マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

眼循環中の標識された血液細胞の生細胞イメージングは​​、糖尿病性網膜症および加齢性黄斑変性における炎症および虚血に関する情報を提供し得る。血球を標識し、網膜循環中の標識細胞を画像化するプロトコルが記載されている。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

網膜および脈絡膜血流動態は、緑内障、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性(AMD)および他の眼炎症状態などの様々な眼疾患の病態生理学および後遺症についての洞察を提供し得る。また、眼の治療反応をモニターするのに役立ちます。標識された細胞の生細胞イメージングと結びついた血液細胞の適切な標識は、網膜および脈絡膜循環における血流動態の調査を可能にする。ここでは、マウス赤血球および白血球のそれぞれ1.5%インドシアニングリーン(ICG)および1%ナトリウムフルオレセイン標識の標準化プロトコルを記載する。 C57BL / 6Jマウス(野生型)の網膜循環中の標識された細胞を視覚化するために走査型レーザー検眼鏡(SLO)を適用した。両方の方法は、マウス網膜循環において明瞭な蛍光標識細胞を示した。これらの標識方法は、様々な眼疾患モデル。

Introduction

網膜および脈絡膜循環における血球の流動ダイナミクスの研究は、潜在的に視力を脅かす眼疾患および他の眼の炎症状態の病因の理解に不可欠である。しかし、蛍光色素の血漿タンパク質への結合を含む従来の血管造影技術は、赤血球または白血球の動態に関する情報を提供していない1 。赤血球網膜流動ダイナミクスは、様々な炎症状態における細胞の移動、認識、接着および破壊を理解するために、網膜における代謝的に効率的な循環および白血球流動の研究に重要である2 。種々の細胞タイプの同定および特徴付けに使用されるいくつかの蛍光分子がある3 。血液細胞の血行動態は、それらを適切な蛍光で染色することによって測定することができる適切なイメージング技術を適用する4

加齢性黄斑変性症(AMD)や糖尿病性網膜症(DR)のような眼内疾患の炎症反応の存在には、病変部にリンパ球が蓄積している5,6 。組織内の免疫細胞を追跡することは、病因のメカニズムに関与する複雑な事象を理解するのに役立ちます。初期の研究では、 51 Crや125 Iのような放射性同位体を細胞トレーサーとして用いた。これらの色素は毒性であり、細胞生存率に影響を及ぼす。放射性マーカー3 Hおよび14 Cは、それらの低い放出エネルギーのために細胞に対して毒性が低いが、系7,8 においてそれらのシグナルを検出することは困難である。関連する潜在的な問題を克服するために、いくつかの蛍光色素が導入された蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを用いたインビトロでのリンパ球遊走の追跡9,10 。 Hoechst 33342およびチアゾールオレンジは、インビボでリンパ球を追跡するために使用されるDNA結合蛍光色素である Hoechst 33342は、DNAのATリッチ領域に結合し、膜透過性であり、2〜4日間蛍光シグナルを保持し、クエンチング9,10 耐性がある。ヘキスト33342およびチアゾールオレンジの欠点は、リンパ球増殖の阻害11および短い半減期9である

カルセイン-AM、フルオレセインジアセテート(FDA)、2 '、7'-ビス - (2-カルボキシエチル)-5-(および-6) - カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル(BCECF-AM)、5-(および-6) - (CFDA)、および5-(および-6) - カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステル(CFDA-AM)リンパ球移動研究に用いられる細胞質蛍光色素である。しかし、FDA、CFDAおよびCFDA-AMは細胞内の保持率が低い9 。 BCECF-AMは、増殖応答を低下させ、走化性およびスーパーオキシド産生に影響を及ぼす9,12。カルセイン-AMは蛍光色素であり、短期インビボリンパ球遊走研究に有用である。それは強い蛍光シグナルを放出し、細胞機能の大部分を妨げず、3日まで蛍光シグナルを保持する 12,13) 。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA-SE)は、リンパ球の移動研究に使用される共有結合性の蛍光色素です。 FITCは、細胞生存率に影響を示さず、Tリンパ球14,15よりもBリンパ球との親和性が強い、インビボで追跡することができる9,16。 C18ジ(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)、DiO(3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩)、Paul Karl Horan(PKH)2、PKH3およびPKH26は、白血球および赤血球を標識するために使用される蛍光親油性カルボシアニン色素を挿入する。 C18 DilおよびDiOは、細胞膜に取り込まれるとより高いシグナルを示し、比較的毒性がない12,17。 PKH2、PKH3およびPKH26標識細胞は、毒性の低い18,19,20,21,22の蛍光シグナルの良好な保持を示す。しかし、PKH2はCD62L発現をダウンレギュレートし、 mphocyte viability 23

上記の研究の大部分は、リンパ球におけるリンパ球の移動および増殖を追跡し、非眼球循環における標識された赤血球を研究するために行われてきた。眼球循環中の血液細胞を研究するための標識技術を応用した研究はほとんどない。走査型レーザー検眼鏡(SLO)の適用は、眼底血管撮影法24によって網膜および脈絡膜循環中の標識細胞をインビボで研究することに大きな利点を有する。 SLO 25,26,27,28,29,30,32,34,36,38,40,42,44,46,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,56,58,56,56,56,56,56,56,56,57,58,56,56,56,56,56,57,58,59,56,56,56,56,56,56,56,56class = "xref"> 31,32,33,34 。アクリジンオレンジの光毒性および発がん性26,27 FITCと細胞活性の干渉、および網膜および脈絡膜血管の解像度のための血管内造影剤の必要性は、インビボ動物実験29 におけるそれらの適用を制限する。フルオレセインナトリウムおよびICGは、食品医薬品局によって承認された非毒性であり、ヒトでの試験に安全です32,35 。フローダイナミックス研究の大部分は、白血球または赤血球の標識および網膜および脈絡膜血管におけるその視覚化に関連する36,37,38,39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

この研究で使用された動物プロトコールはシンガポールSingHealthの動物実験および使用委員会の承認を受けており、眼および視力における動物の使用に関するビジョンアンド眼科研究協会(ARVO)の声明研究。

1.蛍光色素による赤血球および白血球の標識

  1. 試薬の調製
    1. 1800μLの滅菌蒸留水中に3mgのICGを溶解してICG(1.5mg / mL)を調製する。 10×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)200μLを加える。
    2. 滅菌蒸留水6 mLに4 mLの1×PBSを加えて40%1×PBSを調製する。 PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を、10mLの1×PBSに100mgのBSAを加えることによって調製する。 BSAが溶解するまで十分に混合する。
  2. 密度勾配遠心分離を用いた赤血球および白血球の単離
    1. マウスを麻酔する(野生ty(ARVOガイドラインのスケジュール1に従って)塩酸ケタミン塩酸塩(50mg / kg)と塩酸キシラジン塩酸塩(0.5mg / kg)との組み合わせを使用して、C57BL / 6を投与した。ペダル踏み戻し反射( すなわち 、つまみ)で麻酔を確認する。
    2. ゆっくりと29ゲージの針(1mLシリンジに取り付けられています)を心臓に向けた肋骨の角度で挿入します。針が心臓の内側にあることを確認するには、プランジャーをわずかに引き抜き、血液がシリンジに抜き取られているかどうかを確認します。心臓から直接0.8 - 1 mLの血液を蘇生させる。
    3. 直ちに、採血管を含むエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(血液1.8mg / mL)に血液を移し、血液の凝固を防ぐために穏やかに混合する。
    4. ペントバルビタール(80mg / kg)を腹腔内注射することによりマウスを安楽死させる。
    5. ポリスクロースおよびジアトリゾアートナトリウム溶液(1:1比;密度1.077g / mL)の上に全血を2mLのマイクロ遠心チューブおよびセントリ血漿からの白血球および赤血球の分離を可能にするために、フュージ(450×g、30分)。
    6. ピペットを用いて上清(血漿)を除去して捨てる。ピペットを使用してバフィコート(白血球)と赤血球(赤血球層)を新しく分離したチューブに注意深く移す。
  3. 赤血球のICG(1.5%)標識
    1. 汚染物質を除去するために1x PBSで赤血球を洗浄する。赤血球を1×PBS(1:1)に再懸濁し、50%ヘマトクリットを作成する。 0.5%の50%ヘマトクリット(約250μLの充填赤血球)をマイクロ遠心チューブに分注する。赤血球(750×g、5分)を遠心分離し、上清を捨てる。
    2. 40%1×PBS200μLをペレット状の赤血球に加え、よく混合し、室温で5分間インキュベートする。赤血球懸濁液に100μLのICG(1.5mg / mL)を添加し、チューブを反転させて穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートする。 300μLの1×PBSを加え、シェーカーインキュベーターで37℃で60分間インキュベートする。
    3. 担体赤血球(750 xg、3分)を遠心分離し、1 mL PBSで再懸濁する。
    4. 上清が透明になるまで細胞を1×PBSで3〜5回洗浄する(ステップ1.3.3)。最後の洗浄後、上清を傾瀉し、ICG標識赤血球の50%ヘマトクリット(1.25×10 8細胞/ mL)を達成するために、標識された前膨潤赤血球に1%BSA PBS(1:1)を加える。
  4. 白血球のナトリウムフルオレセイン(1%)標識
    1. 密度勾配遠心分離(ステップ1.2.6からの)を用いて血液からバフィコートを分離した後、450xgで10分間遠心分離して10mLの1×PBSで細胞を1回洗浄し、汚染物を除去する。ペレットを900μLの1×PBSに再懸濁する。
    2. 100μLの10%ナトリウムフルオレセインを900μLの白血球懸濁液に加え、室温で2分間インキュベートする。標識された細胞を遠心分離によって10mLの1X PBSで3回洗浄する。ng(450×g、10分)。 100μLの1×PBSに細胞を再懸濁する。

2.蛍光標識細胞のライブイメージング

  1. ICG標識赤血球の生細胞イメージング
    1. 尾静脈または逆行軌道を介して注入する細胞を調製するために、ICG標識赤血球の50%ヘマトクリットを1倍PBSで10倍および50倍希釈して、それぞれ5%および1%ヘマトクリット細胞を作製する。
    2. マウスを赤外線(250W強度)の下に5分間置いて尾静脈を拡張させる。ケタミン塩酸塩(50mg / kg)および塩酸キシラジン(0.5mg / kg)を腹腔内注射(ここでは、ARVOガイドラインのスケジュール1に従って)してマウスを麻酔する。
    3. 0.5%トロピカミドと2.5%フェニレフリン塩酸塩の滴で眼の各瞳孔を希釈する。
    4. イメージングのためにコンタクトレンズを一方の目の上に置きます。イメージングのための媒体として眼科用ゲルを使用し、乾燥物を防ぐsの角膜。マウス眼の屈折を補正するために、+ 25ジオプターレンズを備えた共焦点レーザー走査眼科検査(SLO)カメラを固定する。
    5. マウスをSLOイメージングプラットフォームに置きます。マウスの角膜がSLOマシンの光学ヘッドに向かって真っ直ぐに向いていることを確認します。
    6. イメージングモジュールのスイッチを入れます。関連するイメージングモジュールソフトウェアを使用して、 "New Patient"ボタンをクリックし、マウスの耳のタグ番号、生年月日、蛍光色素のパーセント、および標識細胞タイプなどの動物識別情報を追加します。
      1. イメージングモジュールを操作して、動物の視神経をイメージングスクリーンの中央に配置します。関連するイメージングモジュールソフトウェアを使用して、「Acquire」ボタンをクリックして、30°または15°のアングルビュー設定の赤外線(IR)眼底画像を撮影します。最高品質の画像を得るために、網膜の中心、瞳孔、およびレーザーの光路が調整されていることを確認してください。
    7. ICG眼底ビデオを撮る。
      1. ICGフィルター(790 nm)をオンにし、カメラを30°または15°の角度で高速モードに設定し、ICG強度を85に設定してすべての標準値を読み取ります。コントロールパネルで、 "Acquire"ボタンをクリックして8.8 / 15フレーム/秒で1分間ビデオ(ベースラインコントロール)を撮影します。
    8. 30ゲージの針に取り付けられたインスリンシリンジに100μLのICG標識赤血球をロードする。
      1. 尾静脈経路を介した注射のために、ニードルベベルを尾静脈に挿入する。血液のシリンジへの逆流をチェックして静脈内アクセスを確認し、標識細胞を循環系に注入する。
      2. 眼窩後方経路を介した注入のために、眼に隣接する針を眼窩後方の空間に挿入するe。血液のシリンジへの逆流をチェックし、循環細胞に標識された細胞を注入することにより、眼窩後方へのアクセスを確認する。
    9. 注入後、マウスの位置を変えて、IR眼底画像(ステップ2.1.6.1を参照)とビデオをICGフィルタ(ステップ2.1.7.1を参照)を用いて撮影する。網膜循環中の標識された細胞は、細胞の注入直後に視覚化することができる。
    10. ビデオフレームを取得したら、SLO表示モジュールソフトウェアを使用してビデオを書き出すときに.tiff形式を選択して、ビデオシーケンスの.tiff画像を抽出します。ファイルを目的のフォルダに保存します。
    11. コンタクトレンズを取り外し、もう片方の目の上に置き、ステップ2.1.4〜2.1.7で説明したようにイメージングを完了します。
    12. 撮影後、麻酔をかけた動物を赤外線(250W)下に置き、麻酔から回復するまで体温を維持します。動物が完全に回復したら、マウスを保持ケージに戻します。
  2. 1%ナトリウムフルオレセイン標識白血球の生細胞イメージング
    1. マウスを準備し、セクション2.1で説明されているように機器をセットアップします。
    2. ステップ2.1.4〜2.1.6で説明したように、マウスを置いて赤外線眼底画像を撮影します。
      1. 30°または15°の角度の視野を有する高速カメラモードおよび標準化のためのすべての読み取りについて85でのフルオレセイン強度を有するフルオレセインフィルター(488nm)を使用して、マウスのフルオレセイン血管造影像を得る。 8.8 / 15フレーム/秒でビデオ(ベースライン制御)を記録する(ステップ2.1.7.1を参照)。
        注:ここでは、複数のトラックのビデオ(1分のビデオ)が異なる時間間隔で取得されました。
    3. セクション2.1.8で説明したように、100μLの標識白血球をマウスの尾静脈またはレトロオービタル注射液に注入します。
    4. 注射直後にマウスを置いて、赤外線眼底画像(ステップ2.1.5と2.1.6参照)とフルオマウスの血行再建術(2.2.2節参照)。
    5. イメージングモジュール上のフォーカスつまみを回してスキャンレーザーの焦点を調整し、網膜または脈絡膜血管の標識細胞を観察します。
    6. SLO表示モジュールソフトウェア(ステップ2.1.10参照)を使用してビデオフレームと画像を取得し、目的のフォルダに保存します。
    7. 手順の後、動物の世話のためにステップ2.1.12に従ってください。
  3. MtrackJソフトウェアによる画像解析
    1. 「File」をクリックしてImageJで画像シーケンスを開きます。 "インポート"を選択し、 "イメージシーケンス"を選択し、目的のイメージフォルダを選択し、 "開く"をクリックします。画面に「Sequence options」というポップアップウィンドウが表示されます。 [OK]をクリックします。画像シーケンスが開きます。
    2. 「画像」をクリックして画像のフレーム間隔を設定し、速度測定のために「プロパティ」を選択します。ここでは、それは8.8フレームですes / s。
    3. "プラグイン"を選択してMTrackJプラグインを開きます。 「トラッキング」を選択し、「MtrackJ」を選択します。メニューが表示されます。
    4. トラッキング設定を調整するには、メニューの「トラッキング」を選択し、「ポイントを追加した後の次のタイムフレームのインデックスに移動」チェックボックスをオンにします。
    5. 最初のセルを追跡します。
      1. 1つのセルを探し、後続のフレームで同じセルを追跡します。メニューで「追加」をクリックして新しいトラックを追加します。
      2. 画像(+記号)の上にカーソルを置き、適切なセルをクリックします。
        注:MTrackJは自動的に次の時間フレームにジャンプし、軌跡の最初のポイントの位置をマークする小さな円を追加します。
      3. 画像シーケンスのフレームを移動しながら、セルの現在の位置を続けてクリックします。
        注:時々、軌跡の前のポイントをマークする円は、現在の位置を表示する機能を妨げます。これが発生した場合、ステップ2.3.5.3.1に進んでください。
        1. メニューの「表示」をクリックし、「現時点のトラックポイントのみを表示する」オプションを選択して、軌道の表示オプションを変更します。すべての軌跡を表示するには、このオプションの選択を解除します。
      4. 最初のセルの軌跡が見えるまでクリックし続けます。次に、[保存]をクリックしてトラックを保存します。
    6. 2番目のセルを追跡します。
      1. メニューで、[追加]をクリックして新しいトラックを開始します。新しいセルを追跡するためにステップ2.3.5.1〜2.3.5.4を繰り返します。 2番目のトラックを保存するには、[保存]をクリックします。
      2. 観察されたすべての追跡可能な細胞について、これらのステップを続ける。セルをトラッキングした後、メニュータブで "Measure"と "OK"をクリックして結果を取得します。
        注記:結果ウィンドウが自動的に開き、詳細な分析のためにスプレッドシートに保存して開くことができます。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1.5%ICGで標識した赤血球を、C57BL / 6Jマウス(野生型)の網膜循環において視覚化した。 1.5%ICG標識赤血球の1%および5%ヘマトクリットの両方が、網膜循環において区別可​​能であった。しかし、個々の標識細胞は、1.5%ICG標識赤血球の1%ヘマトクリットでより明瞭に視覚化された( 図1 )。 5%ヘマトクリットでは、網膜血管中の多数の標識細胞のために、個々の細胞にマーキングすることは不可能であった。いずれの条件下でも、若干の赤芽球が乳頭周囲領域で観察されたが、標識赤血球の5%ヘマトクリットでより顕著であった( 図2 )。

白血球は上記プロトコールに従って1%ナトリウムフルオレセインでうまく標識され、蛍光顕微鏡を用いて緑色標識細胞として視覚化された( class = "xfig">図3)。標識されたサンプルでは、​​細胞の小さな塊(4〜5個の細胞)も観察された。細胞をマウス循環に注入すると、標識された白血球が網膜循環中で視覚化された( 図4 )。標識後、赤血球および白血球の両方をマウスに直ちに注入し、30分および60分の時間間隔で視覚化した。蛍光標識した細胞は注射直後に観察されたが、蛍光強度は30分および60分の時間間隔で徐々に減少した。我々はまた、赤血球に白血球染色プロトコール(1%のフルオレセインナトリウム)を使用し、そして赤血球の標識を観察しなかった。 Image Jパブリックドメインソフトウェア上のMtrack Jプラグインを使用して、細胞を網膜循環中で追跡した( 図5 )。

95 / 55495fig1.jpg "/>
図1 :網膜循環における1.5%ICG標識赤血球の1%ヘマトクリット。 ICGは網膜血管に明るいシグナルを示す個々の赤血球を標識した。いくつかの赤芽球が乳頭周囲領域で観察された。スケール=200μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2
図2 :網膜循環における1.5%ICG標識赤血球の5%ヘマトクリット。網膜血管に明るいシグナルを示す多くのICG標識赤血球;乳頭周囲領域に多量の赤芽球が観察された。スケール=200μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3 :1%ナトリウムフルオレセイン標識白血球の蛍光顕微鏡画像。フルオレセインナトリウム標識白血球は、小さな塊(20倍の倍率;スケール=50μm)を有する緑色蛍光シグナルを示す。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図4
図4 :網膜循環における1%ナトリウムフルオレセイン標識白血球。網膜血管に明るいシグナルを示すナトリウムフルオレセイン標識白血球(矢印)。スケール=200μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図5
図5 :画像解析ソフトウェアを用いた網膜循環における標識された個々の細胞の追跡。網膜循環中の標識された細胞の平均速度を計算するために、異なるトラック(画像上に表される色の円および線)を測定した。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

網膜および脈絡膜循環における血行動態の研究は、多くの眼疾患の病態生理を理解する上で不可欠です。網膜循環における血流動態は、フーリエドメイン光コヒーレンストモグラフィ(FD-OCT)、レーザースペックルフローグラフィ(LSFG)および網膜オキシメトリーによって研究することができる。これらの方法は、網膜循環路40,41,42,43,44,45における全血流を研究するために異なるアプローチを使用するが、個々の細胞型の流れダイナミクスを研究することができないという限界を共有している。網膜および脈絡膜組織への栄養素および酸素の供給、ならびに眼の炎症性疾患における免疫細胞の移動および病因の病因におけるそれらの役割は、ERのフローダイナミクスを調べることによって研究することができる網膜および脈絡膜循環における赤血球、赤血球および赤血球である。画像法と結合した標識技術は、循環中の標識細胞を追跡し、標識細胞の流動動態を研究するのに役立つ。血液中の血流動態を調べるために、いくつかの蛍光色素を白血球および赤血球に標識するために首尾よく適用された3,17,18,19。

ここでは、食品医薬品局が承認した非毒性の蛍光色素、インドシアニングリーン、およびフルオレセインナトリウムの網膜循環における赤血球および白血球の標識化および可視化のための適用を報告する。フルオレセインナトリウムは、白血球31,32,33を追跡するために最も一般的に使用される色素であるが46 。

SLOで高品質の画像を得るためには、瞳孔を完全に拡張する必要があり、コンタクトレンズを眼科用ゲルと共に使用して湿った角膜を維持し、白内障の形成を防止する必要がある。高品質の眼底画像および血管造影画像を得るためには、目の位置およびカメラの光路が真直ぐでなければならない。イメージング中の動きを最小にするために、動物は深く鎮静されるべきである。 1.5%ICGの1%および5%ヘマトクリット標識赤血球は網膜循環における蛍光標識細胞の可視化を示し、1%ヘマトクリットは個々の細胞をモニターするのにより適していた。注射された白血球の数が低すぎる場合、蛍光標識された細胞を視覚化することはできない。したがって、網膜循環中の標識細胞のモニタリングにおいてより良い結果を得るために、少なくとも4匹のマウスから白血球を回収し、1%ナトリウムフルオレセインで標識し、単一のマウスに注入することが推奨される。フルオレセインナトリウム(Calcein、FITC、DIO、FDA、およびフルオレセインナトリウムに類似または近似した吸収/発光極大を有するCFDA)のためのいくつかの代替色素があるが、色素保持率および眼組織に対する毒性は、9,12,13 14,17

報告された技術の限界は、60分後に循環中の蛍光シグナルの退色。したがって、標識細胞の流動ダイナミクスは60分以内に分析されなければならない。ここで、白血球を標識するために、あるマウスから血液を採取し、細胞を単離し、標識し、別のマウスに注入し、SLOによって視覚化した。しかし、SLOでは、網膜血管において1フレームあたり0〜1細胞しか観察されなかった。これは、白血球細胞数が不十分であることが原因である可能性がありますので、少なくとも3〜4匹のマウスから血液を集めて、1フレームあたりの細胞数を増やすことをお勧めします。この研究では8.8フレーム/秒のカメラ速度が使用されたが、これは標識細胞のより連続的な画像およびビデオを達成するために増加させることができた。

以前の研究では、異なる段階のDRを有する糖尿病患者の網膜循環における血流速度の変化が報告されている。 Clermont et al。 DR47の初期段階の患者における網膜血流の33%の減少を報告し、Nguyen al。増殖性DR 48を有する糖尿病患者の網膜血流の増加を報告した。血流速度の低下は、進行性緑内障49と関連することも報告されている。前述の研究では、著者らは、網膜循環における全血流速を調べた。各細胞型の流速を研究することにより、異なる疾患および疾患の異なる段階における細胞相互作用に関する情報を提供することができ、予後を助けることができる。ここでは、赤血球と白血球にそれぞれICGとナトリウムフルオレセインを標識し、それらの網膜循環における視覚化を行う方法を報告する。この方法は、インビボ研究のための任意の疾患モデルに適用することができる。

将来の研究では、SLOを用いた我々のラベリング技術を利用して、異なる薬物治療条件下での標識された赤血球および白血球の流動ダイナミクスの変化を研究することができるこの病気の様々な段階で、さらに、本発明者らの方法は、疾患の表現型における赤血球および白血球の役割を理解するのを助けることができる。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者は何も開示することはない。財務的または利益相反はありません。

Acknowledgements

この研究プロジェクトはシンガポール国家医学研究評議会(NMRC)のNew Investigator助成金のもとで資金提供された。研究チームは、2012年11月から2014年10月まで、National Medical Research Council(NMRC)の海外研究訓練フェローシップの下、University College of Ophthalmology(IoO)、University College(UCL)のAgrawal博士に研究訓練を教えていただきます。 David Shima。 Agrawal博士は、細胞を標識し、Shima博士の研究室でライブイメージングの概念と技術を取得しました。チームはDavid Shima教授、Kenith Meissner教授、Peter Lundh博士、Daiju Iwata教授からの訓練フェローシップの監督と指導を認めたいと思っています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101, (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23, (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58, (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47, (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14, (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29, (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104, (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151, (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34, (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2, (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93, (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17, (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88, (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11, (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93, (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49, (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124, (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129, (6), 728-733 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics