ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Published 4/01/2017
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Biochemistry
 

Summary

यहाँ हम लेबल मुक्त मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि और नीले देशी पृष्ठ द्वारा उनके अलग होने के लिए प्रोटोकॉल, प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा के बाद प्रस्तुत करते हैं। इस विधि अलग प्रोटीन परिसरों में interactomes को हल करने में उपयोगी है।

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Pardo, M., Bode, D., Yu, L., Choudhary, J. S. Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling. J. Vis. Exp. (122), e55498, doi:10.3791/55498 (2017).

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Abstract

Introduction

कोशिकाओं में, सबसे प्रोटीन अस्थायी प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया के माध्यम से या स्थिर प्रोटीन विधानसभाओं के गठन से उनके कार्य करते हैं। प्रोटीन बातचीत की विशेषताओं को पूरी तरह से समझ कोशिकीय प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एपी एमएस) के साथ संयोजन में समानता शुद्धि सबसे अधिक आवेदन किया रणनीतियों देशी प्रोटीन बातचीत की पहचान करने से एक है। पिछले एक दशक में हासिल साधन क्षमताओं में महत्वपूर्ण सुधार इस दृष्टिकोण अत्यंत शक्तिशाली बना दिया है। यह ध्यान रखें कि बातचीत एपी एमएस प्रयोगों से पहचान चारा और preys के बीच प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष संघों का एक मिश्रण शामिल महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अक्सर प्रोटीन ही सेलुलर संदर्भ में कई अलग अलग परिसरों, विभिन्न जैविक भूमिका है हो सकता है में भाग लेने, और इसलिए interactors कि एपी एमएस द्वारा पहचाने जाते हैं विशिष्ट प्रोटीन विधानसभाओं या कार्यात्मक संस्थाओं का एक मिश्रण का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। यह प्राप्त करने के लिए संभव नहीं हैइस तरह के संस्थानिक जानकारी सरल एपी एमएस प्रयोगों द्वारा उत्पन्न प्रोटीन की मोनो आयामी सूची से एक प्रायोरी। हालांकि, तकनीक आगे इन विधानसभाओं को हल करने में एक या अधिक तरीकों के साथ संयोजित करके प्रोटीन परिसरों की वास्तुकला को परिभाषित करने के शोषण किया जा सकता।

आदेश एपी एमएस के माध्यम से पहचान प्रोटीन बातचीत के टोपोलॉजी को हल करने के लिए, कई रणनीतियों लागू किया गया है। एक दृष्टिकोण preys फँसाना चाहे 1 के रूप में प्रयोगों की एक पिछले चक्र में पहचान का उपयोग कर पुनरावृत्ति एपी एमएस प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए है। हालांकि बहुत जानकारीपूर्ण, यह काफी श्रम गहन कार्य दोनों प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक है। प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में क्रॉस-लिंकिंग तेजी से प्रोटीन परिसरों 2, 3, 4, 5 पर संस्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता जा रहा है। हालांकि, computatioपार से जुड़े पेप्टाइड्स के एनएएल विश्लेषण अभी भी एक चुनौती भरा काम रहता है और इसलिए कार्यप्रवाह में अड़चन है। MS-cleavable पार जोड़ने अभिकर्मकों के आगमन के एमिनो एसिड अवशेष है कि प्रोटीन 6, 7 बातचीत में निकट हैं की मैपिंग की सुविधा चाहिए। एक अन्य विकल्प पहले ओर्थोगोनल जुदाई तकनीक 8, 9 के साथ आत्मीयता शुद्धि गठबंधन करने के लिए है। जेल निस्पंदन या आयन एक्सचेंज, या सुक्रोज ढाल विभाजन द्वारा Chromatographic विभाजन भी हाल ही में एक सिस्टम-वाइड स्तर पर multiprotein परिसरों का वर्णन करने के द्वारा गुजर जटिल अलगाव कदम 10, 11, 12, 13 मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया है। ब्लू देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन-पृष्ठ) व्यापक रूप से लागू किया गया हैदेशी प्रोटीन बातचीत, आम तौर पर mitochondrial झिल्ली प्रोटीन परिसरों 14 से जुड़े उन की जांच। यह अलगाव तकनीक भी हाल ही में लेबल से मुक्त प्रोटीन मात्रा और सहसंबंध रूपरेखा, mitochondrial परिसरों 15, पर न केवल के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था 16, 17, लेकिन यह भी, पूरे कोशिकाओं 18 से 19 अन्य प्रोटीन परिसरों को उजागर करने के लिए। हम धारणा है कि बाद में देशी विभाजन दृष्टिकोण और मात्रात्मक एमएस के साथ आत्मीयता शुद्धि के संयोजन एक विशेष प्रोटीन युक्त कई प्रोटीन विधानसभाओं के समाधान के लिए एक उपयोगी रणनीति प्रदान करना चाहिए।

यहाँ हम एक विधि है कि पृथक परिसरों के नीले देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ सामान्य एपीटोप आधारित आत्मीयता शुद्धि को जोड़ती है, मात्रात्मक बड़े पैमाने पर एसपी द्वारा पीछा किया वर्णनectrometry और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा, कई विधानसभाओं एक प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है हल करने के लिए। हम मूषक भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं जहां ब्याज की एक प्रोटीन एक एपीटोप टैग करने के लिए जुड़े हुए अंतर्जात ठिकाना से व्यक्त किया जाता है शारीरिक बहुतायत के करीब प्राप्त करने और कुशल देशी सुनिश्चित करने के लिए रोजगार जटिल अलगाव। यह दृष्टिकोण कई बातचीत unravels एक प्रोटीन में संलग्न है, उन्हें, उनके सह-संबंध प्रोफाइल के आधार पर अलग-अलग विधानसभाओं में हल करने पारंपरिक geLC-एमएस 20 से अधिक नहीं काम की आवश्यकता होती है, जबकि।

Protocol

फ्लैग संबंध शुद्धीकरण के अनुसार स्थानीय प्रोटीन परिसरों की 1. अलगाव

  1. तैयारी
    1. सेल गोली विगलन के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान सेट करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक microcentrifuge को ठंडा।
    3. विभिन्न आकार के कई microcentrifuge ट्यूब (1.5 एमएल, 15 एमएल) और बर्फ में एक homogenizer रखें।
    4. lysis बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 150 मिमी NaCl, 0.1% Nonidet पी 40, 1 मिमी EDTA) के 10 एमएल तैयार करें और बर्फ में रहते हैं। बस बफर उपयोग करने से पहले, 1 एम डीटीटी के 10 μL और EDTA मुक्त protease inhibitors के एक कुचले गोली जोड़ें।
  2. एंटीबॉडी से जुड़े मोती की तैयारी
    नोट: एंटीबॉडी में लिपटे मोतियों पहले से एक सप्ताह तक तैयार किया जा सकता है और फ्रिज में रखा जब तक की जरूरत है। अधिकांश प्रजातियों उपप्रकार immunoglobulin के लिए, खरगोश आईजीजी, जो प्रोटीन के लिए एक उच्च संबंध है के अलावा प्रोटीन जी प्रोटीन एक से अधिक संबंध है।
    1. धो 50 प्रोटीन जी लेपित चुंबकीय मोतियों की μL: स्थानांतरण 50 &# 956; एक microcentrifuge ट्यूब मनका घोल का एल, ट्यूब के किनारे पर मोती को इकट्ठा करने और तरल दूर करने के लिए चुंबक में ट्यूब जगह। पीबीएस-0.01% बीच 20 के 0.5 एमएल में मोती Resuspend।
    2. ट्यूब के किनारे पर मोती को इकट्ठा करने और तरल दूर करने के लिए चुंबक में ट्यूब रखें। पीबीएस-0.01% बीच 20 के 40 μL में मोती Resuspend। 10 माइक्रोग्राम (1 मिलीग्राम के 10 μL / एमएल शेयर समाधान) M2 विरोधी फ्लैग एंटीबॉडी की जोड़ें। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए रोटेशन के साथ सेते हैं।
    3. ट्यूब के किनारे पर मोती को इकट्ठा करने और तरल दूर करने के लिए चुंबक में ट्यूब रखें। पीबीएस-0.01% बीच 20 के 0.5 एमएल के साथ मोती धो लें।
    4. मोती के लिए एंटीबॉडी पार जोड़ने के लिए, 0.2 एम triethanolamine पीएच 8.2 से 1 एमएल के साथ दो बार मोती धोने। फिर, 0.2 एम triethanolamine पीएच 8.2 में 20 मिमी DMP (डाइमिथाइल pimelimidate) के 1 एमएल में मोती resuspend (DMP समाधान तुरंत उपयोग करने से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए)। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रोटेशन के साथ सेते हैं। चुंबक में ट्यूब रखें। तैरनेवाला निकालें और 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.5 से 0.5 एमएल में मोती resuspend। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रोटेशन के साथ सेते हैं।
    5. मोती पीबीएस-0.1% बीच 20 के 0.5 एमएल के साथ 3 बार धोएं। पिछले धोने में मोती छोड़ दो जब तक की जरूरत है।
  3. फ्लैग आधारित आत्मीयता शुद्धि
    नोट: समय की एक लंबी अवधि के लिए बफर के बिना मोती नहीं जा में ख्याल रखना। सभी बफ़र्स और ट्यूब हर समय बर्फ में रखा जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रोटोकॉल 2-5 x 10 8 कोशिकाओं से प्रोटीन परिसरों की शुद्धि (10-20 मिलीग्राम प्रोटीन lysate) एक फ्लैग-टैग प्रोटीन 20 के अंतर्जात स्तरों व्यक्त करने के लिए अनुकूलित है।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में सेल गोली पिघलना जब तक यह पिघल शुरू होता है। स्नान से बाहर ट्यूब ले लो, यह ज़ुल्फ़ धीरे जब तक गोली पूरी तरह thawed है, और तुरंत बर्फ पर सेल निलंबन युक्त ट्यूब जगह।
    2. बहुत ठंडा lysis बफर के 5 एमएल जोड़ेंसेल निलंबन और ज़ुल्फ़ के लिए (डीटीटी और प्रोटीज अवरोधकों से युक्त) मिश्रण करने। 10 मिनट के लिए बर्फ में सेते हैं।
    3. एक ठंडा Dounce homogenizer को lysate हस्तांतरण। साथ 20-30 स्ट्रोक तंग मूसल का उपयोग कर (जब तक वहाँ कोई ध्यान देने योग्य चिपचिपापन है) ल्य्से। ठंड microcentrifuge ट्यूब homogenate स्थानांतरण।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 18,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. एक साफ ठंड ट्यूब को मंजूरी दे दी lysate हस्तांतरण। lysate के 50 μL के पीछे छोड़ दें। प्रोटीन एकाग्रता को मापने और शुद्धि की निगरानी के लिए lysate के एक 35 μL विभाज्य है।
    6. मोती से पीबीएस-0.1% बीच 20 निकालें। lysate के 1 एमएल के साथ मोती Resuspend और lysate के बाकी के साथ मिश्रण। 1-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया में मिश्रण सेते हैं।
    7. चुंबक के साथ ट्यूब के किनारे पर मोती इकट्ठा। सतह पर तैरनेवाला के 30 μL विभाज्य को एकत्र करें और सतह पर तैरनेवाला के बाकी त्यागें। IPP150 बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 15 के 0.5 एमएल में मोती Resuspend0 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.1% एनपी 40) 4-6 बार pipetting द्वारा। एक 1.5 एमएल ठंड ट्यूब पर स्थानांतरण।
    8. IPP150 बफर दो बार के 0.5 एमएल के साथ धोने दोहराएँ।
    9. धो फ्लैग देशी क्षालन बफर (20 मिमी बीआईएस Tris पीएच 7, 20 मिमी NaCl, 0.02% Nonidet पी 40, 1 मिमी EDTA, 200 मिमी ε-aminocaproic एसिड) के 0.5 एमएल के साथ तीन बार मोती। पिछले धोने के साथ, एक नया ठंड ट्यूब को मोती हस्तांतरण। बफर अच्छी तरह से निकालें।
    10. देशी क्षालन बफर में 200 माइक्रोग्राम / एमएल 3x फ्लैग पेप्टाइड के 100 μL में मोती Resuspend। कोमल रोटेशन के साथ 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    11. चुंबक के साथ मोती को इकट्ठा करने और एक ठंडा नई ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
    12. दोहराएँ दो बार 1.3.10-1.3.11 कदम दूर है। सभी eluates पूल।
    13. eluate 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 XG पर एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट (10 केडीए नाममात्र आणविक भार सीमा कट, PES) centrifugation द्वारा में 25 μL करने के लिए नीचे ध्यान दें। एक नया ठंड ट्यूब को केंद्रित eluate हस्तांतरण और 50% glyce जोड़ने5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ROL। केंद्रित eluate 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है रातोंरात यदि आवश्यक हो।

2. ब्लू मूल निवासी पृष्ठ

  1. तैयारी
    1. 1x देशी पृष्ठ एनोड बफर, 1x देशी पृष्ठ डार्क ब्लू कैथोड बफर और 1x देशी पृष्ठ हल्का नीला कैथोड बफर के 1 एल तैयार करें।
    2. एक मिल में बना हुआ 3-12% देशी पृष्ठ जेल की कंघी निकालें और 1x देशी पृष्ठ डार्क ब्लू कैथोड बफर के साथ दो बार कुओं धो। 1x देशी पृष्ठ डार्क ब्लू कैथोड बफर के साथ कुओं भरें। चल टैंक में जेल सेट करें लेकिन कैथोड (अंदर) सदन के लिए डार्क ब्लू कैथोड बफर न जोड़ें।
  2. electrophoretic रन
    1. नमूना तैयार करें: eluate क्रमशः 1x के अंतिम सांद्रता और 0.005% के लिए 4x देशी नमूना लोड हो रहा है बफर के उचित मात्रा और 0.5% की जी-250 नमूना additive जोड़ने केंद्रित 25 μL करने के लिए।
    2. नमूना और देशी आणविक भार मार्कर लोड betwee एक खाली अच्छी तरह से छोड़नेउन्हें एन। लोड 10-20 सभी खाली कुओं में 1x देशी नमूना लोड हो रहा है बफर के μL।
    3. ध्यान से 1x देशी पृष्ठ डार्क ब्लू कैथोड बफर के 200 एमएल के साथ कैथोड (अंदर) चैम्बर भरें ताकि नमूनों को परेशान नहीं। 1x देशी पृष्ठ एनोड बफर के 550 एमएल के साथ एनोड (बाहर) चैम्बर भरें।
    4. 30 मिनट के लिए 150 वी पर जेल चलाएँ। रन बंद करो, एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ डार्क ब्लू कैथोड बफर हटाने और 1x हल्का नीला कैथोड बफर के साथ बदलें। 60 मिनट के लिए रन जारी रखें। जेल सी कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री पर चलाया जा सकता है; तापमान प्रोटीन जटिल संरचना पर एक प्रभाव हो सकता है।
  3. जेल धुंधला
    1. जेल कैसेट खोलें और कैसेट प्लेटों में से एक त्यागें। जेल अन्य कैसेट थाली में जुड़ा रहता। एक ट्रे या गोदाम पर्याप्त बंधक समाधान (40% मेथनॉल, 2% एसिटिक एसिड) जेल को कवर और कोमल झटकों के साथ 30 मिनट के लिए सेते हैं युक्त में जेल में स्थानांतरित करें।
    2. बंधक solut निकालेंआयन और जेल को कवर करने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें। जेल भविष्य में संदर्भ के लिए स्कैन किया जा सकता।

3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

नोट: सभी बाद के चरणों लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए यदि संभव हो तो नमूनों की सफाई सुनिश्चित करने के। सभी समाधान HPLC ग्रेड पानी के साथ तैयार रहना चाहिए। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगशाला कि बाहर विश्लेषण ले जाएगा के साथ इस प्रोटोकॉल पर चर्चा करें।

  1. तैयारी
    1. अपशिष्ट इकट्ठा करने के लिए एक और 96-अच्छी तरह प्लेट के ऊपर एक शंक्वाकार नीचे 96-अच्छी तरह थाली रखें। पियर्स एक 21 जी सुई के साथ शंक्वाकार नीचे 96-अच्छी तरह थाली के कुओं के नीचे।
    2. छिद्रित 96-अच्छी तरह थाली के कुओं धो लें।
      1. 50% acetonitrile-0.25% फार्मिक एसिड के 200 μL छिद्रित प्लेट के कुओं में जोड़े। 10 मिनट के लिए एक शेकर में थाली ढेर सेते हैं।
      2. 1 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र ताकि तरल अपशिष्ट संग्रह थाली में छेद के माध्यम से बहती है। डब्ल्यू त्यागेंaste तरल।
      3. चरणों को दोहराएँ 3.1.2.1-3.1.2.2 दो बार।
      4. 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 150 μL से छेद 96-अच्छी तरह थाली के कुओं भरें (हाल में किए गए)।
    3. एक केन्द्रापसारक निस्पंदन 96-अच्छी तरह थाली के कुओं धो लें।
      1. केन्द्रापसारक निस्पंदन प्लेट के नीचे एक सामान्य 96-अच्छी तरह थाली जगह अपशिष्ट इकट्ठा करने के लिए। 50% acetonitrile-0.25% फार्मिक एसिड के 200 μL केन्द्रापसारक निस्पंदन थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें।
      2. 1 मिनट के लिए 200 XG पर थाली ढेर अपकेंद्रित्र। अपशिष्ट त्यागें।
      3. चरणों को दोहराएँ 3.1.3.1-3.1.3.2 दो बार।
  2. जेल छांटना और में जेल पाचन
    नोट: जेल excising के दौरान, की पहचान करने और जेल टुकड़ा प्रोटीन मानकों से प्रत्येक के लिए गठबंधन किया है उसे नोट करें। प्रोटीन मानकों सब जेल स्लाइस के लिए अनुमानित आणविक वजन अनुमान किया जा सकता है।
    1. एक साफ सतह पर कांच की प्लेट के साथ जेल रखें। स्लाइस लेन शामिल48 समान स्लाइस (1.5 मिमी x 5 मिमी) में नमूना ing। 2-3 छोटे टुकड़ों (जेल के शीर्ष पर पिछले पांच स्लाइस को छोड़कर) में प्रत्येक टुकड़ा काटें और छिद्रित में से एक अच्छी तरह से में प्रत्येक टुकड़ा क्रमिक रूप से जगह है और 96-अच्छी तरह प्लेट धोया।
    2. acetonitrile के 50 μL प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। 30-60 मिनट के लिए मिलाते हुए साथ थाली सेते हैं। कदम 3.1.2.2 में के रूप में centrifugation द्वारा तरल निकालें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट में 2 मिमी TCEP के 200 μL जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिलाते हुए साथ थाली सेते हैं। कदम 3.1.2.2 में के रूप में centrifugation द्वारा तरल निकालें।
    4. 200 μL प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट में iodoacetamide 4 मिमी की जोड़ें। अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मिलाते हुए साथ थाली सेते हैं। कदम 3.1.2.2 में के रूप में centrifugation द्वारा तरल निकालें।
    5. 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के 150 μL प्लस acetonitrile के 50 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिलाते हुए साथ थाली सेते हैं। इस धोने कदम एक दोहराएँजब तक सभी नीले रंग जेल टुकड़े से निकाल दिया जाता के रूप में आवश्यक कई बार है।
    6. शुद्ध acetonitrile के 200 μL जोड़कर जेल टुकड़े निर्जलीकरण और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिलाते हुए जब तक जेल टुकड़े सफेद और अपारदर्शी हैं साथ सेते हैं। acetonitrile निकालें।
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ठंड 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट में 0.001 मिलीग्राम / ट्रिप्सिन की एमएल (अनुक्रमण ग्रेड) के 150 μL जोड़ें। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ थाली सेते हैं। 1 घंटे बाद, जांचें कि जेल टुकड़े तरल के साथ कवर कर रहे हैं; अगर ऐसा नहीं होता है, 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट का एक और 50-100 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के बाद, रात भर 25 डिग्री सेल्सियस पर पाचन जारी है।
    8. जेल युक्त थाली के तहत एक साफ शंक्वाकार नीचे प्लेट रखें, प्लेटों के सही ओरिएंटेशन सुनिश्चित। तरल 1 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा पेप्टाइड्स युक्त इकट्ठा।
    9. एक केन्द्रापसारक वाष्पक में पेप्टाइड्स युक्त प्लेट में रखें और जब टी प्रदर्शन तरल लुप्त होवह अगले कदम।
    10. 50% acetonitrile-0.25% फार्मिक एसिड के 150 μL जेल टुकड़े में जोड़े। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ सेते हैं।
    11. तरल 1 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा कदम 3.2.9 से आंशिक रूप से सूखे की थाली में एकत्र। जबकि अगले कदम के प्रदर्शन पेप्टाइड्स युक्त थाली evaporating जारी रखें।
    12. दोहराएँ 3.2.10-3.2.11 कदम दूर है।
    13. शुद्ध acetonitrile के 200 μL जेल टुकड़ों से युक्त थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिलाते हुए साथ सेते हैं।
    14. 1 मिनट के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा पेप्टाइड्स युक्त थाली में तरल इकट्ठा।
    15. सुनिश्चित करें कि सभी कुओं में acetonitrile के अंतिम एकाग्रता 55% से अधिक है सुनिश्चित करें। यदि आवश्यक हो, अतिरिक्त शुद्ध acetonitrile जोड़ें।
    16. धोया केन्द्रापसारक निस्पंदन थाली में पेप्टाइड समाधान में स्थानांतरित करें। एक साफ शंक्वाकार नीचे प्लेट इसे नीचे रखें पेप्टाइड्स इकट्ठा करने के लिए। 1 मिनट के लिए 200 XG पर थाली ढेर अपकेंद्रित्र।
    17. Evaporजब तक कुओं पूरी तरह से सूख रहे हैं शंक्वाकार नीचे थाली में तरल खा लिया। प्लेट एक सिलिकॉन ढक्कन के साथ कवर किया और इस स्तर पर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    18. जोरदार 15 मिनट के लिए मिलाते हुए के साथ 0.5% फार्मिक एसिड के 32 μL में पेप्टाइड्स फिर से भंग। 400 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट के 8 μL जोड़ें और जोरदार 15 मिनट के लिए मिलाते हुए साथ सेते हैं। 1 मिनट के लिए 200 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। एक सिलिकॉन ढक्कन के साथ कवर और -20 डिग्री सेल्सियस मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण जब तक पर थाली की दुकान।
  3. जन स्पेक्ट्रोमेट्री
    ध्यान दें: एक उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर बन्दूक प्रोटिओमिक्स के साथ संगत तरीकों का उपयोग कर स्पेक्ट्रोमीटर पर पेप्टाइड्स का विश्लेषण करें। डाटा निर्भर अधिग्रहण सबसे अधिक इस्तेमाल किया नियंत्रण रेखा-मिलकर एमएस सेट अप विश्लेषण के इस प्रकार के लिए है और कुशल पेप्टाइड पहचान के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, पृष्ठभूमि आवाज पर अनावश्यक अनुक्रमण और उम्मीदवार चयन को कम करने। पहले चरण में बड़े पैमाने पर विश्लेषण स्कैन (MS1) में जन स्पेक्ट्रा प्रोफ़ाइल मोड में दर्ज किया जाना चाहिए। यह सुझाव देते हैंएड को प्राथमिकता दूसरे चरण में बड़े पैमाने पर विश्लेषण (MS2) के लिए दोगुना और triply आयनों का आरोप लगाया चयन करने के लिए। मीटर / z 400-1,600 के एक बड़े पैमाने पर सीमा 8-30 अमीनो एसिड रेंज के बीच सबसे पेप्टाइड्स की पहचान के लिए उपयुक्त है। इधर, एक Orbitrap जन स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है।
    1. एक nanoLC-एमएस / एमएस प्रणाली के स्वत: नमूना का उपयोग कर विश्लेषण प्रति नमूना के 20 μL इंजेक्षन। फीका बनाना और C18 स्तंभ (100 सुक्ष्ममापी आईडी, 2 सेमी) एक रिवर्स चरण पर पेप्टाइड्स ध्यान केंद्रित।
    2. एक विश्लेषणात्मक C18 स्तंभ (75 सुक्ष्ममापी आईडी, 15 सेमी) 300 nl / मिनट 4-28% acetonitrile / 0.1% फार्मिक एसिड की एक 30 मिनट के रेखीय ग्रेडिएंट प्रयोग पर अलग पेप्टाइड्स।
    3. निम्नलिखित मानकों के साथ एक शीर्ष 10 डेटा निर्भर अधिग्रहण विधि के साथ एक जन स्पेक्ट्रोमीटर में पेप्टाइड्स विश्लेषण करें: एम / जेड रेंज 380-1,600, संकल्प 30,000 मीटर में / z 400, 2 गु के अलगाव चौड़ाई, 45 s के लिए ± 10 पीपीएम पर गतिशील बहिष्कार , स्वत: लाभ नियंत्रण लक्ष्य 1 x 10 6 एमएस के लिए और एमएस / एमएस, अधिकतम इंजेक्शन समय के लिए 5000 में एमएस के लिए 150 एमएस औरएमएस / एमएस के लिए 100 एमएस।

4. डेटा विश्लेषण

  1. प्रोटीन की पहचान और मात्रा MaxQuant का उपयोग कर
    1. स्वतंत्र रूप से उपलब्ध MaxQuant सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें मास स्पेक्ट्रोमेट्री कच्चे डेटा से प्रत्येक जेल अंश में पहचान करने और प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए।
      नोट: MaxQuant डेटा पर निर्भर अधिग्रहण बन्दूक प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न डेटा पर काम करता है। नीले देशी जेल भिन्न से एमएस डेटा अलग प्रयोगों के रूप में और एक प्रयोग सभी जेल स्लाइस के संयोजन के भिन्न के रूप में नहीं बैच में विश्लेषण किया जाना चाहिए। stoichiometry गणना करने iBAQ मूल्य बॉक्स को चेक करें। MaxQuant का उपयोग कर डेटाबेस खोज और प्रोटीन मात्रा के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, 22 21 में वर्णित हैं।
  2. प्रोटीन प्रोफ़ाइल Perseus का उपयोग कर विश्लेषण
    1. पहचान प्रोटीन के प्रवास प्रोफाइल प्रदर्शित करने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर Perseus का प्रयोग करें और का उपयोग कर उनकी तुलनासांख्यिकीय विश्लेषण।
      नोट: कैसे Perseus का उपयोग करने पर जनरल प्रलेखन http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials पर उपलब्ध है। एक नमूना डाटासेट पूरक डेटा के रूप में उपलब्ध है।
    2. proteingroups.txt प्रोटीन पहचान और सभी जेल भिन्न के लिए quantitation मूल्यों से युक्त MaxQuant विश्लेषण द्वारा लौटाए गए फ़ाइल अपलोड करें। मुख्य बॉक्स (चित्रा 1) में तीव्रता से पॉप्युलेट करें। एक मैट्रिक्स स्तंभों के रूप में जेल दशमलव वाले पंक्तियों की समस्त प्रोटीन पहचान युक्त, दिखाई देगा।
    3. हिट रिवर्स करने के लिए इसी प्रविष्टियों, प्रोटीन केवल फ़िल्टर पंक्तियों लटकती मेनू में स्पष्ट स्तंभ के आधार पर फ़िल्टर पंक्तियों (चित्रा 2) का चयन करके साइट और संभावित दूषित पदार्थों से पहचान निकालें।
    4. मानक के अनुसार लटकती मेनू में फूट डालो चुनकर, तत्पश्चात योग (चित्रा 3) द्वारा कुल प्रोटीन तीव्रता के खिलाफ प्रोफ़ाइल भर में प्रत्येक प्रोटीन के अंश तीव्रता सामान्य बनाते हैं। एक नया मीटरatrix प्रकट होता है।
    5. दृश्य ड्रॉप-डाउन मेनू (चित्रा 4) में प्रोफ़ाइल प्लॉट का चयन करके सभी प्रोटीन के प्रवास प्रोफ़ाइल भूखंडों प्रदर्शित करें।
    6. फ़िल्टर पंक्तियों लटकती मेनू में मान्य मूल्यों पर आधारित फ़िल्टर करें पंक्तियों। आवश्यक मान्य मान की संख्या में 1 दर्ज करें।
    7. क्लस्टरिंग / पीसीए लटकती मेनू में श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग का चयन करके सभी नीले देशी जेल अंशों भर में पहचान प्रोटीन की श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग निष्पादित करें। कॉलम पेड़ बॉक्स (चित्रा 5) को अनचेक करें। समूहों मैट्रिक्स (चित्रा 6) के बगल में क्लस्टरिंग टैब में एक ऊष्मा-मानचित्र में कल्पना कर रहे हैं।
    8. dendrogram में चारा प्रोटीन युक्त क्लस्टर का पता लगाएँ। क्लस्टर के अन्य घटक प्रोटीन चारा के साथ सह-पलायन का प्रतिनिधित्व करते हैं और इस कारण संभावित बातचीत प्रोटीन / एक ही परिसर के सब यूनिटों कर रहे हैं।

आकृति 1 r /> चित्र 1 Perseus डेटा अपलोड विंडो का स्क्रीनशॉट। आंकड़ा Perseus में प्रोटीन की पहचान और मात्रात्मक डेटा लोड करने के लिए चरणों का पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
दूषित पदार्थों के लिए इसी प्रविष्टियों में से छानने के लिए चित्र 2. Perseus खिड़की का स्क्रीनशॉट, हिट और प्रोटीन साइट से पहचान रिवर्स। स्पष्ट स्तंभ के आधार पर फ़िल्टर पंक्तियों का चयन प्रोटीन प्रविष्टियों के प्रकार के चयन के लिए एक नई विंडो डाटासेट से समाप्त किया जा करने के लिए खुलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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3. Perseus सामान्य खिड़की का स्क्रीनशॉट चित्र। सामान्यीकरण मेनू में फूट डालो का चयन विभिन्न विकल्पों के साथ एक नई विंडो, खुल जाता है। बीमा राशि का चयन सभी भिन्न भर में है कि प्रोटीन की कुल तीव्रता से प्रत्येक अंश में एक प्रोटीन की तीव्रता मूल्य बिताते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. Perseus प्रवास प्रोफ़ाइल भूखंडों दिखा का स्क्रीनशॉट। प्रोटीन प्रोफाइल नीचे मैट्रिक्स उनकी संगत प्रोफ़ाइल उजागर करने के लिए चुना जा सकता है। उपकरण पट्टी को संपादित करने और प्रोफाइल निर्यात करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्र 5. Perseus श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग खिड़की का स्क्रीनशॉट। आंकड़ा मैनहट्टन (एल 1) दूरी मीट्रिक का उपयोग प्रोटीन की श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग सेटिंग दिखाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. Perseus का स्क्रीनशॉट दिखा dendrogram और प्रोटीन तीव्रता हीटमैप। मुख्य पैनल के दाहिने हाथ की ओर कार्यप्रवाह हर कदम किए और परिणामस्वरूप मैट्रिक्स से पता चलता है, और किसी भी कदम पूर्ववत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। कार्यप्रवाह भी किसी भी मध्यवर्ती मैट्रिक्स से शाखा कर सकते हैं। इस च का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंigure।

  1. रिश्तेदार stoichiometry की गणना
    1. एक प्रोटीन चारा प्रोटीन के साथ उनके सह क्लस्टरिंग के आधार पर परिसर के सब यूनिटों का चयन करें और प्रोफ़ाइल शिखर (रों) उन्हें प्रदर्शित करने वाले परिसीमित।
    2. प्रत्येक अंश में प्रत्येक सबयूनिट के लिए MaxQuant विश्लेषण द्वारा दिया iBAQ मानों का उपयोग करें और उस अंश में इसी चारा iBAQ मूल्य द्वारा सामान्य बनाते हैं।
    3. चयनित चोटी के अंशों भर में चारा और प्रोटीन जटिल सब यूनिटों के लिए सामान्यीकृत iBAQs प्लॉट और रेखीय प्रतीपगमन लागू होते हैं। उनके सामान्यीकृत iBAQ मूल्यों की प्रवृत्तियों की तुलना द्वारा प्रलोभन जटिल सबयूनिट के रिश्तेदार राशि की गणना।
  2. प्रोटीन जटिल आकार का आकलन
    1. प्रोटीन मानकों का प्रयोग नमूना लेन से संरेखित नीले देशी जेल स्लाइस के लिए भविष्यवाणी की आणविक वजन की गणना करने के। इनमें से, वाई अक्ष में एक्स अक्ष में जेल स्लाइस और आणविक वजन की साजिश रचने से एक रेखीय प्रतिगमन मॉडल उत्पन्न करते हैं। प्रोटीन जटिल (ते) नीले देशी टुकड़ा (रों), जहां से वे पहचान की गई के आधार पर की प्रेक्षित आणविक भार रेंज अनुमान लगाने के लिए मॉडल का उपयोग करें।

Representative Results

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा समानता शुद्धि ब्लू देशी प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा के कार्यप्रवाह (एबीसी-एमएस) रणनीति चित्रा 7 में दिखाया गया है। ब्याज की एक प्रोटीन के आसपास मूल निवासी प्रोटीन परिसरों आत्मीयता शुद्धि एक एपीटोप टैग के विरुद्ध रोग का उपयोग कर (इस मामले फ्लैग में) और प्रतिस्पर्धी क्षालन द्वारा अलग कर रहे हैं। परिसरों बी एन-पृष्ठ द्वारा हल कर रहे हैं, और पूरे जेल लेन 48 वर्गों में excised है, और बन्दूक LC-एमएस / एमएस के लिए तैयार किया। मात्रात्मक एमएस जानकारी नीले देशी जुदाई भर में प्रत्येक पहचान प्रोटीन के लिए एक प्रवास प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रोटीन, जो कि बातचीत superimposable चोटियों के साथ एक अलग जटिल प्रदर्शन समान माइग्रेशन प्रोफाइल बनाने के लिए। ब्याज की एक प्रोटीन एक से अधिक विधानसभा में भाग लेता है जब, कई चोटियों, अपने प्रवास प्रोफ़ाइल में मनाया जाता है को देखते हुए उप परिसरों नीले देशी जेल के हल करने की शक्ति के भीतर हैं। मिग की एक व्यवस्थित तुलनाराशन प्रोफाइल प्रोटीन सहसंबंध श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग का उपयोग कर की रूपरेखा के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। Dendrogram और सभी भिन्न के लिए शिखर तीव्रता एक ऊष्मा-मानचित्र में कल्पना कर रहे हैं, प्रोटीन कि विशिष्ट प्रोटीन परिसरों के हैं (चित्रा 8) बातचीत की पहचान की सुविधा।

हम Mta2, Nurd क्रोमेटिन remodeling जटिल 20 के एक प्रमुख सबयूनिट की बातचीत भागीदारों का विश्लेषण करने के लिए इस रणनीति का प्रयोग किया। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 9, Mta2 के प्रवास प्रोफ़ाइल कम द्रव्यमान शिखर उच्च बहुतायत प्रदर्शित साथ 700 केडीए और 1.2 एमडीए के बीच अलग तीव्रता के दो चोटियों दिखाया गया है,। Mta1 / 3, Hdac1 / 2 और Mbd3 सहित अन्य Nurd कोर सब यूनिटों,, सब यूनिटों, अर्थात् Chd4 से कुछ के लिए समान जुदाई पैटर्न से पता चला है, चोटियों यद्यपि, Gatad2a / b और Rbbp4 / 7, उलटा बहुतायत वितरण किया था (चित्रा 9 ए, बी)। इसके विपरीत, CDK का प्रोफ़ाइल2ap1, एक नियामक पहलू यह है कि Wnt जीन प्रमोटरों से 23 Nurd जटिल भर्ती करता, केवल उच्च जन शिखर (चित्रा 9) दिखाया गया है, और इसलिए Sall4, एक ट्रांस्क्रिप्शनल repressor कि भी Nurd 20, 24, 25 बाध्य करने के लिए दिखाया गया है था। इस प्रकार, नीले देशी पृष्ठ द्वारा आत्मीयता शुद्ध Mta2 जुड़े प्रोटीन का विभाजन Nurd परिसर के दो अलग अलग रूपों को हल करने में सक्षम था।

एबीसी एमएस भी उन्हें विशेष प्रोटीन संस्थाओं के लिए बताए जबकि उपन्यास interactors की पहचान की अनुमति देता है। प्रोटीन समूहों और अंश तीव्रता एक ऊष्मा-मानचित्र में प्रतिनिधित्व की परीक्षा के माध्यम से हम Nurd सब यूनिटों और Wdr5, एमएलएल मिथाइल जटिल 26 की एक नियामक सबयूनिट, Wdr5 के साथ दो Nurd पी के साथ संपाती दो प्रवास चोटियों प्रदर्शित बीच एक मजबूत संबंध का पता चलाeaks (चित्रा 8), Wdr5 और Nurd के बीच एक उपन्यास बातचीत का सुझाव दे। हम सह प्रतिरक्षक अवक्षेपण और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 20 में सह-प्रवास से इस बातचीत की पुष्टि की।

श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग में दूरी मीट्रिक गणना की पसंद समूहों और इसलिए सह-संबंध के आकार को प्रभावित करती है। हम विभिन्न मीट्रिक के साथ प्रयोग करने की सलाह देते हैं प्रोटीन या ब्याज के परिसर के मौजूदा बातचीत ज्ञान के साथ सबसे अच्छा फिट प्राप्त करने के लिए। आम तौर पर हम मैनहट्टन (एल 1) दूरी मीट्रिक 20 के साथ सबसे अच्छा परिणाम हासिल। पियर्सन सहसंबंध या इयूक्लिडियन दूरी मैट्रिक्स भी वैकल्पिक विभाजन तकनीक 10, 11, 12 के आधार पर परिसरों की पहचान करने के लिए सूचित किया गया है।

क्वाननीले देशी अंशों से प्राप्त titative एमएस डेटा भी प्रोटीन परिसरों के stoichiometry निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। IBAQ (तीव्रता आधारित पूर्ण मात्रा) मूल्य पहचान प्रोटीन 27, 28 के रिश्तेदार बहुतायत का एक उपाय प्रदान करता है। एक प्रवास प्रोफ़ाइल शिखर के भीतर सभी भागों में प्रोटीन जटिल सदस्यों के लिए iBAQ मूल्यों चारा प्रोटीन सापेक्ष मात्रा प्राप्त करने के लिए की है कि सामान्यीकृत होते हैं। किसी दिए गए प्रोटीन जटिल सदस्य के लिए एक प्रोफ़ाइल शिखर भर में सामान्यीकृत iBAQs एक क्षैतिज प्रवृत्ति का पालन करना चाहिए, और प्रवृत्ति मूल्यों चारा प्रोटीन के सापेक्ष बातचीत प्रोटीन के stoichiometry को दर्शाते हैं। Stoichiometry गणना के एक अधिक विस्तृत प्रतिनिधित्व के लिए, 20 को देखते हैं।

चित्रा 7
चित्र 7: योजनाबद्ध कार्यप्रवाह का सारांश एबीसी एमएस रोंtrategy। यह आंकड़ा 20 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
चित्रा 8. Mta2 interactors के बी एन-पृष्ठ प्रवास प्रोफाइल के श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग। Mta2 जुड़े प्रोटीन उनके प्रवास प्रोफाइल के समानता के आधार पर संकुल रहे थे। केवल ऊष्मा-मानचित्र Nurd जटिल युक्त का एक सबसेट दिखाया गया है (नीले बॉक्स में संलग्न)। पीले बॉक्स Nurd परिसर के साथ Wdr5 की मजबूत संबंध पर प्रकाश डाला गया। एनोटेट आणविक भार एक ही जेल में चलाने के प्रोटीन मानकों के प्रवास दूरी से अनुमान था। इस शोध मूल रूप से जैव रसायन और मो के लिए आण्विक और सेलुलर प्रोटिओमिक्स में 20 अमेरिकन सोसायटी प्रकाशित किया गया था lecular जीवविज्ञान। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 9
चित्रा 9. बी एन-पृष्ठ प्रवास Nurd सब यूनिटों और संबंधित प्रोटीन की प्रोफाइल। ए) एक ऐसी ही तीव्रता पैटर्न में उपस्थित Mta2 और Nurd सब यूनिटों। बी) उलटा तीव्रता पैटर्न के साथ Mta2 और Nurd सब यूनिटों। सी) Mta2 और Cdk2ap1 है, जो केवल उच्च आणविक भार Nurd इकाई में मौजूद है। एनोटेट आणविक भार प्रोटीन मानकों के प्रवास प्रोफ़ाइल से अनुमान था। इस शोध मूल रूप से आण्विक और सेलुलर प्रोटिओमिक्स 20 जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी में प्रकाशित हुआ था।_blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल
पूरक डेटा: नमूना डाटासेट। MaxQuant व्युत्पन्न proteingroups.txt एक एबीसी एमएस प्रयोग से प्रोटीन पहचान और मात्रात्मक मूल्यों युक्त फ़ाइल। इस शोध मूल रूप से आण्विक और सेलुलर प्रोटिओमिक्स 20 जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी में प्रकाशित हुआ था। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ, हम प्रोटीन परिसरों को हल करने आत्मीयता मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में नीले देशी जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद शुद्धि के उपयोग का वर्णन। यह दृष्टिकोण क्रियात्मक प्रोटीन विधानसभाओं में एक आयामी प्रोटीन बातचीत सूचियों को जानने के लिए एक विधि प्रदान करता है।

हम विधि एपीटोप-टैग प्रोटीन के उपयोग पर आधारित का प्रदर्शन। हालांकि, अगर एक सेल लाइन एक टैग प्रोटीन व्यक्त उपलब्ध नहीं है, एक विकल्प के हित के प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करने, उपलब्ध कराई गई एक पेप्टाइड देशी प्रतिस्पर्धी क्षालन प्राप्त करने के लिए उपलब्ध नहीं है हो सकता है। सामग्री और मोती की मात्रा शुरू करने की राशि लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। हम आम तौर पर 2-5 x 10 8 कोशिकाओं सामग्री शुरू करने के साथ इस प्रोटोकॉल करते हैं, और यह और भी कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ प्रोटीन के लिए पर्याप्त है। lysis बफर रचना अनुभव से चुना जाना चाहिए प्राप्त करने के लिएके पास चारा के solubilization पूरा करने के लिए। इस प्रोटीन के कुछ प्रकार के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से क्रोमेटिन बंधन या झिल्ली प्रोटीन में। वैकल्पिक विकल्प, नमक की मात्रा बढ़ती है, बशर्ते कि अध्ययन के तहत प्रोटीन जटिल उच्च नमक, या क्रोमेटिन बंधनकारी प्रोटीन 20, 29 के लिए sonication और / या nuclease उपचार का उपयोग करने में स्थिर है शामिल हैं। झिल्ली प्रोटीन के मामले में, DDM या digitonin के लिए डिटर्जेंट स्विचिंग उचित 30 हो सकता है। DNA बाइंडिंग प्रोटीन के मामले में, यह एक nuclease जैसे शुद्धि कदम 20 के दौरान Benzonase शामिल करने के लिए उपयोगी है। न्यूक्लिक एसिड को पूरी तरह निकाला सुनिश्चित करता है कि बातचीत का पता चला प्रोटीन के बीच होते हैं और डीएनए द्वारा मध्यस्थता नहीं कर रहे हैं।

एक महत्वपूर्ण तत्व पर विचार करने के लिए जब इस दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा रही जटिल की स्थिरता है। प्रक्रिया लंबी है और preservin शामिल हो सकता हैग्राम प्रोटीन जटिल रात भर। हम दो क्रोमेटिन remodeling परिसरों (डी बोडे और एम पार्डो, नहीं दिखाया डेटा) के साथ अच्छे सफलता हासिल की है, लेकिन यह मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यदि आवश्यक हो तो आत्मीयता शुद्धि कदम छोटा किया जा सकता।

वैकल्पिक तकनीकों कि देशी विभाजन की अनुमति देते हैं, इस तरह के आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के रूप में, व्यापक रूप से प्रोटीन परिसरों चिह्नित करने के लिए 50 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम और दूसरों से पता चला है नीले देशी पेज के संकल्प आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी 20, 31, 32, 33 का प्रयोग कर प्राप्त है कि करने के लिए बेहतर है। नीले देशी पृष्ठ का एक और लाभ यह है कि यह क्रोमैटोग्राफी प्रणाली है, जो महंगे हैं की आवश्यकता नहीं है, बल्कि प्रोटीन electrophoretic उपकरण है कि प्रयोगशालाओं में व्यापक है उपयोग करता है। के संदर्भ में हाथ समय, इस विधि की तुलना में परंपरागत geLC-एमएस / एमएस एक और अधिक काम शामिल नहीं करता हैpproach या ऑफलाइन chromatographic विभाजन। हालांकि, ज्यादातर विभाजन तकनीक करते हैं, यह उनके समाधान करने के लिए एक सीमा होती है। परिसर है कि बहुत सजातीय या बड़े पैमाने पर और आकार में करीब हैं संकल्प नीले देशी पेज द्वारा की पेशकश की है, और इसलिए प्रोटोकॉल के रूप में यहां सूचना साझा सब यूनिटों के साथ अलग परिसरों को हल करने में सर्वत्र सफल नहीं हो सकता है परे हो सकता है। प्रोत्साहन, हम तीन सब यूनिटों (एम पार्डो, तैयारी में पांडुलिपि) को साझा करने के दो बहुत ही इसी तरह की tetrameric परिसरों को अलग करने में सफल रहे हैं।

के बाद से मास स्पेक्ट्रोमेट्री तेजी से संवेदनशील बन गया है, गैर विशिष्ट interactors और प्रदूषक के भी मिनट मात्रा में एपी एमएस नमूनों में पता लगाया जा सकता। यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण प्रवास चोटियों के साथ प्रोटीन की तुलना में अधिक आणविक भार पर चारा प्रवास चोटियों के साथ मेल खाना पर ध्यान केंद्रित द्वारा आत्मीयता शुद्धि में पृष्ठभूमि संक्रमण से वास्तविक interactors के भेदभाव करने में सहायता कर सकते हैंमोनोमेरिक प्रोटीन।

कई समूह पिछले अलगाव 10, 11, 12, 34 के लिए आवश्यकता के बिना सेलुलर पैमाने पर प्रोटीन परिसरों चित्रित करने के लिए प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा के बाद विभाजन तकनीक का इस्तेमाल किया है। हालांकि, इस उप stoichiometric बातचीत का पता लगाने के विफलता हो सकती है। आत्मीयता शुद्धि के माध्यम से एक संवर्धन कदम का समावेश इस पर काबू पाने के लिए कर सकते हैं। दृष्टिकोण यहाँ वर्णित प्रोटीन परिसरों की टोपोलॉजी की खोज और कई परिसरों किसी दिए गए प्रोटीन ही सेलुलर संदर्भ में में भाग लेता है को उजागर करने के लिए आम तौर पर उपयोगी होना चाहिए। रणनीति सरल और प्रयोगशालाओं कि प्रोटीन परिसरों को हल करने महंगा chromatographic विभाजन उपकरण नहीं हो सकता है के लिए उत्तरदायी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein G Dynabeads Life Technologies 10003D
FLAG antibody M2 Sigma-Aldrich F1804
Tween-20, protein grade, 10% solution Millipore 655206
Dimethyl pimelimidate Sigma-Aldrich 80490
0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 Sigma-Aldrich T0449
3x FLAG peptide Sigma-Aldrich F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES Sartorius VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel Life Technologies BN1001
20x NativePAGE Running Buffer Life Technologies BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive Life Technologies BN2002
4x NativePAGE sample loading buffer Life Technologies BN2003
NativeMARK Life Technologies LC0725
NativePAGE 5% G-250 sample additive  Life Technologies BN2004
Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene Thermo 249944
Multiscreen HTS 96-well filtration system Thermo MSDVN6550
Nunc 96-well cap natural Thermo 276002
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) Sigma-Aldrich 646547
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A/0627/17
Trypsin, sequencing grade Roche 11418475001
MaxQuant (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
Perseus (software) N.A. N.A. http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

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