ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Biology
 

Summary

כתב יד זה משתמש VirusMapper חבילת תוכנות הקוד הפתוח המבוססת פיג'י ליישם ניתוח חד חלקיקים לתמונות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה כדי ליצור מודלים מדויקים של מבנה הננומטרי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gray, R. D., Mercer, J., Henriques, R. Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper. J. Vis. Exp. (122), e55471, doi:10.3791/55471 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מיקרוסקופ פלואורסצנטי סופר-רזולוציה היא מהפכה כרגע מחקר בביולוגיה של התא. יכולתה לשבור את מגבלת הרזולוציה של סביב 300 ננומטר המאפשרת הדמיה השגרתית של מתחמים ביולוגיים ננו ותהליכים. עלייה זו החלטה גם אומרת כי שיטות פופולריות במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון ניתוח חד חלקיקים, יכולות בקלות להיות מיושמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סופר-רזולוציה. על ידי שילוב של גישה האנליטית זה עם הדמיה אופטית ברזולוציה סופר, ניתן יהיה לנצל את קיבולת תיוג ספציפית-מולקולה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ליצור מפות מבניות של אלמנטים מולקולריים בתוך מבנה metastable. לשם כך, פיתחנו אלגוריתם רומן - VirusMapper - ארוז כמו קל לשימוש, בעל ביצועים גבוהים, ו-תפוקה גבוהה תוסף ImageJ. מאמר זה מציג מדריך מפורט לתוכנה זו, מציגה את יכולתה לחשוף תכונות מבניות רומן מ ביולוגימתחמי olecular. כאן, אנו מציגים כיצד להרכיב נתונים תואמים ולספק צעד-אחר-צעד פרוטוקול על אופן השימוש באלגוריתם זה כדי להחיל ניתוח חד חלקיקי תמונות ברזולוציה סופר.

Introduction

מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה (SR) היה השפעה גדולה על ביולוגיה של תא על ידי מתן יכולת תהליכים מולקולריים מפתח תמונה יחד עם התיוג המולקולרי הספציפי מכריע להבנה אותם. SR מאפשר כעת מיקרוסקופ אור להתקרב החלטות (20-150 ננומטר) בעבר רק השגה עם מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) תוך שמירה על היתרונות הגדולים של מיקרוסקופ אור, כגון פוטנציאל תמונה חיה תאים 1, 2. יתר על כן, שימור המבנים גילו ברמת ננו מאפשר היישום של ניתוח חד חלקיקים (SPA) לנתוני SR, קונספט שימוש נרחב במיקרוסקופ אלקטרונים 3. שימוש SPA, רבים מאוד עותקים שמורים של מבנה יכול להיות צילמו בממוצע יחד כדי לשפר את הרזולוציה, דיוק, או אות-לרעש הפנימיים והחיצוניים. כאשר משתמשים בשילוב עם SR, SPA הודגמה להיות כלי רב עוצמה עבור-p גבוההמיפוי recision של רכיבים של המתחם הנקבובי גרעין 4, 5, 6 centrosomes, וירוסים, כגון HIV 7 ו HSV-1 8.

עם זאת, היישום המשולב השיגרתי של SR ו SPA אותגר על ידי חוסר תוכנה זמינה. מסיבה זו, פתחנו VirusMapper, תוסף לתוכנת עיבוד תמונה הפופולרית 9 ImageJ / פיג'י. זוהי חבילת התוכנה הראשונה בחופשיות הזמינה עבור SPA כללית עם תמונות קרינת 10 נועדו לספק מהיר, ידידותי למשתמש, רב ערוצית מיצוע נאיבי של מבנים צלמו עם מיקרוסקופ SR. למרות מיועד וירוסים, זה יכול להיות מיושם על כל מורכבות מולקולארית אשר מינים מולקולריים שונים ניתן הדמיה, מזוהים מקומית.

VirusMapper יכול לשמש כדי לייצר דיוק גבוה מולקולרימודלים של כל מבנה ידוע, המאפשרים החישוב של ממדים ממוצעים ופרמטרים נוספים. עיצוב האלגוריתם עושה את זה שימושי במיוחד עבור הפרדת אוכלוסיות של מבנים, מתן לקביעת נטיות נפרדות או מדינות מורפולוגיים שונות. בנוסף, הדמית רב ערוצית יכול לשמש כדי להעסיק ערוץ התייחסות במקרים בם המבנה הבסיסי הוא ידוע, ובכך לאפשר גילוי מבנה מבוסס הפניה. בהוראות להורדה והתקנה של התוכנה ניתנות על https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . נתוני דוגמא ניתן למצוא גם שם, ומשתמשים מומלצים לתרגל באמצעות התוכנה על נתונים לדוגמה לפני שתנסה ליישם אותו לשלהם.

הנה, את השלבים באמצעות התוסף הזה כדי לייצר מודלים SPA מנתונים גולמיים מתוארים. התוכנה לוקחת תמונות גולמיות המכילות o חדr מבנים רבים-שכותרתו כקלט. זה חוזר, בכפוף למספר הפרמטרים מותאמים כתוכנה מנוהלת, מודלי SPA מראים ההפצות הממוצעות של הרכיבים שכותרתו בתוך המבנים צלמו.

מטרת פרוטוקול זה היא לייצר מודלי SPA מדויקים מתן localizations הממוצע של רכיבים בתוך מבנים צלמו פי בצנרת המתוארת באיור 1. כפי שניתן לראות בתרשים 1, זרימת עבודת התוכנה מחולקת מועילה לשלושה שלבים. השלב הראשון הוא תמונות גדולות פלח, וכתוצאה מכך ערימות של חלקיקים עבור כל ערוץ. חלקיקים אלה הם היחידות שיוקצה בממוצע כדי ליצור מודלים לייצר זרעים עבור דור מודל. השלב השני הוא ליצור תמונות זרע, אשר משמשות כדי לרשום את הסט כולו של חלקיקים בשלב הסופי. הדבר נעשה על ידי בחירת ערוץ התייחסות ובחירת חלקיקים ידנית בערוץ זה כי יתרום היםeeds. זרעים נבחרים בערוץ האזכור הזה אבל יכול להיות שנוצר עבור כל הערוצים. חלקיקים בתחילה הם העמידו על ידי התאמת גאוס 2D באפיק זה. כל החלקיקים אשר נבחרו וכיוונו את עצמם מחדש הם מיצוע לייצר זרע. עבור כל מבנה נפוץ לראות את הנתונים הם להיות מודל, יש לבחור חלקיקים כמו זרעים בצורה ברורה ומדויק מייצגים מבנה. הממשק בשלב זה שימושי גם עבור סריקת נתונים עבור מבנים כאלה.

השלב האחרון הוא ליצור מודלים באמצעות התאמת תבנית. זו מושגת באמצעות הרישום של חלקיקי חילוץ במקור על תמונות הזרע שנוצרו בסעיף הקודם על ידי מתאמים צולבים. תת-קבוצה קטנה של חלקיקים הרשום בממוצע יחד, והתהליך חוזר על עצמו עוד יותר כדי להפחית מודל טעות ריבועית ממוצעת, אם ירצה בכך. משנה זו נקבעת על פי הגדרת דמיון מזערי כנגד הזרע כי חייב להיות מרוצה. בעת יצירת מודלזה בו זמנית מספר רב של ערוצים, הדמיון המשותף, או לממוצע של הדמיון עבור כל ערוץ, משמש. מודלי כתוצאה ואת החלקיקים הרשומים שתרמו אותם לאחר מכן ניתן לנתח נוסף.

Protocol

הערה: זה פרוטוקול ווידאו להשלים את הנייר המקורי 10 המתאר את חבילת התוכנה ביתר פירוט. קוראים מוזמנים אותם בעיון עבור הדרכה נוספת בנוגע לשימוש בתוכנה. ישנם שלושה שלבים עיקריים: מיצוי חלקיקים, אשר מגזרי תמונות גדולות לתוך חלקיקים בודדים; בחירת זרע, שבו מבנים משותפים מזוהים בנתונים ומיושרים לייצר זרעים, אשר משמשים את השלב הסופי; מודל הדור, שבו התאמת תבנית מבוססת על הזרעים האלה מיישרת את חלקיקי חילוץ וממוצע משנה כדי לייצר את דגמי SPA.

1. הגדרה לפני הפעלת חבילת התוכנה

  1. הכן דגימות של המבנה הנחקרת על coverslip או תנאי הניסוי הרלוונטיים.
  2. תמונה דגימות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סופר-רזולוציה, כגון מיקרוסקופיה תאורה מובנית (SIM) 11 או stimulaדלדול פליטה טד (STED) 12 מיקרוסקופ.
    הערה: הפרטים המדויקים של איך להכין דגימות תמונה מאוד תלויות באופי המבנה נחקר, כך בספרות הרלוונטית יש להתייעץ. כדוגמא, השיטה המדויקת עבור הכנת הדמית דגימות של נגיף vaccinia, כגון אלו המשמשים כאן, מתוארת בסעיף תוצאות הנציג.
  3. יצירת תמונות של שדות מרובים מבט מראים מספר גדול של עותקים נפרדים של המבנה או חלקיקים, רצוי אלף. חלקיקי תמונה המופרדים גם זה מזה ככל האפשר ולוודא שהתמונות הן ללא לכלוך או מבני ניאון אחרים שאינם בעלי עניין.
  4. פתח את כל התמונות המכילות החלקיקים בפיג'י ידי גרירת הקבצים לתוך סרגל כלי פיג'י או על ידי בחירה "קובץ"> "פתיחה".
  5. בחר "תמונה"> "Stack"> "כלים"> "לשרשר" כדי לשרשרתמונות לתוך ערימה אחת. ואז, אם לתמונה שתתקבל הוא hyperstack, להפוך אותו בערימה על ידי בחירת "תמונה"> "Hyperstacks"> "hyperstack לערום".
    הערה: המחסנית הסופית צריכה ערוצי intercalated. אם יש שני ערוצים, את החתיכה הראשונה של הערימה להיות ערוץ 1 מהתמונה הראשונה, את הפרוסה השנייה צריכה להיות ערוץ 2 המתאים, הפרוסה השלישית צריכה להיות ערוץ 1 מתוך התמונה השנייה, וכן הלאה.

2. חלצו את החלקיקים

  1. בחר את התמונה פלח ובחר "חלץ מבנים ויראלי". בחר היכן לשמור את חלקיקי חילוץ ולהציג את "חלץ מבנים ויראלי" שיח (איור 2).
  2. הקצאת פרמטרי חילוץ עם הערכות ראשוניות באמצעות הזין לתוך "מבנים ויראלי חלץ" השיח כדלקמן. מקצה שיפורים של פרמטרים אלה לאחר התצוגה מקדימה פילוח התמונה.
    1. הגדר את קההאה של ערוצים במערך ככל שמספר ערוצי פלואורסצנטי שונים כי כבר צלם (למשל, 2).
    2. הגדר את ערוץ ההתייחסות שממנו החלקיקים המחולצים ידי זיהוי של פסגות ב ערוץ על-ידי הזנת מספר הבחירה של ערוץ. בחר ערוץ העקבי ביותר; כלומר, הערוץ שבו החלקיקים ביותר לקבל אותו המראה.
      הערה: במידת האפשר, חלקיקים בערוץ זה יהיה מקסימום המרכזי.
    3. בחר האם או לא להחיל טשטוש פעמוני טרום זיהוי. הגדר את טשטוש פעמוני טרום זיהוי כדי 0 ליישם שום טשטוש; אם ערך זה הוא גדל, מסנן טשטוש פעמונים של הרדיוס הנתון מוחל לפני גילוי מקסימום מקומי. השתמש בתכונה זו אם ערוץ הפנייה אין מקסימום מרכזי (למשל, צורת טבעת); טשטוש גורם להופעה אחד.
      הערה: בדיקה מחולקת לאזורים בעלי עניין (ROIs) אין לי טשטוש הפעמונים להחיל אותם, כפי תכונה זו היא שימוש רקד למקם ROIs בערוץ הפניה.
    4. הגדר את רדיוס ROI (אשר ייקבע סביב כל מקסימלית מקומית) בפיקסלים. בחר ערך כזה ROIs כי הם קצת יותר גדולים החלקיקים הגדולים, כגון באיור 3. לדוגמה, אם החלקיקים הגדול נראה שיש בקוטר של כ 30 פיקסלים (משוער בערך לפי העין), ולאחר מכן קבע את רדיוס ROI כדי 20 פיקסלים.
    5. הגדר את מספר ROIs להשתמש בכל מסגרת ערך קטן ראשוני, יחסית מתחת 100.
    6. הגדר את חפיפת ROI המרבית. אם החלקיקים מופרדים היטב, לשמור קטן זה; אם חלקיקי מקובצים, להגדיל זה כדי לאפשר את ROIs כדי חפיפה.
  3. בחר "תצוגה מקדימה".
    הערה: כאשר זו נבחרת, את ROIs החילוץ עבור ערוץ ההתייחסות קשור המסגרת הנוכחית יופיע.
  4. התאם את רדיוס ROI, מספר רואיס, ואת החפיפה ROI המרבי שיהיה ROIs בגודל מתאים סביב חלקיקים רבים ככל האפשר, כמו באיור 3.
  5. "אישור" בחר להפעיל את הפילוח. סגור את התמונה ואת מנהל ROI.
    הערה: אין לשנות את שמות הקבצים של סטי חלקיקים. השמות הללו חייבים להיות בפורמט "חלקיקי ויראלי - channelX" עבור בסעיפים הבאים.

3. זרעים בחרו

  1. בחר "צור זרעים", לבחור את התיקייה שבה חלקיקי החילוץ נשמרים, ולהציג את הדו-שיח וחלונות "צור זרעים" (איור 4).
  2. הקצאת פרמטרי זרע-בחירה ראשוניות באמצעות הזין לתוך שיח "צור זרעים", כדלקמן.
    1. הגדר את ערוץ הפנייה תהיה מצויד ליישר ומרכז את כל הערוצים. בחר ערוץ שבו רוב יש חלקיקים באותו המראה כי יש לכל היותר מרכזיים, במידת האפשר.
    2. בחר את התיבות עבור כל הערוצים עבורו זרע צריך להיות שנוצר.
    3. בחר אם הזרעים צריכים להיות rotated ידי 90 °. השתמש בתכונה זו כדי לקבל את היישור בקנה אחד עם מודלים אחרים
    4. בחר האם או לא להחיל טשטוש פעמונים טרום יישור. הגדר את הרדיוס הטישטוש עבור כל ערוץ 0 ליישם שום טשטוש. גדל ערך זה כדי להחיל מסנן טשטוש פעמונים של הרדיוס הנתון לפני ההתכנסות. השתמש בתכונה זו אם החלקיקים אין מקסימום מרכזי; טשטוש גורם להופעה אחד.
      הערה: זרעים לא יהיו הטשטוש המוחל, כפי שתכונה זו זמינה רק כדי לקבל יישור עקבי.
    5. בחר אם להשתמש בתיקון המעבר למרכז הזרעים בנפרד עבור ערוצים שאינם הפניה, אם כי לא לסובב אותם, על ידי סימון או ביטול הסימון בתיבות "Shift תיקון" עבור כל ערוץ.
      הערה: השתמש באפשרות זו אם הערוצים אינם היטב מיושר עם השני; גם זה יכול להיות שימושי עבור יישור ערוצים אחרים אך ורק על פי ההפניה, ללא תיקון משמרת.
  3. בחר חלקיקים שישמשו זרעים. חיפוש באמצעות tהוא חלקיק רצף למצוא חלקיק דומה במבנה כי הוא להיות דגם ולהקליט את מספר המסגרת.
  4. הזן את המספר "המסגרות להשתמש" תיבה, ועוד חלונות תופיע (איור 5). זן מספר במסגרות מרובות מופרדות בפסיקים.
  5. הצג את מסגרות הזרע והזרעים הממוצעים המתקבלים בחלונות המופיעים.
    הערה: יומן יציע זרעים דומים לממוצע.
  6. התאם את ערוץ ההתייחסות, רדיוס טשטוש הפעמונים, ואת אפשרויות תיקון SHIFT כדי לייעל את תהליך הבחירה זרע כך מספר מסגרות זרע גילו מראה דומה. המשך זרעים הוספה עד זרעים ממוצעים מכך נוצרים באופן משביע רצון להידמות המבנה לראות את הנתונים הוא להיות דגם.
  7. שם הזרעים והיכן הם יישמרו ולוחצים על "אישור" כדי לשמור את תמונות הזרע הסופיות לשימוש מאוחר בדור מודל.

4. ליצור מודלים

  1. Select "צור מודלים המבוססים על זרעים", לבחור את התיקייה שבה חלקיקים חילוץ נשמרים, ולהציג את הדו-שיח "ליצור מודלים" (איור 6).
  2. טען את הזרעים עבור כל ערוץ באמצעות תיבות הסימון.
    הערה: זרעים יישמרו בתיקיית משנה כי נקראה בדו-שיח "צור זרעים". שם ברירת המחדל הוא "ניתוח". תשמור על עצמך כדי לבחור את ממוצעי הזרע, ולא מסגרות, אשר נשמרות גם לעיון.
  3. הקצאת פרמטרים הדור מודל ראשוני באמצעות הזנתם לתוך שיח "ליצור מודלים", כדלקמן. מקצה שיפורים של פרמטרים אלה מאוחר יותר.
    1. בחר אם להשתמש בערוץ התייחסות יישור, מחשבת תרגומי סיבובים בלבד מערוץ ההתייחסות ומחיל אותם לכל הערוצים. אם אתה משתמש באפשרות זו, בחר את הערוץ להשתמש כהפניה.
      הערה: אפשרות זו יש לבחור רק להשתמש בערוץ אחד במיוחד בתור refereNCE, כגון אם עושה גילוי מבנה מבוסס הפניה. אחרת, זה יגרום מודלים פחות מדויקים. הערוצים צריכים להיות מתואמים היטב אם אתה משתמש באפשרות זו.
    2. בחר אם לרבע בעוצמות תמונה במהלך התאמת התבנית. זה יהיה להדגיש הבדלים קטנים, כך להשתמש בעת יצירת מודל שבו יש בעיקר תכונות מהותיות.
    3. בחר דמיון מזערי כנגד זרע באמצעות "דמיון מזערי כנגד זרע" המחוון או על ידי הזנת מספר לתוך התיבה.
      הערה: רק חלקיקים בעלי דמיון הזרעים הגדולים מזו חתוכים ישמש. 60-80% הם בדרך כלל בחירה טובה להתחיל עם.
    4. הגדר את המספר המרבי של חזרות כדי 1, לייעל את הדמיון מינימום נגד זרע, ולהגדיל אותו מאוחר יותר, כנדרש.
    5. בחר את התיבות לבחור את האלמנטים של תהליך יצירת המודל שיופיע.
      הערה: "זרעי צג" תציג את הזרעים כי הוטענו עם בקופסותים בראש תיבת הדו-שיח. "מודלי צג" יציגו את כל החזרות של הדגמים כי נוצרים שקלול המשנה של חלקיקים העומד דמיון המזערי כנגד זרע. "הצג MSE" יציג שגיאה בריבוע ממוצע תמונה (MSE) שמדגיש את תחומי המודל משתנה ביותר. "חלקיקי צג" יציגו את תת-הקבוצה של חלקיקים המשמשים ליצירת המודלים, רשום על פי איטרציה הגבוהה ביותר של המודל מוצג.
  4. בחר "תצוגה מקדימה" כדי ליצור מודלים המקדימה ולהציג את התוצאות.
    הערה: זהו הצעד הכי אינטנסיבי המחשוב של התהליך. השעה פועלת עבור קבוצה של כמה אלף חלקיקים בקוטר של כמה עשרות פיקסלים במחשב השולחני צריכה להיות סביב 10 דקות. אם זמן חישוב הוא סוגיה, המשתמשים צריכים לנסות קודם את האלגוריתם על קבוצת משנה קטנה יותר של הנתונים או להשתמש ברדיוס ROI קטן בשלב 2.2.4, אם אפשר.
  5. הצגה ליצורמודלים ד לייעל את הפרמטרים, במיוחד דמיון המינימום נגד זרע. גדל דמיון המינימום נגד זרע עד חלקיקים אמיתיים היחיד של מורפולוגיה הדגם כלולים במודל.
  6. להגדיל את המספר המרבי של חזרות על ידי שימוש "המספר המרבי של חזרות" מחוון או על ידי הזנת מספר לתוך התיבה ולאפשר את תהליך יצירת מודל איטרטיבי. השתמש בערך סביב 10 עבור איטרציה מירבית.
  7. שם דגמים ולחץ על "אישור" כדי לשמור ערימות אבולוצית מודל המכילות כל החזרות של תהליך יצירת מודל הסופי.
    הערה: אם דמיון המינימום נגד זרע הוא כל כך גבוה כי אין להם חלקיקי הדמיון הזה, שום דבר עודכן. אם הפלאגין נראה קפוא, לשקול את האפשרות כי הדמיון המינימלי הוא גבוה מדי.

Representative Results

הנה, אנחנו מדגימים את התוכנה על poxvirus מודל, וירוס vaccinia. אחד נגיפים יונקים המורכבות ביותר, חבילות vaccinia סביב 80 חלבונים שונים בתוך 350 x 270 x 250 ננומטר 3 חלקיקים בצורת לבנים 13, 14. שלושה גבי תשתיות של ניכרים על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים: גרעין מרכזי, המכיל את הגנום dsDNA; שני מבנים חלבוניים, גופים לרוחב שנקרא, אשר לאגף את הליבה; וכן bilayer proteolipid יחיד המעטפה 15. גודל גדול, מבנה מורכב, ואת המוכנות שלהם כדי תיוג חלבון פלואורסצנטי רקומביננטי לעשות vaccinia מערכת מצוינת להפגין את זרימת העבודה VirusMapper.

השימוש בתוכנה כפי שמתואר כאן, חלוקת מגוון של חלבונים על virion vaccinia יכול להיות המודל. חלבון היה שכותרתו צלם, אולי קומביאומה עם חלבון אחר של חלוקה ידועה כנקודת התייחסות, ואת התוכנה שמשה כמתואר לייצר מודלים ממוצעים של הלוקליזציה של אותו החלבון על החלקיק. בדוגמא זו, שני חלבונים עוצבו, את L4 חלבון ליבה הפנימי, ואת F17 רכיב הגוף לרוחב הגדול.

וירוס vaccinia רקומביננטי אשר יש F17 מתויג עם GFP ו L4 מתויג עם mCherry 16 שימש. וירוס מטוהרים היה מדולל ב 1 מ"מ טריס, pH 9, וכמעט ודאי שלא נשטף, coverslips עתירי ביצועים על ידי ציפוי אותם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הדגימות נקבעו אז על ידי יישום פורמלדהיד 4% ב PBS עבור 20 דקות. Coverslips היו רכובים מיד על השקופיות antifade הרכבה בינונית. ההדמיה בוצעה על ידי SIM על מיקרוסקופ SIM מסחרי. שדה הראייה נבחרה המכיל מאות וירוסים ותמונות נרכשו באמצעות 5 משמרות שלב סיבובים רשת 3 עם 561 ננומטר (32 מיקרומטר צורם PEלתיעוד מלחמה) ו 488 ננומטר (32 מיקרומטר לייזרים צורמים תקופה). תמונות נרכשו באמצעות מצלמת sCMOS ומעובדות באמצעות תוכנת מיקרוסקופ. ערוצים היו מיושרים מבוסס על שקופית חרוז צבעוניות צלמה עם הגדרות הרכישה אותה התמונה. אחרי תמונות יישור שיקום ערוץ SIM נפתחו בפיג'י בשרשור לתוך ערימת תמונה אחת.

חלקיקים נגיפיים חולצו מן התמונות באמצעות ערוץ L4 כהפניה וללא החלת טשטוש פעמונים, כפי שיש חלקיקים אלה היותר מרכזיים. בסביבות 15,000 חלקיקים חולצו בניסוי הזה.

בשל הגיאומטריה של vaccinia, הגופים לרוחב יש מראה שונה במובהק על סמך כיוון הווירוס. אנחנו דמיינו שתי אוריינטציות שבו משני גופים לרוחב אחד או שניים אפשר להבחין. הפנינו כלפי הנטיות הללו פרונטלי sagittal, כבודively.

זרעים נפרדים אוריינטציות פרונטלי sagittal נבחרו על ידי חיפוש דרך רשימת החלקיקים בשלב "צור זרעים" (איורים 4 ו 5); חלקיקים שהיו בבירור בכיוון זה או אחר נבחרו. ערוץ L4 שמש ערוץ ההתייחסות ליישר את הזרעים אחד עם השני. שוב, אין טשטוש פעמונים היה הכרחי. 5 חלקיקים עבור כל כיוון נבחרו היו ממוצעים לייצר זרעים.

מודלים שנוצרו עבור כל כיוון המבוסס על הזרעים האלה. גם ערוץ פנייה ולא ערכים עוצמים בריבוע שמשו. המספר המרבי של חזרות נקבע בתחילה 1, ואת הדמיון המינימלי נקבע לכלול סביב 1000 חלקיקים בכל מקרה, אשר נתן מראה עקבי עבור כל כיוון. המספר המרבי של חזרות אז הוגדל ללאפשר התכנסות של המודל. מודלים ובכך נוצרו עבור שתי האוריינטציות בשני הערוצים (איור 7).

איור 1
איור 1: עבודת VirusMapper. התוסף הוא מחולק לשלושה שלבים עיקריים. חלקיקים נגיפיים המחולצים תמונות גדולות, תמונות או זרעי תבנית נבחרות חצי ידניות מהנתונים, ומודלי SPA סופיים נוצרים מהנתונים ידי בהתייחסו הזרעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: "חלץ מבנים ויראלי" שיח. בעת בחירת "חלץ ויראלי structur es", דו-שיח זו תופיע. הפרמטרים צריכים להיות מלאים הערכות ראשוניות עבור פילוח אופטימלי. 'תצוגה מקדימה' אז יכול להיות שנבחר, המאפשר ROIs כדי לראות תצוגה מקדימה של הפרמטרים להיות מכויל. אנא לחץ כאן כדי לצפות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: הגדרת פרמטרי חילוץ. לאחר התצוגה המקדימה את ROIs יחולצו, רדיוס ROI, מספר רואיס, ואת החפיפה ROI המרבי מותאמים רצו להגיע למצב כזה. ROIs הם קצת יותר גדול החלקיקים, כל החלקיקים שנכללים ROI, ו ROIs יכול לחפוף מספיק כדי לאפשר חלקיקים באשכולות להיות מופרדים.ה' "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: יצירת זרעי התאמת תבנית. תיבת הדו-שיח "צור זרעים" (1) קובע את הפרמטרים יוקצו. רצף חלקיקי הפניה (2) מאפשר למשתמש לסרוק באמצעות חלקיקים בערוץ ההפניה. כאשר חלקיק מוצג ברצף חלקיקים הפניה, חלקיקים למקומם עבור כל הערוצים ניתן לראות תצוגה מקדימה החלקיקים למקומם (3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: הוספת תמונות זרע. כמו זרעים מתווספים "מסגרות להשתמש" תיבה, הממוצע של כל הזרעים (4) ואת המסגרות המעורבות (5) מוצגים. חלקיקים דומים הזרעים הממוצעים הנוכחיים מוצעים בתיבת הדו-השיח (6). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: "ליצור מודלים" שיח. בעת בחירת "צור מודלים המבוססים על זרעים," דו-שיח זו תופיע. הפרמטרים צריכים להיות מלאים הערכות ראשוניות לייצור מודל אופטימלי, ואת האלמנטים של תהליך הפקת מודל שיוצגו במהלך חישוב צריך להיבחר. "תצוגה מקדימה" אז יכול להיות שנבחר, ומאפשר את תהליך יצירת מודל לרוץ הפרמטרים להיות מכויל."Target = 'ftp_upload / 55,471 / 55471fig6large.jpg _ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7: מודלים שנוצרו עם VirusMapper. virions Vaccinia עם חלבון הליבה L4 מתויג עם mCherry ואת החלבון בגוף לרוחב F17 מתויג עם EGFP היו הדמיה באמצעות SIM. מודלים ואז נוצרו עם התוכנה, כמתואר בפרוטוקול. שתי אוריינטציות, חזיתית ועל sagittal, מאופיינים במראה של גופים לרוחב. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

בעזרת שיטה זו, חוקרים מצוידים לשלב את העוצמה של SPA מיקרוסקופית SR כדי ליצור מודלים 2D דיוק גבוהה, רב ערוצית של אדריכלות חלבון של וירוסים מתחמי macromolecular אחרים. עם זאת, כמה שיקולים חשובים צריכים להילקח בחשבון.

זרעים יש לבחור לייצג מבנה נתפס באופן עקבי. לפיכך, הנתונים הגולמיים יש לבדוק היטב לפני הזרעים נבחרים. זה חשוב למניעת דגמים משוחדים. בחירות יכולות להיות מאומתות על ידי בחינת סף הדמיון המינימאלי הדרוש כדי לכלול מספר מסוים של חלקיקי הדגמים. ברור, עבור בחירה של הזרע, כך עולה סף זה צריך להיות עבור מספר נתון של חלקיקים, מבנה יותר כי הוא לכאורה בנתונים.

הקונספט התאמת התבנית הוא שימושי במיוחד כאשר ישנה הטרוגניות בנתונים. כל המבנים השונים כי הם visible יש לזהות מודלים שונים שנוצרו עבור כל מקרה. על ידי הפרדת מבנים הטרוגנית בערוץ אחד אבל בו זמנית יוצרים מודלים בערוץ שני, דפוסים יכולים לצוץ לא היה ברור מייד.

שיקול נוסף כדי להיות מודע כאשר באמצעות אלגוריתם זה הוא כי ההליך איטרציה יהיה למקסם אסימטריה סטוכסטיים. לדוגמא, בעת בניית המודל של מבנה עם שתי מקסימה סימטרית, כל הסימטריות הקלות בין המקסימום תהיינה מיושרות עם השני במהלך איטרציה, ואת המודל הסופי ובכך יהיה אסימטרי מקסימאלי. אם זה אינו משקף סימטריה ידועה במבנה להיות מודל, אז זה צריך להילקח בחשבון. נכון לעכשיו, הדרך היחידה למנוע מיצוי זו היא להגביל את מספר החזרות כדי 1, למרות התפתחות פוטנציאל תהיה עבור VirusMapper לשלב צירה הסימטריה לתוך תהליך יצירת מודל. כל גרסאות חדשות של VirusMapper יהיו available באתר ההפניה (ראה טבלת חומרים). משתמשים יוכלו למצוא שאלות נפוצות כאן כדי לענות על כל שאלות נפוצות.

התוכנה כמתוארת ישימה לכל מבנה שיכול להיות צלם עם רזולוציה מספיקה כדי להמחיש את התכונות שהמשתמש מבקש לבנות מודל. למרות SPA יכול לשפר את הרזולוציה, זה בבירור לא ישפר את הנראות של תכונות שאינן אחר לא גלויים. פרוטוקול זה אינו, אפוא, שיטה לשיפור איכות הנתונים. כמו בכל טכניקה, הכנת מדגם זהירה ואופטימיזציה של אסטרטגיית הדמיה תספק את הנתונים הנקיים דגמי כתוצאה הטובים.

הבחירה של שיטת הדמיה SR הוא גם חשוב, בכלל, יהיה תלוי מדגם בהישג יד. VirusMapper אומת לעבוד היטב עם ה- SIM STED 10, וזה גם יכול לשמש עם נתונים מיקרוסקופיה לוקליזציה באיכות גבוהה, אך יש להיזהר במקרה הזה,כמו תיוג דליל יכול לגרום לבעיות דומות לאלו של מקסום סימטריה.

נכון לעכשיו, VirusMapper הוא האלגוריתם רק בחופשיות הזמינה עבור הניתוח חד חלקיקים של תמונות קרינה ואת תוכנת 2D SPA מיצוע למטרות כלליות בלבד. מחקרים אחרים שהפכו שימוש באותם העקרונות 4, 6, 8 השתמשו בתוכנה מותאמת אישית מתמחה לכל מחקר מסוים. אלגוריתמים תכליתיים כללית לשיקום נתוני 3D פורסמו 5, 18, למרות שאף תוכנה סופקת.

כאשר נעשה שימוש כמתואר במאמר זה, VirusMapper יכול לשמש כדי לייצר מודלים מדויקים, מדויקים, וכן חזקים של אדריכלות החלבון מולקולארית של וירוסי מתחמי אחרים. עם מודלים אלה, חוקרים יכולים לבצע מדידות מדויקות של הממדים הממוצעים של structures תחת מחקר, באופן פוטנציאלי לאפשר להם להגיע למסקנות ביולוגיות כי לא היו אפשרית אחרת.

יתר על כן, עם היכולות הרבות ערוצית של טכניקה זו, אפשר למפות מספר בלתי מוגבל של חלבונים ורכיבים בתוך מתחמים ולגלות ארגון חלבון רומן. בחינת שינויים במבנה ננומטרי בתנאים שונים הרלוונטיים ביולוגית, כגון בשלבים שונים של מחזור החיים של הנגיף, יש את הפוטנציאל להציע תובנות רבות ערך בביולוגיה.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות קורינה Beerli, יז'י Samolej, פדרו מטוס פרירה, כריסטופר בלק, ואת קתרין שרר על תרומתם לפיתוח ואימות המקורי של VirusMapper. אנחנו גם רוצים להודות ארתור Yakimovich לקריאה הביקורתית שלו של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BB / M022374 / 1) (RH); מימון הליבה אל מעבדה MRC עבור לביולוגיה מולקולרית של התא, ביוניברסיטי קולג 'בלונדון (JM); המועצה האירופית למחקר (649,101-UbiProPox) (JM); ואת המועצה למחקר רפואי (MR / K015826 / 1) (RH ו- JM). RG ממומנת על ידי המועצה למחקר הנדסה המדעים הפיזיקליים (EP / M506448 / 1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fiji Open-source image analysis software
NanoJ-VirusMapper developed by the Henriques lab Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
VectaShield antifade mounting medium Vector Labs H-100
Elyra PS1 Zeiss
ZEN BLACK Zeiss Image processing software for SIM
High performance coverslip Zeiss  474030-9000-000
TetraSpeck beads ThermoFisher T7279

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution. Biopolymers. 95, (5), 322-331 (2011).
  2. Gustafsson, N., Culley, S., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun. 7, 12471 (2016).
  3. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161, (3), 438-449 (2015).
  4. Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341, (6146), 655-658 (2013).
  5. Broeken, J., Johnson, H., et al. Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy. Methods Appl Fluoresc. 3, (1), 14003 (2015).
  6. Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication. Elife. (2015).
  7. Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Nat Acad Sci U S A. 109, (22), 8564-8569 (2012).
  8. Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat Commun. 6, 5980 (2015).
  9. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  10. Gray, R. D. M., Beerli, C. VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy. Sci Rep. 6, 29132 (2016).
  11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J of Micros. 198, (2), 82-87 (2000).
  12. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Let. 19, (11), 780 (1994).
  13. Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles. J Virol. 80, (5), 2127-2140 (2006).
  14. Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Ovid. (2010).
  15. Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion. Adv Virus Res. 66, (6), 31-124 (2006).
  16. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies. Cell Rep. 4, (3), 464-476 (2013).
  17. Nanoj-virusmapper. Available from: https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper (2016).
  18. Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept. IEEE J Sel Topics Signal Process. 10, (1), 61-70 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics