胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ren, J., Liu, S., Cui, C., ten Dijke, P. Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55459, doi:10.3791/55459 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

多くの場合、癌患者は、原発腫瘍で死ぬのではなく、理由転移のしないでください。多数のげっ歯類モデルは、in vivoで癌転移を研究するために利用可能であるが、他の効率的な、信頼性の高い、低コストのモデルはすぐに(エピ)の遺伝的変化または薬理学的化合物の潜在的な効果にアクセスするために必要とされています。そのため、我々は説明し、この目標をサポートするために、ゼブラフィッシュの胚に注入ヒト乳癌細胞を用いた異種移植モデルの実現可能性を説明します。顕微鏡下で、蛍光タンパク質または化学的に標識されたヒト乳癌細胞は、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に移植され、Tgは(FLI:EGFP)、48時間受精後囲卵腔またはキュビエ(DOC)のダクトに。まもなくして、生きている魚の体内の癌細胞の浸潤、普及、および転移の時間的・空間的なプロセスは、蛍光顕微鏡下で可視化されます。別の注射部位を使用したモデル、 すなわち、あたりivitellineスペースまたはドキュメントは、イベントの多段階転移カスケードの初期段階(血管内のステップ)及び後期(血管外遊出ステップ)を反映し、互いに相補的です。また、腫瘍周囲および腫瘍内血管新生は囲卵腔への注射を用いて観察することができます。全実験期間は、これ以上の8日未満です。これらの2つのモデルが、遺伝的および薬理学的操作に応じて、癌転移の迅速な評価を可能にする、細胞標識、マイクロ移植、および蛍光イメージング技術を兼ね備えています。

Introduction

クリニックでの明白な癌の転移は「転移カスケード」として知られ、複雑で多段階の一連のイベントを含みます。カスケードは広く概説されており、連続したステップに解剖することができます:局所浸潤、脈管内、普及、逮捕、血管外漏出、および植民地化1、2。癌転移の病因の理解とin vivoでの潜在的な治療戦略の開発は、癌細胞の広がりの強力なホストモデルが必要です。げっ歯類のモデルは十分に確立され、広く転移3を評価するために使用されているが、これらのアプローチは、低効率性と倫理的な限界があり、特定の操作が転移性の表現型に影響を与える可能性があるかどうかを判断するために最先端モデルとして高価です。その他の効率的な、信頼性の高い、低コストのモデルはすぐに(エピ)遺伝的変化やpharmacologの潜在的な影響へのアクセスに必要なiCalの化合物。その高い遺伝ヒトに対する相同性およびその胚のゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ )の透明性に重要な脊椎動物のモデルとして浮上していると、ますます発達プロセス、微生物宿主相互作用、ヒトの疾患、薬物スクリーニングなどの研究に適用されています。4。ゼブラフィッシュに設立された癌転移モデルは、齧歯類モデル5、6の欠点に対する答えを提供することができます。

自発的新生物はほとんど野生ゼブラフィッシュ7に見られないが、ゼブラフィッシュにおいて所望癌を誘発するためのいくつかの長年の技術があります。発癌物質誘発性の遺伝子突然変異またはシグナル伝達経路の活性化は、組織学的および分子モデル発癌、ゼブラフィッシュ7、8、9、ヒト疾患を模倣することができます。 TAKにより、前方多様の利点をすると、癌遺伝子または腫瘍抑制因子の遺伝子操作を逆に、(遺伝子組換え)ゼブラフィッシュまた、癌の形成と維持6、10の潜在的な研究を有効にしています。ゼブラフィッシュにおける誘導癌モデルは、消化器、生殖、血液、神経系、および上皮6を含む広いスペクトルをカバーしています。

癌研究におけるゼブラフィッシュの利用はこれによる生物におけるヒト腫瘍細胞の異種移植モデルの確立に最近拡大しています。これは、最初に成功した2005年11胞胚段階でゼブラフィッシュの胚に移植したヒト転移メラノーマ細胞で報告されました。いくつかの独立した研究室では、様々なサイトや発達段階でゼブラフィッシュへの哺乳動物の癌細胞株の多様な範囲を導入することで、この先駆的な仕事の実現可能性を検証してきた5 </ SUP>。例えば、胚盤および胞胚期の胚盤胞の近くに注射します。 5日齢の胚に卵黄嚢、卵黄周囲スペース、キュビエ(DOC)のダクト、及び6-H-の後部主静脈への注射;および30日齢の免疫抑制幼虫の腹腔内への注射は、5、12行ってきました。また、同種異系腫瘍移植もゼブラフィッシュ12、13で報告されました。異種移植片を使用しての大きな利点の一つは、移植された癌細胞が簡単に蛍光標識し、正常細胞と区別することができるということです。したがって、microtumor形成14、細胞浸潤および転移15、16、17、腫瘍誘導血管形成15、1の動的挙動の調査8、および癌細胞とホスト間の相互作用は、トランスジェニックゼブラフィッシュの行は5に適用されている場合は特に、17は明らかに生きた魚の体に可視化することができる要因。

ドク注射〜16ゼブラフィッシュの胚転移を評価するために、ゼブラフィッシュ異種移植モデルの高電位に触発され、我々は、Tgは(EGFP FLI)の尾翼領域に異なる乳癌細胞株の経血管外遊出の性質を示しました。プロ/抗乳癌細胞の浸潤や転移におけるトランスフォーミング増殖因子βの役割(TGF-β)16と、骨形成タンパク質(BMP)19のシグナル伝達経路はまた、このモデルで検討しました。また、我々はまた、卵黄周囲スペース注射で異種移植ゼブラフィッシュモデルを使用して循環に様々な乳癌細胞株の脈管内の能力を再現し。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

トランスジェニック蛍光ゼブラフィッシュのTg(FLI:EGFP)を使用して、すべての研究緑色蛍光タンパク質(EGFP)を増大した株は、住宅や実験を含む、血管系20を標識は、国際的なガイドラインに従って行ったと地元の制度委員会によって承認されましたライデン大学医療センターの動物福祉(DIER Ethische Commissie(DEC)のために。

注:胚の収集( 図1A)、マイクロインジェクション( 図1B)、スクリーニング( 図1C)、及び分析( 図1D)。 図1にまとめたように、プロトコルは、大きく4つのステップに分解されます。

1.注射針を準備

  1. ホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリーに注射針を準備します。次の設定でマイクロピペットプラー装置にマイクロキャピラリーを入れ:空気圧、500。熱、650。 、100を引きます。速度、200;時間、これらは、注射のために使用されるまで40針ホルダプレートに注射針を保ちます。

2.注射用蛍光灯、遺伝的に標識乳癌細胞を準備します

  1. 100ペニシリン - ストレプトマイシン(ペニシリン - ストレプトマイシン):L-グルタミン、10%ウシ胎児血清、および1を含むDMEM高グルコース培地中で37℃で培養ヒト乳癌MDA-MB-231細胞。
  2. 培養5%ウマ血清、20ng / mlの上皮増殖因子、の10mg / mlのL-グルタミンを含むDMEM / F12培地中で37℃で乳房上皮細胞株MCF10A(M1)およびMCF10A-RAS(M2)、インスリン、100ng / mlのコレラエンテロトキシン、を0.5mg / mLのヒドロコルチゾン、および1:100ペニシリン - ストレプトマイシン。
  3. HEK293T細胞にPLV-mCherryを、のpCMV-VSVG 21、pMDLg-RRE(GAG / POL)22、とのpRSV-REV 22プラスミドを共トランスフェクトすることによってmCherryをレンチウイルスを産生します。収穫細胞上清を-80℃でトランスフェクションし、店舗48時間後。
  4. 私5 / mlのポリブレンの存在下で通常の培地で1:nfectレンチウイルス上清と共に24時間、30%コンフルエンスでMDA-MB-231、M1、およびM2細胞は、1に希釈しました。
  5. 安定mCherryを発現する細胞株が得られるまで、単離された細胞クローンの増殖を可能にする96ウェルプレートに細胞を希釈することによって、単一細胞クローンを選択します。
  6. 注射のための細胞の培養1つのT75フラスコ。 0.5%トリプシン-EDTA処理で80%コンフルエンスで細胞を採取。 1×PBS 2~3時間で細胞を洗浄。
  7. PBSの約200μLで細胞を再懸濁。注射の前に、以下の5時間のためにそれら4°Cで保存。

3.注射用ゼブラフィッシュ胚を準備します

  1. ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、ローゼンによる以前のJoveの記事に示されるように、胚を収集します 23。
  2. 未受精卵や胚の異常を除去することにより、0-4 HPFである胚を選択します。ペトリDISに胚を保ちます卵水(60 / mlの海の塩;〜60個の胚/皿)の完全な時間とは、28℃でインキュベートします。
  3. 48 HPFで細かいピンセットで胚をDechorionate。
  4. しかし、もう2時間よりも注射前、注射前に卵の水、約2分を含有する40μgの/ mLのトリカイン(3-アミノ安息香酸)に転送することによって胚を麻酔ありません。
    注:トリカインストック溶液(4 mg / mlと、100X)7.4にpH調整して、二重蒸留水97.9 mLの1 Mトリス塩基(pHを9)の2.1 mLのトリカイン粉末400mgのように調製されます。 -20°Cの冷凍庫に保管してください。

4.卵黄周囲空間にヒト乳癌細胞を注入

  1. 注射針への細胞懸濁液の負荷15μL。マイクロマニピュレーターに針をマウントし、5〜10ミクロンの先端開口径を得るために、細いピンセットで針の先端を断ちます。
  2. マイクロインジェクションを実行するために、空気圧picopumpとマニピュレータを使用してください。 AdjuST 400個のセルごとに注入するpicopump。注射前に、1%アガロースを含むペトリ皿の上に細胞を注入することによって手動で細胞数を数えます。
  3. 10個の胚各年頃ラインナップ麻酔胚フラット、1%アガロース注入プレート上の(2-3日後に受精(DPF))。
  4. すなわち 、斜めに)針を挿入するための好ましい位置に胚を配置する注射中に手でオリエント噴射板。
  5. 注射部位に針の先端を指し、穏やかに卵黄嚢およびゼブラフィッシュ胚( 図2A)の周皮との間の囲卵腔に針の先端を挿入します。
  6. 約400 mCherryを標識腫瘍細胞を注入します。卵黄嚢は、卵黄嚢への移植を避けるために破裂されていないことを確認します。

5.ドキュメントにヒト乳癌細胞を注入

  1. 私が説明するように、注射針やゼブラフィッシュの胚を準備します Nプロトコルは、1,2、及び3の手順。
  2. ドクは、胚の背側からアプローチすることができるように45°の角度針を使用してください。
  3. ちょうどダクトが卵黄嚢の上に広げる始まるまで背側、及び約400細胞を注入し、ドク( 図3A)の出発点に針を挿入します。ダクト内の容積は、パルスと卵黄嚢の後に直接膨張場合注射が正確です。
    注:いくつかの連続した注射針を抽出することなく行うことができます。
  4. 卵の水に注入ゼブラフィッシュ胚を転送します。
    注:としてかなりの変動は、個々のゼブラフィッシュ胚の中に存在し、注入後の胚の死が起こり得るように、(100程度)ゼブラフィッシュ胚の比較的多数の癌細胞を注入しなければなりません。
  5. 魚および哺乳動物細胞のための最適な温度要件に対応するために33°Cでのゼブラフィッシュ胚を維持します。
_title "> 6。注入した胚を選別

  1. 囲卵腔注射2時間後噴射(HPI)( 図2)における蛍光実体顕微鏡下で各魚をスクリーニングまたはドキュメントの注入( 図2)のための2-24 HPIで胚の全てを用いて注入されることを確実にするために腫瘍細胞の同様の数。卵黄嚢のような破裂( 図2B)、または注射などの注射エラー、( 図3B)で胚を削除し、以下注入された細胞( 図2Cおよび3B)を有する、または( 図2Dおよび図3B)上記胚を取り出す閾値。文化の中で約400細胞と胚のみを保管してください。
  2. 細胞は、すでに流通している細胞と胚を除去することにより、射出プロセス中に循環内に直接導入される可能性を排除します。また、ドキュメント質量近い細胞( 図2dで任意胚を除去

7.画像および転移プロセスを分析

  1. ワイドチップパスツールピペットを用いていくつかの麻酔胚を収集し、ポリスチレンディッシュのガラス底部に転送します。
  2. 過剰の水を除去し、卵の水の限られた量を保ちます。髪のループツールを使用して所定の位置に胚を操作し、ガラスの上にカバーを置きます。
  3. 水浸や長距離ドライ目標と組み合わせて倒立共焦点顕微鏡を使用してください。関心領域は、可能な限り客観的に近くなるように胚を置き。
  4. 液体の蒸発による死亡のリスクを軽減するために、すぐに麻酔後に撮影を行います。
    1. 同時登録2つの撮像チャネルをマージすることにより、血管を有する細胞を注入する胚の同じ位置におけるEGFP標識血管系およびmCherryを標識した腫瘍細胞からの信号を捕捉します。
    2. 各ゼブラフィッシュの胚のために、画像の2つの異なるセットを収集頭部と尾部から。
  5. 散在性細胞の数を定量化します。
    1. 囲卵空間注射のために、ヘッドとテール領域4,15内胚魚の体に向かって細胞塊から播種した各魚における細胞の数を数えます。領域は浮き袋の背側の上に、正面心腔の境界を越えており、泌尿生殖器の開口部を越えて尾側に。
    2. ドキュメントの注射のために、個々の循環(MDA-MB-231)から尾翼のコラーゲン繊維に侵入した細胞または尾造血組織(CHT)の中の細胞まとめ(M2)によって形成されるクラスタの数の数を数えますそれぞれが19をゼブラフィッシュ。
  6. 共焦点顕微鏡を使用して、より詳細に浸潤・転移を研究する(強く推奨)。
    1. 画像全体に低倍率(4Xの目標)を使用します腫瘍細胞の普及パターンの概要を取得するために、本体と。
      注:高倍率(20Xと40Xの目標は)内および腫瘍周囲の血管形成および胚体内における播種細胞の正確な局在を研究するのに適しています。
    2. 赤色蛍光で標識した移植された腫瘍細胞をスキャンするためにゼブラフィッシュ胚の血管系と543 nmのレーザーをスキャンするために488nmのレーザーを使用してください。 8〜10の手順で各胚をスキャンすることで、高品質な画像を得ます。 6回スキャンし、各ステップを平均化します。
  7. それがさらなる実験のために必要な場合は慎重に卵水に戻す胚を置きます。

8. 事後解析が続く分散(ANOVA)の一方向分析を用いた統計解析を実行します

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

囲卵腔注入して胚性異種移植ゼブラフィッシュモデルでは、魚の体中の標識された癌細胞の血行性の普及を積極的移行と考えられています。上記の方法に記載のように、このプロセスは、蛍光顕微鏡下で検出および定量することができます。この異種移植モデルを説明するために、我々は、in vitroに応じて公知の(又は無し)浸潤/転移電位と異なる乳癌細胞株の普及過程を追跡し、良性の正常乳房上皮M1細胞、HRAS形質転換前悪性含むインビボマウス研究 M2細胞、および高転移性MDA-MB-231細胞、以降1日の注射後(DPI)。高解像度の共焦点顕微鏡画像は、MDA-MB-231細胞(赤色)は囲卵腔に不規則な境界と、攻撃的な表現型を示すことを示しました。偽足状の突起と侵襲前線も頻繁に存在していました ( 図4A、左)。少数の細胞は、早くも1つのDPI( 図4A、右)として血液循環に播種します。 2 dpiで、明確な普及(右図4A)魚の遠位部分で観察されました。播種細胞の数は3 DPI( 図4Aおよび図4D)でさらに増加しました。 M2細胞はゼブラフィッシュでチャレンジした場合は対照的に、それらは2 DPI( 図4B)の後に魚の体の適度な広がりを示しました。彼らはまた、( 図4F)の経過時間後に増加普及を示しました。 図4Cおよび4Gに示すように、M1細胞はまれにゼブラフィッシュ循環中に播種し、囲卵腔の中でもアクティブなローカル移動は、観察期間中にまれでした。 M1細胞塊は、事実上、元の注射部位で拘束されました。魚体中> 5個の細胞のような正の普及や転移を定義する場合SS = "外部参照"> 4は、MDA-MB-231およびM2細胞転移は、3 DPI( 図4G)で、それぞれ、92%及び魚類の57%で観察されました。対照的に、正の普及がM1細胞で観察されませんでした。従って、ヒト癌細胞の進行のこのゼブラフィッシュモデルを正確マウスにおける異なる細胞の転移の可能性の相対的レベルを反映します。胚ゼブラフィッシュの腸管下神経叢から発芽及びMDA-MB-231又はM2細胞塊はまた、インキュベーション( 図4A及び4Bの3日間続いて、腫瘍細胞の囲卵腔注射後に存在した貫通新生血管(緑色)、左)。普及における障害と一致して、わずかな血管新生は、M1細胞移植( 図4C)の際に検出されました。

mCherryを標識したMDA-MB-231細胞と胚性異種移植ゼブラフィッシュモデルおよびドク注射、実験室でゼブラフィッシュの尾翼でELED癌細胞は活発な血管外漏出の代表と考えられています。 mCherryを標識したMDA-MB-231細胞は2 DPFで注入しました。 3つのdpiで、細胞がコラーゲンで濃縮され尾翼に血管の外へ移動し始めました。単一MDA-MB-231細胞は、独立して血管から、遠い尾翼( 図5A)に、一枚ずつ移動しました。 6つのdpiで、侵入は尾翼組織に遊走した細胞の数を計数することによって定量することができます。 mCherryを標識したM2細胞ドク注入モデルでは、注入はまた、2 DPFで行いました。ただし、クラスタ化された表現型は、アクティブ溢出プロセス中に観察されました。 1つのdpiで、M2細胞は、ゼブラフィッシュのCHTに血管から出て移行し始めました。 2 dpiで、移行されたM2細胞は、CHT( 図5B)で容器間クラスタを形成し始めました。 CHT領域におけるM2浸潤性細胞クラスタ数の定量化は、で行うことができ6つのDPI。

図1
図1: 胚ゼブラフィッシュにおける乳癌細胞の浸潤性の挙動を調査するための主な手順。 (A)は、一晩親ゼブラフィッシュを横断した後、Tgは(FLI1:EGFP)ゼブラフィッシュ胚を、翌朝回収し、28℃に維持しました。 (B)胚を実体顕微鏡48時間後に受精(HPF)下微細ピンセットでdechorionatedました。標識された乳癌細胞を回収し、PBSを少量に再懸濁しました。よく準備した後、懸濁した細胞は、1針に装填しました。約400細胞を、実体顕微鏡下で囲卵腔のキュビエ(DOC)のダクトに注入しました。注入された胚を33℃に維持しました。 (C)2時間ポスト噴射(HPI)、胚は、CAを行いました。蛍光実体顕微鏡下refulスクリーニング。胚は3または6日間33℃に維持しました。インターバルの間、胚を設計処理を行いました。ドク注入による囲卵空間注射または浸潤により(D)は、癌細胞の播種は、検出カウント、および共焦点顕微鏡3または6日間注射後(DPI)により画像化しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2: 卵黄周囲スペース注射部位と一般的なエラー。 (A)約400 mCherryを標識細胞(MDA-MB-231)は囲卵腔に注射しました。注入の明視野(最上位)、緑色脈管構造(上部中央)、および赤血球質量(下部中央)編ゼブラフィッシュの胚は、共焦点顕微鏡で撮影しました。三つのチャネルの合成画像(最下部)は、胚における細胞塊の定位を示します。 (B)細胞を適切囲卵腔を標的としませんでした。卵黄嚢が破裂しました。 (C)は (400よりはるかに少ない)閾値未満の細胞を注入しました。 (D)は (400よりもはるかに)閾値を上回る細胞を注射しました。細胞塊は、広い血流を有するキュビエのダクトに近すぎました。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: キュビエ(DOC)の注射のダクトの概要。受精後2日目のドキュメントの注射の(A)は概略(Dゼブラフィッシュ胚における乳癌細胞とPF)。矢印は、ドキュメントを示します。 (B)約400乳癌細胞をポジティブ注射として、。卵黄misinjection含む負注射、;細胞の誤った数が4 HPIで注入します。矢印と円は、注入された細胞を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4: 様々な乳がん細胞株の間で普及能力の比較。約400 mCherryを標識したMDA-MB-231、MCF10Aras(M2)、またはMCF10A(M1)細胞は、ゼブラフィッシュ胚48 HPFの囲卵腔に注射しました。注入した胚は3日間続きました。 (A、B、及びC)高RESOlutionのMDA-MB-231(A)の代表的な移行と普及プロセスを示す顕微鏡写真、M2(B)、および個々の胚体1、2、3日間注射後(DPI)におけるM1(C)細胞。左、囲卵腔(赤)および腫瘍周囲および腫瘍内血管系(緑)における細胞移動。黄色信号が微小血管細胞の重なりを示しています。中東、胚の全体像。胚の後部における播種細胞の右、可視化。黄色の矢印は、単一の播種細胞を示します。 =50μmのスケールバー。 (D、E、及びF)1、2、および3 dpiで各胚体内における播種細胞の数の定量。結果は、平均±SEMとして表されています。事後分析に続く一元配置分散分析(ANOVA)の結果が示されています。 P <0.05(統計学的に有意として受け入れた* 0.01 <P <0.05; ** 0。001 <P <0.01。 *** P <0.001。 (G)1、2、および3 dpiで胚体におけるMDA-MB-231、M2、およびM1細胞のための血管内の発生率の比較。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5: キュビエの注入のダクトとゼブラフィッシュにおけるMDA-MB-231およびM2細胞の転移の様々な行動。 (A)ゼブラフィッシュの代表的な共焦点画像は、ゼブラフィッシュにおけるMDA-MB-231細胞の単一細胞遊走挙動を示すために、3、4、および5 dpiで続きます。矢印はtailfinsに血管の外に移行し、侵襲性MDA-MB-231細胞を示します。左の列のスケールバー= 200μmで、右欄の50μmです。 (B)代表ゼブラフィッシュの共焦点画像は、ゼブラフィッシュにおけるM2細胞の細胞クラスターの移行挙動を示すように1、2、および3 dpiで続きます。矢印は尾造血組織(CHT)に血管の外移行と血管との間のクラスタを形成侵襲M2細胞を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

囲卵腔とドク注射でゼブラフィッシュ胚、:ここでは、Tgは(EGFP FLI1)における乳癌細胞の浸潤性の挙動を調査するために二つの方法を説明しました。トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に化学色素または蛍光タンパク質で標識された癌細胞を注入することにより、浸潤および転移の動的及び空間特性は、明らかに蛍光顕微鏡下で単細胞またはクラスタレベルでリアルタイムに追跡することができます。ほとんどのケースでは、ゼブラフィッシュにおける転移の急速な進行は、アッセイは、移植後1週間以内に実行することができることを保証します。また、強力な統計は魚の大規模コホートで得ることができます。

転移カスケードの初期および後期のイベントはシミュレートし、それぞれ囲卵腔またはドキュメントの中にがん細胞を注入することによって再現される可能性があります。囲卵腔は、魚の周皮と卵黄嚢、アロ間の限られた空間でありますWS 1は、生体内のプライマリサイトからの単一の腫瘍細胞の播種を監視します。注入後、癌細胞は、卵黄周囲空間内のローカル遊走および浸潤を受ける(プライマリサイトと考えられる)、その後、彼らは血管にintravasateと循環と一緒に広めます。頭と尾翼(見なさ遠くの標的部位)で、癌細胞は、狭い毛細血管床及び浸出に蓄積します。そのため、魚の体内の遠隔部位で発見された細胞の数は、転移能の測定です。加えて、より多くの血管外遊出した細胞はまた、ドキュメントの噴射アッセイの真である、後の時点で観察することができます。

ドクは、大規模な血流24と拡大し、共通の主静脈です。直接注射部位としてドキュメントを標的とする循環器系に癌細胞を導入しています。実際には、乳癌細胞は、胚を経由して身体全体に拡散しますドク注射後すぐに、血流。次いで、細胞を尾静脈と背側大動脈で逮捕します。血管外漏出、浸潤、および微小転移の形成は、6日以内に連続的に観察することができます。以前に16に報告されたように、転移性MDA-MB-231細胞及び前癌性乳房M2細胞は、異なる侵襲性の表現型を示します。 MDA-MB-231細胞は、コラーゲンマトリックスが豊富な尾翼の単一細胞浸潤を受けます。このように、MDA-MB-231細胞の浸潤能は、溢出および尾翼組織に侵入した細胞の数を計数することによって測定することができます。対照的に、M2細胞は、異なるサイズのクラスターを形成し、CHTの集団侵入を受けます。このプロトコルにおけるクラスタの数をカウントすることにより、M2細胞の浸潤能を定量化することは困難であり、好ましくは、共焦点顕微鏡を使用して3D画像を作成し、クラスタ化された腫瘍細胞の量を決定することによって行われます。

癌細胞のマイクロにおける技術的な課題注入は成功し囲卵腔またはドキュメントを狙っています。胚の多数のマイクロインジェクションは、高度に熟練した患者のオペレータを必要とする面倒な手順です。注入した細胞の数、及び卵黄嚢への細胞の漏れで、違いを注入する際、個々の魚における結果のばらつきに寄与する因子は、胚の発生段階を含みます。珍しいものの、操作が意図せずに血管系に浸透することができ、特に卵黄周囲のスペース注射で、直接循環系に細胞を紹介します。さらに変動を低減し、分析の信頼性を確保するために、顕微鏡検査は、プロセス全体の時点で修飾されていない魚を除外する必要があります。また、設定の知識がなくて専門家による分析を盲目にすることを強く公平な定量化を達成するために提案されます。

要約すると、我々はここで導入された2つのモデルが上に光を当てます侵襲的処置せずに生体内での細胞の浸潤や転移のプロセスを可視化します。我々は唯一の転移の可能性に関する2つのモデルが乳癌細胞を研究しますが、彼らは他のタイプの癌に外挿することができます。また、モデルは、メカニズムと(エピ)遺伝子操作を使用して、がん細胞の転移を制御する新たな分子標的を決定する上でより広範な用途を持つことができます。摂食又はげっ歯類25の注入と比較して、小分子化合物によるゼブラフィッシュ胚のより高い浸透性に二つ提示モデルはまた、潜在的な新しい抗浸潤/転移薬のハイスループットスクリーニングの点で利点を有します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は、開示することは何もありません。

Acknowledgments

TGF-βファミリーのメンバーの研究は、がんゲノム解析センターオランダでサポートされています。シジア・リューと江漣はライデン大学の研究の4年間の中国奨学金委員会によってサポートされています。私たちは、MCF10A細胞株のために博士フレッド・ミラー(バーバラ・アン・カルマノス癌研究所、デトロイト、MI、USA)を感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose MP Biomedicals AGAF0500
Borosilicate glass capillary Harvard Apparatus 300038
Cholera enterotoxin  Calbiochem 227035
Confocal microscope Leica SP5 STED
DMEM-high glucose media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 11965092
DMEM/F-12 media containing L-glutamine ThermoFisher Scientific 21041025
Dumont #5 forceps Fine Science Tools Inc 11252-20
Epidermal growth factor Merck Millipore 01-107
Fetal bovine serum  ThermoFisher Scientific 16140071
Fluorescent stereo microscope Leica M165 FC
HEK293T cell line American Type Culture Collection CRL-1573
Hydrocortisone SigmaAldrich 227035
Horse serum ThermoFisher Scientific 26050088
Insulin SigmaAldrich I-6634
MCF10A (M1) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MCF10Aras (M2) cell line Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA) 
MDA-MB-231 cell line American Type Culture Collection CRM-HTB-26
Manual micromanipulator  World Precision Instruments M3301R
Micropipette puller Sutter Instruments P-97 
Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 µL) Eppendorf F276456I
pCMV-VSVG plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
PLV-mCherry plasmid Addgene 36084
pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Pneumatic picoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Polybrene SigmaAldrich 107689
Prism 4 software GraphPad Software
pRSV-REV plasmid Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)
Stereo microscope Leica MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebrafish strain Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)
Tris-base SigmaAldrich 11814273001
Tricaine (3-aminobenzoic acid) SigmaAldrich A-5040
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher Scientific 15400054
Petri dishes, polystyrene (60 × 15 mm) SigmaAldrich P5481-500EA
Polystyrene dish with glass bottom WillCo GWST-5040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic. Nat. Med. 19, (11), 1450-1464 (2013).
  2. Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a distance: Organ-specific metastasis. Trends Cancer. 1, (1), 76-91 (2015).
  3. Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol. Oncol. 7, (2), 283-296 (2013).
  4. Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC cancer. 13, (1), 453 (2013).
  5. Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, (1), 124-137 (2012).
  6. Zhao, S., Huang, J., Ye, J. A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 34, (1), 80 (2015).
  7. Stanton, M. F. Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio. J. Natl. Cancer Inst. 34, (1), 117-130 (1965).
  8. Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression. Nat. Biotechnol. 24, (1), 73-75 (2006).
  9. Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations. Toxicol. Pathol. 31, Suppl 1. 62-87 (2003).
  10. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, (33), 4509-4520 (2008).
  11. Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev. Dynam. 233, (4), 1560-1570 (2005).
  12. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat. Protoc. 5, (3), 383-394 (2010).
  13. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66, (6), 3120-3125 (2006).
  14. Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, (44), 17406-17411 (2007).
  15. Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat. Protoc. 5, (12), 1911-1918 (2010).
  16. Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model. Breast Cancer Res. 15, (6), R106 (2013).
  17. He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227, (4), 431-445 (2012).
  18. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat. Protoc. 2, (11), 2918-2923 (2007).
  19. de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model. Sci. Rep. 6, 24968 (2016).
  20. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  21. Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, (4), 493-501 (2003).
  22. Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 72, (11), 8463-8471 (1998).
  23. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  24. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat. Rev. Genet. 3, (9), 674-682 (2002).
  25. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (1), 35-44 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics