一个定制HPLC纯化协议,产量高纯度淀粉样蛋白β42和贝塔淀粉样蛋白肽40,有能力寡聚物形成的

Biochemistry

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Summary

在此,我们报告说,得到高纯度的β淀粉样蛋白42(Aβ42)和β淀粉样蛋白40(Aβ40)肽,能够形成低聚物量身定制的HPLC纯化协议。 β淀粉样蛋白在阿尔茨海默氏症牵连高度易聚集,疏水肽。该肽的淀粉样蛋白性质使得其净化是一个挑战。

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Warner, C. J., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation. J. Vis. Exp. (121), e55482, doi:10.3791/55482 (2017).

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Abstract

Introduction

阿尔茨海默氏症是一种神经退行性疾病的全球影响超过35万人。 1在疾病的发作和发展强烈牵连,是高度易聚集,疏水肽β淀粉样蛋白(Aβ)。 2Aβ从长度36至43个氨基酸的范围内,但是,它被认为是42-氨基酸变体,淀粉样蛋白β42(Aβ42),是蛋白质的最毒的形式。 3这是由于在大多数情况下,以Aβ42的容易地形成被认为是特别神经毒性实体扩散,低聚物质的能力。 4为了进一步提供了对Aβ肽的了解,有必要定期地获得高纯度的材料。微量杂质的存在已经显示出显着改变肽的聚集倾向的属性。

ŧraditionally,高效液相色谱(HPLC)的疏水性肽,例如Aβ的分离已通过使用C 4或C 8的二氧化硅基固定相和酸性流动相的组合完成的。 6然而,这样的条件可以提出一个挑战的肽的纯化。所述Aβ肽的低等电点(pI约5.5)7意味着在酸性条件下,肽聚集增加,并且作为结果宽,非分辨的HPLC峰是常常难以分离产生( 图2A)。此外,这样的宽峰常常含有可能影响所述肽的聚集的空间,通常需要后续的轮次的纯化,其可以极大地影响肽的产生量的杂质。

的聚(苯乙烯/二乙烯基苯)固定相,PLRP-S,表示PURIF的替代手段英疏水性肽。固定相已在许多不同的蛋白质和信使核糖核酸(mRNA)的的纯化被使用。 8,9 PLRP-S固定相需要用于反相分离没有额外的烷基配体,而且更重要的是化学稳定在高pH导致肽的解聚。 7在此,我们报告说,得到高纯度的β淀粉样蛋白42(Aβ42)和β淀粉样蛋白40(Aβ40)肽量身定制的HPLC纯化协议。

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Protocol

1.Aβ40或Aβ42肽的制备型HPLC纯化

  1. 准备以下缓冲区的HPLC纯化。
    1. 加入1.3毫升NH 4 OH(28%溶液)到1000毫升超纯水制备缓冲液A(20毫米NH 4 OH)。
    2. 通过加入1.3毫升 NH 4 OH(28%溶液)的800毫升的HPLC级乙腈和200毫升的超纯水的溶液中制备的缓冲液B(80%乙腈的20mM NH 4 OH)。
    3. 通过加入100微升的NH 4 OH(28%溶液)至100毫升的超纯水制备样品溶解缓冲液(0.1%的NH 4 OH)。
  2. 设置为在图1所示的高效液相色谱仪。
    1. 适合的溶剂瓶是包含缓冲A和缓冲B到HPLC泵的使用聚合物管道入口。附加聚合物管与单件式接头的HPLC泵。确保聚合物管每个缓冲器被装配到仪器的正确入口阀。契合脱气HPLC泵。
    2. 耦合HPLC泵与300埃为8μm25毫米х300毫米制备柱的入口使用聚合物管( 图1B,最左边列中,见材料列表)。
      1. 附加聚合物管连接到制备柱上用一单件手指紧接头。确保聚合物列以正确的方式定向。
        注:制备柱的固定相由聚(苯乙烯 - 二乙烯基苯)的颗粒。该聚合物列的正确方向上标有与单个方向箭头的外壳。
    3. 使用聚合物管列的出口连接到双波长检测器和波长检测器设定至214纳米和280纳米。
      1. 在的设置仪器方法选项改变检测波长参数改变波长内置型HPLC软件。
    4. 附加聚合物管波长检测器的入口有一个单件的手指紧身。附加聚合物管连接到波长检测器的输出阀。与单件式手指紧身附加聚合物管连接到HPLC检测器的出口阀。这将是样品收集管。
      注:缺乏对Aβ肽的强烈的发色团的决定了214nm处被用作初级紫外线(UV)波长为峰集合。

图1
图1:用于淀粉样蛋白β肽的纯化的HPLC仪器的实验装置。 (A)中的季HPLC泵装有一个脱气器和可变波长检测器设定至214纳米和280纳米;用于淀粉样蛋白β肽的纯化(B)的HPLC柱,从从左到右,25×300毫米2制备柱,7.5×300毫米2半制备柱和4.6×250毫米2分析柱; (C)手动进样器与用于HPLC分析20微升不锈钢注射循环; (D)的手动喷射器与用于制备和半制备纯化10mL的不锈钢注射环。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 编程性HPLC软件以运行该纯化方法如表1所示,通过改变溶剂时间表参数(在内置到HPLC软件的安装仪器方法选项)输入的纯化方法。通过点击HPLC软件的“上”按钮打开HPLC泵。
    注:该泵将开始提供缓冲液A开始比,并通过预备缓冲液Barative柱和HPLC仪器。
    1. 离开系统30分钟以充分平衡。
次/分 缓冲液A 的% 缓冲液B 的B% 流量d /毫升-1
0 80 20 6
45 75.5 24.5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 95℃ 6

<强>表1:时间表使用25×300毫米聚合物列中的Aβ42和Aβ40肽的纯化。 一个缓冲A - H 2 O运用20毫米NH 4 OH; B 80%乙腈/ 20%H 2 O 20毫米NH 4 OH; Ç冉15分钟以洗涤之前样品的下一注射柱; d在为了运行上的HPLC仪器6毫升/分钟的流速,压力限制需要被降低到200巴。

  1. 该Aβ肽样品的分离纯化
    注意:通过自动固相肽合成而获得粗肽。 10
    1. 溶解3毫克粗的Aβ肽在4毫升的样品溶解缓冲液中。超声处理样品30-60■在室温下,并在40千赫兹以促进溶解的频率。
    2. 注入整个样品上用装有16号5毫升塑料注射器HPLC柱不锈钢针。如在子步骤1.3中概述运行的纯化方法。
      注:该系统使样品注入到通过使用安装有10毫升不锈钢注射环( 图1D)的手动喷射器来完成。所需的Aβ肽将洗脱分钟72和74之间作为一个尖锐分辨峰( 图2C)。
    3. 收集样品到50mL锥形离心管中。确认Aβ峰通过收集洗脱液直接注入质谱的身份。 11商店洗脱液为在-20℃达12小时。
      注:长于12小时没有到期的肽的氧化宜电位期间将溶液的贮藏。
    4. 隔离通过快速纯化肽冷冻收集的等分试样/液氮冷冻干燥的Aβ肽的等分试样。通过冷冻干燥该样品在-60℃,PRES的温度下进行冷冻干燥确保20毫托,为期24小时的。
    5. 运行分析型HPLC协议如下所述来确定Aβ肽的纯度。商店肽在-20℃,为期6个月的冷冻干燥的形式。

2.纯化的Aβ蛋白的分析性HPLC分析

  1. 准备HPLC缓冲区在小节1.1概述。上述协议。
  2. 设置的分析性HPLC按步骤1.2.1并且与4.6×250毫米分析柱( 图1B,最右列),并用20微升不锈钢注入环的手动进图1所示( 图1C)装配到仪器。
  3. 编程性HPLC软件以运行该分析方法如表2所示下列类似于在步骤1.3的指令。
时间 / 缓冲液A 的% 缓冲液B 的B% 流量/毫升-1
0 95 1
三十 50 50 1

表2:时间表的Aβ肽的HPLC纯度分析。 一个缓冲A - H 2 O运用20毫米NH 4 OH; B 80%乙腈/ 20%H 2 O 20毫米NH 4 OH。

  1. 该Aβ肽的纯度分析
    1. 通过在样品缓冲液中的肽的溶解制备纯化的肽的1毫克/毫升溶液。
      注:缓冲区配方可在小节1.1中找到。蛋白质浓度通过在280nm(A 280毫微米 )测定蛋白质的吸收来确定。 12 m个用于确定浓度OLAR消光系数(ε)为ε= 1,490分米3摩尔-1 -1。 13
    2. 注入1毫克/毫升(222μM)溶液到HPLC柱20微升并运行的分析方法,该方法是设置在步骤2.3。
      注:不用于分析剩余的溶液可以在液氮快速冷冻和冷冻干燥以回收的Aβ肽。冻干细节可以在子1.4.4节中找到。 Aβ的肽将洗脱从16和18分钟( 图2D)之间的分析柱。使用伴随HPLC仪器来确定Aβ肽的纯度内置整合分析软件。纯度通过每个单独的峰的积分在光谱并计算肽峰面积百分比来确定。通常情况下,“95%的纯化应来确定。

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图2:Aβ42的代表性HPLC曲线。 (A)的传统 C 4的二氧化硅纯化,条件为:缓冲液A:H 2 O与0.1%三氟乙酸(TFA),缓冲液B:MeCN中(乙腈),0.1%TFA,梯度:20到27%缓冲液B,经40分钟,随后通过等度27%缓冲液B; (B)使用25×300毫米2聚合物列,条件制备纯化:缓冲液A:H 2 O 20毫米NH 4 OH,缓冲液B:80%乙腈/ 20%H 2 O 20毫米NH 4 OH,渐变:70分钟; 20到27%缓冲液B,接着等度27%缓冲液B; ( )优化使用25×300毫米2聚合物制备色谱柱净化,条件在位于小节协议描述文本1.3表1所示; (D)分析用HPLC使用4.6×250毫米2聚合物柱,CONDitions:缓冲液A:H 2 O 20毫米NH 4 OH,缓冲液B:80%乙腈/ 20%H 2 O超过30分钟20毫米NH 4 OH,梯度5至50%缓冲液B。对于部分A,B和C对应Aβ42峰用星号标记。标记Aβ42峰值在C部分揭示了> 95%的纯度所示部分D质谱的集合被用来确定Aβ42峰的身份。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Representative Results

所述Aβ42肽的使用和PLRP-S固定相的组合的高pH的流动相在用于Aβ肽的尖锐,解析峰的形成在保留时间72和74分钟( 图2C)之间的结果的纯化。峰的身份的确认是通过收集洗脱液直接注射质谱完成。洗脱液可以存储在长达12小时的溶液-20℃。存储的时间较长,可能会导致该蛋白质的氧化。以分离纯化的肽,洗脱剂是闪光灯在液氮中并冻干冷冻。该纯化的肽的分析型HPLC显示> 95%( 图2D)的纯度。相同的过程可用于未经方法的修改来净化Aβ40肽( 图3A)。分析型HPLC表明Aβ40的纯度为大于95%( 图3B)。 图3
图3:Aβ40的代表性HPLC曲线。 )优化利用25×300毫米2聚合物制备色谱柱净化,条件在位于该协议说明文字小节1.3表1所示。对应Aβ40的峰标有星号。 ( )分析HPLC使用4.6×250毫米2聚合物柱条件:缓冲液A:H 2 O 20毫米NH 4 OH,缓冲液B:80%乙腈/ 20%H 2 O 20毫米NH 4 OH,渐变:在30分钟内5〜50%缓冲液B。标记Aβ40峰A部分揭示了> 95%的纯度所示B部分质谱的集合被用来确定Aβ40峰的身份 请点击她的E要查看此图的放大版本。

为了确认该纯化的肽可以形成低聚混合物,我们进行如前所述14,15和能够鲁棒地观察寡聚物形成未修饰的蛋白质(PICUP)的光致交联。 10

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Discussion

所述Aβ肽的HPLC纯化是高度依赖于两者在纯化中使用的固定相和选择,以洗脱所述肽的流动相的选择。肽和高倾向聚集低等电点呈现疏水蛋白质的分离(C4或加上酸性移动洗脱液C8固定相)挑战传统色谱条件下,与Aβ肽洗​​脱作为延长的宽,非分辨峰( 图2A)。

为了避免这个问题,PLRP-S固定相,在高pH下是化学稳定的被发现是有效的Aβ肽( 图2B2C)的纯化。使用高pH流动相的最小化聚集程度,和优化时,就产生了一个尖锐的,很好分辨的峰。在优化的协议,缓冲液B的比例为迅速SWITC从20%建置到27%在52分钟的时间点,其结果,就产生了一个良好定义的Aβ峰( 图2C)。这种优化的协议依赖于所有的疏水杂质被从柱中缓冲液B的浓度初始20至24.5%的增加的过程中洗脱。如果发现杂质,这是一个类似疏水性的Aβ肽,高效液相色谱协议,那么进一步的优化可能有必要。优化的方法,合成Aβ的个别批次之间高度重复性,并能够净化肽的两个40和42的变种没有任何改变优化的过程( 图3)。对于这两种肽,如通过分析型HPLC确定的纯度被认为是大于95%。

定的微量杂质改变Aβ肽的聚集倾向的报告,这是可取的,正交的生物物理表征被用于确认该纯化的肽是能够进行低聚。使用先前报道,我们选择执行PICUP协议。 如图14所示 纯化的蛋白质的15 PICUP分析表明通过用于Aβ40肽和通过七聚体分布与Aβ42肽相关联的单体六聚人口分布的特性的单体。 10这些结果证实使用PLRP-S固定相和Aβ蛋白,其能够聚合的高pH移动洗脱液结果的Aβ肽的该纯化。

报告的纯化方法被设计为能够净化最多3毫克的Aβ肽在单一色谱运行。对于此过程,它是设置在6毫升/分钟高效液相色谱仪的流率的关键。如果所使用的HPLC泵的低流率时,HPLC的运行时间应扩展到容纳于此。 CONVERsely,采用较高的流速可以保证在HPLC运行时间的减少。然而,减少的运行时间可导致与其它峰的Aβ峰的共洗脱并因此降低收集到的Aβ肽的纯度。此外,用于纯化色谱柱的HPLC仪器和尺寸可以极大地影响可在单次运行中纯化的材料的量。如果没有峰是在Aβ肽的预期洗脱时间产生,并且一个大的峰值在对应于溶剂前沿洗脱液时间产生的,然后太多的材料最初被装载到柱上。减少材料注射到HPLC柱每次运行的量将绕过这个问题。一旦Aβ肽得到了净化,强烈建议溶液中尽快冷冻干燥。在溶液中的肽的长期贮存会导致Aβ的氧化,因此,形成的杂质。普该Aβ肽RITY应始终由HPLC分析确定。痕量的杂质可以显着改变肽的聚集倾向。如果分析型HPLC跟踪显示的杂质的存在,则该样品应重新经受HPLC纯化协议并通过分析HPLC纯度重新确定。

希望对Aβ42和Aβ40肽的提纯这种量身定制的过程将有利于为科学界,使用户能够获得高纯度Aβ能够寡聚物形成。可以预计,这个过程可以适用于其他淀粉样蛋白形成肽难以分离和纯化。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

笔者想感谢安捷伦为他们提供技术援助。凯特·马卡姆和拉斐尔·帕洛米诺都记在合成的初始帮助纯化的Aβ肽和Hsiau伟李博士在准备手稿图1感谢他的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1260 Infinity II quarternary pump Agilent G7111B http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector Agilent G7114A http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop Agilent 0101-1232 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop Agilent G1328C http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Ring Stand Mounting Bracket Agilent 1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) Agilent PL1512-5501 http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ42 or Aβ40 peptide Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer.
Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) Fisher Scientific A669-500
Acetonitrile Fisher Scientific A998-4
HPLC grade water Fisher Scientific W5-4
Falcon 50 mL conical centrifuge tube Fisher Scientific 14-954-49A
Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea Sigma-Aldrich Z227250
Normject 5 cc sterile syringe Fisher Scientific 1481729
16 Gauge SS Needle Rheodyne 3725-086

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References

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