Etiquetagem de corantes fluorescentes de eritrócitos e leucócitos para estudar a dinâmica do fluxo na circulação da retina do mouse

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

A imagem em células vivas das células sanguíneas marcadas na circulação ocular pode fornecer informações sobre inflamação e isquemia na retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade. É descrito um protocolo para rotular as células do sangue e imagem das células rotuladas na circulação da retina.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A dinâmica da corrente retiniana e coroidal pode fornecer informações sobre a fisiopatologia e seqüelas de várias doenças oculares, como glaucoma, retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e outras condições inflamatórias oculares. Também pode ajudar a monitorar as respostas terapêuticas no olho. A rotulagem adequada das células do sangue, juntamente com imagens de células vivas das células rotuladas, permite a investigação da dinâmica do fluxo na circulação retiniana e coróide. Aqui, descrevemos os protocolos padronizados de 1,5% de indocyanina verde (ICG) e 1% de marcação de fluoresceína de sódio de ratos eritrócitos e leucócitos, respectivamente. Foi aplicada a oftalmoscopia laser de varredura (SLO) para visualizar as células rotuladas na circulação da retina de camundongos C57BL / 6J (tipo selvagem). Ambos os métodos demonstraram células distintas marcadas fluorescentemente na circulação da retina do mouse. Estes métodos de rotulagem podem ter aplicações mais amplas em várias doenças ocularesModelos.

Introduction

Estudar a dinâmica do fluxo das células sanguíneas na circulação retiniana e coróide é imperativo para a compreensão da patogênese de doenças oculares potencialmente ameaçadoras de visão e outras condições inflamatórias oculares. No entanto, as técnicas de angiografia convencional, que envolvem a ligação de corantes fluorescentes a proteínas plasmáticas, não fornecem nenhuma informação sobre a dinâmica dos eritrócitos ou leucócitos 1 . A dinâmica do fluxo da retina dos eritrócitos é importante para estudar a circulação metabolicamente eficiente na retina e a dinâmica do fluxo de leucócitos, para entender a migração celular, reconhecimento, adesão e destruição em várias condições inflamatórias 2 . Existem várias moléculas fluorescentes usadas na identificação e caracterização de vários tipos de células 3 . A hemodinâmica das células do sangue pode ser medida por coloração com as fluorescências apropriadasCorantes centrais e aplicando as técnicas adequadas de imagem 4 .

A presença de respostas inflamatórias em doenças intraoculares como a degeneração macular relacionada à idade (AMD) e a retinopatia diabética (DR) envolvem a acumulação de linfócitos na área doente 5,6. O rastreamento das células imunes nos tecidos pode ajudar a compreender os eventos complexos envolvidos no mecanismo da patogênese da doença. Os isótopos radioativos como 51 Cr e 125 I foram utilizados como traçadores celulares em estudos iniciais. Esses corantes são tóxicos e afetam a viabilidade celular. Embora os marcadores radioativos 3 H e 14 C sejam menos tóxicos para as células, devido às suas energias de emissão mais baixas, é difícil detectar seus sinais no sistema 7 , 8 . Uma série de corantes de fluorochrome foram introduzidos para superar os problemas potenciais associados wIth marcadores radioativos e acompanhar a migração de linfócitos in vitro usando microscopia fluorescente e citometria de fluxo 9 , 10 . Hoechst 33342 e laranja de tiazol são corantes fluorescentes que ligam DNA, que são utilizados para rastrear linfócitos in vivo. O Hoechst 33342 liga-se a regiões ricas em AT no DNA, é permeável à membrana, mantém os sinais fluorescentes durante 2 a 4 dias e é resistente à extinção 9 , 10 . As desvantagens do Hoechst 33342 e da laranja de tiazole são a inibição da proliferação de linfócitos 11 e a meia-vida curta, respectivamente 9 .

Calcein-AM, diacetate de fluoresceína (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e -6) -carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo (BCECF-AM), 5- (e -6) Diacetate de carboxifluoresceína (CFDA) e éster de acetoximetilo de ácido 5- (e -6) -carboxifluoresceína (CFDA-AM)São os corantes fluorescentes citoplasmáticos utilizados para estudos de migração de linfócitos. No entanto, FDA, CFDA e CFDA-AM têm menor retenção nas células 9 . BCECF-AM reduz a resposta proliferativa e influencia a produção de quimiotaxia e superóxido 9 , 12 . Calcein-AM é um corante fluorescente e útil para estudos de migração de linfócitos in vivo a curto prazo. Ele emite sinais fluorescentes fortes, não interfere com a maioria das funções celulares e retém sinais fluorescentes por até 3 dias 12 , 13 . O isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA-SE) são corantes fluorescentes de acoplamento covalente, que são utilizados para estudos de migração de linfócitos. FITC não exibe nenhum efeito sobre a viabilidade celular e tem maior afinidade com os linfócitos B do que os linfócitos T 14 , 15 in vivo por mais de 8 semanas e até 8 divisões de células 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3-tetrametilindocarbocanina perclorato), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanina perclorato), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 e PKH26 são membrana- Inserindo corantes de carbocyanina lipofílicos fluorescentes usados ​​para rotular leucócitos e eritrócitos. C18 Dil e DiO exibem sinais mais elevados quando incorporados na membrana celular e são relativamente não tóxicos 12 , 17 . As células marcadas com PKH2, PKH3 e PKH26 exibem uma boa retenção dos sinais fluorescentes com menos toxicidade 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . No entanto, o PKH2 regula a expressão CD62L e reduz-se Viabilidade de mphocyte 23 .

A maioria dos estudos acima mencionados foram realizados para rastrear a migração e proliferação de linfócitos no linfatismo e estudar os eritrócitos marcados na circulação não ocular. Existem poucos estudos aplicando as técnicas de rotulagem para estudar as células sanguíneas na circulação ocular. A aplicação de oftalmose de laser de varredura (SLO) tem uma grande vantagem ao estudar as células marcadas na circulação retiniana e coróide in vivo pela angiografia do fundo 26. Existem vários corantes fluorescentes, como ICG, laranja de acridina, FITC, fluoresceína de sódio e CFDA que são utilizados para estudar os leucócitos na circulação da retina por SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . A fototoxicidade e a carcinogenicidade da laranja de acridina 26 , 27 , a interferência da FITC com a atividade celular e a exigência de um agente de contraste intravascular para a resolução dos vasos sanguíneos retinianos e coroidais limitam sua aplicação em experiências com animais in vivo 29 . A fluoresceína de sódio e o ICG são não tóxicos, aprovados pela Food and Drug Administration e seguros para testes em seres humanos 32 , 35 . A maioria dos estudos dinâmicos de fluxo estão relacionados à rotulagem dos leucócitos ou eritrócitos e sua visualização nos vasos sanguíneos da retina e coróide 36 , 37 , 38 , 39

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Os protocolos de animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal de SingHealth, em Cingapura e estão de acordo com as diretrizes da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o Uso de Animais em Oftálmica e Visão Pesquisa.

1. Rotulagem de eritrócitos e leucócitos com corantes fluorescentes

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare ICG (1,5 mg / mL) dissolvendo 3 mg de ICG em 1800 μL de água destilada esterilizada. Adicione 200 μL de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS).
    2. Preparar 40% 1x PBS adicionando 4 mL de 1x PBS a 6 mL de água destilada esterilizada. Prepare 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por adição de 100 mg de BSA a 10 mL de 1x PBS. Misture bem até que a BSA seja dissolvida.
  2. Isolamento de eritrócitos e leucócitos usando centrifugação por gradiente de densidade
    1. Anestesiar os camundongos (tipo selvagemPe C57BL / 6) usando uma combinação de cloridrato de cetamina (50 mg / kg) e cloridrato de xilazina (0,5 mg / kg) (de acordo com o cronograma 1, de acordo com as diretrizes ARVO). Confirme a anestesia por reflexo de retirada do pedal ( isto é , pitada do dedo do pé).
    2. Insira lentamente a agulha de calibre 29 (anexada a uma seringa de 1 mL) em um ângulo costal direcionado ao coração. Para confirmar que a agulha está dentro do coração, retire o êmbolo ligeiramente e verifique se o sangue é retirado para dentro da seringa. Exsanguinate 0,8 - 1 mL de sangue diretamente do coração.
    3. Transfira imediatamente o sangue para um tubo de coleta de sangue contendo ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) (1,8 mg / ml de sangue) e misture suavemente para evitar a coagulação do sangue.
    4. Eutanizar os camundongos administrando pentobarbital (80 mg / kg) por injeção intraperitoneal.
    5. Coloque o sangue inteiro em cima de uma solução de polissonídeos e diatrizoato de sódio (razão 1: 1, densidade 1,077 g / mL) num tubo de microcentrífuga de 2 mL e centri(450 xg, 30 min) para permitir a separação dos leucócitos e eritrócitos do plasma.
    6. Remova e descarte o sobrenadante (plasma) usando uma pipeta. Transmita cuidadosamente o revestimento buffy (leucócitos) e eritrócitos (camada de glóbulos vermelhos) em tubos novos e separados usando pipetas.
  3. ICG (1,5%) rotulagem de eritrócitos
    1. Lave os eritrócitos com 1x PBS para remover quaisquer contaminantes. Ressuspenda os eritrócitos em 1x PBS (1: 1) para produzir 50% de hematócrito. Alíquota 0,5 mL de 50% de hematócrito (~ 250 μL de eritrócitos embalados) em tubos de microcentrífuga. Centrifugar os eritrócitos (750 xg, 5 min) e descartar o sobrenadante.
    2. Adicione 200 μL de 40% 1x PBS aos eritrócitos granulados, misture bem e incube à temperatura ambiente durante 5 min. Adicione 100 μL de ICG (1,5 mg / mL) à suspensão de eritrócitos, misture suavemente invadindo o tubo e incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Adicionar 300 μL de 1x PBS e incubar a37 ° C numa incubadora de agitação durante 60 min.
    3. Centrifugar os eritrócitos transportadores (750 xg, 3 min) e ressuspender em 1 mL 1x PBS.
    4. Lave as células ~ 3 a 5 vezes com 1x PBS até o sobrenadante ficar limpo (passo 1.3.3). Após a última lavagem, decanta o sobrenadante e adiciona 1% de BSA PBS (1: 1) aos eritrócitos pre-inchados etiquetados para atingir um hematócrito a 50% (1,25 x 10 8 células / mL) de eritrócitos marcados com ICG.
  4. Rotina de fluorescência de sódio (1%) de leucócitos
    1. Depois de separar o revestimento buffy do sangue usando centrifugação em gradiente de densidade (do passo 1.2.6), lavar as células uma vez com 10 mL de 1x PBS por centrifugação a 450 xg durante 10 minutos para remover quaisquer contaminantes. Ressuspender o sedimento em 900 μL de 1x PBS.
    2. Adicionar 100 μL de fluoresceína de sódio a 10% a 900 μL da suspensão de leucócitos e incubar à temperatura ambiente durante 2 min. Lavar as células rotuladas três vezes com 10 mL de PBS 1X por centrifugaçãoNg (450 xg, 10 min). Ressuspender as células em 100 μL de 1x PBS.

2. Imagem ao vivo de células com etiquetas fluorescentes

  1. Imagens de células vivas de eritrócitos marcados com ICG
    1. Para preparar células para injeção via veia da cauda ou rota retro-orbital, diluir o hematócrito de 50% de eritrócitos marcados com ICG em 10 vezes e 50 vezes com 1x PBS para produzir células de hematócrito a 5% e 1%, respectivamente.
    2. Coloque o mouse sob a luz infravermelha (intensidade de 250W) por 5 minutos para permitir que a veia da cauda se dilate. Anestesiar o rato com cloridrato de cetamina (50 mg / kg) e cloridrato de xilazina (0,5 mg / kg) através de injeção intraperitoneal (aqui, de acordo com o cronograma 1, de acordo com as diretrizes ARVO).
    3. Dilate cada pupila dos olhos com uma gota de 0,5% de tropicamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina.
    4. Coloque as lentes de contato sobre um olho para imagens. Use o gel oftálmico como meio para a imagem e para evitar secasS da córnea. Corrija a câmara de oftalmocoscopia de varredura a laser confocal (SLO) com +25 dioptrias para compensar a refração do olho do mouse.
    5. Coloque o mouse na plataforma de imagem SLO. Certifique-se de que a córnea do mouse está virada diretamente para a cabeça óptica da máquina SLO.
    6. Ligue o módulo de imagem. Usando o software do módulo de imagem associado, clique no botão "Novo Paciente" e adicione detalhes de identificação de animais, como número de etiqueta da orelha do mouse, data de nascimento, porcentagem de corante fluorescente e tipo de célula rotulada.
      1. Posicione o nervo óptico do animal no centro da tela de imagem ao manobrar o módulo de imagem. Usando o software do módulo de imagem associado, clique no botão "Adquirir" para tirar as imagens do fundo do infravermelho (IR) com a configuração de ângulo de 30 ° ou 15 °. Certifique-se de que o centro da retina, a pupila e o caminho óptico do laser estão alinhados para alcançar uma imagem de melhor qualidade.
    7. Pegue o vídeo ICG fundus.
      1. Ligue o filtro ICG (790 nm), ajuste a câmera para o modo de alta velocidade com a visão angular de 30 ° ou 15 ° e defina a intensidade ICG em 85 para todas as leituras para padronização. No painel de controle, clique no botão "Adquirir" para tirar o vídeo (controle de linha de base) em 8,8 / 15 quadros / s por 1 min.
    8. Coloque 100 μL de eritrócitos marcados com ICG em uma seringa de insulina anexada a uma agulha de calibre 30.
      1. Para a injeção através da via da veia da cauda, ​​insira o chanfro da agulha na veia da cauda. Confirme o acesso intravenoso, verificando a refluxo do sangue na seringa e injetar as células rotuladas na circulação.
      2. Para a injeção através da via retro-orbital, insira a agulha adjacente ao olho no espaço retro-orbitalE. Confirme o acesso retro-orbital, verificando o refluxo do sangue na seringa e injetar as células marcadas na circulação.
    9. Após a injeção, reposicione o mouse e pegue as imagens do fundo do IR (veja o passo 2.1.6.1) e o vídeo usando o filtro ICG (veja o passo 2.1.7.1). As células rotuladas na circulação da retina podem ser visualizadas imediatamente após a injeção das células.
    10. Depois de adquirir os quadros de vídeo, extraie imagens .tiff das sequências de vídeo, escolhendo o formato .tiff ao exportar o vídeo usando o software do módulo de visualização SLO. Salve os arquivos em uma pasta desejada.
    11. Remova a lente de contato, coloque-a sobre o outro olho e complete a imagem conforme descrito nas etapas 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Após a imagem, coloque o animal anestesiado sob a luz infravermelha (250W) para manter a temperatura corporal até que ele se recupere da anestesia. Quando o animal estiver totalmente recuperado, coloque o mouse de volta na gaiola de retenção.
  2. Imagem de células vivas de 1% de leucócitos marcados com fluoresceína de sódio
    1. Prepare o mouse e configure o instrumento conforme descrito na seção 2.1.
    2. Posicione o mouse e tire as imagens do fundo do IR conforme descrito nas etapas 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Obtenha o angiograma de fluoresceína do mouse usando o filtro de fluoresceína (488 nm) com o modo de câmera de alta velocidade com ângulo de 30 ° ou 15 ° e intensidade de fluoresceína em 85 para todas as leituras para padronização. Grave o vídeo (controle de linha de base) em 8.8 / 15 quadros / s (veja o passo 2.1.7.1).
        NOTA: Aqui, várias faixas de vídeos (vídeos de 1 min) foram adquiridas em diferentes intervalos de tempo.
    3. Injete leucócitos marcados com 100 μL no mouse através da veia da cauda ou injeção retro-orbital como descrito na seção 2.1.8.
    4. Imediatamente após a injeção, posicione o mouse e tire as imagens do fundo do IR (veja as etapas 2.1.5 e 2.1.6) e o fluoAngiograma rescein do mouse (ver seção 2.2.2).
    5. Observe as células rotuladas na retina ou nos vasos sanguíneos coroidais ajustando o ponto focal do laser de varredura girando o botão de focagem no módulo de imagem.
    6. Adquira os quadros de vídeo e as imagens usando o software do módulo de visualização SLO (veja a etapa 2.1.10) e guarde-o na pasta desejada.
    7. Após o procedimento, siga o passo 2.1.12 para cuidar de animais.
  3. Análise de imagem por software MtrackJ
    1. Abra a sequência da imagem no ImageJ clicando em "Arquivo". Selecione "Importar" e escolha "Seqüência de imagens", selecione a pasta de imagem desejada e clique em "Abrir". Uma janela pop-up chamada "Opções de Seqüência" aparecerá na tela. Clique em "Ok"; A seqüência da imagem será aberta.
    2. Defina o intervalo de quadros do vídeo da imagem clicando em "Imagem" e selecione "Propriedades" para medições de velocidade. Aqui, é 8.8 framEs / s.
    3. Abra o plugin MTrackJ selecionando "Plugins". Selecione "Rastreamento" e selecione "MtrackJ". Um menu deve aparecer.
    4. Para ajustar as configurações de rastreamento, selecione "Rastreamento" (no menu) e marque a caixa "Mover para o próximo índice de tempo após o ponto de adição".
    5. Acompanhe a primeira célula.
      1. Localize uma célula e rastreie a mesma célula em quadros subseqüentes. No menu, clique em "Adicionar" para adicionar uma nova faixa.
      2. Passe o cursor sobre a imagem (+ sinal) e clique na célula apropriada.
        NOTA: O MTrackJ irá automaticamente para o próximo período de tempo e adicionará um pequeno círculo, marcando a posição do primeiro ponto na trajetória.
      3. Continue clicando na posição atual da célula enquanto se desloca através dos quadros da seqüência da imagem.
        NOTA: Ocasionalmente, os círculos que marcam os pontos anteriores na trajetória interferem na capacidade de visualizar a localização atual. Se isso ocorrer,Avance para a etapa 2.3.5.3.1.
        1. Altere a opção de exibição para a trajetória clicando em "Exibição" no menu e selecionando a opção "exibir apenas pontos de trilha na hora atual". Para ver todas as trajetórias, desmarque essa opção.
      4. Continue clicando até que a trajetória da primeira célula seja vista. Em seguida, guarde a faixa clicando em "Salvar".
    6. Acompanhe a segunda célula.
      1. No menu, clique em "Adicionar" para iniciar uma nova faixa. Repita as etapas 2.3.5.1 - 2.3.5.4 para rastrear a nova célula. Clique em "Salvar" para salvar a segunda faixa.
      2. Continue estas etapas para todas as células rastreáveis ​​observadas. Depois de rastrear as células, clique em "Medir" e "OK" na guia do menu para obter os resultados.
        NOTA: Uma janela de resultados se abre automaticamente, que pode ser salva e aberta em uma planilha para posterior análise.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Os eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram visualizados na circulação da retina de ratinhos C57BL / 6J (tipo selvagem). Tanto o hematócrito de 1% como o de 5% de eritrócitos marcados com ICG a 1,5% foram distinguíveis na circulação da retina. No entanto, as células rotuladas individuais foram mais claramente visualizadas com 1% de hematócrito de 1,5% de eritrócitos marcados com ICG ( Figura 1 ). Em 5% de hematócrito, devido ao grande número de células marcadas nos vasos da retina, não foi possível marcar a célula individual. Observou-se eritroostasia na região peripapilar em ambas as condições, mas foi mais proeminente no hematócrito de 5% de eritrócitos marcados ( Figura 2 ).

Os leucócitos foram marcados com sucesso com 1% de fluoresceína de sódio seguindo o protocolo acima e foram visualizados como células marcadas verdes usando a microscopia fluorescente ( Class = "xfig"> Figura 3). Pequenos aglomerados de células (4 a 5 células em conjunto) também foram observados em amostras marcadas. Quando as células foram injetadas na circulação do mouse, os leucócitos marcados foram visualizados na circulação da retina ( Figura 4 ). Após a rotulagem, ambos os eritrócitos e leucócitos foram imediatamente injetados nos camundongos e visualizados a intervalos de tempo de 30 e 60 minutos. As células rotuladas de forma fluorescente foram observadas imediatamente após a injeção, mas as intensidades de fluorescência diminuíram gradualmente aos intervalos de tempo de 30 e 60 min. Também usamos o protocolo de coloração de leucócitos (1% de fluoresceína de sódio) nos eritrócitos e não observamos rotulagem dos eritrócitos. Usando o plugin Mtrack J no software de domínio público Image J, as células foram rastreadas na circulação da retina ( Figura 5 ).

95 / 55495fig1.jpg "/>
Figura 1 : Hematócrito de 1% de Erythrocytes com ICG de 1,5% na Circulação Retinal. Os eritrócitos individuais rotulados por ICG exibem sinais brilhantes nos vasos retinianos. Observou-se eritromostase na região peripapilar. Escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2 : Hematócrito de 5% de Erythrocytes com ICG de 1,5% na Circulação Retinal. Muitos eritrócitos marcados com ICG apresentando sinais brilhantes nos vasos retinianos; Uma grande quantidade de eritroostasia foi observada na região peripapilar. Escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3
Figura 3 : Imagem de Microscopia de Fluorescência de Leucócitos Etiquetados com Fluoresceína de Sódio a 1%. Leucócitos marcados com fluoresceína de sódio que mostram sinais fluorescentes verdes com pequenas aglomerações (ampliação 20X, escala = 50 μm). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 4
Figura 4 : Leucócitos com 1% de Fluoresceína de Sódio em Circulação Retinal. Leucócitos marcados com fluoresceína de sódio (seta) mostrando sinal brilhante nos vasos retinianos. Escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 5
Figura 5 : Rastreamento de células individuais rotuladas na circulação de retina usando o software de análise de imagem. Diferentes faixas (círculos coloridos e linhas representadas na imagem) foram medidas para calcular a velocidade média das células marcadas na circulação da retina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Estudar a hemodinâmica na circulação retiniana e coróide é vital para a compreensão da fisiopatologia de muitas doenças oculares. A dinâmica do fluxo sanguíneo na circulação da retina pode ser estudada por tomografia de coerência óptica de domínio de Fourier (FD-OCT), fluxografia de speckle laser (LSFG) e oximetria retiniana. Embora estes métodos utilizem diferentes abordagens para estudar o fluxo sanguíneo total na circulação da retina 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , compartilham a limitação da incapacidade de estudar a dinâmica do fluxo de tipos de células individuais. Os nutrientes e o fornecimento de oxigênio aos tecidos retinianos e coroides, bem como a migração de células imunes em doenças inflamatórias oculares e seu papel na patogênese da doença, podem ser estudados investigando a dinâmica do fluxo de erYtiócitos e leucócitos na circulação retiniana e coróide, respectivamente. As técnicas de rotulagem combinadas com métodos de imagem ajudarão a rastrear as células rotuladas na circulação e a estudar a dinâmica do fluxo das células rotuladas. Vários corantes fluorescentes foram aplicados com sucesso para rotular os leucócitos e os eritrócitos para investigar sua dinâmica de fluxo na circulação 3 , 17 , 18 , 19 .

Aqui, relatamos a aplicação de corantes fluorescentes não tóxicos aprovados pela Food and Drug Administration, indocyanina verde e fluoresceína de sódio, para a rotulagem e visualização dos eritrócitos e leucócitos na circulação da retina, respectivamente. Embora a fluoresceína de sódio seja o corante mais utilizado para o rastreamento dos leucócitos 31 , 32 , 33 34 34 , a vantagem de marcar simultaneamente eritrócitos e leucócitos com ICG e fluoresceína de sódio, respectivamente, é uma visualização eficiente de células marcadas simultaneamente no olho do animal, alterando os filtros no SLO. O SLO é um método não-invasivo de imagem da retina que é amplamente utilizado no estudo de alterações patológicas em várias doenças da retina em seres humanos e animais. Também pode ajudar a comparar as alterações da retina em resposta a um determinado tratamento 46 .

Para obter imagens de qualidade no SLO, as pupilas precisam ser completamente dilatadas e as lentes de contato devem ser usadas com gel oftálmico para manter uma córnea úmida e prevenir a formação de catarata. A posição dos olhos e o caminho óptico da câmera devem ser diretos para obter imagens de fundo e angiograma de qualidade. O animal deve ser profundamente sedado para minimizar o movimento durante a imagem. Embora tanto 1% como 5% de hematócrito de 1,5% ICGOs eritrócitos marcados demonstraram a visualização de células marcadas com fluorescência na circulação da retina, 1% de hematócrito foi mais adequado para monitorar as células individuais. As células rotuladas de forma fluorescente não podem ser visualizadas se o número de leucócitos injetados for muito baixo. Portanto, para obter melhores resultados no monitoramento das células rotuladas na circulação da retina, recomenda-se coletar leucócitos de pelo menos 4 ratos, rotular com 1% de fluoresceína de sódio e injetar em um único mouse. Embora existam alguns corantes alternativos para a fluoresceína de sódio (Calcein, FITC, DIO, FDA e CFDA com máximos de absorção / emissão semelhantes ou perto de fluoresceína de sódio), a taxa de retenção de corantes e a toxicidade para os tecidos oculares devem ser avaliadas 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

A limitação da técnica relatada é aDesvanecimento do sinal fluorescente em circulação após 60 min. Portanto, a dinâmica do fluxo das células rotuladas deve ser analisada dentro de 60 min. Aqui, para rotular leucócitos, o sangue foi retirado de um mouse, as células foram isoladas, rotuladas, injetadas em outro mouse e visualizadas pela SLO. No entanto, em SLO, apenas 0 a 1 célula por quadro foi observada nos vasos sanguíneos da retina. Isso pode ser devido ao número insuficiente de células leucocitárias e, portanto, recomendamos coletar sangue de pelo menos 3 a 4 ratos para visualizar um número de células mais alto por quadro. A velocidade da câmera de 8,8 quadros / s foi utilizada no estudo, mas isso pode ser aumentado para obter mais imagens seqüenciais e vídeos das células rotuladas.

Estudos anteriores relataram mudanças na velocidade do fluxo sanguíneo na circulação retiniana de pacientes diabéticos com diferentes estádios de DR. Clermont et al. Relataram uma diminuição de 33% do fluxo sanguíneo da retina em pacientes com estágio inicial da DR 47 e Nguyen etAl. Relataram aumento do fluxo sanguíneo da retina em pacientes diabéticos com DR proliferativo 48 . Uma velocidade diminuída da circulação sanguínea também foi relatada como associada ao glaucoma progressivo 49 . Nos estudos acima mencionados, os autores investigaram as velocidades do fluxo sanguíneo total na circulação da retina. Estudar as velocidades de fluxo de cada tipo de célula pode fornecer informações sobre as interações celulares em diferentes doenças e em diferentes estádios da doença e podem ajudar no prognóstico. Aqui relatamos um método para rotular os eritrócitos e leucócitos com ICG e fluoresceína de sódio, respectivamente, e sua visualização na circulação da retina; Este método pode ser aplicado em qualquer modelo de doença para estudos in vivo .

Pesquisas futuras podem utilizar nossas técnicas de rotulagem usando SLO para estudar a variação na dinâmica de fluxo dos eritrócitos e leucócitos marcados sob diferentes condições de tratamento de drogasEm vários estágios da doença. Além disso, nossos métodos podem ajudar a compreender o papel dos eritrócitos e leucócitos nos fenótipos da doença.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar. Não há conflito financeiro ou financeiro.

Acknowledgements

O projeto de pesquisa foi financiado pela bolsa do New Investigator do National Medical Research Council (NMRC), em Cingapura. A equipe gostaria de reconhecer o treinamento de pesquisa fornecido ao Dr. Agrawal no Instituto de Oftalmologia (IOO), University College London (UCL) sob a Associação de Treinamento de Pesquisa no Exterior do National Research Research (NMRC) de novembro de 2012 a outubro de 2014 sob orientação do Prof. David Shima. O Dr. Agrawal adquiriu o conceito e habilidades para rotular as células e imagens em vivo no laboratório do Dr. Shima. Por conseguinte, a equipe gostaria de reconhecer supervisão e orientação durante a bolsa de treinamento do Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh e Dr. Daiju Iwata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101, (10), 1716-1726 (1994).
  2. Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent labels when used for cell migration. J Fluoresc. 23, (5), 975-987 (2013).
  3. Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, (6), 499-508 (1999).
  4. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  5. Nowak, J. Z. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacol Rep. 58, (3), 353-363 (2006).
  6. Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, (13), 1227-1239 (2012).
  7. Rannie, G. H., Thakur, M. L., Ford, W. L. An experimental comparison of radioactive labels with potential application to lymphocyte migration studies in patients. Clin Exp Immunol. 29, 509-514 (1977).
  8. Ford, W. L. The preparation and labeling of lymphocytes. Handbook of Experimental Immunology. 3, Blackwell Scientific Pubs. Oxford. (1978).
  9. Weston, S. A., Parish, C. R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies: Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy. J Immunol Meth. 133, 87-97 (1990).
  10. Brenan, M., Parish, C. R. Intracellular fluorescent labeling of cells for analysis of lymphocyte migration. J Immunol Meth. 74, 31-38 (1984).
  11. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  12. DeClerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leukocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. J Immunol Meth. 172, 115-124 (1994).
  13. Chiba, K., et al. FTY720, a novel immunosuppressant, induced sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. I. FTY720 selectively decreases the number of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing. J Immunol. 160, 5037-5044 (1998).
  14. Butcher, E. C., Weissman, I. L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. J Immunol Meth. 37, 97-108 (1980).
  15. Butcher, E. C., Scollay, R. G., Weissman, I. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. II. Potential application to studies of lymphocyte migration and maturation. J Immunol Meth. 37, 109-121 (1980).
  16. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Meth. 171, 131-137 (1994).
  17. Unthank, J. L., Lash, J. M., Nixon, J. C., Sidner, R. A., Bohlen, H. G. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 45, 193-210 (1993).
  18. Slezak, S. E., Horan, P. K. Fluorescent in vivo tracking of hematopoietic cells. Part I. Technical considerations. Blood. 74, 2172-2177 (1989).
  19. Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: The migration of PKH-labeled lymphocytes. Cell Immunol. 134, 157-170 (1991).
  20. Johnsson, C., Festin, R., Tufveson, G. T., Tötterman, T. H. Ex vivo PKH26-labeling of lymphocytes for studies of cell migration in vivo. Scand. J Immunol. 45, 511-514 (1997).
  21. Khalaf, A. N., Wolff-Vorbeck, G., Bross, K., Kerp, L., Petersen, K. G. In vivo labeling of the spleen with a red-fluorescent cell dye. J Immunol Meth. 165, 121-125 (1993).
  22. Albertine, K. H., Gee, M. H. In vivo labeling of neutrophils using a fluorescent cell linker. J Leukoc Biol. 59, 631-638 (1996).
  23. Samlowski, W. E., Robertson, B. A., Draper, B. K., Prystas, E., McGregor, J. R. Effects of supravital fluorochromes used to analyze the in vivo homing of murine lymphocytes on cellular function. J Immunol Meth. 144, 101-115 (1991).
  24. Manivannan, A., et al. Digital fundus imaging using a scanning laser ophthalmoscope. Physiol Meas. 14, 43-56 (1993).
  25. Okanouchi, T., Shiraga, F., Takasu, I., Tsuchida, Y., Ohtsuki, H. Evaluation of the dynamics of choroidal circulation in experimental acute hypertension using indocyanine green-stained leukocytes. Jpn J Ophthalmol. 47, (6), 572-577 (2003).
  26. Zdolsek, J. M., Olsson, G. M., Brunk, U. T. Photooxidative damage to lysosomes of cultured macrophages by acridine orange. Photochem Photobiol. 51, 67-76 (1990).
  27. Molnar, J., et al. Antiplasmid and carcinogenic molecular orbitals of benz[c]acridine and related compounds. Anticancer Res. 13, 263-266 (1993).
  28. Fillacier, K., Peyman, G. A., Luo, Q., Khoobehi, B. Study of lymphocyte dynamics in the ocular circulation: technique of labeling cells. Curr Eye Res. 14, (7), 579-584 (1995).
  29. Horan, P. K., et al. Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking. Methods Cell Biol. 33, 469-490 (1990).
  30. Hossain, P., et al. In vivo cell tracking by scanning laser ophthalmoscopy: quantification of leukocyte kinetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, (10), 1879-1887 (1998).
  31. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Visualization of retinal and choroidal blood flow with fluorescein leukocyte angiography in rabbits. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, (1), 27-31 (1997).
  32. Kim, J., Yang, Y., Shin, B., Cho, C. Visualization and flow of platelets and leukocytes in vivo in rat retinal and choroidal vessels. Ophthalmic Res. 29, (6), 374-380 (1997).
  33. Le Gargasson, J. F., et al. Scanning laser ophthalmoscope imaging of fluorescein-labeled blood cells. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 235, 56-58 (1997).
  34. Yang, Y., Kim, S., Kim, J. Fluorescent dots in fluorescein angiography and fluorescein leukocyte angiography using a scanning laser ophthalmoscope in humans. Ophthalmology. 104, (10), 1670-1676 (1997).
  35. Yannuzzi, L. A. Indocyanine green angiography: a perspective on use in the clinical setting. Am J Ophthalmol. 151, (5), 745-751 (2011).
  36. Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent labeling of blood cells for evaluation of retinal and choroidal circulation. Ophthalmic Surg Lasers. 30, (2), 140-145 (1999).
  37. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. J Neurosci. 34, (34), 11504-11513 (2014).
  38. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2, (2), (2015).
  39. Matsuda, N., et al. Visualization of leukocyte dynamics in the choroid with indocyanine green. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37, (11), 2228-2233 (1996).
  40. Wang, Y., Lu, A., Gil-Flamer, J., Tan, O., Izatt, J. A., Huang, D. Measurement of total blood flow in the normal human retina using Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Br J Ophthalmol. 93, (5), 634-637 (2009).
  41. Wang, Y., Fawzim, A., Tan, O., Gil-Flamer, J., Huang, D. Retinal blood flow detection in diabetic patients by Doppler Fourier domain optical coherence tomography. Opt Express. 17, (5), 4061-4073 (2009).
  42. Srinivas, S., Tan, O., Wu, S., Nittala, M. G., Huang, D., Varma, R., Sadda, S. R. Measurement of retinal blood flow in normal Chinese-American subjects by Doppler Fourier-domain optical coherence tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (3), 1569-1574 (2015).
  43. Sugiyama, T., Araie, M., Riva, C. E., Schmetterer, L., Orgul, S. Use of laser speckle flowgraphy in ocular blood flow research. Acta Ophthalmol. 88, (7), 723-729 (2010).
  44. Nakano, Y., Shimazaki, T., Kobayashi, N., Miyoshi, Y., Ono, A., Kobayashi, M., Shiragami, C., Hirooka, K., Tsujikawa, A. Retinal Oximetry in a Healthy Japanese Population. PLoS One. 11, (7), 0159650 (2016).
  45. Turksever, C., Orgul, S., Todorova, M. G. Reproducibility of retinal oximetry measurements in healthy and diseased retinas. Acta Ophthalmol. 93, (6), 439-445 (2015).
  46. Sharp, P. F., Manivannan, A., Xu, H., Forrester, J. V. The scanning laser ophthalmoscope-a review of its role in bioscience and medicine. Phys Med Biol. 49, (7), 1085-1096 (2004).
  47. Clermont, A. C., Aiello, L. P., Mori, F., Aiello, L. M., Bursell, S. E. Vascular endothelial growth factor and severity of nonproliferative diabetic retinopathy mediate retinal hemodynamics in vivo: a potential role for vascular endothelial growth factor in the progression of nonproliferative diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol. 124, (4), 433-446 (1997).
  48. Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16, (1), 25 (2016).
  49. Schumann, J., Orgül, S., Gugleta, K., Dubler, B., Flammer, J. Interocular difference in progression of glaucoma correlates with interocular differences in retrobulbar circulation. Am J Ophthalmol. 129, (6), 728-733 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics