भ्रूणीय Zebrafish में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार

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Cancer Research

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Summary

यहाँ, हम दो अलग-अलग इंजेक्शन साइटों, यानी, perivitelline अंतरिक्ष और कुवियर की वाहिनी का उपयोग कर, आक्रामक व्यवहार की जांच के लिए और मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं की intravasation और तरल पदार्थ का स्त्राव संभावित आकलन करने के लिए क्रमश: जेनोग्राफ्ट zebrafish मॉडल का वर्णन।

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Ren, J., Liu, S., Cui, C., ten Dijke, P. Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55459, doi:10.3791/55459 (2017).

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Abstract

कई मामलों में, कैंसर रोगियों एक प्राथमिक ट्यूमर के मर जाते हैं, बल्कि मेटास्टेसिस की वजह से। हालांकि कई कृंतक मॉडल विवो में कैंसर मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए उपलब्ध हैं, अन्य कुशल, विश्वसनीय, कम लागत वाली मॉडल जल्दी से (एपि) आनुवंशिक परिवर्तन या औषधीय यौगिकों के संभावित प्रभावों का उपयोग करने की जरूरत है। जैसे, हम उदाहरण देकर स्पष्ट करना और मानव स्तन कैंसर zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट इस लक्ष्य को समर्थन करने के लिए कोशिकाओं का उपयोग कर जेनोग्राफ्ट मॉडल की व्यवहार्यता की व्याख्या। माइक्रोस्कोप के तहत, फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रासायनिक लेबल मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, टीजी (fli: EGFP), perivitelline अंतरिक्ष या Cuvier (डॉक्टर) की वाहिनी 48 ज निषेचन के बाद में। शीघ्र ही बाद में, कैंसर कोशिका आक्रमण, प्रसार, और रहने वाले मछली शरीर में मेटास्टेसिस के अस्थायी स्थानिक प्रक्रिया एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कल्पना है। अलग इंजेक्शन साइटों, यानी का उपयोग कर मॉडल, प्रतिivitelline अंतरिक्ष या डॉक्टर एक-दूसरे के पूरक हैं, प्रारंभिक चरण (intravasation कदम) और अंतिम चरण की घटनाओं की multistep मेटास्टेटिक झरना (परिस्त्राव कदम) को दर्शाती है। इसके अलावा, peritumoral और intratumoral एंजियोजिनेसिस perivitelline अंतरिक्ष में इंजेक्शन के साथ मनाया जा सकता है। पूरे प्रयोगात्मक अवधि 8 दिन से अधिक नहीं है। इन दो मॉडल, सेल लेबलिंग, सूक्ष्म प्रत्यारोपण, और प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक गठबंधन आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ के जवाब में कैंसर मेटास्टेसिस के तेजी से मूल्यांकन सक्षम करने से।

Introduction

क्लिनिक में प्रकट कैंसर मेटास्टेसिस "मेटास्टेटिक झरना" के रूप में जाना जटिल और बहु-चरण घटनाओं की एक श्रृंखला शामिल है। झरना बड़े पैमाने पर समीक्षा की गई है और लगातार चरणों में विच्छेदित किया जा सकता है: स्थानीय आक्रमण, intravasation, प्रसार, गिरफ्तारी, तरल पदार्थ का स्त्राव, और उपनिवेशन 1, 2। कैंसर मेटास्टेसिस के रोगजनन और विवो में संभावित उपचार रणनीतियों के विकास का एक बेहतर समझ कैंसर कोशिका प्रसार की मजबूत मेजबान मॉडल की आवश्यकता है। कृंतक मॉडल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं और व्यापक रूप से मेटास्टेसिस 3 मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन इन तरीकों कम दक्षता और नैतिक सीमाएं हैं और एक मामले में सबसे आगे मॉडल निर्धारित करने के लिए एक विशेष हेरफेर मेटास्टेटिक फेनोटाइप को प्रभावित कर सकता है कि क्या के रूप में महंगा है। अन्य कुशल, विश्वसनीय, कम लागत वाली मॉडल जल्दी से (एपि) आनुवंशिक परिवर्तन या Pharmacolog के संभावित प्रभावों का उपयोग करने की जरूरत हैiCal यौगिकों। मनुष्य के लिए अपने उच्च आनुवंशिक अनुरूपता और उनके भ्रूण zebrafish (Danio rerio) की पारदर्शिता के कारण एक महत्वपूर्ण हड्डीवाला मॉडल के रूप में उभरा है और तेजी से विकास प्रक्रियाओं, सूक्ष्म जीव मेजबान बातचीत, मानव रोगों, दवा स्क्रीनिंग, आदि के अध्ययन के लिए लागू किया जा रहा 4। कैंसर मेटास्टेसिस zebrafish में स्थापित मॉडल कृंतक मॉडल 5, 6 की कमियों का उत्तर दे सकते हैं।

हालांकि सहज रसौली शायद ही जंगली zebrafish 7 में देखा जाता है, वहाँ zebrafish में वांछित कैंसर प्रेरित करने के लिए कई लम्बे समय से की तकनीक है। कैसरजन-प्रेरित जीन म्यूटेशन या संकेतन मार्ग सक्रियण Histologically और molecularly मॉडल कैंसरजनन, zebrafish 7, 8, 9 में मानव रोग नकल उतार सकते हैं। तक तकविविध का लाभ ing आगे और ओंकोजीन या ट्यूमर शामक की आनुवंशिक जोड़तोड़ रिवर्स (ट्रांसजेनिक) zebrafish भी कैंसर के गठन और रखरखाव 6, 10 की क्षमता के अध्ययन सक्षम है। Zebrafish में प्रेरित कैंसर मॉडल पाचन, प्रजनन, रक्त, तंत्रिका तंत्र, और उपकला 6 सहित एक व्यापक स्पेक्ट्रम, कवर किया।

कैंसर अनुसंधान में zebrafish के उपयोग हाल ही में इस जीव में मानव ट्यूमर कोशिका जेनोग्राफ्ट मॉडल की स्थापना की वजह से विस्तार किया गया है। यह पहला मानव मेटास्टेटिक मेलेनोमा कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक 2005 11 में ब्लासटुला चरण में zebrafish भ्रूण में engrafted रहे थे के साथ सूचना मिली थी। कई स्वतंत्र प्रयोगशालाओं विभिन्न साइटों और विकास के चरणों में zebrafish में स्तनधारी कैंसर की कोशिकाओं को लाइनों की एक विविध रेंज शुरू करने से इस अग्रणी काम करने की व्यवहार्यता की पुष्टि की है 5 </ Sup>। उदाहरण के लिए, blastodisc और ब्लासटुला चरण के ब्लास्टोसिस्ट के पास इंजेक्शन; जर्दी थैली, perivitelline अंतरिक्ष, Cuvier (डॉक्टर) की वाहिनी, और 6-एच के पीछे कार्डिनल नस 5 दिन की उम्र में भ्रूण के लिए में इंजेक्शन; और 30 दिन की उम्र में immunosuppressed लार्वा के पेरिटोनियल गुहा में इंजेक्शन 5 प्रदर्शन किया गया है, 12। साथ ही, अनुवांशिक रूप से भिन्न ट्यूमर प्रत्यारोपण भी zebrafish 12, 13 में सूचित किया गया। xenografts का उपयोग कर के महान लाभ यह है engrafted कैंसर की कोशिकाओं को आसानी से fluorescently लेबल और सामान्य कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसलिए, microtumor गठन 14, सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस 15, 16, 17, ट्यूमर प्रेरित एंजियोजिनेसिस 15, 1 की गतिशील व्यवहार की जांच8, और कैंसर की कोशिकाओं और मेजबान के बीच संपर्क के कारकों 17 स्पष्ट रूप से जीवित मछली शरीर में देखे जा सकते हैं, खासकर जब ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों लागू किए जाते हैं 5।

डॉक्टर इंजेक्शन 16 के माध्यम से zebrafish भ्रूण: zebrafish जेनोग्राफ्ट मॉडल की उच्च क्षमता से प्रेरित होकर मेटास्टेसिस मूल्यांकन करने के लिए, हम टीजी (EGFP fli) की टेलफिन क्षेत्र में विभिन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के transvascular परिस्त्राव गुणों का प्रदर्शन। विकास कारक-β (TGF-β) 16 और हड्डी morphogenetic प्रोटीन बदलने की भूमिका (बीएमपी) प्रो- / विरोधी स्तन कैंसर कोशिका आक्रमण और मेटास्टेसिस में 19 संकेत रास्ते भी इस मॉडल में जांच की गई। इसके अलावा, हम भी intravasation perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन के साथ जेनोग्राफ्ट zebrafish मॉडल का उपयोग कर संचलन में विभिन्न स्तन कैंसर कोशिका लाइनों की क्षमता recapitulated।

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Protocol

ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट zebrafish टीजी (fli: EGFP) का उपयोग करते हुए सभी शोध तनाव है, जो हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन में इजाफा किया है (EGFP) अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार वाहिका 20 -labeled, आवास और प्रयोगों सहित बाहर किया गया था और स्थानीय संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था पशु लीडेन यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर के कल्याण (Dier Ethische Commissie (डीईसी) के लिए।

नोट: भ्रूण संग्रह (चित्रा 1 ए), microinjection (चित्रा 1 बी), स्क्रीनिंग (चित्रा 1C), और विश्लेषण (चित्रा 1 डी): चित्रा 1 में संक्षेप के रूप में, प्रोटोकॉल मोटे तौर पर चार चरणों में बांटा गया है।

1. इंजेक्शन सुई तैयार

  1. borosilicate ग्लास microcapillaries साथ इंजेक्शन सुइयों तैयार करें। निम्न सेटिंग के साथ एक micropipette खींचने डिवाइस में एक microcapillary रखो: हवा के दबाव, 500; गर्मी, 650; खींच, 100; वेग, 200; पहर,40. एक सुई धारक थाली में इंजेक्शन सुइयों जब तक वे इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाता है रखें।

2. इंजेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट, आनुवंशिक रूप से लेबल किए गए स्तन कैंसर की कोशिकाओं को तैयार

  1. संस्कृति मानव स्तन कैंसर एमडीए MB-231 DMEM-उच्च ग्लूकोज माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं एल glutamine, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1 युक्त: 100 पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप)।
  2. संस्कृति स्तन उपकला कोशिका लाइनों, MCF10A (एम 1) और MCF10A रास (M2), 37 डिग्री सेल्सियस पर DMEM / F12 मीडिया में एल glutamine युक्त 5% घोड़े सीरम, 20 एनजी / एमएल एपिडर्मल वृद्धि कारक, 10 मिलीग्राम / एमएल के साथ इंसुलिन, 100 एनजी / एमएल हैजा आंत्रजीवविष, 0.5 मिलीग्राम / एमएल hydrocortisone, और 1: 100 कलम स्ट्रेप।
  3. सह परासंक्रमित HEK293T कोशिकाओं में PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-आरआरई (गैग / पोल) 22, और pRSV-REV 22 प्लाज्मिड द्वारा mCherry lentivirus उत्पादन। हार्वेस्ट सेल supernatants 48 ज -80 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मक और दुकान के बाद।
  4. मैं5 एनजी / एमएल polybrene की उपस्थिति में सामान्य संस्कृति माध्यम के साथ 1: nfect lentiviral supernatants के साथ 24 घंटे के लिए 30% संगम पर एमडीए MB-231, एम 1, और M2 कोशिकाओं 1 पतला।
  5. एक 96 अच्छी तरह से थाली है, जो पृथक सेल क्लोन के परिणाम की अनुमति देता है में कोशिकाओं को कमजोर, स्थिर mCherry व्यक्त सेल लाइनों प्राप्त करने तक से एकल सेल क्लोन का चयन करें।
  6. इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की संस्कृति एक T75 फ्लास्क। एक 0.5% ट्रिप्सिन- EDTA उपचार के साथ 80% संगम पर कोशिकाओं जल को संचित करें। 1x पीबीएस 2-3 बार के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  7. पीबीएस के लगभग 200 μL में कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं। इंजेक्शन से पहले कम से कम 5 घंटे के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

3. इंजेक्शन के लिए Zebrafish भ्रूण तैयार

  1. Zebrafish प्रजनन जोड़े को सेट करें और के रूप में रोजेन एट अल द्वारा पिछले जौव लेख में दिखाया गया है, भ्रूण इकट्ठा। 23।
  2. भ्रूण कि unfertilized और असामान्य भ्रूण निकाल कर 0-4 HPF पर कर रहे हैं का चयन करें। एक पेट्री जिले में भ्रूण रखेंज अंडा पानी (60 माइक्रोग्राम / एमएल समुद्र लवण, ~ 60 भ्रूण / पकवान) से भरा और 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. 48 HPF पर ठीक चिमटी के साथ भ्रूण Dechorionate।
  4. उन्हें 40 माइक्रोग्राम / एमएल tricaine (3 aminobenzoic एसिड) अंडा युक्त पानी लगभग 2 मिनट इंजेक्शन से पहले, लेकिन कोई 2 से अधिक समय ज इंजेक्शन से पहले करने के लिए स्थानांतरित करके भ्रूण anesthetize।
    नोट: Tricaine शेयर समाधान (4 मिलीग्राम / एमएल, 100x) पीएच 7.4 करने के लिए समायोजित के साथ, डबल आसुत जल के 97.9 एमएल और 1 एम Tris आधार (9 पीएच) के 2.1 एमएल में tricaine पाउडर के 400 मिलीग्राम के रूप में तैयार किया जाता है। -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर।

4. सुई मानव Perivitelline अंतरिक्ष में स्तन कैंसर की कोशिकाओं

  1. लोड 15 एक इंजेक्शन की सुई में सेल निलंबन की μL। micromanipulator पर सुई माउंट और 5-10 सुक्ष्ममापी की एक टिप खोलने व्यास प्राप्त करने के लिए ठीक चिमटी के साथ सुई टिप को तोड़ने।
  2. microinjection प्रदर्शन करने के लिए एक वायवीय PicoPump और एक जोड़तोड़ का प्रयोग करें। adjuसेंट PicoPump 400 कोशिकाओं हर बार इंजेक्षन करने के लिए। इंजेक्शन करने से पहले, 1% agarose युक्त एक पेट्री डिश के शीर्ष पर कोशिकाओं इंजेक्शन लगाने के द्वारा मैन्युअल रूप से सेल नंबर गिनती।
  3. रेखा संज्ञाहरण भ्रूण (2-3 दिन बाद निषेचन (DPF)) एक फ्लैट, 1% agarose इंजेक्शन थाली पर, 10 भ्रूण हर बार के आसपास।
  4. इंजेक्शन के दौरान हाथ से इंजेक्शन प्लेट सही दिशा में रखें सुई (यानी, तिरछे) सम्मिलित करने के लिए इच्छित स्थान में भ्रूण जगह।
  5. इंजेक्शन स्थल पर सुई टिप प्वाइंट और धीरे जर्दी थैली और zebrafish भ्रूण (चित्रा 2 ए) के periderm के बीच perivitelline अंतरिक्ष में सुई टिप सम्मिलित करें।
  6. लगभग 400 mCherry लेबल ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन। सुनिश्चित करें कि जर्दी थैली जर्दी थैली में आरोपण से बचने के लिए उठी नहीं किया गया है।

5. दस्तावेज़ में मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं सम्मिलित करें

  1. के रूप में मैं वर्णित इंजेक्शन की सुई और zebrafish भ्रूण तैयार n प्रोटोकॉल 1, 2, और 3 कदम दूर है।
  2. एक 45 ° सुई कोण का प्रयोग करें ताकि डॉक्टर भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष से संपर्क किया जा सकता है।
  3. डॉक्टर (चित्रा 3 ए) का प्रारंभिक बिंदु में सुई, बस जहां वाहिनी जर्दी थैली से अधिक व्यापक बनाने शुरू होता है करने के लिए पृष्ठीय, और लगभग 400 कोशिकाओं इंजेक्षन डालें; यदि वाहिनी के भीतर मात्रा नाड़ी और जर्दी थैली के बाद सीधे फैलता इंजेक्शन सही है।
    नोट: लगातार कई इंजेक्शन सुई निकालने के बिना किया जा सकता है।
  4. अंडा पानी के लिए इंजेक्शन zebrafish भ्रूण स्थानांतरण।
    नोट: के रूप में काफी भिन्नता व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण के बीच मौजूद है, और भ्रूण के बाद इंजेक्शन हो सकता है की मृत्यु के रूप में, zebrafish भ्रूण की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में (100 के आसपास) कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन दिया जाना चाहिए।
  5. मछली और स्तनधारी कोशिकाओं के लिए इष्टतम तापमान आवश्यकताओं को समायोजित करने 33 डिग्री सेल्सियस पर zebrafish भ्रूण बनाए रखें।
_title "> 6। स्क्रीन इंजेक्ट भ्रूण

  1. Perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन के लिए 2 घंटे के बाद इंजेक्शन (HPI) (चित्रा 2) पर एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत प्रत्येक मछली स्क्रीन या डॉक्टर इंजेक्शन (चित्रा 2) के लिए 2-24 HPI पर सुनिश्चित करना है कि भ्रूण के सभी एक साथ इंजेक्ट किया जाता ट्यूमर कोशिकाओं के समान संख्या। इस तरह टूटना (चित्रा 2 बी) या जर्दी थैली के इंजेक्शन (चित्रा 3 बी) के रूप में इंजेक्शन त्रुटियों, साथ भ्रूण निकालें, और इंजेक्शन से ऊपर नीचे कोशिकाओं (आंकड़े 2C और 3 बी) या (आंकड़े 2 डी और 3 बी) सीमा के साथ भ्रूण बाहर लेने। संस्कृति में लगभग 400 कोशिकाओं के साथ ही भ्रूण रखें।
  2. संभावना है कि कोशिकाओं को पहले से ही प्रचलन में कोशिकाओं के साथ भ्रूण को हटाने के द्वारा इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान प्रचलन में सीधे पेश किया जाता है से इनकार। इसके अलावा, एक कोशिका द्रव्यमान डॉक्टर के पास (चित्रा 2 डी के साथ किसी भी भ्रूण को हटा दें

7. छवि और मेटास्टैटिक प्रक्रिया का विश्लेषण करें

  1. एक व्यापक टिप पाश्चर विंदुक के साथ कई संज्ञाहरण भ्रूण को इकट्ठा करने और उन्हें एक polystyrene पकवान की गिलास नीचे करने के लिए स्थानांतरित करें।
  2. अतिरिक्त पानी निकाल दें और अंडे पानी की एक सीमित मात्रा में रहते हैं। एक बाल पाश उपकरण के साथ स्थिति में भ्रूण में हेरफेर और कांच के शीर्ष पर एक आवरण डाल दिया।
  3. पानी विसर्जन या लंबी दूरी की सूखी उद्देश्यों के साथ संयोजन में एक औंधा कोंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। भ्रूण संभव के रूप में उद्देश्य के रूप में करीब है ऐसी है कि ब्याज की क्षेत्र स्थित करें।
  4. संज्ञाहरण के तुरंत बाद इमेजिंग प्रदर्शन तरल वाष्पीकरण की वजह से मौत का खतरा कम करने के लिए।
    1. भ्रूण पर एक ही स्थान पर EGFP लेबल वाहिका संरचना और mCherry लेबल ट्यूमर कोशिकाओं से कब्जा संकेत इंजेक्शन दो इमेजिंग चैनलों का विलय करके रक्त वाहिकाओं के साथ कोशिकाओं सह रजिस्टर करने के लिए।
    2. प्रत्येक zebrafish भ्रूण के लिए, छवियों के दो अलग सेट इकट्ठासिर क्षेत्र और पूंछ क्षेत्र से।
  5. प्रचारित कोशिकाओं की संख्या यों।
    1. Perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन के लिए, प्रत्येक मछली में कोशिकाओं है कि सिर और पूंछ क्षेत्रों 4, 15 के भीतर भ्रूण मछली शरीर के प्रति कोशिका द्रव्यमान से प्रचारित किया है की संख्या की गणना; क्षेत्रों तैरना मूत्राशय पृष्ठीय रूप से शीर्ष पर, सामने की ओर से दिल गुहा की सीमाओं से परे हैं, और मूत्रजननांगी खोलने परे दुमदारी।
    2. डॉक्टर इंजेक्शन के लिए, व्यक्तिगत कोशिकाओं या की दुम hematopoietic ऊतक (CHT) में कोशिकाओं को सामूहिक रूप से (M2) द्वारा गठित समूहों की संख्या कि संचलन (एमडीए MB-231) से टेलफिन की मज्जा तंतुओं पर आक्रमण किया है की संख्या की गणना प्रत्येक 19 zebrafish।
  6. कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और अधिक विस्तार में आक्रमण और मेटास्टेसिस अध्ययन (अत्यधिक की सिफारिश की)।
    1. छवि पूरी करने के लिए कम आवर्धन (4 एक्स उद्देश्य) का उपयोग करेंशरीर और ट्यूमर कोशिका प्रसार पैटर्न के एक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए।
      नोट: उच्चतर आवर्धन (20X और 40X उद्देश्यों) अंतर और पेरी tumoral एंजियोजिनेसिस और भ्रूण के शरीर में फैलाया कोशिकाओं के सटीक स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए उपयुक्त है।
    2. प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं लाल प्रतिदीप्ति के साथ लेबल स्कैन करने के लिए zebrafish भ्रूण वाहिका संरचना और एक 543 एनएम लेजर स्कैन करने के लिए एक 488 एनएम लेजर का उपयोग करें। आठ से दस चरणों में प्रत्येक भ्रूण को स्कैन करके एक उच्च गुणवत्ता वाले छवि प्राप्त करें। स्कैन और प्रत्येक चरण के छह बार औसत निकालते हैं।
  7. ध्यान से अंडे पानी में वापस भ्रूण जगह अगर यह आगे के प्रयोगों के लिए आवश्यक है।

8. विचरण (एनोवा) में से एक तरह से विश्लेषण का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करना पोस्ट अनौपचारिक विश्लेषण इसके उपरांत

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Representative Results

एक perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन के साथ भ्रूण जेनोग्राफ्ट zebrafish मॉडल में, मछली के शरीर में लेबल कैंसर कोशिकाओं के प्रसार hematogenous सक्रिय माइग्रेशन के रूप में माना जाता है। इस प्रक्रिया का पता चला और इसके बाद के संस्करण के तरीकों में वर्णित है, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे की मात्रा निर्धारित की जा सकती है। इस जेनोग्राफ्ट मॉडल समझने के लिए, हम इन विट्रो करने के लिए और, HRAS-बदल premalignant सौम्य सामान्य स्तन उपकला एम 1 कोशिकाओं सहित विवो माउस अध्ययन, में अनुसार ज्ञात (या बिना) आक्रमण / मेटास्टेसिस क्षमता के साथ अलग अलग स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के प्रचार-प्रसार प्रक्रिया का पालन M2 कोशिकाओं, और अत्यधिक मेटास्टेटिक एमडीए MB-231 कोशिकाओं, 1 दिन के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) आगे। एक उच्च संकल्प कोंफोकल माइक्रोस्कोपी छवि से पता चला कि एमडीए MB-231 कोशिकाओं (लाल) perivitelline अंतरिक्ष में अनियमित सीमाओं के साथ, एक आक्रामक phenotype दिखा रहे हैं। Pseudopodia की तरह उभार और आक्रामक मोर्चों भी अक्सर उपस्थित थे (चित्रा 4 ए, बाएं)। कुछ कोशिकाओं (, चित्रा 4 ए दाएं) के रूप में जल्दी 1 डीपीआई के रूप में रक्त परिसंचरण में फैलाया। 2 डीपीआई में स्पष्ट प्रसार मछली के बाहर का भागों में मनाया गया (चित्रा 4 ए, दाएं)। प्रचारित कोशिकाओं की संख्या 3 डीपीआई (चित्रा 4 ए और 4D) पर आगे बढ़ गया। इसके विपरीत, जब M2 कोशिकाओं zebrafish में चुनौती दी गई है, वे मछली के शरीर में मामूली प्रसार 2 डीपीआई (चित्रा 4 बी) के बाद प्रदर्शन किया। उन्होंने यह भी वृद्धि हुई प्रसार समय बीत के बाद (चित्रा 4F) से पता चला है। जैसा कि चित्र 4C और 4 जी में दिखाया गया है, एम 1 कोशिकाओं बार बार zebrafish संचलन में प्रचारित किया, और यहां तक सक्रिय स्थानीय प्रवास perivitelline अंतरिक्ष के भीतर अवलोकन की अवधि के दौरान निराला था। एम 1 कोशिका द्रव्यमान लगभग मूल इंजेक्शन स्थल पर हिरासत में ले लिया गया था। मछली के शरीर में सकारात्मक प्रचार-प्रसार या> 5 कोशिकाओं के रूप में मेटास्टेसिस को परिभाषित करते हैंएस एस = "xref"> 4, एमडीए MB-231 और M2 सेल मेटास्टेसिस 92% और मछली के 57%, क्रमशः में मनाया गया, 3 डीपीआई (चित्रा 4 जी) पर। इसके विपरीत, कोई सकारात्मक प्रसार एम 1 कोशिकाओं के साथ मनाया गया। इसलिए, मानव कैंसर कोशिका प्रगति के इस zebrafish मॉडल सटीक चूहों में विभिन्न कोशिकाओं के मेटास्टेटिक संभावित के रिश्तेदार स्तर को दर्शाता है। Neovascularization (हरा) कि भ्रूण zebrafish की subintestinal जाल से अंकुरित और प्रवेश एमडीए MB-231 या M2 कोशिका द्रव्यमान भी ऊष्मायन (चित्रा 4 ए और 4 बी के 3 दिन के बाद ट्यूमर कोशिकाओं के perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन के बाद उपस्थित थे, छोड़ दिया )। प्रसार में विकलांगता के अनुरूप, केवल मामूली neovascularization एम 1 सेल आरोपण (चित्रा 4C) पर खोजा गया था।

mCherry लेबल एमडीए MB-231 कोशिकाओं के साथ भ्रूण जेनोग्राफ्ट zebrafish मॉडल और डॉक्टर इंजेक्शन, प्रयोगशाला मेंzebrafish की टेलफिन में eLED कैंसर की कोशिकाओं को सक्रिय तरल पदार्थ का स्त्राव का प्रतिनिधि माना जाता है। mCherry लेबल एमडीए MB-231 कोशिकाओं 2 DPF पर इंजेक्ट किया गया। 3 डीपीआई पर, कोशिकाओं टेलफिन, जो कोलेजन के साथ समृद्ध है करने के लिए वाहिकाओं से बाहर स्थानांतरित करने के लिए शुरू कर दिया। एकल एमडीए MB-231 कोशिकाओं एक दूर टेलफिन (चित्रा 5 ए) के लिए स्वतंत्र रूप से वाहिकाओं से एक-एक करके चले गए,। 6 डीपीआई में आक्रमण कोशिकाओं है कि टेलफिन ऊतक में स्थानांतरित की संख्या की गणना मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। mCherry लेबल M2 सेल डॉक्टर इंजेक्शन मॉडल में, इंजेक्शन भी 2 DPF पर प्रदर्शन किया था। हालांकि, एक क्लस्टर फेनोटाइप सक्रिय तरल पदार्थ का स्त्राव की प्रक्रिया के दौरान देखा गया था। 1 डीपीआई में M2 कोशिकाओं zebrafish की CHT में वाहिकाओं से बाहर स्थानांतरित करने के लिए शुरू कर दिया। 2 डीपीआई में माइग्रेट M2 कोशिकाओं CHT (चित्रा 5 ब) में जहाजों के बीच एक क्लस्टर के रूप में शुरू कर दिया। CHT क्षेत्र में M2 आक्रामक सेल क्लस्टर नंबर की मात्रा में आयोजित किया जा सकता है6 डीपीआई।

आकृति 1
चित्र 1: भ्रूण zebrafish में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार की जांच के लिए मुख्य चरणों। (ए) रात भर माता पिता का zebrafish को पार करने के बाद, टीजी (fli1: EGFP) zebrafish भ्रूण अगली सुबह एकत्र किए गए थे और 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। (बी) भ्रूण एक stereomicroscope 48 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के तहत ठीक चिमटी के साथ dechorionated रहे थे। लेबल स्तन कैंसर की कोशिकाओं एकत्र किए गए थे और पीबीएस की एक छोटी राशि में फिर से निलंबित कर दिया। अच्छी तरह से तैयार करने के बाद, निलंबित कोशिकाओं एक सुई में लोड कर रहे थे। लगभग 400 कोशिकाओं stereomicroscope के तहत perivitelline अंतरिक्ष के Cuvier (डॉक्टर) की वाहिनी में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन भ्रूण 33 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। (सी) 2 घंटे के बाद इंजेक्शन (HPI), भ्रूण सीए का शिकार हुएएक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत REFUL स्क्रीनिंग। भ्रूण 3 या 6 दिनों के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। अंतराल के दौरान भ्रूण तैयार किया गया उपचार का शिकार हुए। (डी) perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन या आक्रमण से कैंसर कोशिका प्रसार डॉक्टर इंजेक्शन द्वारा, का पता चला गिना, और कोंफोकल माइक्रोस्कोपी 3 या 6 दिन के बाद इंजेक्शन (डीपीआई) से ली गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: Perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन साइट और आम त्रुटियों। (ए) लगभग 400 mCherry लेबल कोशिकाओं (एमडीए MB-231) perivitelline अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया गया था। brightfield (ऊपरवाला), हरा वाहिका (मध्य ऊपरी), और लाल कोशिका द्रव्यमान (मध्य कम) डालेगी कीएड zebrafish भ्रूण कोंफोकल माइक्रोस्कोप द्वारा कब्जा कर लिया गया। तीन चैनलों के मर्ज किए गए छवि (सब से नीचा) भ्रूण में कोशिका द्रव्यमान का स्टीरियो स्थान को दर्शाता है। (बी) कोशिकाओं को उचित रूप से perivitelline अंतरिक्ष को लक्षित नहीं किया। जर्दी थैली उठी किया गया था। (सी) सीमा (ज्यादा 400 से भी कम समय) नीचे इंजेक्शन कोशिकाओं। (डी) इंजेक्ट कोशिकाओं ऊपर सीमा (ज्यादा 400 से अधिक)। कोशिका द्रव्यमान भी कुवियर की वाहिनी है, जो एक व्यापक रक्त प्रवाह है के करीब था। स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: Cuvier (डॉक्टर) इंजेक्शन की वाहिनी का अवलोकन। 2 दिन बाद निषेचन पर डॉक्टर इंजेक्शन के (ए) योजनाबद्ध (घपीएफ) zebrafish भ्रूण में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के साथ। तीर डॉक्टर इंगित करता है। (बी) के सकारात्मक इंजेक्शन के उदाहरण हैं, लगभग 400 स्तन कैंसर की कोशिकाओं के साथ; जर्दी misinjection सहित नकारात्मक इंजेक्शन,; और कोशिकाओं की गलत संख्या 4 HPI में इंजेक्ट किया। तीर और हलकों इंजेक्शन कोशिकाओं से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: विभिन्न स्तन सेल लाइनों के बीच प्रसार की क्षमता की तुलना। लगभग 400 mCherry लेबल एमडीए MB-231, MCF10Aras (M2), या MCF10A (एम 1) कोशिकाओं zebrafish भ्रूण 48 hpf की perivitelline अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया गया था। इंजेक्शन भ्रूण 3 दिनों के लिए पीछा किया गया था। (ए, बी, और सी) उच्च resolution एमडीए MB-231 (ए), एम 2 (बी) के प्रतिनिधि के प्रवास और प्रसार प्रक्रिया दिखाते हुए सूक्ष्मग्राफ, और व्यक्तिगत भ्रूण निकायों 1, 2 में एम 1 (सी) कोशिकाओं, और 3 दिन के इंजेक्शन के बाद (डीपीआई)। वाम, perivitelline अंतरिक्ष (लाल) और peritumoral और intratumoral वाहिका (हरा) में कोशिका प्रवास। पीला संकेत microvessels और कोशिकाओं के ओवरलैप संकेत मिलता है। मध्य, भ्रूण के पूरे छवि। ठीक है, भ्रूण के पीछे में फैलाया कोशिकाओं के दृश्य। पीला तीर एकल फैलाया कोशिकाओं से संकेत मिलता है। स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी =। (डी, ई, और एफ) 1, 2, और 3 डीपीआई पर प्रत्येक भ्रूण शरीर में फैलाया कोशिकाओं की संख्या की मात्रा। परिणाम SEM ± मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। विचरण (एनोवा) की एक तरह से विश्लेषण के बाद अनौपचारिक विश्लेषण के बाद से परिणाम दिखाए जाते हैं। पी <0.05 (सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में स्वीकार कर लिया गया * 0.01 <पी <0.05, ** 0।001 <पी <0.01; *** पी <.001। (G) 1, 2, और 3 डीपीआई पर भ्रूण शरीर में एमडीए MB-231, एम 2, और एम 1 कोशिकाओं के लिए intravasation की घटनाओं की तुलना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: कुवियर इंजेक्शन की वाहिनी के साथ zebrafish में एमडीए MB-231 और M2 सेल मेटास्टेसिस के विभिन्न व्यवहार। (ए) zebrafish के प्रतिनिधि कोंफोकल छवियों zebrafish में एमडीए MB-231 कोशिकाओं के एकल सेल प्रवास व्यवहार दिखाने के लिए 3, 4, और 5 डीपीआई पर पीछा किया। तीर आक्रामक एमडीए MB-231 कोशिकाओं है कि tailfins में जहाजों से बाहर चले गए संकेत मिलता है। स्केल बार बाएँ स्तंभ में = 200 सुक्ष्ममापी, अधिकार स्तम्भ में 50 सुक्ष्ममापी। (बी) के प्रतिनिधिzebrafish की कोंफोकल छवियों zebrafish में M2 कोशिकाओं के सेल क्लस्टर प्रवास व्यवहार दिखाने के लिए 1, 2, और 3 डीपीआई पर पीछा किया। तीर आक्रामक M2 कोशिकाओं है कि दुम hematopoietic ऊतक (CHT) करने के लिए वाहिकाओं से बाहर चले गए और जहाजों के बीच एक क्लस्टर का गठन संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Zebrafish भ्रूण, perivitelline अंतरिक्ष और डॉक्टर इंजेक्शन के साथ: यहाँ, हम टीजी (EGFP fli1) में स्तन कैंसर की कोशिकाओं के आक्रामक व्यवहार की जांच के लिए दो विधियों का वर्णन किया। रासायनिक डाई या ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के द्वारा, आक्रमण और मेटास्टेसिस के गतिशील और स्थानिक विशेषताओं स्पष्ट रूप से एकल कक्ष या एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे क्लस्टर स्तर पर वास्तविक समय में ट्रैक किया जा सकता। ज्यादातर मामलों में, zebrafish में मेटास्टेसिस के तेजी से प्रगति सुनिश्चित करता है कि परख प्रत्यारोपण के बाद 1 सप्ताह के भीतर किया जा सकता है। इसके अलावा, शक्तिशाली आंकड़े मछली की बड़ी साथियों के साथ प्राप्त किया जा सकता।

मेटास्टेटिक झरना के प्रारंभिक और देर घटनाओं नकली और perivitelline अंतरिक्ष या डॉक्टर, क्रमशः में कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के द्वारा recapitulated किया जा सकता है। perivitelline अंतरिक्ष मछली की periderm और जर्दी थैली, जो allo के बीच सीमित स्थान हैws एक जीवित शरीर में प्राथमिक साइटों से एक ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार की निगरानी के लिए। आरोपण के बाद, कैंसर की कोशिकाओं को perivitelline अंतरिक्ष के भीतर स्थानीय प्रवास और आक्रमण (प्राथमिक साइट माना जाता है) से गुजरना और फिर वे रक्त वाहिकाओं में intravasate और रक्त परिसंचरण के साथ प्रसार। सिर और टेलफिन (माना दूर लक्ष्य साइटों) में कैंसर की कोशिकाओं को संकीर्ण केशिका बेड और बहना में जमा। इसलिए, मछली शरीर में दूर के स्थानों पर पाए जाते हैं कि कोशिकाओं की संख्या मेटास्टेटिक क्षमता का पैमाना है। इसके अलावा, अधिक extravasated कोशिकाओं बाद में समय अंक है, जो भी डॉक्टर इंजेक्शन परख का सच है पर देखा जा सकता है।

डॉक्टर एक व्यापक रक्त प्रवाह 24 के साथ एक बढ़े हुए आम कार्डिनल नस है। सीधे डॉक्टर को लक्षित कर के रूप में एक इंजेक्शन साइट संचार प्रणाली में कैंसर की कोशिकाओं को प्रस्तुत करता है। अभ्यास में, स्तन कैंसर की कोशिकाओं के माध्यम से भ्रूण पूरे शरीर में फैलानाडॉक्टर इंजेक्शन के बाद रक्त प्रवाह तुरन्त। कोशिकाओं तो दुम नस और पृष्ठीय महाधमनी में गिरफ्तार। तरल पदार्थ का स्त्राव, आक्रमण, और micrometastasis गठन 6 दिनों के भीतर क्रमिक मनाया जा सकता है। जैसा कि पहले 16 सूचना दी, मेटास्टैटिक एमडीए MB-231 कोशिकाओं और premalignant स्तन M2 कोशिकाओं विभिन्न आक्रामक समलक्षणियों दिखा रहे हैं। एमडीए MB-231 कोशिकाओं कोलेजन मैट्रिक्स युक्त टेलफिन की एकल कोशिका आक्रमण गुज़रना पड़ता है। इस प्रकार, एमडीए MB-231 कोशिकाओं के आक्रमण संभावित कोशिकाओं है कि extravasated और टेलफिन ऊतक पर आक्रमण किया है की संख्या की गणना के द्वारा मापा जा सकता है। इसके विपरीत, M2 कोशिकाओं विभिन्न आकार के समूहों फार्म और CHT की सामूहिक आक्रमण गुज़रना पड़ता है। इस प्रोटोकॉल में समूहों की संख्या की गणना M2 कोशिकाओं के आक्रमण क्षमता मात्र निर्धारण मुश्किल है और अच्छा होगा यदि कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एक 3 डी छवि बनाने और क्लस्टर ट्यूमर कोशिकाओं की मात्रा का निर्धारण द्वारा किया जाता है।

में कैंसर कोशिका सूक्ष्म तकनीकी चुनौतीइंजेक्शन सफलतापूर्वक perivitelline अंतरिक्ष या डॉक्टर लक्षित कर रहा है। भ्रूण की बड़ी संख्या के microinjection एक उच्च कुशल और रोगी ऑपरेटर की आवश्यकता होती है एक कठिन प्रक्रिया है। , जब इंजेक्शन इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या में मतभेद, और जर्दी थैली में कोशिकाओं के रिसाव कारक है कि अलग-अलग मछली में परिणाम में बदलाव के लिए योगदान भ्रूण के विकास मंच शामिल हैं। हालांकि दुर्लभ, हेरफेर अनजाने वाहिका संरचना घुसना और विशेष रूप से perivitelline अंतरिक्ष इंजेक्शन में सीधे संचार प्रणाली में कोशिकाओं का परिचय, कर सकता है। आगे भिन्नता को कम करने के लिए और विश्लेषण की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, सूक्ष्म परीक्षण प्रक्रिया के दौरान समय बिंदुओं पर अयोग्य मछली को बाहर करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, एक पेशेवर द्वारा विश्लेषण अंधा सेटिंग के ज्ञान के बिना दृढ़ता से निष्पक्ष मात्रा प्राप्त करने के लिए सुझाव दिया है।

संक्षेप में, दो मॉडल हम यहाँ शुरू की पर प्रकाश डालाआक्रामक तरीके के बिना विवो में सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस की प्रक्रिया visualizing। हालांकि हम केवल मेटास्टेटिक संभावित संबंध में दो मॉडल में स्तन कैंसर की कोशिकाओं का अध्ययन किया, वे कैंसर के अन्य प्रकार की वाग्विस्तार जा सकता है। इसके अलावा, मॉडल तंत्र और नया आणविक (एपि) आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग कर कैंसर कोशिका मेटास्टेसिस को नियंत्रित करने के लक्ष्यों को निर्धारित करने में व्यापक अनुप्रयोगों हो सकता था। खिला या कृन्तकों 25 के इंजेक्शन की तुलना में छोटे अणु यौगिकों द्वारा zebrafish भ्रूण के उच्च भेद्यता के कारण, दो प्रस्तुत मॉडल भी संभावित नए आक्रमण-विरोधी / मेटास्टेसिस दवाओं की उच्च throughput स्क्रीनिंग के मामले में फायदे हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

TGF-β परिवार के सदस्यों पर अध्ययन कैंसर जीनोमिक्स केंद्र नीदरलैंड द्वारा समर्थित हैं। सिजिया लिउ और जियांग रेन लीडेन विश्वविद्यालय में अध्ययन के 4 साल के लिए चीन छात्रवृत्ति परिषद द्वारा समर्थित हैं। हम MCF10A सेल लाइनों के लिए डॉ फ्रेड मिलर (बारबरा एन Karmanos कैंसर संस्थान, डेट्रॉइट, MI, संयुक्त राज्य अमरीका) धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose MP Biomedicals AGAF0500
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 300038
Cholera enterotoxin  Calbiochem 227035
Confocal microscope Leica SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 21041025
Dumont #5 forceps Fine Science Tools Inc 11252-20
Epidermal growth factor Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum  ThermoFisher Scientific 16140071
Fluorescent stereo microscope Leica M165 FC
HEK293T cell line American Type Culture Collection CRL-1573
Hydrocortisone SigmaAldrich 227035
Horse serum ThermoFisher Scientific 26050088
Insulin SigmaAldrich I-6634
MCF10A (M1) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MCF10Aras (M2) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MDA-MB-231 cell line American Type Culture Collection CRM-HTB-26
Manual micromanipulator  World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller Sutter Instruments P-97 
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) Eppendorf F276456I
pCMV-VSVG plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PLV-mCherry plasmid Addgene 36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Polybrene SigmaAldrich 107689
Prism 4 software GraphPad Software
pRSV-REV plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope Leica MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base SigmaAldrich 11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid) SigmaAldrich A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher Scientific 15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) SigmaAldrich P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom WillCo GWST-5040

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References

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