Etichettatura fluorescente colorante di eritrociti e leucociti per studiare la dinamica del flusso nella circolazione retinica del mouse

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Summary

L'imaging di cellule vascolari delle cellule ematiche in circolo oculare può fornire informazioni sull'infiammazione e l'ischemia nella retinopatia diabetica e nella degenerazione maculare legata all'età. Viene descritto un protocollo per etichettare le cellule del sangue e l'immagine delle cellule etichettate nella circolazione retinica.

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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

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Abstract

La dinamica del flusso sanguigno retinico e coroideo può fornire un'idea della fisiopatologia e delle sequele delle varie malattie oculari, come il glaucoma, la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e altre condizioni infiammatorie oculari. Può anche aiutare a monitorare le risposte terapeutiche nell'occhio. La corretta etichettatura delle cellule del sangue, accoppiata con l'imaging a cellule vive delle celle etichettate, consente di analizzare le dinamiche di flusso nella retina e nella circolazione choroidale. Qui descriviamo i protocolli standardizzati di etichettatura di indocyanina verde (ICG) di 1,5% e fluoresceina di sodio 1% rispettivamente degli eritrociti dei topi e dei leucociti. La scansione di oftalmoscopia laser (SLO) è stata applicata per visualizzare le cellule etichettate nella circolazione della retina dei topi C57BL / 6J (tipo selvatico). Entrambi i metodi hanno dimostrato distinte cellule etichettate con fluorescenza nella circolazione retinica del mouse. Questi metodi di etichettatura possono avere applicazioni più ampie in varie malattie oculariModelli.

Introduction

Studiare le dinamiche di flusso delle cellule del sangue nella circolazione retinica e choroidale è indispensabile per comprendere la patogenesi delle malattie oculari potenzialmente visibili e altre condizioni infiammatorie oculari. Tuttavia, le tecniche convenzionali di angiografia, che coinvolgono il legame dei coloranti fluorescenti alle proteine ​​plasmatiche, non forniscono alcuna informazione relativa alla dinamica degli eritrociti o dei leucociti 1 . Le dinamiche di flusso della retina eritrocita sono importanti per studiare la circolazione metabolica efficiente nella retina e le dinamiche di flusso delle leucociti, per comprendere la migrazione cellulare, il riconoscimento, l'adesione e la distruzione in varie condizioni infiammatorie2. Ci sono diverse molecole fluorescenti utilizzate per l'identificazione e la caratterizzazione di vari tipi di cellule 3 . L'emodinamica delle cellule del sangue può essere misurata colorandoli con i fluorescenti appropriatiCentesimi e applicando le tecniche di imaging corrette 4 .

La presenza di risposte infiammatorie nelle malattie intraoculari, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la retinopatia diabetica (DR), comportano l'accumulo di linfociti nell'area affetta 5 , 6 . Il monitoraggio delle cellule immunitarie nei tessuti può aiutare a comprendere gli eventi complessi coinvolti nel meccanismo della patogenesi della malattia. Gli isotopi radioattivi come 51 Cr e 125 I sono stati usati come traccianti di cellule negli studi iniziali. Questi coloranti sono tossici e influenzano la vitalità cellulare. Anche se i marcatori radioattivi 3 H e 14 C sono meno tossici per le cellule, a causa delle loro energie di emissione minori, è difficile rilevare i loro segnali nel sistema 7 , 8 . Sono stati introdotti diversi coloranti fluorochromici per superare i potenziali problemi associatiIth marcatori radioattivi e migrazione linfocitaria in pista in vitro utilizzando microscopia fluorescente e citometria a flusso 9 , 10 . Hoechst 33342 e tiazolo arancione sono coloranti fluorescenti legati al DNA, che vengono usati per monitorare i linfociti in vivo. Hoechst 33342 si lega a regioni ricche di AT nel DNA, è membrana permeabile, mantiene i segnali fluorescenti per 2 - 4 giorni ed è resistente alla spegnimento 9 , 10 . Gli svantaggi di Hoechst 33342 e di tiazolo arancione sono l'inibizione della proliferazione linfocitaria 11 e la breve emivita, rispettivamente 9 .

Calcein-AM, fluoresceina diacetato (FDA), 2 ', 7'-bis (2-carbossietil) -5- (e-6) -carbossilfluoresceina, acetossimetil estere (BCECF-AM) Carbossiofluoresceina diacetato (CFDA) e 5- (e-6) -carbossilfluoresceina diacetato acetossimetil estere (CFDA-AM)Sono i coloranti fluorescenti citoplasmatici utilizzati per studi di migrazione dei linfociti. Tuttavia, FDA, CFDA e CFDA-AM hanno una ritenzione inferiore nelle cellule 9 . BCECF-AM riduce la risposta proliferativa e influenza la produzione di chimotassi e superossido 9 , 12 . Calcein-AM è un colorante fluorescente e utile per studi di migrazione linfocitaria a breve termine in vivo . Emette forti segnali fluorescenti, non interferisce con la maggior parte delle funzioni cellulari e mantiene i segnali fluorescenti fino a 3 giorni 12 , 13 . I fluoresceina isotiocianato (FITC) e il carbossiofluoresceina diacetato succinimidil estere (CFDA-SE) sono coloranti fluorescenti di accoppiamento covalente, utilizzati per studi di migrazione dei linfociti. FITC non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare e ha una più forte affinità con linfociti B rispetto ai linfociti T 14 , 15 in vivo per più di 8 settimane e fino a 8 divisioni cellulari 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanina perclorato), DiO (3,3'-dioctadecilossacarbocanina perchlorato), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 e PKH26 sono membrana- Inserendo coloranti lipocilici fluocalcificanti carbocyanina utilizzati per etichettare leucociti ed eritrociti. C18 Dil e DiO mostrano segnali più elevati quando incorporati nella membrana cellulare e sono relativamente non tossici 12 , 17 . Le cellule etichette PKH2, PKH3 e PKH26 presentano una buona ritenzione dei segnali fluorescenti con meno tossicità 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Tuttavia, PKH2 giù regola l'espressione CD62L e riduce la lunghezza Viabilità del mphocyte 23 .

La maggior parte degli studi sopra menzionati sono stati eseguiti per monitorare la migrazione e la proliferazione dei linfociti nelle linfatiche e studiare gli eritrociti etichettati nella circolazione non oculare. Esistono pochissimi studi applicando le tecniche di etichettatura per studiare le cellule del sangue nella circolazione oculare. L'applicazione dell'Otalmoscopia laser di scansione (SLO) ha un grande vantaggio nello studio delle cellule etichettate nella circolazione retinica e coroidale in vivo mediante angiografia del fundus 24 . Esistono diversi coloranti fluorescenti quali ICG, arancio acridina, FITC, fluoresceina di sodio e CFDA che vengono utilizzati per studiare le leucociti nella circolazione retinica da SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . La fototossicità e la cancerogenicità dell'acidino arancio 26 , 27 , l'interferenza di FITC con l'attività cellulare e il requisito di un agente di contrasto intravascolare per la risoluzione dei retini e dei vasi sanguigni coroidali limita la loro applicazione in esperimenti animali in vivo 29 . La fluoresceina di sodio e ICG non sono tossiche, approvate dalla Food and Drug Administration e sono sicure per le prove sugli esseri umani 32 , 35 . La maggior parte degli studi dinamici di flusso sono legati all'etichettatura dei leucociti o agli eritrociti e la sua visualizzazione nei vasi sanguigni retinici e coroidali 36 , 37 , 38 , 39

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Protocol

I protocolli animali utilizzati in questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di SingHealth, Singapore e sono conformi alle linee guida dell'associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) Dichiarazione per l'uso degli animali in oftalmica e di visione Ricerca.

1. Etichettatura di eritrociti e leucociti con coloranti fluorescenti

  1. Preparazione di reagenti
    1. Preparare ICG (1,5 mg / ml) sciogliendo 3 mg di ICG in 1800 μL di acqua distillata sterilizzata. Aggiungere 200 μl di 10 volte salina fosfata tamponata (PBS).
    2. Preparare 40% 1x PBS aggiungendo 4 ml di 1x PBS a 6 ml di acqua distillata sterilizzata. Preparare 1% di albumina serica bovina (BSA) in PBS aggiungendo 100 mg di BSA a 10 ml di 1x PBS. Mescolare bene fino alla dissoluzione della BSA.
  2. Isolamento di eritrociti e leucociti utilizzando centrifugazione gradiente di densità
    1. Anestetizzare i topi (selvaggio tyPe C57BL / 6) utilizzando una combinazione di cloridrato di ketamina (50 mg / kg) e xilazina cloridrato (0,5 mg / kg) (secondo il programma 1, secondo le linee guida ARVO). Confermare l'anestesia con il riflesso di ritiro del pedale ( cioè , pizzico del piede).
    2. Inserire lentamente l'ago da 29 gauge (attaccato ad una siringa da 1 ml) ad un angolo costoso rivolto verso il cuore. Per confermare che l'ago sia dentro il cuore, ritirare leggermente lo stantuffo e verificare se il sangue è ritirato nella siringa. Exsanguinate 0,8 - 1 ml di sangue direttamente dal cuore.
    3. Trasferire immediatamente il sangue in un acido acetico di etanolo diammina tetra (EDTA) (1,8 mg / ml di sangue) contenente il tubo di raccolta del sangue e mescolare delicatamente per prevenire la coagulazione del sangue.
    4. Eutanizzare i topi somministrando pentobarbital (80 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale.
    5. Sistemare l'intero sangue in cima a una soluzione di diatrizoato di polisolfuro e sodio (rapporto 1: 1, densità 1.077 g / mL) in un tubo di microcentrifuga da 2 mL e centriFuge (450 xg, 30 min) per consentire la separazione dei leucociti e degli eritrociti dal plasma.
    6. Rimuovere e scartare il supernatante (plasma) usando una pipetta. Trasferire con cautela il cappotto buffy (leucociti) e gli eritrociti (strato di globuli rossi) in tubi nuovi e separati utilizzando pipette.
  3. ICG (1,5%) etichettatura degli eritrociti
    1. Lavare gli eritrociti con 1x PBS per rimuovere eventuali contaminanti. Resuspendere gli eritrociti in 1x PBS (1: 1) per ottenere il 50% di ematocrito. Aliquota 0,5 mL di ematocrito al 50% (~ 250 μL di eritrociti confezionati) in tubi di microcentrifuga. Centrifugare gli eritrociti (750 xg, 5 min) e scartare il surnatante.
    2. Aggiungere 200 μl di 40% 1x PBS agli eritrociti pelletati, mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 100 μL di ICG (1,5 mg / ml) alla sospensione di eritrociti, mescolare delicatamente invertendo il tubo e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 300 μL di 1x PBS e incubare a37 ° C in un incubatore a scuotitore per 60 min.
    3. Centrifugare gli eritrociti vettoriali (750 xg, 3 min) e risospendere in 1 ml di 1x PBS.
    4. Lavare le cellule ~ 3 - 5 volte con 1x PBS finché il surnatante non è chiaro (passo 1.3.3). Dopo l'ultimo lavaggio, decantare il surnatante e aggiungere 1% BSA PBS (1: 1) agli eritrociti pre-gonfiati etichettati per ottenere un ematocrito al 50% (1,25 x 10 8 cellule / ml) di eritrociti etichettati con ICG.
  4. Etichettatura di fluoresceina di sodio (1%) di leucociti
    1. Dopo aver separato il buffy coat dal sangue usando la centrifugazione di gradiente di densità (dal punto 1.2.6), lavare le cellule una volta con 10 mL di 1x PBS centrifugando a 450 xg per 10 minuti per rimuovere eventuali contaminanti. Resispendere il pellet in 900 μl di 1x PBS.
    2. Aggiungere 100 μl di 10% di sodio fluoresceina a 900 μL della sospensione di leucociti e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Lavare le cellule etichettate per tre volte con 10 mL di 1X PBS per centrifugheNg (450 xg, 10 min). Resuspendere le cellule in 100 μl di 1x PBS.

2. Imaging in diretta di celle con etichette fluorescenti

  1. Imaging a cellule vive di eritrociti etichettati con ICG
    1. Per preparare le cellule per l'iniezione attraverso la vena della coda o il percorso retro-orbitale, diluire il 50% di ematocrito di eritrociti contrassegnati da ICG da 10 volte e 50 volte con 1x PBS per rendere rispettivamente le cellule ematocritiche del 5% e dell'1%.
    2. Posizionare il mouse sotto la luce infrarossa (intensità 250W) per 5 minuti per far dilatare la vena della coda. Anestetizzare il topo con il ketamine cloridrato (50 mg / kg) e xilazina cloridrato (0,5 mg / kg) attraverso l'iniezione intraperitoneale (qui, secondo il programma 1, secondo le linee guida ARVO).
    3. Dilare ogni allievo degli occhi con una goccia di tropicamide 0,5% e 2,5% cloridrato di fenilefrina.
    4. Posizionare la lente a contatto su un occhio per l'imaging. Utilizzare gel ophthalmic come mezzo per l'imaging e per prevenire secchezzaS della cornea. Fissare la fotocamera confocale per l'ophthalmoscopy (SLO) di scansione laser con obiettivo a diottroteria +25 per compensare la rifrazione dell'occhio del topo.
    5. Posizionare il mouse sulla piattaforma di imaging SLO. Assicurarsi che la cornea del mouse sia rivolta dritto verso la testa ottica della macchina SLO.
    6. Accendere il modulo di imaging. Utilizzando il software del modulo di imaging associato, fare clic sul pulsante "Nuovo paziente" e aggiungere dettagli sull'identificazione animale, ad esempio il numero di tag dell'orecchio del mouse, la data di nascita, la percentuale di colorante fluorescente e il tipo di cella etichettata.
      1. Posizionare il nervo ottico dell'animale al centro dello schermo di imaging guidando il modulo di imaging. Utilizzando il software del modulo di imaging associato, fare clic sul pulsante "Acquisisci" per catturare le immagini a fondale a infrarossi (IR) con l'impostazione dell'angolo di 30 ° o 15 °. Assicurarsi che il centro della retina, l'alunno e il percorso ottico del laser siano allineati per ottenere un'immagine di qualità migliore.
    7. Prendi il video del fundus ICG.
      1. Accendere il filtro ICG (790 nm), impostare la fotocamera in modalità ad alta velocità con la vista angolare a 30 o 15 gradi e impostare l'intensità ICG a 85 per tutte le letture per la standardizzazione. Sul pannello di controllo fare clic sul pulsante "Acquisisci" per riprendere il video (controllo basale) a 8,8 / 15 fotogrammi / s per 1 minuto.
    8. Caricare 100 μL di eritrociti etichettati con ICG in una siringa per insulina attaccata ad un ago da 30 gauge.
      1. Per l'iniezione tramite la via della coda della coda, inserire l'ago in alto nella vena della coda. Confermare l'accesso endovenoso verificando il flusso di flusso del sangue nella siringa e iniettare le cellule etichettate nella circolazione.
      2. Per l'iniezione tramite l'itinerario retro-orbitale, inserire l'ago adiacente all'occhio nello spazio sporgente orbitalee. Confermare l'accesso retro-orbitale controllando il flusso di sangue nella siringa e iniettando le cellule etichettate nella circolazione.
    9. Dopo l'iniezione, riposizionare il mouse e riprendere le immagini del fundus IR (vedere la fase 2.1.6.1) e il video utilizzando il filtro ICG (vedere la fase 2.1.7.1). Le cellule etichettate nella circolazione retinica possono essere visualizzate immediatamente dopo l'iniezione delle cellule.
    10. Dopo aver acquisito i fotogrammi video, estrarre le immagini .tiff delle sequenze video scegliendo il formato .tiff quando esportate il video utilizzando il software del modulo di visualizzazione SLO. Salvare i file in una cartella desiderata.
    11. Rimuovere la lente a contatto, posizionarla sopra l'altro occhio e completare l'imaging come descritto nei passaggi 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Dopo l'imaging, posizionare l'animale anestetizzato sotto la luce a infrarossi (250W) per mantenere la temperatura corporea fino a recuperare dall'anestesia. Quando l'animale è completamente recuperato, posizionare il mouse nella gabbia della tenuta.
  2. Imaging a cellule vive di 1% di leucociti a base di fluoresceina di sodio
    1. Preparare il mouse e impostare lo strumento come descritto nella sezione 2.1.
    2. Posizionare il mouse e prendere le immagini del fundus IR come descritto nei passaggi 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Ottenere l'angiogramma del fluorescein del mouse usando il filtro fluorescein (488 nm) con la modalità ad alta velocità della macchina fotografica con la vista angolare a 30 o 15 ° e l'intensità di fluoresceina a 85 per tutte le letture per la standardizzazione. Registrare il video (controllo basale) a 8,8 / 15 frame / s (vedere passo 2.1.7.1).
        NOTA: qui sono stati acquisiti più tracce di video (video di 1 min) in intervalli di tempo diversi.
    3. Iniettare 100 μL di leucociti etichettati nel topo attraverso la vena della coda o l'iniezione retro-orbitale come descritto nella sezione 2.1.8.
    4. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il mouse e prendere le immagini del fundus IR (vedere punti 2.1.5 e 2.1.6) e il fluoSalvare l'angiogramma del mouse (vedere la sezione 2.2.2).
    5. Osservare le celle etichettate nel retino o nei vasi sanguigni coroidali regolando il punto focale del laser di scansione ruotando la manopola di messa a fuoco sul modulo di imaging.
    6. Acquisire i fotogrammi e le immagini video utilizzando il software del modulo di visualizzazione SLO (vedere la fase 2.1.10) e salvarlo in una cartella desiderata.
    7. Dopo la procedura, seguire la fase 2.1.12 per la cura degli animali.
  3. Analisi delle immagini dal software MtrackJ
    1. Aprire la sequenza di immagini in ImageJ facendo clic su "File". Selezionare "Importa" e scegliere "Sezione immagine", selezionare la cartella immagine desiderata e fare clic su "Apri". Sullo schermo apparirà una finestra popup denominata "Opzioni di sequenza". Fare clic su "Ok"; La sequenza di immagini si aprirà.
    2. Impostare l'intervallo di frame del video dell'immagine facendo clic su "Immagine" e selezionare "Proprietà" per le misurazioni della velocità. Qui, è 8,8 frames / s.
    3. Apri il plugin MTrackJ selezionando "Plugins". Selezionare "Tracking" e quindi selezionare "MtrackJ". Dovrebbe apparire un menu.
    4. Per regolare le impostazioni di monitoraggio, selezionare "Tracking" (sotto il menu) e selezionare la casella "Sposta nell'indice del frame successivo dopo l'aggiunta di punti".
    5. Traccia la prima cella.
      1. Individuare una cella e tracciare la stessa cella nei fotogrammi successivi. Nel menu fare clic su "Aggiungi" per aggiungere una nuova traccia.
      2. Spostare il cursore sull'immagine (+ segno) e fare clic sulla cella appropriata.
        NOTA: MTrackJ salterà automaticamente alla cornice successiva e aggiungerà un piccolo cerchio, contrassegnando la posizione del primo punto nella traiettoria.
      3. Continuare a cliccare sulla posizione corrente della cella mentre si muove attraverso i fotogrammi della sequenza di immagini.
        NOTA: Occasionalmente, i cerchi che contrassegnano i punti precedenti nella traiettoria interferiscono con la possibilità di visualizzare la posizione corrente. Se ciò accade,Procedere al punto 2.3.5.3.1.
        1. Cambiare l'opzione di visualizzazione per la traiettoria facendo clic su "Visualizzazione" nel menu e selezionando l'opzione "visualizza solo i punti di traccia all'ora corrente". Per visualizzare tutte le traiettorie, deselezionare questa opzione.
      4. Continuare a fare clic fino alla visualizzazione della traiettoria della prima cella. Quindi salvare la traccia cliccando su "Salva".
    6. Traccia la seconda cella.
      1. Nel menu, fai clic su "Aggiungi" per avviare una nuova traccia. Ripetere i passaggi 2.3.5.1 - 2.3.5.4 per il monitoraggio della nuova cella. Fai clic su "Salva" per salvare la seconda traccia.
      2. Continuare questi passaggi per tutte le celle tracciate osservate. Dopo aver monitorato le celle, fare clic su "Misura" e "OK" nella scheda menu per ottenere i risultati.
        NOTA: si apre automaticamente una finestra dei risultati, che può essere salvata e aperta in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.

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Representative Results

Gli eritrociti etichettati con l'ICG dell'1,5% sono stati visualizzati nella circolazione retinica dei topi C57BL / 6J (tipo selvatico). Sia l'1% e il 5% di ematocrito dell'1,5% gli eritrociti etichettati con ICG erano distinguibili nella circolazione retinica. Tuttavia, le singole cellule etichettate sono state più chiaramente visualizzate con il 1% di ematocrito dell'1,5% di eritrociti etichettati con ICG ( Figura 1 ). Nel 5% di ematocrito, a causa del numero elevato di cellule etichettate nelle vasi retiniche, non era possibile contrassegnare la singola cellula. Alcune eritrostasi sono state osservate nella regione peripapillare in entrambe le condizioni, ma è stato più evidente nel 5% di ematocrito di eritrociti etichettati ( Figura 2 ).

I leucociti sono stati etichettati con successo con 1% di fluoresceina di sodio seguendo il protocollo precedente e sono stati visualizzati come cellule a marchio verde utilizzando la microscopia fluorescente ( Classe = "xfig"> Figura 3). Piccole catene di cellule (4 - 5 cellule insieme) sono state osservate anche nei campioni etichettati. Quando le cellule sono state iniettate nella circolazione del topo, leucociti etichettati sono stati visualizzati nella circolazione retinica ( Figura 4 ). Dopo l'etichettatura, entrambi gli eritrociti e leucociti sono stati immediatamente iniettati nei topi e visualizzati a intervalli di tempo di 30 e 60 minuti. Le cellule etichettate con fluorescenza sono state osservate immediatamente dopo l'iniezione, ma le intensità di fluorescenza sono diminuite gradualmente a intervalli di tempo di 30 e 60 minuti. Abbiamo anche usato il protocollo di colorazione delle leucociti (1% di sodio fluoresceina) sugli eritrociti e non abbiamo osservato alcuna etichettatura degli eritrociti. Utilizzando il plugin Mtrack J sul software di dominio pubblico Image J, le celle sono state tracciate nella circolazione retinica ( Figura 5 ).

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Figura 1 : 1% ematocrito di 1,5% ICG etichettati eticitati nella circolazione retinica. L'ICG ha identificato singoli eritrociti che presentano segnali luminosi nei vasi retinici. Alcune eritrostasi sono state osservate nella regione peripapillare. Scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : 5% ematocrito dell'1,5% ICG etichettati etichettati nella circolazione retinica. Molti eritrociti etichettati da ICG che presentano segnali luminosi nei vasi retinici; Una grande quantità di eritrostasi è stata osservata nella regione peripapillare. Scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 : Microscopia a fluorescenza Immagine di 1% di leucociti di fluoresceina a base di sodio. Leucociti con fluoresceina di sodio che mostrano segnali fluorescenti verdi con piccoli clumps (ingrandimento 20X, scala = 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 : 1% di sodio fluoresceina etichettati leucociti nella retinica circolazione. La fluoresceina di sodio ha indicato leucociti (freccia) che mostrano segnale luminoso nei vasi retinici. Scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5 : Controllo delle singole cellule etichettate nella circolazione retinica utilizzando il software di analisi delle immagini. Sono stati misurati diversi binari (cerchi colorati e linee rappresentati nell'immagine) per calcolare la velocità media delle cellule etichettate nella circolazione retinica.

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Discussion

Studiare l'emodinamica nella circolazione retinica e choroidale è fondamentale per comprendere la fisiopatologia di molte malattie oculari. La dinamica del flusso sanguigno nella circolazione retinica può essere studiata mediante tomografia ottica di coefficiente di Fourier-dominio (FD-OCT), flussografia laser speckle (LSFG) e ossimetria retinica. Sebbene questi metodi utilizzino approcci diversi per studiare il flusso sanguigno totale nella circolazione retinica 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , condividono la limitazione dell'incapacità di studiare le dinamiche di flusso dei singoli tipi di cellule. Le sostanze nutritive e l'ossigeno al tessuto retinico e coroidale, così come la migrazione di cellule immunitarie nelle malattie infiammatorie oculari e il loro ruolo nella patogenesi della malattia, possono essere studiati studiando le dinamiche di flusso di erYtrociti e leucociti in circolo retinico e choroidale, rispettivamente. Le tecniche di etichettatura accoppiate con metodi di imaging consentono di monitorare le celle etichettate nella circolazione e di studiare le dinamiche di flusso delle cellule etichettate. Molti coloranti fluorescenti sono stati applicati con successo per etichettare i leucociti e gli eritrociti per esaminare le loro dinamiche di flusso nella circolazione 3 , 17 , 18 , 19 .

Qui riportiamo l'applicazione della Food and Drug Administration approvata di coloranti fluorescenti non tossici, verde di indocyanina e fluoresceina di sodio, per l'etichettatura e la visualizzazione degli eritrociti e dei leucociti nella circolazione retinica rispettivamente. Anche se la fluoresceina di sodio è la colorazione più comunemente utilizzata per il monitoraggio dei leucociti 31 , 32 , 33 34 , il vantaggio di etichettare simultaneamente gli eritrociti e leucociti con ICG e la fluoresceina di sodio è rispettivamente un'efficace visualizzazione delle cellule etichettate contemporaneamente nell'occhio degli animali cambiando i filtri nello SLO. SLO è un metodo non invasivo di immagini retiniche che viene ampiamente utilizzato nello studio dei cambiamenti patologici nelle varie malattie della retina umana e degli animali. Può anche aiutare a confrontare le modifiche della retina in risposta a un dato trattamento 46 .

Per ottenere immagini di qualità nella SLO, gli allievi devono essere dilatati e la lente a contatto deve essere utilizzata con gel oftalmico per mantenere una cornea umida e prevenire la formazione di cataratta. La posizione degli occhi e il percorso ottico della telecamera deve essere diritta per ottenere immagini di fondo e angiogrammi di qualità. L'animale deve essere accuratamente sedato per minimizzare il movimento durante l'imaging. Anche se l'1% e il 5% di ematocrito dell'1,5% ICGEtichettati con etichettatura hanno dimostrato la visualizzazione di cellule etichettate con fluorescenza nella circolazione retinica, l'ematocrito dell'1% era più adatto per il monitoraggio delle singole cellule. Le cellule etichettate con fluorescenza non possono essere visualizzate se il numero di leucociti iniettati è troppo basso. Pertanto, per ottenere migliori risultati nel monitoraggio delle cellule etichettate nella circolazione retinica, si raccomanda di raccogliere leucociti da almeno 4 topi, etichetta con fluoresceina sodica al 1% e iniettare in un unico topo. Sebbene ci siano alcuni coloranti alternativi per la fluoresceina di sodio (Calcein, FITC, DIO, FDA e CFDA con assorbimento / emissioni maxima simili a o in prossimità di fluoresceina di sodio), il tasso di ritenzione del tinture e la tossicità nei tessuti oculari devono essere valutati 9 , 12 , 14 , 17 .

La limitazione della tecnica riportata è laScolorimento del segnale fluorescente in circolazione dopo 60 min. Pertanto, le dinamiche di flusso delle celle etichettate devono essere analizzate entro 60 min. Qui, per etichettare leucociti, il sangue è stato ritirato da un solo topo, le cellule sono state isolate, etichettate, iniettate in un altro topo e visualizzate da SLO. Tuttavia, in SLO, solo vasi da 0 a 1 per struttura è stata osservata nei vasi sanguigni retinici. Ciò potrebbe essere dovuto al numero insufficiente di celle di leucociti e perciò consigliamo di raccogliere sangue da almeno 3 - 4 topi per visualizzare un numero di cellule superiore per fotogramma. La velocità della fotocamera di 8,8 fotogrammi / s è stata utilizzata nello studio, ma questo potrebbe essere aumentato per ottenere immagini sequenziali e video delle celle etichettate.

Studi precedenti hanno riportato variazioni della velocità di flusso sanguigno nella circolazione retinica di pazienti diabetici con diverse fasi di DR. Clermont et al. Riportarono una diminuzione del 33% del flusso sanguigno della retina nei pazienti con stadio precoce della DR 47 e Nguyen etal. Ha riportato un aumento del flusso sanguigno della retina nei pazienti diabetici con DR 48 proliferante. Si è anche riferito che una diminuzione della velocità del flusso sanguigno è associata a glaucoma progressivo 49 . Negli studi sopra citati, gli autori hanno studiato l'intera velocità di flusso sanguigno nella circolazione retinica. Studiare le velocità di flusso di ciascun tipo di cellula possono fornire informazioni sulle interazioni cellulari in diverse malattie e in diverse fasi della malattia e possono aiutare nella prognosi. Qui riportiamo un metodo per etichettare gli eritrociti e leucociti con ICG e la fluoresceina di sodio rispettivamente e la loro visualizzazione nella circolazione retinica; Questo metodo può essere applicato su qualsiasi modello di malattia per studi in vivo .

La ricerca futura può utilizzare le nostre tecniche di etichettatura usando SLO per studiare la variazione delle dinamiche di flusso degli etichetti etichettati etichettati e dei leucociti sotto diversi condi di trattamento farmacologicoIn varie fasi della malattia. Inoltre, i nostri metodi possono aiutare a comprendere il ruolo degli eritrociti e dei leucociti nei fenotipi di malattia.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Nessun finanziamento o conflitto d'interesse.

Acknowledgements

Il progetto di ricerca è stato finanziato sotto la concessione di New Investigator dal National Medical Research Council (NMRC), Singapore. La squadra apprezzerà la formazione di ricerca fornita al dottor Agrawal presso l'Istituto di Oftalmologia (IoO), Università di Londra (UCL) sotto il National Medical Research Council (NMRC) borse di studio per la ricerca estera dal novembre 2012 al ottobre 2014 sotto tutorato del prof. David Shima. Il dottor Agrawal ha acquisito il concetto e le competenze per l'etichettatura delle cellule e l'imaging in diretta nel laboratorio del dottor Shima. La squadra apprezzerà quindi la supervisione e la guida durante la borsa di formazione del prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh e il dott. Daiju Iwata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

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