माउस रेटिना संचलन में फ्लो डायनेमिक्स के अध्ययन के लिए एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स के फ्लोरोसेंट डाई लेबलिंग

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Summary

ओकुलर संचलन में लेबल वाले रक्त कोशिकाओं के लाइव-सेल इमेजिंग मधुमेह के रेटिनोपैथी और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन में सूजन और ischemia के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। रेटिनल परिसंचरण में लेबल वाले कोशिकाओं को रक्त कोशिकाओं और छवि को लेबल करने वाला एक प्रोटोकॉल वर्णित है।

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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

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Abstract

रेटिनल और कोरॉयडल रक्त प्रवाह की गतिशीलता विभिन्न आक्सीलर बीमारियों के रोग विज्ञान और सिक्वेल में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं, जैसे कि कांच का दर्द, मधुमेह, रेटिनोपैथी, उम्र से संबंधित मैकिलेटर अध: पतन (एएमडी) और अन्य ओकुलर भड़काऊ परिस्थितियां। यह आंखों में चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने में भी मदद कर सकता है। लेबल कोशिकाओं के लाइव-सेल इमेजिंग के साथ रक्त कोशिकाओं के उचित लेबलिंग, रेटिना और कोरोजल परिसंचरण में प्रवाह गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति देता है। यहां, हम 1.5% इंडोकेनिन हरी (आईसीजी) और चूहों एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स के 1% सोडियम फ्लोरसेसेन लेबलिंग के मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सी 57 बीएल / 6 जे चूहों (जंगली प्रकार) के रेटिना परिसंचरण में लेबल वाली कोशिकाओं को देखने के लिए स्कैनिंग लेजर ऑफ्थेल्मोस्कोपी (एसएलओ) लागू किया गया था। दोनों तरीकों ने माउस रेटिनल परिसंचरण में विशिष्ट फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। इन लेबलिंग विधियों में विभिन्न आंत्र रोगों में व्यापक अनुप्रयोग हो सकते हैंमॉडल के।

Introduction

रेटिना और कोरोजल परिसंचरण में रक्त कोशिकाओं के प्रवाह की गतिशीलता का अध्ययन करना संभवतः दृष्टि-धमकी वाले नेत्र रोगों और अन्य ओकुलर भड़काऊ परिस्थितियों के रोगजनन को समझने के लिए आवश्यक है। हालांकि, परंपरागत एंजियोग्राफी तकनीकों, जिसमें प्लाज्मा प्रोटीन के लिए फ्लोरोसेंट डाईज की बाध्यकारी शामिल होती है, एरिथ्रोसाइट्स या लेकोसाइट 1 की गतिशीलता के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करती है। रेटिना में मेटाबोलिस्टिक कुशल परिसंचरण और एल्यूकोकाइट प्रवाह गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एरिथ्रोसाइट रेटिना प्रवाह गतिशीलता महत्वपूर्ण हैं, विभिन्न भड़काऊ परिस्थितियों में सेल प्रवासन, मान्यता, आसंजन और विनाश को समझने के लिए 2 । विभिन्न सेल प्रकार 3 की पहचान और लक्षण वर्णन में प्रयुक्त कई फ्लोरोसेंट अणु मौजूद हैं। रक्त कोशिकाओं के hemodynamics उन्हें उचित फ्लुर्स के साथ धुंधला करके मापा जा सकता हैसेंट डाइज और उचित इमेजिंग तकनीकों को लागू करना 4

उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) और मधुमेह के रेटिनोपैथी (डीआर) जैसे इंटोकोक्युलर बीमारियों में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति में रोगग्रस्त क्षेत्र 5 , 6 में लिम्फोसाइटों का संग्रह शामिल है। ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को ट्रैक करने से रोग रोगजनन के तंत्र में शामिल जटिल घटनाओं को समझने में मदद मिल सकती है। 51 सीआर और 125 जैसे रेडियोधर्मी आइसोटोप को प्रारंभिक अध्ययनों में सेल ट्रैसर के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ये रंजक विषाक्त हैं और सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं। यद्यपि रेडियोधर्मी मार्करों 3 एच और 14 सी कम उत्सर्जन ऊर्जा के कारण, कोशिकाओं को कम विषैले होते हैं, सिस्टम 7 , 8 में अपने संकेतों का पता लगाना मुश्किल है। फ्लोराकोरम डाईज की एक संख्या को जुड़ी संभावित समस्याओं से उबरने के लिए पेश किया गया थारेडियोधर्मी मार्करों के साथ और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमैट्री 9 , 10 का उपयोग करके इन विट्रो में लिम्फोसाइट प्रवास को ट्रैक करें। Hoechst 33342 और थियाज़ोल नारंगी डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट रंजक हैं, जो कि vivo में लिम्फोसाइट्स को ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है Hoechst 33342 डीएनए में एटी-समृद्ध क्षेत्रों में बांधता है, झिल्ली पारगम्य है, 2-4 दिनों के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों को बरकरार रखता है और 9 , 10 शमन करने के लिए प्रतिरोधी है। होच्स्ट 33342 और थियाज़ोल नारंगी के नुकसान लिम्फोसाइट प्रसार 11 और शॉर्ट आधा जीवन, क्रमशः 9 का निषेध है।

कैलसेन-एएम, फ्लोरोसिसिन डायसिसेटेट (एफडीए), 2 ', 7'-बीआईएस- (2-कार्बोक्सीथाइल) -5- (और -6) -कारबॉक्साइफ्लोरेससेन, एसिटोॉक्सिमथिल एस्टर (बीसीईसीएफ-एएम), 5- (और -6) - कार्बोक्सीफ्लोरोरेससेन डायसिसेटेट (सीएफडीए), और 5- (और -6) -कारबॉक्साइफ्लोरेससेन डायसिसेट एसिटोक्सीमाइथाइल एस्टर (सीएफडीए-एएम)लिम्फोसाइट प्रवासन अध्ययनों के लिए उपयोग किया गया cytoplasmic फ्लोरोसेंट रंजक हैं। हालांकि, एफडीए, सीएफडीए और सीएफडीए-एएम कोशिकाओं 9 में कम प्रतिधारण हैं बीसीईसीएफ-एएम प्रजननशील प्रतिक्रिया को कम कर देता है और केमोटाक्सिस और सुपरऑक्साइड उत्पादन 9 , 12 को प्रभावित करता है। कैल्सेन-एएम एक फ्लोरोसेंट डाई है और विवो लिम्फोसाइट प्रवासन अध्ययन में अल्पावधि के लिए उपयोगी है। यह मजबूत फ्लोरोसेंट संकेतों का उत्सर्जन करता है, अधिकांश सेलुलर फ़ंक्शंस में हस्तक्षेप नहीं करता है और 3 दिन 12 , 13 तक फ्लोरोसेंट संकेतों को बरकरार रखता है। फ्लोरेससेन isothiocyanate (एफआईटीसी) और कार्बोक्सीफ्लोरेससेन्स डायैसिसेट सुक्किनिमिड एस्टर (सीएफडीए-एसई) सहसंयोजक युग्मन फ्लोरोसेंट रंजक हैं, जो लिम्फोसाइट प्रवासन अध्ययनों के लिए उपयोग किया जाता है। एफआईटीसी सेल व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं दर्शाती है और टी लिम्फोसाइटों 14 , 15 की तुलना में बी लिम्फोसाइटों के साथ मजबूत संबंध है 9 , 16 तक के लिए विवो में ट्रैक किया जा सकता है। सी 18 डीआईआई (1,1'-डायोटेक्टेसीएल -3,3,3 ', 3'-टेट्रामिथिलंडोकार्बोकाइनाइन प्रक्लोरेट), डीआईओ (3,3 डीओएटीएडीसीडीसीएकोबोर्काइनाइन पेरक्लोरेनेट), पॉल कार्ल होरान (पीकेएच) 2, पीकेएच 3, और पीकेएच 26 झिल्ली- ल्यूकोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट लाइपोफिलिक कार्बोकाइनाइन डाईज डालें। सी 18 दिल और डीआईओ उच्च संकेतों को पेश करते हैं जब कोशिका झिल्ली में शामिल होता है और अपेक्षाकृत गैर विषैले 12 , 17 है । पीकेएच 2, पीकेएच 3 और पीकेएच 26 लेबल वाले कोशिकाएं कम विषाक्तता 18 , 1 9 , 20 , 21 , 22 के साथ फ्लोरोसेंट संकेतों की अच्छी प्रतिधारण दर्शाती हैं। हालांकि, पीकेएच 2 नीचे CD62L अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है और ली को कम कर देता है माफ़ोसाइट व्यवहार्यता 23

लिम्फेटिक्स में लिम्फोसाइट प्रवासन और प्रसार पर नज़र रखने और गैर-ओकुलर परिसंचरण में लेबल एरिथ्रोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए उपरोक्त वर्णित अधिकांश अध्ययन किए गए हैं। ओकुलर परिसंचरण में रक्त कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए लेबलिंग तकनीकों को लागू करने में बहुत कुछ अध्ययन हैं। स्कैनिंग लेजर ऑथेथोमॉस्कोपी (एसएलओ) के आवेदन को फुडस एंजियोग्राफी 24 द्वारा रेटिव और कोरोएडियल संचरण में लेबल वाले कोशिकाओं का अध्ययन करने में बहुत अच्छा फायदा है। कई फ्लोरोसेंट रंजक जैसे कि आईसीजी, एसी्रिडिन नारंगी, एफआईटीसी, सोडियम फ्लोरसेसेन और सीएफडीए हैं जो स्लो 25 , 26 , 27 , 28 , 2 9 , 30 , द्वारा रेटिना संचलन में ल्यूकोसाइट्स का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है वर्ग = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 एक्रुडीन नारंगी 26 , 27 की फोटोटोक्सिसिटी और कार्सिनोजेसिटीटी, सेलुलर गतिविधि के साथ एफआईटीसी के हस्तक्षेप और रेटिना और कोरॉयडल रक्त वाहिकाओं के संकल्प के लिए एक इंट्रावास्कुलर कंट्रास्ट एजेंट की आवश्यकताएं विवो पशु प्रयोगों में अपने आवेदन को सीमित करती हैं। सोडियम फ्लोरोसिसिन और आईसीजी गैर-विषैले हैं, जो कि खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित है, और मानवों के परीक्षण के लिए सुरक्षित 32 , 35 अधिकांश प्रवाह गतिशील अध्ययन लियोकोसाइट्स या एरिथ्रोसाइट्स के लेबलिंग से संबंधित हैं और रेटिना और कोरॉयडल रक्त वाहिकाओं 36 , 37 , 38 , 3 9 में इसकी दृश्यता

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Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए जाने वाले पशु प्रोटोकॉल को सिंहल, सिंगापुर की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ऑप्थेल्मोलॉजी (एआरवीओ) के दिशानिर्देशों के अनुसार ऑथ्थेलिक और विजन में जानवरों के उपयोग के विवरण अनुसंधान।

1. फ्लोरोसेंट डाईज के साथ एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स का लेबलिंग

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 1800 μL निष्प्रभावित आसुत जल में 3 मिलीग्राम आईसीजी भंग करके आईसीजी (1.5 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। 200 μL 10x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें।
    2. 40 एमएल 1x पीबीएस को 6 एमएल की निष्फल डिस्टिल्ड वॉटर में जोड़कर 40% 1x पीबीएस तैयार करें। पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (बीएसए) तैयार करें, 100 एमजी बीएसए को 10 एमएल 1 एक्स पीबीएस जोड़कर बीएसए भंग होने तक अच्छी तरह मिलाएं।
  2. एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स का घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके अलगाव
    1. चूहों anesthetize (जंगली टाइपे सी 57 बीएल / 6) केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (50 मिलीग्राम / किग्रा) और एक्सलायलिन हाइड्रोक्लोराइड (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) के संयोजन (एआरवीओ दिशानिर्देशों के तहत अनुसूची 1 के अनुसार) का उपयोग करते हुए। पेडल निकासी प्रतिवर्त ( यानी , पैर की अंगुली का चोंच) से संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
    2. धीरे धीरे दिल की ओर निर्देशित कोयले के कोण पर 29 गेज सुई (1 एमएल सिरिंज से जुड़ा) डालें। यह पुष्टि करने के लिए कि सुई दिल के अंदर है, सवार को थोड़ा निकालना और जांचें कि क्या सिरिंज में रक्त वापस ले लिया गया है। हृदय से सीधे 0.8-1 एमएल का रक्त निकालना।
    3. खून को रक्त संग्रह ट्यूब युक्त एथिलीन डायरीन डायरेन डायरेलीन डायरेलीन डायरेलीन एसिटिक एसिड (ईडीटीए) (1.8 मिलीग्राम / एमएल रक्त) में तुरंत स्थानांतरित करें और रक्त के जमावट को रोकने के लिए धीरे-धीरे मिलाएं।
    4. इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा पेंटोबारबिटल (80 मिलीग्राम / किग्रा) को नियंत्रित करके चूहों को कुचलाते हैं।
    5. एक polysucrose और सोडियम diatrizoate समाधान (1: 1 अनुपात, घनत्व 1.077 ग्राम / एमएल) के ऊपर एक पूरे 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब और केंद्रप्लाज्मा से ल्यूकोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स को अलग करने की अनुमति देने के लिए फ्यूज (450 xg, 30 मिनट)।
    6. एक विंदुक का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला (प्लाज्मा) निकालें और त्यागें। पिपेट्स का उपयोग करके नए और अलग ट्यूब्स में बफ़ी कोट (ल्यूकोसाइट्स) और एरिथ्रोसाइट्स (लाल रक्त कोशिका परत) को ध्यानपूर्वक स्थानांतरित करें।
  3. एरिथ्रोसाइट्स के आईसीजी (1.5%) लेबलिंग
    1. किसी भी दूषित पदार्थ को हटाने के लिए एरिथ्रोसाइट्स 1x पीबीएस के साथ धोएं। 50% हेमटोक्रिट बनाने के लिए 1x पीबीएस (1: 1) में एरिथ्रोसाइट्स को फिर से खोलें। सूक्ष्मदर्शी सूक्ष्मदर्शी ट्यूबों में 50% हेमटोक्रिट (~ 250 μL पैक एरिथ्रोसाइट्स) के 0.5 एमएल। एरिथ्रोसाइट्स (750 xg, 5 मिनट) अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    2. पिलेटेड एरिथ्रोसाइट्स में 200 μL 40% 1x पीबीएस जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। एरिथ्रोसाइट निलंबन के लिए 100 μL आईसीजी (1.5 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें, ट्यूब को उलटा करके धीरे-धीरे मिलाएं, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते रहें। 300 μL का 1x पीबीएस जोड़ें और इसमें सेते60 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस
    3. वाहक एरिथ्रोसाइट्स (750 xg, 3 मिनट) अपकेंद्रित्र और 1 एमएल 1x पीबीएस में resuspend।
    4. सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट (चरण 1.3.3) तक कोशिकाओं ~ 3 - 1 बार 1x पीबीएस के साथ धो लें। आखिरी धोने के बाद, सतह पर तैरने वाले को छानना और एरिथ्रोसाइट्स नामित आईसीजी लेबल के 50% हेमटोक्रिट (1.25 x 10 8 कोशिकाओं / एमएल) प्राप्त करने के लिए लेबल के पूर्व-बढ़े एरिथ्रोसाइट्स के लिए 1% बीएसए पीबीएस (1: 1) जोड़ना।
  4. ल्यूकोसाइट्स के सोडियम फ्लोरेससेन (1%) लेबलिंग
    1. घनत्व ढाल केन्द्रितकरण (चरण 1.2.6 से) का उपयोग करते हुए रक्त से बफी कोट को अलग करने के बाद, कोशिकाओं को एक बार 10 एमएल के 1x पीबीएस के साथ सेंटीफ्यूगिंग द्वारा 10 मिनट के लिए 10 मिनट में किसी भी दूषित पदार्थ को हटाने के लिए धो लें। 900 μL 1x पीबीएस में गोली को फिर से खोलें।
    2. 100 μL 10% सोडियम फ्लोरोसिसिन को ल्यूकोसाइट निलंबन के 900 μL तक और 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। लेबल वाली कोशिकाओं को तीन बार 10 मिमी 1X पीबीएस द्वारा सेंट्रीफुगी के साथ धो लेंएनजी (450 xg, 10 मिनट) कोशिकाओं को 100 μL 1x पीबीएस में रीससपेंड करें

2. फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कक्षों की लाइव इमेजिंग

  1. आईसीजी के लाइव-सेल इमेजिंग एरिथ्रोसाइट्स नामित
    1. पूंछ नस या रेट्रो-ऑर्बिटल मार्ग के माध्यम से इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए, क्रमशः 5% और 1% हेमटोक्रिट कोशिकाओं को बनाने के लिए 10x गुणा और 50 गुना 1x पीबीएस द्वारा आईसीजी लेबल वाले आईसीजी लेबल के 50% हेमटोक्रिट को कम करना।
    2. 5 मिनट के लिए अवरक्त प्रकाश (250W तीव्रता) के नीचे माउस रखें और पूंछ नस को फैलाने दें। इंट्राटेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन हाइड्रोक्लोराइड (50 मिलीग्राम / किग्रा) और एक्सलायलिन हाइड्रोक्लोराइड (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस को एनेस्थेटिज़ करें (एआरवीओ दिशानिर्देशों के तहत अनुसूची 1 के अनुसार, यहां)
    3. 0.5% ट्रॉपिकैमाइड की एक बूंद और 2.5% फेनिलफ्रिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ आंखों के प्रत्येक छात्र को मिलाएं।
    4. इमेजिंग के लिए एक आंख पर संपर्क लेंस रखें। नेत्र जेल का उपयोग इमेजिंग के लिए एक माध्यम के रूप में और सूखने से रोकने के लिए करेंकॉर्निया के एस माउस आंख के अपवर्तन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए confocal लेजर स्कैनिंग नेफ़ाल्मोस्कोपी (एसएलओ) कैमरा +25 डायपर लेंस के साथ ठीक करें।
    5. एसएलओ इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर माउस रखें। सुनिश्चित करें कि माउस का कॉर्निया सीधे एसएलओ मशीन के ऑप्टिकल प्रमुख की तरफ आ रहा है।
    6. इमेजिंग मॉड्यूल पर स्विच करें। जुड़े इमेजिंग मॉड्यूल सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, "नया रोगी" बटन पर क्लिक करें और जानवरों की पहचान विवरण जैसे माउस कान टैग नंबर, जन्म तिथि, फ्लोरोसेंट डाई का प्रतिशत और लेबल वाले सेल प्रकार जोड़ें।
      1. इमेजिंग मॉड्यूल को नियंत्रित करके इमेजिंग स्क्रीन के केंद्र में जानवर के ऑप्टिक तंत्रिका को अवस्थित करें। जुड़े इमेजिंग मॉड्यूल सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना, 30 डिग्री या 15 डिग्री कोण दृश्य सेटिंग के साथ अवरक्त (आईआर) फ्यूंडस छवियों को लेने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि रेटिना का केंद्र, छात्र और लेजर के ऑप्टिकल पथ को एक बेहतरीन गुणवत्ता वाली छवि प्राप्त करने के लिए गठबंधन किया गया है।
    7. आईसीजी फूनस वीडियो लें
      1. आईसीजी फिल्टर (790 एनएम) चालू करें, कैमरे को 30 डिग्री या 15 डिग्री कोण दृश्य के साथ उच्च गति मोड में सेट करें और मानकीकरण के सभी रीडिंग के लिए 85 पर आईसीजी तीव्रता सेट करें। कंट्रोल पैनल पर, 1 मिनट के लिए 8.8 / 15 फ्रेम / एस पर वीडियो (बेसलाइन नियंत्रण) लेने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें
    8. एक 30 गेज सुई से जुड़ी इंसुलिन सिरिंज में एरिथ्रोसाइट्स नामित आईसीजी के 100 μL लोड करें।
      1. पूंछ नस मार्ग के माध्यम से इंजेक्शन के लिए, पूंछ नस में सुई बेवल डालें। सिरिंज में रक्त के बैकफ़्लो की जांच करके और रक्त कोशिकाओं को परिसंचरण में इंजेक्षन द्वारा अंतःशिरा पहुंच की पुष्टि करें।
      2. रेट्रो-ऑर्बिटल मार्ग के माध्यम से इंजेक्शन के लिए, रेट्रो-ऑर्बिटल स्पाक में आंख के आस-पास सुई डालेंई। सिरिंज में खून के बैकफ्लो की जांच करके रेट्र-ऑर्बिटल एक्सेस की पुष्टि करें और लेबल की गई कोशिकाओं को संचलन में इंजेक्षन करें।
    9. इंजेक्शन के बाद, माउस को दोबारा लगाने और आईआर फूंडस छवियों को ले जाएं (चरण 2.1.6.1 देखें) और आईसीजी फिल्टर का उपयोग करते हुए वीडियो (चरण 2.1.7.1 देखें)। रेटिनल परिसंचरण में लेबल वाले कोशिकाओं को कोशिकाओं के इंजेक्शन के तुरंत बाद देखा जा सकता है।
    10. वीडियो फ्रेम प्राप्त करने के बाद, एसएलओ दृश्य मॉड्यूल सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए वीडियो निर्यात करते समय। TIF प्रारूप का चयन करके वीडियो अनुक्रमों की। फ़ाइलों को वांछित फ़ोल्डर में सहेजें
    11. संपर्क लेंस निकालें, इसे दूसरी आंखों पर रखें, और 2.1.4 - 2.1.7 के चरण में वर्णित इमेजिंग को पूरा करें।
    12. इमेजिंग के बाद, एनेस्थेसिया से ठीक होने तक शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए अवरक्त प्रकाश (250W) के तहत संवेदनाहारी जानवर रखें। जब जानवर पूरी तरह से ठीक हो जाए, तो माउस को पकड़ने पिंजरे में रखें।
  2. लाइको-सेल इमेजिंग 1% सोडियम फ्लोरसेसेन लेबल लेकोकेट्स
    1. माउस को तैयार करें और खंड 2.1 में बताए अनुसार सेट अप करें।
    2. माउस की स्थिति जानें और आईआर फ़ंडस छवियों को 2.1.4 - 2.1.6 चरण में बताए अनुसार लें।
      1. मानकीकरण के लिए सभी रीडिंग के लिए 30 डिग्री या 15 डिग्री कोण दृश्य और फ्लोरोसिसिन की तीव्रता के साथ उच्च गति वाले कैमरा मोड के साथ fluorescein फ़िल्टर (488 एनएम) का उपयोग करके माउस का फ्लुरेससेन एंजियोग्राम प्राप्त करें। 8.8 / 15 फ्रेम / एस पर वीडियो (बेसलाइन नियंत्रण) रिकॉर्ड करें (चरण 2.1.7.1 देखें)।
        नोट: यहां, वीडियो के एक से अधिक पटरियों (1 मिनट के वीडियो) को अलग-अलग समय के अंतराल पर अधिग्रहण किया गया था।
    3. खंड 2.1.8 में वर्णित अनुसार पूंछ नस या रेट्रो-कक्षीय इंजेक्शन के माध्यम से माउस में लियोकोसाइट्स का 100 μL इंजेक्षन करें।
    4. इंजेक्शन के तुरंत बाद, माउस की स्थिति बनाएं और आईआर फ़ुटस छवियों को ले जाएं (चरण 2.1.5 और 2.1.6 देखें) और फ्लूमाउस के rescein एंजियोग्राम (देखें अनुभाग 2.2.2)।
    5. इमेजिंग मॉड्यूल पर ध्यान केंद्रित घुंडी को बदलकर स्कैनिंग लेजर के फोकल बिंदु को समायोजित करके रेटिना या कोरॉयडल रक्त वाहिकाओं में लेबल वाली कोशिकाओं को देखें।
    6. एसएलओ देखने मॉड्यूल सॉफ्टवेयर (देखें 2.1.10 देखें) का उपयोग करके वीडियो फ़्रेम और छवियां प्राप्त करें और इसे वांछित फ़ोल्डर में सहेजें।
    7. प्रक्रिया के बाद, जानवरों की देखभाल के लिए चरण 2.1.12 का पालन करें।
  3. MtrackJ सॉफ्टवेयर द्वारा छवि विश्लेषण
    1. "फाइल" पर क्लिक करके छविज में छवि अनुक्रम खोलें। "आयात करें" चुनें और "छवि अनुक्रम" चुनें, वांछित छवि फ़ोल्डर चुनें और "खोलें" पर क्लिक करें। स्क्रीन पर "क्रम विकल्प" नामक एक पॉप अप विंडो दिखाई देगी। ओके पर क्लिक करें"; छवि अनुक्रम खुलेगा
    2. "चित्र" पर क्लिक करके छवि वीडियो के फ्रेम अंतराल को सेट करें और वेग मापन के लिए "गुण" चुनें। यहां, यह 8.8 फ्रेम हैes / एस।
    3. "प्लगइन्स" का चयन करके MTrackJ प्लगइन खोलें "ट्रैकिंग" चुनें और फिर "MtrackJ" चुनें एक मेनू दिखना चाहिए
    4. ट्रैकिंग सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए, "ट्रैकिंग" (मेनू के अंतर्गत) का चयन करें और "बिंदु जोड़ने के बाद अगली बार फ़्रेम अनुक्रमणिका पर जाएं" बॉक्स को चेक करें।
    5. पहला सेल ट्रैक करें
      1. एक सेल का पता लगाएँ और बाद के फ़्रेमों में एक ही सेल को ट्रैक करें। मेनू पर एक नया ट्रैक जोड़ने के लिए "जोड़ें" पर क्लिक करें
      2. छवि (+ साइन) पर कर्सर होवर करें और उपयुक्त सेल पर क्लिक करें।
        नोट: MTrackJ स्वचालित रूप से अगली बार सीमा पर कूद जाएगा और एक छोटा सा सर्कल जोड़ देगा, जिसमें प्रक्षेपवक्र में पहले बिंदु की स्थिति को चिह्नित किया जाएगा।
      3. छवि अनुक्रम के फ्रेम के माध्यम से आगे बढ़ते समय सेल की वर्तमान स्थिति पर क्लिक करना जारी रखें।
        नोट: कभी-कभी, सर्कल जो वर्तमान स्थान को देखने की क्षमता के साथ प्रक्षेपवक्र में पिछले अंक अंकन करते हैं। अगर ऐसा होता है,2.3.5.3.1 कदम आगे बढ़ें
        1. मेनू में "प्रदर्शन" पर क्लिक करके प्रक्षेपवक्र के लिए डिस्प्ले विकल्प को बदलें और विकल्प "वर्तमान समय पर केवल ट्रैक बिंदु दिखाएं" का चयन करें सभी trajectories को देखने के लिए, इस विकल्प का चयन रद्द करें
      4. पहले सेल के प्रक्षेपवक्र तक क्लिक जारी रखें देखा जाता है। फिर "सहेजें" क्लिक करके ट्रैक को बचाएं
    6. दूसरे सेल को ट्रैक करें
      1. मेनू में, एक नया ट्रैक शुरू करने के लिए "जोड़ें" पर क्लिक करें। नए सेल पर नज़र रखने के लिए चरण 2.3.5.1 - 2.3.5.4 दोहराएं। दूसरे ट्रैक को बचाने के लिए "सहेजें" पर क्लिक करें
      2. मनाया गया सभी ट्रैकनीय कक्षों के लिए इन चरणों को जारी रखें। कोशिकाओं पर नज़र रखने के बाद, परिणाम पाने के लिए मेनू टैब में "उपाय" और "ठीक" पर क्लिक करें।
        नोट: एक परिणाम विंडो स्वचालित रूप से खुलती है, जिसे आगे की विश्लेषण के लिए स्प्रैडशीट में बचाया और खोला जा सकता है।

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Representative Results

1.5% आईसीजी वाले लेबल एरिथ्रोसाइट्स को सी 57 बीएल / 6 जे चूहों (जंगली प्रकार) के रेटिना संचलन में देखा गया था। आरिथ्रोसाइट्स नामित 1.5% आईसीजी के 1% और 5% हेमटोक्रिट रेटिना परिसंचरण में अलग-अलग थे। हालांकि, व्यक्तिगत लेबल वाली कोशिकाओं को 1.5% आईसीजी लेबल एरिथ्रोसाइट्स ( चित्रा 1 ) के 1% हेमटोक्रिट के साथ स्पष्ट रूप से देखा गया। रेटिनल जहाजों में बड़ी संख्या में लेबल वाली कोशिकाओं के कारण 5% हेमटोक्रिट में, व्यक्तिगत सेल को चिह्नित करना संभव नहीं था। कुछ एरिथ्रोस्टेसिस दोनों स्थितियों के तहत पेरिपैपलरी क्षेत्र में मनाया गया था, लेकिन यह लेबल एरिथ्रोसाइट्स ( चित्रा 2 ) के 5% हेमटोक्रिट में अधिक प्रमुख था।

लियोकाइट्स को ऊपर प्रोटोकॉल के बाद सफलतापूर्वक 1% सोडियम फ्लोरसेसेन के साथ लेबल किया गया था और उन्हें फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करके हरी लेबल वाली कोशिकाओं के रूप में देखा गया था ( Class = "xfig"> चित्रा 3)। लेबल के नमूनों में कोशिकाओं के छोटे समूह (4-5 कोशिकाओं को एक साथ) भी मनाया गया। जब कोशिकाओं को माउस संचलन में अंतःक्षिप्त किया गया था, तो लेबल वाले ल्यूकोसाइट्स को रेटिना संचलन ( चित्रा 4 ) में देखा गया था। लेबलिंग के बाद, एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स को तुरंत चूहों में अंतःक्षिप्त किया गया और 30 और 60 मिनट के समय अंतराल पर देखा गया। फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं को इंजेक्शन के तुरंत बाद देखा गया था, लेकिन प्रतिदीप्ति तीव्रता धीरे-धीरे 30 और 60 मिनट के समय अंतराल पर कमी आई। हमने एरिथ्रोसाइट्स पर ल्यूकोसाइट स्टैनिंग प्रोटोकॉल (1% सोडियम फ्लुरेससेन) का इस्तेमाल किया और एरिथ्रोसाइट्स का लेबलिंग नहीं देखा। छवि जे सार्वजनिक डोमेन सॉफ़्टवेयर पर Mtrack J प्लगइन का उपयोग करते हुए, कोशिकाओं को रेटिना संचलन ( चित्रा 5 ) में ट्रैक किया गया था।

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चित्रा 1 : 1% रेटिना संचलन में 1.5% आईसीजी लेबल एरिथ्रोसाइट्स के हेमटोक्रिट। आईसीजी ने व्यक्तिगत एरिथ्रोसाइट्स को रेटिनल वाहिल में उज्ज्वल सिग्नल दिखाए। कुछ एरिथ्रोस्टेसिस पेरिपैपलरी क्षेत्र में मनाया गया था। स्केल = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : रेटिना संचलन में 1.5% आईसीजी लेबल एरिथ्रोसाइट्स का 5% हेमटोक्रिट। कई आईसीजी ने एरीथ्रोसाइट्स को रेटिनल वाहिनी में उज्ज्वल सिग्नल दिखाते हुए लेबल किया; इरिथ्रोस्टेसिस की एक बड़ी मात्रा में पेरिपैपलरी क्षेत्र में देखा गया था। स्केल = 200 माइक्रोन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 1% सोडियम फ्लोरेससेन लेबल की गई ल्यूकोसाइट्स की छवि सोडियम फ्लोरेसेसीन लियूकासैट्स को छोटे झुमके (20 एक्स बढ़ाई, पैमाने = 50 माइक्रोन) के साथ हरे फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : 1% सोडियम फ्लोरेससेन लेबल वाले ल्यूकोसाइट्स रेटिना संचलन में। सोडियम फ्लोरेससेन ने ल्यूकोसाइट (एरो) को लेबल किया है, जो रेटिना के जहाजों में उज्ज्वल संकेत दिखा रहा है। स्केल = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5 : छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए रेटिना संचलन में लेबल वाले व्यक्तिगत कक्षों का ट्रैकिंग। रेटिना परिसंचरण में लेबल वाले कोशिकाओं की औसत वेग की गणना करने के लिए अलग-अलग पटरियों (छवि पर चित्रित रंगीन हलकों और रेखाएं) को मापा गया था।

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Discussion

रेटिना और कोरोज़डिकल परिसंचरण में हेमोडायनामिक्स का अध्ययन करना कई आंत्र रोगों के पैथोफिजियोलॉजी को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। रेटिनल परिसंचरण में रक्त प्रवाह की गतिशीलता का अध्ययन फूरियर-डोमेन ऑप्टिकल कॉसहेंस टोमोग्राफी (एफडी-ओसीटी), लेजर ब्रैक्लेफ्लग्राफी (एलएसएफजी) और रेटिनल ऑक्सीमेट्री द्वारा किया जा सकता है। हालांकि, ये तरीकों 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 के रेटिना परिसंचरण में कुल रक्त प्रवाह का अध्ययन करने के लिए अलग-अलग तरीकों का इस्तेमाल करते हैं, हालांकि वे व्यक्तिगत सेल प्रकारों के प्रवाह की गतिशीलता के अध्ययन की अक्षमता की सीमा को साझा करते हैं। रेटिनल और कोरोएडाल ऊतकों को पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की आपूर्ति, साथ ही ओक्यूलर भड़काऊ बीमारियों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास और बीमारी रोगजनन में उनकी भूमिका, का अध्ययन किया जा सकता है कि ईंधन प्रवाह की गतिशीलता की जांचक्रमशः रेटिनल और कोरोएडियल संचलन में यौथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स। लेबलिंग तकनीक इमेजिंग विधियों के साथ मिलकर परिचालित होने वाले लेबल वाले कोशिकाओं को ट्रैक करने और लेबल वाले कोशिकाओं के प्रवाह की गतिशीलता का अध्ययन करने में मदद करेंगे। परिसंचरण 3 , 17 , 18 , 1 9 में अपने प्रवाह गतिशीलता की जांच के लिए कई फ्लोरोसेंट रंजियां सफलतापूर्वक लागू हुईं थीं, ल्यूकोसाइट्स और एरिथ्रोसाइट्स को लेबल करने के लिए।

यहां, हम क्रमशः रेटिना परिसंचरण में एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स के लेबिलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन को गैर-विषाक्त फ्लोरोसेंट डाईज, इंडोकाइनिन ग्रीन और सोडियम फ्लुरेससेन को मंजूरी देते हैं। यद्यपि ल्यूकोसाइट्स 31 , 32 , 33 को ट्रैक करने के लिए सोडियम फ्लोरेससेन सबसे अधिक इस्तेमाल किया डाई है 34 , आईसीजी और सोडियम फ्लोरोसिसिन के साथ एरिथ्रोसाइट्स और लियोकाइट्स को एक साथ लेबलिंग का लाभ क्रमशः एसएलओ में फिल्टर बदलकर जानवरों की आंखों में लेबल वाले कोशिकाओं के कुशल दृश्यमान हैं। एसएलओ रेटिना इमेजिंग का एक गैर-इनवेसिव तरीका है जो मनुष्यों और पशुओं में विभिन्न रेटिना रोगों में रोग परिवर्तन के अध्ययन में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है। यह किसी दिए गए उपचार 46 के जवाब में रेटिनल परिवर्तनों की तुलना करने में भी मदद कर सकता है।

एसएलओ में गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए, विद्यार्थियों को पूरी तरह फैलाने की ज़रूरत होती है और निचले कॉर्निया को बनाए रखने और मोतियाबिंद गठन को रोकने के लिए नेत्र जेल के साथ संपर्क लेंस का उपयोग किया जाना चाहिए। आँखों की स्थिति और कैमरे के ऑप्टिकल पथ को सीधे गुणवत्ता वाले फ्यूंडस और एंजियोग्राम चित्र प्राप्त करना चाहिए। इमेजिंग के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए पशु को गहराई से लगाया जाना चाहिए। हालांकि 1.5% आईसीजी की 1% और 5% हेमटोक्रिट दोनोंलेबल एरिथ्रोसाइट्स ने रेटिनल परिसंचरण में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले कोशिकाओं के दृश्य का प्रदर्शन किया, 1% हेमटोक्रिट व्यक्तिगत कोशिकाओं की निगरानी के लिए बेहतर था। यदि इंजेक्शन ल्यूकोसाइट्स की संख्या बहुत कम है तो फ्लोरोसेंटली लेबल वाली कोशिकाओं को नहीं देखा जा सकता है। इसलिए, रेटिनल परिसंचरण में लेबल वाले कोशिकाओं की निगरानी में बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए, कम से कम 4 चूहों से ल्यूकोसाइट्स एकत्र करने, 1% सोडियम फ्लोरोसिसिन के साथ लेबल, और एक माउस में इंजेक्शन लगाने की सिफारिश की जाती है। यद्यपि सोडियम फ्लोरोसिसिन (कैल्सेन, एफआईटीसी, डीआईओ, एफडीए और सीएफडीए के साथ अवशोषण / उत्सर्जन अधिकतममा के साथ सोडियम फ्लोरोसिसिन के समान या निकटता के लिए कुछ वैकल्पिक रंजक हैं), डाई अवधारण दर और ओकुलर टिश्यू को विषाक्तता का मूल्यांकन 9 , 12 , 13 , 14 , 17

रिपोर्ट की गई तकनीक की सीमा है60 मिनट के बाद संचरण में फ्लोरोसेंट सिग्नल का लुप्त हो जाना इसलिए, लेबल की कोशिकाओं के प्रवाह की गतिशीलता का विश्लेषण 60 मिनट के भीतर होना चाहिए। यहां, लेकोसाइट्स को लेबल करने के लिए, एक माउस से रक्त वापस ले लिया गया, कोशिकाओं को पृथक किया गया, लेबल किया गया, एक और माउस में इंजेक्ट किया गया, और एसएलओ द्वारा देखा गया। हालांकि, एसएलओ में, रेटिना रक्त वाहिकाओं में केवल 0 - 1 सेल प्रति फ्रेम ही देखा गया था। यह अपर्याप्त ल्यूकोसाइट सेल नंबर के कारण हो सकता है और इसलिए हम प्रति फ्रेम उच्च सेल नंबर की कल्पना करने के लिए कम से कम 3-4 चूहों से रक्त इकट्ठा करने की सलाह देते हैं। अध्ययन में 8.8 फ्रेम / एस की कैमरा गति का उपयोग किया गया था, लेकिन लेबल कोशिकाओं के अधिक अनुक्रमिक छवियों और वीडियो को प्राप्त करने के लिए इसे बढ़ाया जा सकता है।

इससे पहले के अध्ययनों ने डॉ। के विभिन्न चरणों के साथ मधुमेह रोगियों के रेटिनल संचलन में रक्त प्रवाह वेग में परिवर्तन की सूचना दी। क्लेरमोंट एट अल डॉ 47 के शुरुआती चरण में मरीजों में रेटिनल रक्त के प्रवाह की 33% कमी, और गुयेन एट की सूचना दीअल। ने प्रत्यारोपित डीआर 48 के साथ मधुमेह रोगियों में रेटिनल रक्त के प्रवाह में वृद्धि की सूचना दी है। एक कमी हुई रक्त प्रवाह वेग प्रगतिशील ग्लॉकोमा 49 के साथ जुड़ा हुआ है। उपर्युक्त अध्ययनों में, लेखकों ने रेटिना संचलन में पूरे रक्त प्रवाह वेग की जांच की। प्रत्येक सेल प्रकार के प्रवाह वेगों का अध्ययन विभिन्न बीमारियों और रोग के विभिन्न चरणों में सेलुलर बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है और पूर्वानुमान में मदद कर सकता है। यहां हम क्रमशः आईसीजी और सोडियम फ्लोरोसिसिन के साथ एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स को लेबल करने की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं और रेटिना संचलन में उनका विज़ुअलाइज़ेशन; इस विधि को विवो अध्ययन में किसी भी बीमारी मॉडल पर लागू किया जा सकता है।

भविष्य की शोध एसएलओ द्वारा लेबलिंग एरिथ्रोसाइट्स की प्रवाह गतिशीलता और विभिन्न दवा उपचार कंडीस के तहत ल्यूकोसाइट्स के अध्ययन के लिए हमारी लेबलिंग तकनीकों का उपयोग कर सकती है।रोग के विभिन्न चरणों में तनाव इसके अलावा, हमारे तरीकों रोगों के फीनोटाइप में एरिथ्रोसाइट्स और ल्यूकोसाइट्स की भूमिका को समझने में मदद कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है। कोई वित्तीय या ब्याज का विरोध नहीं।

Acknowledgements

अनुसंधान परियोजना को नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएमआरसी), सिंगापुर से न्यू इन्वेस्टीग्रेटर अनुदान के तहत वित्त पोषित किया गया था। टीम नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एनएमआरसी) ओवरसीज रिसर्च ट्रेनिंग फैलोशिप के तहत नवंबर 2012 से अक्टूबर 2014 तक प्रोफेसर के मार्गदर्शन में डॉ। अग्रवाल इंस्टीट्यूट ऑफ ऑप्थल्मोलॉजी (आईओओ), यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन (यूसीएल) को प्रदान की गई अनुसंधान प्रशिक्षण को स्वीकार करना चाहूंगा। डेविड शिमा डा। शिमा के प्रयोगशाला में कोशिकाओं को लेबल करने और लाइव इमेजिंग के लिए डा। अग्रवाल ने अवधारणा और कौशल हासिल किए। इसलिए टीम प्रो। डेविड शिमा, प्रो.एफ. केनिथ मेइस्नर, डॉ। पीटर लुंड और डॉ। दयजू इवाता से प्रशिक्षण सहभागिता के दौरान पर्यवेक्षण और मार्गदर्शन को स्वीकार करना चाहेंगे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

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