر الإيجابي مع خلايا M1. لذلك، هذا النموذج الزرد من الإنسان تطور الخلايا السرطانية يعكس بدقة المستوى النسبي للإمكانات النقيلي من خلايا مختلفة في الفئران. اتساع الأوعية الدموية (الخضراء) التي ظهرت من الضفيرة subintestinal من الزرد الجنينية واخترقت كانت MDA-MB-231 أو M2 كتلة الخلية الحالية بعد الحقن الفضاء محيط بالمح الخلايا السرطانية تليها 3 أيام من الحضانة (الشكل 4A و 4B أيضا، غادر ). واتساقا مع العجز في نشرها، تم الكشف عن اتساع الأوعية الدموية طفيف فقط على الخلايا M1 زرع (الشكل 4C).

في نموذج الجنينية طعم أجنبي الزرد مع المسمى mCherry الخلايا MDA-MB-231 وحقن الوثيقة، المختبروتعتبر الخلايا السرطانية eled في tailfin من الزرد ممثل تسرب نشط. تم حقن الخلايا MDA-MB-231 المسمى mCherry-في 2 DPF. في 3 نقطة في البوصة، بدأت الخلايا إلى الهجرة من السفن إلى tailfin، التي يتم تخصيبها مع الكولاجين. هاجرت واحدة MDA-MB-231 خلية واحدة تلو الأخرى، بشكل مستقل عن السفن، إلى tailfin البعيد (الشكل 5A). في 6 نقطة في البوصة، الغزو يمكن أن يكون كميا عن طريق حساب عدد الخلايا التي هاجرت في الأنسجة tailfin. في M2 نموذج حقن الخلايا الوثيقة المسماة mCherry، تم إجراء حقن أيضا في 2 DPF. ومع ذلك، لوحظ وجود النمط الظاهري عنقودية أثناء عملية التسرب النشطة. في 1 نقطة في البوصة، بدأت خلايا M2 إلى الهجرة خارج من السفن في CHT من الزرد. في 2 نقطة في البوصة، بدأت خلايا M2 ترحيلها لتشكيل كتلة بين السفن في CHT (الشكل 5B). يمكن إجراء القياس الكمي لM2 الغازية عدد الكتلة خلية في المنطقة CHT في6 نقطة في البوصة.

شكل 1
الشكل 1: الخطوات الرئيسية للتحقيق في السلوك العدواني من خلايا سرطان الثدي في الزرد الجنينية. (A) بعد عبور الزرد الوالدين بين عشية وضحاها، تيراغرام (fli1: EGFP) تم جمع الأجنة الزرد في صباح اليوم التالي وتمت المحافظة على 28 ° C. تم dechorionated (B) الأجنة مع ملاقط غرامة تحت مجهر تشريحي 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). تم جمع خلايا سرطان الثدي وصفت وإعادة علقت في كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني. بعد إعداد جيد، تم تحميل الخلايا علقت في إبرة واحدة. تم حقن ما يقرب من 400 الخلايا في القناة كوفييه (الوثيقة) من مساحة محيط بالمح تحت مجهر تشريحي. تم الحفاظ على الأجنة المحقونة في 33 ° C. (C) 2 ساعة بعد الحقن (HPI)، تعرض الأجنة إلى كاليفورنيافحص reful تحت مجهر تشريحي مضان. تم الحفاظ على الأجنة عند 33 درجة مئوية لمدة 3 أو 6 أيام. خلال هذه الفترة، وتعرض الأجنة لعلاج تصميم. تم الكشف عن (D) نشر خلايا السرطان عن طريق الحقن الفضاء المحيط بالمح أو الغزو عن طريق الحقن الوثيقة، عد، والتقط بواسطة المجهر متحد البؤر 3 أو 6 أيام حقن آخر (نقطة في البوصة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: محيط بالمح موقع الحقن الفضاء والأخطاء الشائعة. (A) تم حقن ما يقرب من 400 الخلايا المسمى mCherry (MDA-MB-231) في الفضاء محيط بالمح. وbrightfield (العلوي)، الأوعية الدموية الأخضر (المتوسطة العليا)، والأحمر كتلة الخلية (المتوسط ​​أقل) من حقنتم القبض على إد الأجنة الزرد بواسطة المجهر متحد البؤر. الصورة المدمجة (الأدنى) من ثلاث قنوات يبين موقع ستيريو من كتلة الخلايا في الجنين. (B) الخلايا لم تستهدف الفضاء محيط بالمح بشكل مناسب. وقد تمزق الكيس المحي. (C) حقن الخلايا دون عتبة (أقل بكثير من 400). (D) حقن الخلايا عتبة أعلاه (أكثر بكثير من 400). وكانت كتلة الخلية قريبة جدا من القناة كوفييه، التي لديها مجرى الدم واسع. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): نظرة عامة حول القناة كوفييه (الوثيقة) الحقن. (A) تخطيطي لحقن الوثيقة في 2 يوما بعد الإخصاب (دالجبهة الوطنية) مع خلايا سرطان الثدي في الأجنة الزرد. يشير السهم في الوثيقة. (B) أمثلة من الحقن إيجابية، مع حوالي 400 خلايا سرطان الثدي. حقن السلبية، بما في ذلك misinjection صفار البيض. وعدد غير صحيح من حقن الخلايا في 4 HPI. السهام والدوائر تشير إلى حقن الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مقارنة القدرة نشرها بين مختلف خطوط الخلايا الثدي. تم حقن ما يقرب من 400 mCherry المسمى MDA-MB-231، MCF10Aras (M2)، أو MCF10A (M1) الخلايا في الفضاء محيط بالمح الأجنة الزرد 48 HPF. تمت متابعة الأجنة حقن لمدة 3 أيام. (A، C و) عالية RESO-الميكروسكوب lution تبين الهجرة ونشر عملية تمثيلية من MDA-MB-231 (A)، M2 (B)، وM1 (C) الخلايا في الهيئات الجنينية الفردية 1 و 2 و 3 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة). اليسار، والهجرة خلية في الفضاء محيط بالمح (الحمراء)، والأوعية الدموية peritumoral وintratumoral (الخضراء). وتشير الإشارات الصفراء للتداخل microvessels والخلايا. الوسط، وصورة كاملة للجنين. الصحيح، والتصور الخلايا نشرها في مؤخرة الجنين. النصال الصفراء تشير الخلايا منتثرة واحدة. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. (D، F و) الكمي لعدد الخلايا نشرها في كل هيئة الجنينية في 1 و 2 و 3 نقطة في البوصة. يتم التعبير عن النتائج على النحو يعني ± SEM. وأظهرت نتائج تحليل التباين الأحادي (ANOVA)، يليه تحليل ما بعد مخصصة. وقد قبلت <P 0.05 كما دلالة إحصائية (* 0.01 <P <0.05؛ ** 0.001 <P <0.01. *** P <0.001. (G) مقارنة بين حالات دخول الوعاء للخلايا MDA-MB-231، M2، M1 وفي الهيئات الجنينية في 1 و 2 و 3 نقطة في البوصة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: سلوكيات مختلفة من MDA-MB-231 و M2 خلية ورم خبيث في الزرد مع القناة من حقن كوفييه. (A) وجاءت الصور مبائر التمثيلية للالزرد في 3 و 4 و 5 نقطة في البوصة لإظهار السلوك الهجرة من خلية واحدة من الخلايا MDA-MB-231 في الزرد. تشير الأسهم الغازية MDA-MB-231 الخلايا التي هاجرت من السفن في tailfins. شريط مقياس = 200 ميكرون في العمود الأيسر، 50 ميكرون في العمود الأيمن. (B) الممثلوجاءت الصور مبائر من الزرد في 1 و 2 و 3 نقطة في البوصة لإظهار السلوك الهجرة كتلة خلية من خلايا M2 في الزرد. السهام تشير الخلايا M2 الغازية التي هاجرت من الأوعية إلى الأنسجة المكونة للدم الذيلية (CHT) وشكلت كتلة بين السفن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا، وصفنا طريقتين للتحقيق في السلوك العدواني من خلايا سرطان الثدي في تيراغرام (fli1: EGFP) الأجنة الزرد، مع حقن مساحة محيط بالمح وثيقة. عن طريق حقن الخلايا السرطانية التي تحمل صبغة كيماوية أو البروتين الفلوري في الأجنة الزرد المعدلة وراثيا، وخصائص ديناميكية والمكانية للغزو والانبثاث يمكن تتبع بشكل واضح في الوقت الحقيقي في خلية واحدة أو مستوى التجمعات تحت المجهر مضان. في معظم الحالات، فإن التقدم السريع من ورم خبيث في الزرد يضمن أن الفحص لا يمكن أن يؤديها في حدود 1 في الاسبوع بعد الزرع. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على إحصاءات قوية مع أفواج كبيرة من الأسماك.

الأحداث المبكرة والمتأخرة من تتالي النقيلي يمكن محاكاة وتلخيصها عن طريق حقن الخلايا السرطانية في الفضاء محيط بالمح أو الوثيقة، على التوالي. مساحة محيط بالمح هي المساحة المحصورة بين محيط بالأدمة من الأسماك والكيس المحي، الذي ألووفاء سلطان واحد لمراقبة نشر الخلايا السرطانية واحدة من المواقع الأساسية في الجسم الحي. بعد زرع، والخلايا السرطانية الخضوع الهجرة المحلية وغزو الفضاء داخل محيط بالمح (يعتبر الموقع الرئيسي) وبعد ذلك intravasate في الأوعية الدموية وتنشر جنبا إلى جنب مع الدورة الدموية. على رأس وtailfin (تعتبر المواقع المستهدفة البعيدة)، وخلايا سرطان تتراكم في سرير الشعرية الضيقة ويتسرب. ولذلك، فإن عدد الخلايا التي تم العثور عليها في مواقع بعيدة في الجسم الأسماك هو قياس قدرة النقيلي. وبالإضافة إلى ذلك، خلايا أكثر extravasated يمكن ملاحظتها في نقطة زمنية لاحقة، وهو صحيح أيضا للمقايسة حقن الوثيقة.

والوثيقة عبارة عن تضخم الوريد الكاردينال المشتركة مع تيار الدم واسعة 24. تستهدف بشكل مباشر على الوثيقة كموقع حقن يدخل الخلايا السرطانية في الدورة الدموية. في الممارسة العملية، تنتشر خلايا سرطان الثدي في جميع أنحاء الجسم عبر الجنينيةمجرى الدم على الفور بعد حقن الوثيقة. ثم القبض على خلايا في الذيلية الوريد والشريان الأبهر الظهري. التسرب، والغزو، وتشكيل نقيلة مجهرية يمكن ملاحظتها على التوالي في غضون 6 أيام. كما ذكرت سابقا 16، النقيلي MDA-MB-231 الخلايا والخلايا الثديية M2 ما قبل سرطان يحمل الظواهر الغازية المختلفة. MDA-MB-231 الخلايا تخضع الغزو خلية واحدة من الكولاجين tailfin مصفوفة الغنية. وهكذا، فإن احتمال غزو MDA-MB-231 الخلايا يمكن قياسها عن طريق حساب عدد الخلايا التي extravasated وغزت الأنسجة tailfin. في المقابل، خلايا M2 تشكل مجموعات من أحجام مختلفة، وتخضع لغزو الجماعي للCHT. قياس إمكانية غزو خلايا M2 عن طريق حساب عدد من الكتل في هذا البروتوكول من الصعب، ويتم تنفيذها ويفضل أن يكون من خلال جعل صورة 3D باستخدام متحد البؤر المجهري وتحديد حجم الخلايا السرطانية متفاوت المسافات.

التحدي التقني في الدقيقة الخلايا السرطانيةحقن يستهدف بنجاح الفضاء محيط بالمح أو الوثيقة. وMicroinjection من أعداد كبيرة من الأجنة هو إجراء شاقة تتطلب مشغل درجة عالية من المهارة والصبر. وتشمل العوامل التي تسهم في الاختلافات في النتائج في الأسماك الفردية المرحلة التنموية للجنين عند حقن، والاختلافات في عدد من حقن الخلايا، وتسرب من الخلايا في الكيس المحي. وإن كانت نادرة، يمكن التلاعب اختراق غير قصد الأوعية الدموية وإدخال الخلايا في الدورة الدموية مباشرة، لا سيما في حقن الفضاء المحيط بالمح. لمزيد من خفض التباين ولضمان موثوقية التحليلات، الفحص المجهري ضروري لاستبعاد الأسماك غير المشروط في نقاط زمنية طوال العملية. وبالإضافة إلى ذلك، أعمى تحليل من قبل الفنيين دون معرفة الإعداد ويقترح بقوة لتحقيق الكمي غير منحازة.

وباختصار، فإن النموذجين قدمنا ​​هنا تسليط الضوء علىتصور عمليات غزو الخلايا والانبثاث في الجسم الحي دون إجراءات الغازية. على الرغم من أن درسنا فقط خلايا سرطان الثدي في نموذجين بشأن إمكانية المتنقل، يمكن استقراء لأنواع أخرى من السرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن للنماذج لها تطبيقات أوسع في تحديد آليات وأهداف جزيئية جديدة السيطرة على ورم خبيث الخلايا السرطانية باستخدام (برنامج التحصين الموسع) التلاعب الجيني. نظرا لنفاذية عالية من الأجنة الزرد بواسطة مركبات جزيء صغير بالمقارنة مع التغذية أو حقن القوارض 25، واثنين من النماذج المقدمة أيضا مزايا من حيث فحص عالية الإنتاجية من المحتمل الأدوية الجديدة المضادة للغزو / ورم خبيث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

يتم دعم دراسات على أفراد الأسرة TGF بيتا من السرطان الجينوم المركز الهولندي. معتمدة سيجيا ليو جيانغ ورن من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني لمدة 4 سنوات من الدراسة في جامعة ليدن. نشكر الدكتور فريد ميلر (معهد السرطان كارمانوس آن باربرا، ديترويت، MI، الولايات المتحدة الأمريكية) للخطوط الخلايا MCF10A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose MP Biomedicals AGAF0500
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 300038
Cholera enterotoxin  Calbiochem 227035
Confocal microscope Leica SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 21041025
Dumont #5 forceps Fine Science Tools Inc 11252-20
Epidermal growth factor Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum  ThermoFisher Scientific 16140071
Fluorescent stereo microscope Leica M165 FC
HEK293T cell line American Type Culture Collection CRL-1573
Hydrocortisone SigmaAldrich 227035
Horse serum ThermoFisher Scientific 26050088
Insulin SigmaAldrich I-6634
MCF10A (M1) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MCF10Aras (M2) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MDA-MB-231 cell line American Type Culture Collection CRM-HTB-26
Manual micromanipulator  World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller Sutter Instruments P-97 
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) Eppendorf F276456I
pCMV-VSVG plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PLV-mCherry plasmid Addgene 36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Polybrene SigmaAldrich 107689
Prism 4 software GraphPad Software
pRSV-REV plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope Leica MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base SigmaAldrich 11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid) SigmaAldrich A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher Scientific 15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) SigmaAldrich P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom WillCo GWST-5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19, (11), 1450-1464 (2013).
  2. Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1, (1), 76-91 (2015).
  3. Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7, (2), 283-296 (2013).
  4. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13, (1), 453 (2013).
  5. Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, (1), 124-137 (2012).
  6. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34, (1), 80 (2015).
  7. Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34, (1), 117-130 (1965).
  8. Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24, (1), 73-75 (2006).
  9. Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
  10. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, (33), 4509-4520 (2008).
  11. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233, (4), 1560-1570 (2005).
  12. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5, (3), 383-394 (2010).
  13. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66, (6), 3120-3125 (2006).
  14. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, (44), 17406-17411 (2007).
  15. Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5, (12), 1911-1918 (2010).
  16. Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15, (6), R106 (2013).
  17. He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227, (4), 431-445 (2012).
  18. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2, (11), 2918-2923 (2007).
  19. de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
  20. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  21. Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, (4), 493-501 (2003).
  22. Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  23. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  24. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3, (9), 674-682 (2002).
  25. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (1), 35-44 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics