VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Biology
 

Summary

이 논문은 나노 구조의 정확한 모델을 생성하기 위해 슈퍼 해상도 현미경 이미지에 단일 입자 분석을 적용 할 수있는 피지 기반의 오픈 소스 소프트웨어 패키지 VirusMapper를 사용합니다.

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Gray, R. D., Mercer, J., Henriques, R. Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper. J. Vis. Exp. (122), e55471, doi:10.3791/55471 (2017).

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Abstract

슈퍼 해상도의 형광 현미경은 현재 세포 생물학 연구에 혁명을 일으키고있다. 그 용량은 나노 생물 단지 및 프로세스의 일상적인 이미징을 허용 내지 300의 해상도 한계를 깰 수 있습니다. 해상도의 증가는 또한 단일 입자 분석 전자 현미경 등의 인기있는 방법은, 용이 초해 형광 현미경에 적용 할 수 있다는 것을 의미한다. 수퍼 - 해상도 광 화상이 분석 방법을 조합함으로써, 준 안정 분자 구조 내의 요소의 구조 맵을 생성하는 형광 현미경의 특정 분자 표지 능력을 활용하는 것이 가능해진다. VirusMapper - - AN, 고성능의 사용하기 쉽고, 높은 처리량 ImageJ에 플러그인으로 패키지이를 위해, 우리는 새로운 알고리즘을 개발했다. 이 문서에서는 생물학적 m에 새로운 구조적 특징을 발견 할 수있는 능력을 보여주는,이 소프트웨어에 대한 깊이있는 가이드를 제공합니다olecular 단지. 여기, 우리는 호환되는 데이터를 조립하고 슈퍼 해상도의 이미지에 단일 입자 분석을 적용하려면이 알고리즘을 사용하는 방법에 대한 단계별 프로토콜을 제공하는 방법을 제시한다.

Introduction

슈퍼 해상도 (SR) 현미경을 이해하는 중요한 분자 특정 라벨과 함께 이미지 키 분자 처리 할 수있는 기능을 제공함으로써 세포 생물학에 큰 영향을 미쳤습니다. SR은 이제 이미지 살아있는 세포 1, 2에 대한 잠재적으로 광학 현미경의 주요 장점을 유지하면서 전자 현미경 (EM)로 이전에는 달성 할 수있는 해상도 (20 ~ 150 nm의) 접근하는 광학 현미경을 할 수 있습니다. 또한, 나노 레벨에있는 구조적 보전 SR 데이터의 단일 입자 분석 (SPA), 전자 현미경 (3)에서 광범위하게 사용되는 개념의 적용을 허용한다. SPA를 사용하는 구조의 대부분 고도로 보존 사본 묘화 해상도, 정밀도 또는 신호 - 대 - 잡음 가시 오브젝트를 개선하기 위해 함께 평균 될 수있다. SR과 함께 사용하는 경우, SPA 높은-P를위한 강력한 도구로 증명되었다이러한 HIV 7 및 HSV-1 (8)로 핵공 복합체 (4, 5)의 구성 요소, 중심체 (6), 및 바이러스의 recision 매핑.

그러나, SR 및 SPA의 일상 결합 된 응용 프로그램을 사용할 수있는 소프트웨어의 부족에 의해 도전을 받고있다. 이러한 이유로, 우리는 VirusMapper, 인기 이미지 처리 소프트웨어 ImageJ에 / 피지 9 플러그인을 개발했다. 이것은 SR 현미경으로 몇 군데 구조의 빠르고 사용하기 쉬운, 멀티 채널 순진한 평균을 제공하도록 설계 형광 이미지 (10)와 일반화 SPA에 대한 첫 번째 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어 패키지입니다. 바이러스를 설계하지만, 서로 다른 분자 종, 군데 식별 및 지역화 할 수있는 어떤 고분자 복합에 적용 할 수 있습니다.

VirusMapper 고정밀 분자를 생산하는 데 사용될 수 있습니다평균 치수 및 다른 파라미터의 계산을 가능하게 공지 구조의 모델. 알고리즘 설계 구별 방향 또는 다른 형태의 상태 판별에 제공하는 구조의 집단을 분리하는 것이 유용한다. 또한, 멀티 채널 영상은 기본 구조가 공지되어 여기서 참조 구조 기반 검색을 가능 경우 기준 채널을 채용 할 수있다. 소프트웨어를 다운로드하고 설치하기위한 지침을 제공 https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . 예 데이터도 발견 할 수 있으며, 사용자는 자신의에 적용하기 전에 예를 들어 데이터의 소프트웨어를 사용하여 연습하는 것이 좋습니다.

여기서, 원 데이터로부터 SPA 모델을 생성하기 위해 플러그를 사용하는 단계를 설명한다. 소프트웨어는 단일 O를 포함하는 원시 이미지를 얻는입력으로서 멀티 - 표지 구조 r에. 그것은 소프트웨어가 실행으로 조정되는 매개 변수의 수에 따라 반환, 영상화 된 구조 내에서 표시된 구성 요소의 평균 분포를 보여주는 SPA 모델.

이 프로토콜의 목적은 그림 1에 나와있는 파이프 라인에 따라 몇 군데 구조 내에서 구성 요소의 평균 지역화를주는 정확한 SPA 모델을 생산하는 것입니다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 소프트웨어 흐름 유용 3 단계로 분할된다. 첫 번째 단계는 각 채널에 대한 입자의 스택 결과 세그먼트 큰 화상이다. 이 입자들은 모델을 만들 수 및 모델 생성을위한 씨앗을 생산하기 위해 평균됩니다 단위입니다. 두 번째 단계는 최종 단계에서 입자의 전체 세트를 등록하는 데 사용되는 시드 이미지를 생성하는 것이다. 이것은 S에 기여할이 채널에서 입자를 선택 수동 기준 채널을 선택하고 수행한다eeds. 씨앗이 기준 채널로 선정되지만 모든 채널에 대해 생성 될 수있다. 입자는 처음에이 채널에서 2 차원 가우시안 피팅으로 재편된다. 선택 재편성 된 모든 입자는있는 씨앗을 생산하기 위해 평균. 모델링 될 데이터에서 본 각 공통 구조, 입자가 명확하고 정확하게 그 구조를 나타내는 종자로서 선택 될 것이다. 이 단계에서 인터페이스는 또한 이러한 구조에 대한 데이터를 검색하는 데 유용하다.

마지막 단계는 템플릿 매칭을 사용하여 모델을 생성하는 것입니다. 이것은 원래의 상호 상관에 의해 이전 섹션에서 생성 된 종자 이미지 추출 된 입자의 등록을 통해 달성된다. 등록 된 입자의 집합은 평균을, 처리는 또한 원하는 경우, 평균 제곱 에러 모델을 줄이기 위해 반복된다. 이 부분 집합을 만족해야 종자에 대한 최소한의 유사성을 설정에 의해 결정됩니다. 모델을 만들 때여러 개의 채널을 동시에 s가 공동 유사성, 또는 각각의 채널에 대한 유사성의 평균이 사용된다. 이들 기여 얻어진 모델 등록 입자는 추가로 분석 될 수있다.

Protocol

참고 :이 프로토콜 및 비디오 더 자세히 소프트웨어 패키지를 설명하면 원본 용지 (10)를 보충합니다. 독자는 소프트웨어의 사용에 대한 자세한 안내를주의 깊게 검토하는 것이 좋습니다. 세 가지 단계가있다 : 입자 추출 개별 입자로 세그먼트 큰 이미지; 일반적인 구조의 최종 단계에서 사용되는 시드를 생성하기 위해 상기 데이터를 식별하고 정렬 시드 선택; 및 템플릿 매칭이 종자에 기초 모델 생성은, 상기 추출 된 입자 평균에게 SPA 모델을 생성하기 위해 서브 세트를 정렬.

1. 설치 이전에 소프트웨어 패키지를 실행에

  1. 커버 슬립 또는 관련 실험 조건에서 연구중인 구조의 샘플을 준비합니다.
  2. 이미지 구조화 조명 현미경 (SIM) 11 stimula 같은 초 - 해상도 형광 현미경으로 시료,테드 방출 고갈 (STED) 12 현미경.
    참고 : 준비하고 관련 문헌을 참고해야한다, 그래서 이미지 샘플, 연구중인 구조의 특성에 크게 의존하는 방법의 정확한 세부 사항. 예로서, 제조 및 여기에 사용되는 것과 같은 백시 니아 바이러스의 샘플을 이미징하는 정확한 방법은 대표적인 결과 섹션에서 설명된다.
  3. 구조 또는 입자, 바람직하게는 수천의 개별 복사본 다수를 나타내는 뷰의 여러 필드의 이미지를 만든다. 뿐만 아니라 가능한 한 서로 분리 이미지가 먼지 나 관심이 아닌 다른 형광 구조의이 없는지 확인하는 이미지 입자.
  4. 피지 도구 모음에 파일을 드래그하거나> "열기"를 "파일"을 선택하여 피지의 입자를 포함하는 모든 이미지를 엽니 다.
  5. 을 연결하는 "연결할" "이미지"> "스택"> "도구"> 선택하나의 스택에 이미지. 결과 이미지가 Hyperstack 인 경우,> "Hyperstacks는"> "Hyperstack는 스택" "이미지"를 선택하여 스택 변환합니다.
    참고 : 마지막 스택은 인터 채널이 있어야합니다. 두 개의 채널이있는 경우, 스택에서 제 슬라이스의 첫 번째 이미지에서 채널 1이어야 번째 슬라이스가 대응하는 채널 2, 제 슬라이스 번째 이미지에서 채널 1 일 등해야해야한다.

2. 입자를 추출

  1. 세그먼트에 이미지를 선택하고 "바이러스 성 구조의 압축을 풉니 다"를 선택합니다. 추출 된 입자를 저장하고 "추출 바이러스 성 구조를"볼 위치를 선택 대화 상자 (그림 2).
  2. 다음과 같이 "바이러스 성 구조의 압축을 풉니 다"대화 상자에 입력하는 방식으로 초기 추정치 추출 매개 변수를 지정합니다. 이미지 분할 미리보기 후 이러한 매개 변수를 미세 조정.
    1. 마비 설정묘화 한 다른 형광 채널의 수와 같은 데이터 세트의 채널 어 (예 2).
    2. 입자가 채널의 원하는 번호를 입력하여 그 채널에서의 피크 검출 수단에 의해 추출되는 기준 채널을 설정한다. 가장 일치하는 채널을 선택합니다; 즉, 채널이있는 대부분의 입자는 같은 모양을 가지고있다.
      참고 :이 채널에서 입자가 중심의 최대 값을 갖 가능합니다.
    3. 미리 감지 가우시안 블러를 적용할지 여부를 선택합니다. 어떠한 흔들림을 가하지 0으로 미리 검출 가우스 블러를 설정; 이 값이 증가하면, 주어진 반경 가우스 블러 필터는 로컬 최대치 검출되기 전에 적용된다. 기준 채널은 중심의 최대 값 (예를 들어, 링 모양)이없는 경우이 기능을 사용; 블러 링은 하나의 모양을 유도한다.
      참고 :이 기능은 사용이기 때문에 관심의 분단 된 지역 (로아)이 적용된 가우시안 블러가없는D는 상기 기준 채널의 ROI를 배치한다.
    4. 픽셀 (각 로컬 최대 주위 설정 될 것이다)가 ROI의 반경을 설정한다. 그 로아는도 3에서와 같이 큰 입자보다 약간 크고되도록 값을 선택. 큰 입자 (눈에 의해 대략 추정) 30 픽셀의 직경으로 나타나는 예를 들어, 픽셀 (20)에 ROI를 설정 반경.
    5. 100 이하, 초기 상대적으로 작은 값으로 프레임 당 사용하는 ROI의 수를 설정한다.
    6. 최대 ROI의 중복을 설정합니다. 입자가 잘 분리되어있는 경우,이 작은을 유지; 입자가 클러스터 된 경우, 중복하는 로아를 사용하려면이 증가.
  3. "쇼 미리보기"를 선택합니다.
    주 :이 선택되면, 현재 프레임에 관련된 기준 채널에 대한 상기 추출 된 ROI를 게재한다.
  4. ROI를 반경 로아 수 및 가능한 많은 입자 주위에 적당한 크기의 ROI를 갖도록 최대 ROI 오버랩을 조정도 3에서와 같이.
  5. 분할을 실행하려면 "OK"를 선택합니다. 이미지와 투자 수익 (ROI) 관리자를 닫습니다.
    참고 : 입자 세트의 파일의 이름을 변경하지 마십시오. 이 이름은 형식이어야합니다 "바이러스 성 입자 - channelX을"다음 섹션을 위해.

3. 씨앗

  1. "씨앗을 생성"을 선택하여 추출 된 입자가 저장되어있는 폴더를 선택하고 "씨앗을 생성"대화 상자 및 창 (그림 4) 볼 수 있습니다.
  2. 다음과 같이 "씨앗을 생성"대화 상자에 입력하는 방식으로 초기 종자 선택 매개 변수를 지정합니다.
    1. 모든 채널을 맞추고 중심에 맞춰진다 기준 채널을 설정한다. 대부분의 입자는 모양이 동일하고, 가능하면 그 중앙 최대 값을 갖고있는 채널을 선택한다.
    2. 시드가 생성되어야하는 모든 채널에 대한 상자를 선택합니다.
    3. 씨앗이 rotat 할 필요가있는 경우 선택90 ° 에디션. 다른 모델과 일치 정렬을하려면이 기능을 사용하여
    4. 미리 정렬 가우시안 블러를 적용할지 여부를 선택합니다. 어떠한 흔들림을 가하지 0으로 각 채널의 흐림 반경을 설정한다. 재배치하기 전에 주어진 반경 가우스 블러 필터를 적용하기 위해이 값을 증가시킨다. 입자가 중심의 최대 값이없는 경우이 기능을 사용; 블러 링은 하나의 모양을 유도한다.
      참고 :이 기능은 일관된 정렬을 얻기 위해 단지이기 때문에 씨앗이 적용된 흐림이 없습니다.
    5. 확인 또는 각 채널은 "시프트 보정"상자의 선택을 취소하여 그들을 회전하지 않지만, 별도로 비 레퍼런스 채널의 씨앗을 가운데 시프트 보정을 사용할지 여부를 선택합니다.
      참고 : 채널이 서로 잘 정렬되지 않는 경우에 사용; 또한, 시프트 보정없이 단독 기준에 따라 다른 채널을 정렬하는 데 유용 할 수있다.
  3. 씨앗으로 사용할 입자를 선택합니다. t을 통해 검색그 모델링 프레임 번호를 기록 할 수있는 구조와 유사한 입자를 발견 순서 입자.
  4. 상자 "를 사용하는 프레임"는에 번호를 입력하고 더 창 (그림 5)이 나타납니다. 쉼표로 구분 된 여러 프레임 번호를 입력합니다.
  5. 표시되는 창에서 씨앗 프레임과 결과 평균 씨앗을 볼 수 있습니다.
    참고 : 로그 평균과 비슷한 씨앗을 제안합니다.
  6. 발견 시드 다수의 프레임 유사한 외관을 갖도록 시드 선택 과정을 최적화하는 기준 채널, 가우스 블러 반경 시프트 보정 옵션 조정. 평균 씨앗이 만족스럽게 모델링 될 데이터에서 볼 수있는 구조를 닮은 생성 될 때까지 추가 씨앗을 계속합니다.
  7. 씨앗의 이름을 지정하고 그들이에 저장을 선택합니다 여기서 "OK"모델 생성에서 나중에 사용하기 위해 최종 씨의 이미지를 저장합니다.

4. 모델을 생성

  1. 괜찮다lect "씨앗을 기반으로 모델을 생성"추출 된 입자가 저장되어있는 폴더를 선택하고, "모델을 생성"대화 상자 (그림 6)를 볼 수 있습니다.
  2. 체크 박스를 사용하여 각 채널의 씨앗을로드합니다.
    참고 : 씨는 "씨앗을 생성"대화 상자에서 명명 된 하위 폴더에 저장됩니다. 기본 이름은 "분석"입니다. 종자 평균이 아니라도 참조를 위해 저장되는 프레임을 선택주의하십시오.
  3. 다음과 같이 "모델을 생성"대화 상자에 입력하는 방식으로 초기 모델 생성 매개 변수를 지정합니다. 이러한 매개 변수 나중에 미세 조정.
    1. 유일한 기준 채널에서 번역과 회전을 계산하고 모든 채널에 적용합니다 조정의 채널을 사용할지 여부를 선택합니다. 이 옵션을 사용하는 경우, 참조로 사용할 수있는 채널을 선택합니다.
      참고 :이 옵션은 특별히]을 참조로 한 채널을 사용하도록 선택해야합니다이러한 기준 구조 기반 검색을 수행하는 경우 등 NCE. 그렇지 않으면, 덜 정확한 모델 발생합니다. 채널은 물론이 옵션을 사용하는 경우 정렬되어야합니다.
    2. 템플릿 매칭 동안 이미지의 강도를 광장할지 여부를 선택합니다. 이 작은 차이를 강조하므로 특히 미묘한 기능이있는 모델을 만들 때 사용합니다.
    3. 은 "최소 유사성 씨에 대해"슬라이더를 사용하거나 상자에 숫자를 입력하여 종자에 대한 최소한의 유사성을 선택합니다.
      참고 : 사용되는이 컷 - 오프보다 더 큰 씨앗에 유사성과 입자. 60-80%는 일반적으로 시작하기에 좋은 선택이 될 것입니다.
    4. 1로 최대 반복 횟수를 설정 시드에 대해 최소의 유사성을 최적화하며, 필요에 따라 이상을 증가시킨다.
    5. 이 나타납니다 모델 생성 프로세스의 요소를 선택할 수있는 상자를 선택합니다.
      참고 : "쇼 씨"는 상자에 포장으로로드 된 씨앗을 표시합니다대화 상자의 상단의. "연락처보기 모델"씨에 대한 최소한의 유사성을 충족 입자의 집합을 평균에서 생성 된 모델의 모든 반복을 표시합니다. "연락처보기 MSE는"대부분의 변수가있는 모델의 영역을 강조 평균 제곱 오차 (MSE) 이미지를 표시합니다. 은 "입자"가 표시됩니다 모델의 가장 높은 반복에 따라 등록 된 모델을 만드는 데 사용되는 입자의 집합을 표시합니다.
  4. 미리보기 모델을 생성하고 결과를 볼 수 "미리보기 표시"를 선택합니다.
    참고 :이 프로세스의 가장 연산 집약적 인 단계입니다. 데스크탑 PC의 픽셀의 수십의 직경이 몇 천 입자의 집합에 대한 실행 시간은 약 10 분이어야한다. 계산 시간이 문제가되는 경우, 사용자는 먼저 데이터의 작은 서브 세트의 알고리즘을 시도해야하거나 가능하다면, 단계 2.2.4의 ROI 작은 반경을 사용한다.
  5. 생성보기D 모델 파라미터, 특히 종자에 대해 최소한의 유사성을 최적화. 모델링 된 형태의 진정한 입자가 모델에 포함 될 때까지 종자에 대한 최소한의 유사성을 높입니다.
  6. 슬라이더 "반복의 최대 수"를 사용하거나 박스에 숫자를 입력하여 반복의 최대 수를 증가시키고, 모델 생성 프로세스를 반복 할 수있다. 최대 반복에 대해 약 10의 값을 사용합니다.
  7. 모델의 이름을 지정하고 최종 모델 생성 과정의 모든 반복을 포함하는 모델 진화 스택을 저장하려면 "OK"를 선택합니다.
    참고 : 종자에 대한 최소한의 유사성이 더 입자가이 유사성이없는 너무 높은 경우, 아무것도 업데이트되지 않습니다. 플러그인을 동결 나타나는 경우, 최소 유사성이 너무 높은 가능성을 고려한다.

Representative Results

여기, 우리는 모델 폭스 바이러스, 우두 바이러스의 소프트웨어를 보여줍니다. 가장 복잡한 포유류 바이러스, 백시 패키지 중 하나는 350 X 270 × 250 내지 3 벽돌 형상 입자 (13), (14) 내에서 약 80 가지 단백질. 세 하부 구조는 전자 현미경에 의해 식별 같습니다 dsDNA 게놈을 포함하는 중앙 코어; 두 단백질 구조, 코어의 측면에 호출 측 몸체; 단일 테오 이중층 15 봉투. 재조합 단백질 형광 태그에 대형의 복잡한 구조 및 가공성은 우두에게 VirusMapper 흐름을 설명하기위한 우수한 시스템을 만든다.

여기에 기술 된 바와 같이 소프트웨어를 사용하여, 백시 비리에서 다양한 단백질의 분포를 모델링 할 수있다. 단백질은 라벨과 콤비에 아마도 몇 군데 있었다입자 해당 단백질의 지역화의 평균 모델을 생성하기 위해 설명 된 바와 같이 참조로 공지 분포의 다른 단백질, 및 소프트웨어와 국가를 사용 하였다. 이 예에서, 두 단백질은, 내부 코어 단백질 L4를 모델링하고, 주요 본체 측면 성분 F17 하였다.

F17을 가진 재조합 우두 바이러스는 GFP 태그와 mCherry (16)가 사용되었다와 L4는 태그. 정제 된 바이러스는 1 개 mM 트리스, pH를 9로 희석하고, 실온에서 30 분 동안이를 코팅함으로써 세정 고성능 커버 슬립에 결합시켰다. 샘플은 그 다음 20 분 동안 PBS에서 4 % 포름 알데히드를 도포하여 고정시켰다. 커버 슬립 antifade 설치 매체에서 슬라이드에 바로 장착되었다. 영상은 상업 SIM 현미경에 SIM에 의해 수행되었다. 시야는 5 위상 시프트 및 561 nm의 격자 3 회전 (32 ㎛의 격자 PE를 사용하여 획득 된 바이러스 및 이미지 수백 함유 선택한로부터 bit_count) 및 488 nm의 (32 ㎛의 격자주기) 레이저. 이미지는 sCMOS 카메라를 사용하여 획득하고, 현미경 소프트웨어를 이용하여 처리 하였다. 채널은 동일한 화상 취득 설정 묘화 천연색 비드 슬라이드에 기초하여 배향 하였다. SIM 재구성 채널 정렬 이미지 피지 개방 한 화상 스택로 결합 된 후.

이들 입자는 중앙이 최대로 바이러스 입자는 기준으로서 임의 가우시안 블러를 적용하지 않고 L4의 채널을 이용하여 이미지에서 추출 하였다. 약 15,000 입자는이 실험에서 추출 하였다.

때문에 우두의 형상에, 측면 몸은 바이러스 방향에 따라 완전히 다른 모습을 가지고있다. 우리는 하나 또는 두 개의 중 측면 몸을 구별 할 수있는 두 가지 방향을 시각화. 우리는 정면 및 시상, 존중 이러한 방향이라ively.

전방 시상 방향 따로 씨는 "종자 생성 '단계에서 입자 목록을 검색하여 선택 하였다 (도 4 및도 5); 하나 개의 방향으로 분명했다 또는 다른이 선택된 입자. L4 채널은 서로 씨앗 정렬 기준 채널로서 사용 하였다. 다시 말하지만, 더 가우시안 블러는 필요 없었다. 각 방향 5 개 입자를 선택하고, 종자를 생산하는 평균화 하였다.

모델이 씨앗에 따라 각 방향에 대해 생성되었다. 기준 채널이나 제곱 세기 값이 어느 사용 하였다. 반복의 최대 수는 1로 초기 설정하고, 최소의 유사성은 각 방향에 대해 일관된 모습을 준 각각의 경우에 약 1000 입자를 포함 하였다. 반복의 최대 수는 증가했다모델의 융합을 위해 할 수 있습니다. 모델 따라서 두 채널의 두 방향 (도 7)에 대해 생성 하였다.

그림 1
그림 1 : VirusMapper 워크 플로우. 플러그인은 세 가지 주요 단계로 구성되어있다. 바이러스 입자는 큰 이미지로부터 추출되고, 이미지 템플릿 또는 종자 데이터로부터 반 수동으로 선택되고, 최종 SPA 모델 종자를 참조하여, 데이터로부터 생성된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 대화 "바이러스 성 구조의 압축을 풉니 다". 선택했을 때 "바이러스 성 Structur을 추출 ES ROI 영역을 미리 볼 수 있도록 미리보기 표시가 "다음을 선택할 수 있습니다"이 대화 상자가 나타납니다. 매개 변수는. 최적의 분할을위한 초기 추정 가득해야 "및 매개 변수를 미세 조정합니다. 을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.

그림 3
그림 3 : 추출 매개 변수를 설정. 추출한다 로아 상기 ROI 반경 로아 수 및 최대 ROI 오버랩 미리 후 이런 상황을 달성하도록 조정된다. 모든 입자의 ROI는 ROI에 포함되며, 클러스터는 ROI의 입자가 분리 될 수 있도록 충분히 겹칠 수 있고, 입자보다 약간 크다.ANK ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 템플릿 매칭 씨앗을 생성. 은 "씨앗을 생성"대화 상자 (1) 할당 할 수있는 매개 변수를 설정합니다. 레퍼런스 시퀀스 입자 (2)는 사용자가 기준 채널 입자를 스캔 할 수있다. 입자는 입자가 상기 기준 서열로 표시되는 경우, 모든 채널에 대한 재정렬 입자는 입자 재정비 프리뷰 (3)에서 볼 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 종자 이미지 추가. 씨앗은에 추가되면 상자 "프레임 사용", 관련된 모든 씨앗 (4)의 평균 프레임 (5) 표시됩니다. 현재 평균 씨앗과 유사 입자는 대화 상자 (6)에 제시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 대화를 "모델을 생성합니다." 선택 "씨앗을 기반으로 모델을 생성,"때이 대화 상자가 나타납니다. 매개 변수는 최적의 모델 생성을위한 초기 추정치로 채워 져야하고, 모델 생성 방법의 요소를 선택해야 계산 중에 도시한다. "미리보기 표시"을 선택 후 실행 모델 생성 과정을 수 있도록 선택할 수 있으며 매개 변수를 미세 조정합니다.ftp_upload / 55471 / 55471fig6large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
도 7 : VirusMapper 생성 모델. mCherry 태그 번과 핵심 단백질과 EGFP 태그 F17의 측면 바디 단백질 우두 비리는 SIM을 사용하여 몇 군데 있었다. 프로토콜에 설명 된 모델은 다음에, 소프트웨어로 생성 하였다. 정면 및 시상 두 방향은, 측면 몸의 모양에 의해 구별된다. 스케일 바 = 100 내지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 방법으로, 연구진은 바이러스 및 기타 거대 분자 복합체의 단백질 구조의 고정밀, 멀티 채널 2D 모델을 생성하기 위해 SPA와 SR 현미경의 힘을 결합되어 있습니다. 그러나, 몇 가지 중요한 고려 사항이 고려되어야한다.

씨앗은 지속적으로 볼 수있는 구조를 표현하기 위해 선택해야합니다. 따라서 원 데이터는 종자가 선택된다 전에주의 깊게 검사되어야한다. 이 바이어스 모델을 방지하는 것이 중요하다. 선택은 모델에 입자의 특정 번호를 포함하는 데 필요한 최소 유사성 임계 값의 시험에 의해 검증 될 수있다. 분명히, 종자의 선택을 위해, 더 높은이 임계 값은 입자의 특정 번호를 할 필요가, 더 그 구조는 데이터에서 알 수있다.

데이터의 얼룩이있을 때 템플릿 매칭 개념은 특히 유용하다. VI 모든 다른 구조sible이 확인되어야하고, 다른 모델은 각각의 경우에 대해 생성. 하나 개의 채널에서 이종 구조의 분리하지만 동시에 제 2 채널에서 모델을 생성함으로써, 패턴은 즉시 분명하지 않았을 나타날 수있다.

또 다른 고려 사항은이 알고리즘을 사용하여 반복 절차는 확률 적 비대칭 성을 극대화하는 것입니다 때주의해야합니다. 두 개의 대칭 최대치와 구조를 모델링 할 때, 예를 들어, 최대 값 사이의 모든 약간 비대칭은 반복 동안 서로 정렬되며, 최종 모델 따라서 최대한 비대칭 일 것이다. 이 모델링되는 구조에서 알려진 대칭을 반영하지 않는 경우, 다음이 고려되어야한다. VirusMapper 모델 생성 과정에 대칭 축선을 포함하는 잠재적 인 개발 될 것이지만 현재이 극대화를 방지 할 수있는 유일한 방법은, (1) 반복 횟수를 제한하는 것이다. VirusMapper의 모든 새 버전은 avai 것참조 된 웹 사이트에 LABLE (재료 표 참조). 사용자는 어떤 공통 질의 답변을 여기에 질문을 찾을 수 있습니다.

설명이 소프트웨어는 사용자가 모델링하고자하는 기능을 시각화하기에 충분한 해상도로 이미지화 할 수있는 모든 구조에 적용 할 수있다. SPA는 해상도를 향상시킬 수 있지만, 명확하게, 그렇지 않으면 볼 수없는 기능의 가시성이 향상되지 않습니다. 이 프로토콜은 따라서 방법은 데이터의 품질을 향상시킬 수 없습니다. 깨끗한 데이터와 최적의 결과 모델을 제공 할 것입니다 이미징 전략의 기술,주의 샘플 준비 및 최적화와 마찬가지로.

SR 영상 기법의 선택은 일반적으로 손의 샘플에 따라 달라집니다, 또한 중요하다. , VirusMapper는 SIM과 STED (10)와 함께 잘 작동하도록 검증되었습니다, 그것은 또한 고품질의 현지화 현미경 데이터를 사용할 수 있지만주의가이 경우에주의해야한다같은 스파 스 라벨은 비대칭 극대화 유사한 문제가 발생할 수 있습니다.

현재 VirusMapper 형광 이미지의 단일 입자 분석 및 유일한 범용 2D SPA 평균 소프트웨어에 대한 유일한 자유롭게 사용할 알고리즘이다. 같은 원칙 4, 6의 사용을 만들었습니다 다른 연구, 8은 각각의 특정 연구 전문 사용자 정의 소프트웨어를 사용하고 있습니다. 별도의 소프트웨어가 제공되지 않았지만 3D 데이터의 재구성을위한 범용 알고리즘, 5, 18을 발표했다.

이 문서에 설명 된대로 사용하는 경우, VirusMapper는 바이러스 및 기타 단지의 고분자 단백질 구조의 정밀하고 정확하며 강력한 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 모델로, 연구진은 구조체의 평균 치수의 정확한 측정을 할 수 있습니다연구 대상 URES는 잠재적으로 그들이 그렇지 않으면 불가능했을 것입니다 생물학적 결론에 도달 할 수 있도록.

또한,이 기술의 다중 채널 기능, 단지 내 단백질 성분을 무제한 매핑 및 신규 단백질 조직을 발견 할 수있다. 이러한 바이러스 라이프 사이클의 다른 단계와 같은 다른 생물학적으로 관련 조건에서 나노 구조의 변화를 검사, 생물학으로 가치있는 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고있다.

Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 VirusMapper의 원래 개발 및 검증에 대한 그들의 공헌 코리나 비어리, 저지 사모리지, 페드로 마토스 페레이라, 크리스토퍼 블렉 및 카트린 쉐러 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 비판적 읽기 아르투르 Yakimovich에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회에서 교부금에 의해 투자되었다 (BB / M022374 / 1) (RH); 분자 세포 생물학에 대한 MRC 연구소의 핵심 자금, 영국 런던 대학 (JM); 유럽 ​​연구위원회 (649101-UbiProPox) (JM); 및 의료 연구위원회 (MR / K015826 / 1) (RH와 JM). RG는 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EP / M506448 / 1)에 의해 지원된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fiji Open-source image analysis software
NanoJ-VirusMapper developed by the Henriques lab Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
VectaShield antifade mounting medium Vector Labs H-100
Elyra PS1 Zeiss
ZEN BLACK Zeiss Image processing software for SIM
High performance coverslip Zeiss  474030-9000-000
TetraSpeck beads ThermoFisher T7279

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References

  1. Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution. Biopolymers. 95, (5), 322-331 (2011).
  2. Gustafsson, N., Culley, S., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun. 7, 12471 (2016).
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  17. Nanoj-virusmapper. Available from: https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper (2016).
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