रेडियोलैलेड एटीपी के साथ प्रोटीन किनास गतिविधि पर काबू पाने

Biochemistry

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Summary

प्रोटीन की किस्में अत्यधिक सिग्नलिंग एंजाइम और स्कॉफॉल्ड्स विकसित होती हैं जो अंतर- और इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हम रेडियोलैलेबेड एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट ([γ- 32 P] एटीपी) के उपयोग के माध्यम से किनीज गतिविधि को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, सेलुलर सिगनल विनियमन की व्याख्या के लिए एक विश्वसनीय तरीका है।

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Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

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Abstract

प्रोटीन कीइजिजियां उत्तेजनाओं के जटिल सरणियों के जवाब में बड़े पैमाने पर सेलुलर परिवर्तनों को नियंत्रित करने में सक्षम हैं, और उनके विनियमन के सबोटेरिक विवरणों को उजागर करने के लिए बहुत प्रयास किया गया है। किनासेस में सिग्नलिंग नेटवर्क शामिल होते हैं जिनके दोष अक्सर कैंसर और संबंधित बीमारियों के कई रूपों की पहचान करते हैं, जो एक उन्नत प्लेटफॉर्म को अपस्ट्रीम नियामक कारकों के हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी बनाते हैं और बेहतर चिकित्सीयताओं की तलाश में प्रतिक्रिया की आवश्यकताओं के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण हैं। यहां, हम एक बुनियादी किनाज परख का वर्णन करते हैं जो आसानी से विशिष्ट प्रयोगात्मक सवालों के अनुरूप हो सकते हैं जिनमें जैव रासायनिक और औषधीय एजेंटों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए सीमित है, लेकिन आनुवंशिक जोड़ों जैसे कि उत्परिवर्तन और विलोपन, साथ ही साथ सेल संस्कृति की स्थिति और जांच के उपचार सेल सिग्नलिंग तंत्र इस परख रेडियोलैलेड [γ- 32 P] एटीपी का उपयोग करता है, जो मात्रात्मक तुलना और परिणामों के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है, और आधुनिक हो सकता हैप्रतिदीप्त या पुनः संयोजक केनेज, विशिष्ट या विशिष्ट सब्सट्रेट्स के साथ उपयोग की जाने वाली इत्तफाक, सभी विस्तृत प्रतिक्रियाओं की स्थिति में

Introduction

प्रोटीन केन्या परिष्कृत एंजाइम हैं जो उचित प्रतिक्रियाओं में सेलुलर संकेतों के प्रसारण के लिए महत्वपूर्ण हैं 1 । होमोस्टेसिस को बनाए रखने और रोग की रोकथाम या बढ़ावा देने में उनकी भूमिकाओं को देखते हुए, किनाज गतिविधि का आकलन करने के लिए जैव रासायनिक विधियां यूकेरियोटिक सिग्नलिंग के विवरणों को चित्रित करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। हालांकि फ़ॉस्फो-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने वाली रणनीति सेल सिग्नलिंग स्टेटस 4 पर विभिन्न उपचार की स्थितियों के प्रभाव को मापने के मामले में बेहद जानकारीपूर्ण रही है, एक कीनेस परख अलग-अलग उपचार की स्थिति के प्रभावों को सीधे मापने के लिए अनुमति देता है। ब्याज। जबकि इसी तरह के एशेज के लिए कई विकल्प हैं जो कि रेडियोधर्मी सामग्री का उपयोग नहीं करते 5 , हम इस विधि पर भरोसा करते हैं कि परिणामों की मात्रा बहुत अधिक है। क्या आप वहां मौजूद हैंइस परख के दो विशिष्ट अनुप्रयोग हैं, जो अलग-अलग कारणों के लिए मूल्यवान हैं: प्रतिरक्षा प्रत्यारोपण (आईपी) कीनेस परख ( चित्रा 1 ) और पुनः संयोजक प्रोटीन कीनेज परख ( चित्रा 2 )।

आईपी ​​कीनेस परख विशिष्ट प्रोटीन केनेज को सक्रिय करने और साथ ही निरोधात्मक उपचार की स्थिति का अनुमान लगाने में सक्षम कारकों की पहचान करने के लिए काफी उपयोगी है। संक्षेप में, ब्याज के एक मिलान टैग किनेज़ को संवर्धित यूकेरियोटिक कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जाता है, विभिन्न उपचारों के अधीन, रेडियोलैबैड फॉस्फेट को एक मॉडल सब्सट्रेट ( जैसे मैलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी)) में शामिल करने की क्षमता के लिए immunoprecipitated, और assayed। आईपी ​​किनेज परख भी ओवर एक्सप्रेशन का सहारा लेने के बिना किया जा सकता है, या तो अंतर्जात प्रोटीन के इम्युनोप्रेएबैग या जीनोम-संपादन तकनीकों की किसी भी संख्या के द्वारा। क्योंकि उपचार संस्कृति में किया जाता है, यह विधि कई अपस्ट्रीम कारकों के माध्यम से संचारित उत्तेजनाओं का पता लगा सकता हैया इन विट्रो वाचआउट द्वारा समानांतर मार्ग। इस पद्धति का एक बड़ा फायदा यह है कि इसमें प्रत्यक्ष अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम कारकों या फोस्फोराइलेशन साइटों के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं है। इसके अतिरिक्त, एक बार ब्याज की एक किनेज के लिए विशिष्ट सबस्ट्रेट्स की पहचान हो चुकी है, उसी प्रकार कीइज अभेद्य प्रोटोकॉल को पुनः संयोजक घटकों के साथ प्रयोग किया जा सकता है जिससे कि प्राकृतिक सबस्ट्रेट्स की ओर विशिष्ट गतिविधि का पता लगाया जा सके और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ मिलकर विशिष्ट फास्फोरेटेशन साइटों की पहचान की जा सके। सब्सट्रेट म्यूटेंट का उपयोग करने वाले किनेज एलेसेस के साथ इस तरीके में पहचाने जाने वाली साइट्स को और अधिक मान्य किया जा सकता है। अन्त में, इस पद्धति का उपयोग ऑटोफॉस्फोरायरेलेशन का पता लगाने और मापने के लिए भी किया जा सकता है।

यहां उपलब्ध प्रोटोकॉल में सुसंस्कृत कोशिकाओं में रुचि के एक आत्मीयता टैग कीज़ को व्यक्त करने के लिए या तो एक अनुकूलित प्रोटीन शुद्धि योजना या अभिकलन विधि है। अभिकर्मक, विश्लेषण, immunoprecipitation, और प्रोटीन शोधन प्रोट के अधिक विस्तृत व्याख्याओं के लिएओकोल, हम कॉल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रोटोकॉल 6 का संदर्भ देते हैं। परख विकास और संशोधन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया प्रोटीन फास्फोरायलेशन का संदर्भ लें: एंजाइमोलॉजी में चयनित तरीके 7

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Protocol

1. किनास शुद्धिकरण संसाधन और सामान्य इम्यूनोपरैपिपी पाइपलाइन

नोट: इस परख के साथ उपयोग करने के लिए किनेसेस को सुसंस्कृत कोशिकाओं के प्रतिरक्षकों या फिर संयमी-टैग शुद्धि 6 जैसे पुनः संयोजक साधनों से प्राप्त किया जा सकता है। नीचे फ्लैग-टैग इम्युनोपेरेग्रेशन के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल है, जो ब्याज की किनेस के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। जब संभव हो तो सब कुछ बर्फ पर रखा जाना चाहिए

  1. 200 लीटर कोशिका lysates (आमतौर पर ~ 1 मिलीग्राम / एमएल कुल प्रोटीन एकाग्रता) के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल एंटीबॉडी के 2 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जबकि कमाल करना
  2. प्रोटीन को धो लें और 2-3 बार लेस बफर के साथ 2-3 बार (नीचे देखें) 5 डिग्री सेल्सियस ("टच स्पिन") पर 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कताई करके, एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटाकर और बफर में रीसस्पेंडिंग मोती ।
    1. एलिसैस बफर तैयार करें: 50 मिमी एचईपीईएस पीएच 7.7, 150 मिमी NaCl, 1.5 मिमी एमजीसी 2, 1 एमएम ईजीटीए, 10% ग्लिसरॉल, 0.2 एमएम सोडियम ओरथोवानेटेट, 100 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 50 एमएम β-ग्लिसराफोस्फेट, 0.1% ट्राइटन एक्स 100 या 0.1% एनपी -40।
  3. प्रोटीन के 50% घोल का 30 μL जोड़ें और lysates के लिए lysis बफर में एक sepharose मोती; कमाल के दौरान 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. मोती को गोली मारने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  5. 1 एमएल ऑफ बीड वॉश बफर के साथ 3 बार धोएं (1 एम नाओकल, 20 एमएम ट्रिएस पीएच 7.4)।
  6. एक बार 1x किनेज प्रतिक्रिया बफर (10 मिमी HEPES पीएच 8.0, 10 मिमी एमजीसीएल 2 ) के साथ धो लें। मोतियों को हटाने के बिना जितना संभव हो उतना बफर निकालें।

2. किनास प्रतिक्रियाएं आरंभ करना

नोट: आईपी किनेज एसेज के लिए, ~ 15 μ एल निषेधात्मक मोती एक विशिष्ट शुरुआती नमूना है। पुनः संयोजक प्रोटीन किनेज एसेल्स के लिए, विशिष्ट प्रारंभिक मात्रा में 25-50 μL अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा के लिए 1-10 में 0.1-1.0 माइक्रोन से लेकर होती है। पुनः संयोजक प्रोटीन नमूने की मात्रा समायोजित करेंएस को उस बफर के बराबर होना चाहिए जो परख को प्रारंभ करने से पहले संग्रहीत किया जाता है। जब उच्च मात्रा में किनेज़ का इस्तेमाल किया जाता है, तो बीएसए के रूप में एक वाहक प्रोटीन शामिल है जो परख की अवधि के लिए प्रोटीन स्थिरता बनाए रखने में सहायता करता है।

  1. नीचे दिया गया 5x किनेज प्रतिक्रिया बफर तैयार करें:
    50 मिमी एचईपीईएस पीएच 8.0
    50 मिमी एमजीसीएल 2
    50 मिमी बेंजामिडीन (प्रोटीज इनहिबिटर)
    50 मिमी डीटीटी (कमी एजेंट)
    250 माइक्रोन एटीपी (लेबल रहित, या "ठंडा")
  2. 1.5 एमएल ट्यूब में बर्फ पर किनेज नमूनों को रखें। अलग, ठंडा 1.5 एमएल ट्यूबों में निम्न प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें:
    21 μL एच 2
    6 μL 5x किनेज प्रतिक्रिया बफर
    1 μL रेडियॉलाबेल्ड ("गर्म") एटीपी
    2 μL सब्सट्रेट (~ 5 मिलीग्राम / एमएल)
    नोट: पुनः संयोजक किनेज एसेल्स के लिए, शुद्ध प्रोटीन को समायोजित करने के लिए मात्रा को समायोजित किया जा सकता है। गणना करें कि अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा 30 μL है। एक मास्टर तैयार करने के लिए इस विधि का उपयोग करेंमिश्रण। लेबल एटीपी प्राप्त होने पर, प्रतिक्रिया मिश्रण को जोड़ने से पहले 0.01 एमसीआई / μL की एक विशिष्ट गतिविधि के लिए एच 2 ओ में स्टॉक को कम करना।
  3. परख को प्रारंभ करने के लिए, kinase नमूने के लिए पूरी प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें और 5 मिनट से 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं जो किनाज की गतिविधि पर निर्भर करता है।
    नोट: जब एक किनेज के साथ काम करना होता है जिसका गतिविधि पहले से नहीं किया गया है, तो समय अंक के बीच 5 मिनट के अंतराल के साथ कीज़ गतिविधि का एक समय कोर्स करें।

3. प्रतिक्रिया समाप्ति और एसडीएस पृष्ठ

  1. बर्फ पर डालने और 7.5 μL 5x Laemmli नमूना बफर 6 जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
  2. गर्मी ब्लॉक में 30 से 2 मिनट तक 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी।
  3. टच स्पिन और 10-15% एसडीएस-पेज जेल पर 20 μL प्रति अच्छी तरह लोड करें। जेल को लंबे समय तक अलग करने के लिए पर्याप्त kinase और सब्सट्रेट (आमतौर पर 5 घंटे की निरंतर शक्ति पर 1 घंटे) जेल उपकरण को 32 से एक्सपोजर सीमित करने के लिए परिरक्षित रखना सुनिश्चित करें
  4. यहां, होममेड जेल ऐपरेट्स का उपयोग करें, लेकिन मानक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिनी-जैल बिल्कुल उपयुक्त हैं। निम्नानुसार आयामों का उपयोग करें:
    जैल: 8 सेमी की चौड़ाई, 5.5 सेमी लंबाई (हल), 1.5 मिमी मोटाई।
    कंघी: 15 कुएं, 1.5 मिमी मोटाई, 2. 9 मिमी चौड़ाई, 16 मिमी की गहराई

4. जेल धुंधला और सुखाने

सावधानी: सभी चरणों के लिए निजी सुरक्षा उपकरणों को रेडियोधर्मी परिरक्षण और पहनने से 32 पी के निजी व्यक्तित्व को कम करना सुनिश्चित करें। विशिष्ट चरणों के बारे में अधिक जानकारी के लिए कुछ उपयोगी संदर्भ शामिल किए गए हैं।

  1. काँच / एल्यूमिना प्लेटों से जेल निकालें और 50 मिलीलीटर कूमेस्सी दाग ​​(10% हिमनदों एसिटिक एसिड, 50% मेथनॉल, 0.25% आर -50 डाई) में 1 घंटा के लिए ऑर्बिटल शेकर 50 आरपीएम पर सेट करें। इस चरण के लिए एक कंटेनर का उपयोग करें जो जेल से थोड़ी बड़ा है। 8
  2. दाग से फिक्सिंग समाधान (10% हिमनदों एसिटिक एसीडी, 20% मेथनॉल) क्रम में डी-दाग के लिए। 50 आरपीएम पर कक्षीय प्रकार के बरतन पर रातोंरात फिक्सिंग समाधान के 600-700 एमएल में जेल रॉक। कूमेसी डाई 8 , 9 को अवशोषित करने के लिए जेल के साथ कंटेनर में फोम के टुकड़े रखें या प्रयोगशाला पोंछे
  3. समाधान तय करने से जेल को निकालें और 200 मील मेथनॉल में कोमल आंदोलन के साथ 1-2 मिनट में भिगो दें, जब तक जेल दूधिया सफेद न हो जाए। यह सुखाने के चरण के दौरान टूटने को रोकने में मदद करेगा।
  4. मेथनॉल के साथ गुणात्मक फिल्टर पेपर का 14 सेमी x 14 सेमी टुकड़ा गीला और स्लैब जेल वैक्यूम ड्रायर पर रखें। जेल नीचे फिल्टर पेपर सामने की तरफ ऊपर का सामना करना पड़
  5. झिलकों और हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधानीपूर्वक प्लास्टिक की जेल के साथ कवर करें। 1.5 घंटे के लिए ड्रायर को चलाने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस वैक्यूम के बाद ढक्कन को खोलने के लिए और नरम रबर ब्रेयर के साथ किसी भी हवा के बुलबुले को खोलने के बाद प्राप्त किया गया है।

5. आटोरायडियोग्राम और सीनिटाइलेशन कैट्स

  1. ड्रा निकालेंएड जेल और जेल के किनारे पर फ़िल्टर पेपर को ऑटराड मार्कर, फॉस्फोरसेंट शासक या डॉट्स संलग्न करें। यदि डॉट्स का प्रयोग करना सुनिश्चित होता है कि वे असममित पैटर्न में हैं यह एक्सपोजर और विकास के बाद फिल्म के साथ जेल को संरेखित करेगा।
  2. सिग्नल की तीव्रता की जांच करने के लिए एक गीजर काउंटर का उपयोग करें। कमजोर संकेतों के लिए -70 डिग्री सेल्सियस से -80 डिग्री सेल्सियस पर एक तेज स्क्रीन के साथ एक्सपोजर फिल्म बैंड घनत्व में वृद्धि होगी।
  3. एक अंधेरे कमरे में फिल्म के साथ एक फिल्म केसेट में सूखे जेल और ऊपर से नीचे तक के क्रम में एक तेज स्क्रीन रख दी गई: जेल, फिल्म, तेज स्क्रीन।
  4. कैसेट के ढक्कन को तेज स्क्रीन संलग्न करें और इस कदम को आसान बनाने के लिए जेल को टेप करें तेज स्क्रीन 32 पी से बीटा कणों द्वारा विकिरण के दौरान प्रकाश का उत्सर्जन करता है। ये प्रकाश उत्सर्जन बीटा कणों की तुलना में फिल्म को अधिक कुशलतापूर्वक घुसना देती है।
    1. सुनिश्चित करें कि तेज स्क्रीन कोर से उत्सर्जित तरंग दैर्ध्यतरंग दैर्ध्य के लिए तालाबों को फ़िल्म बेहद संवेदनशील होती है।
    2. एक गीजर काउंटर का प्रयोग करें कि यह निर्धारित करने के लिए कि कितने समय तक एक्सपोजर को छोड़ना है: यदि सीपीएम गणना 100% या उससे कम है, तो -70 डिग्री सेल्सियस पर रात भर का प्रयास करें यदि गणना ~ 10,000 है, तो 1 एच एक्सप्लोरर के साथ शुरुआत करें और वहां से ऑप्टिमाइज़ करें।
  5. एक्सपोज़र के समापन पर फिल्म को दूर किया जाता है और चिकित्सा / एक्स-रे फिल्म प्रोसेसर में विकसित होता है। यदि एक्सपोजर को -70 से -80 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था, तो या तो फिल्म पर संक्षेपण को कम करने के लिए कैसेट को कमरे के तापमान पर गर्म करने की अनुमति दें या फिर संक्षेपण रूपों 10 से पहले फिल्म को निकाल दें।
  6. सूखे जेल / फिल्टर पेपर पर फिल्म रखो और सूक्ष्म जेल पर मार्कर / डॉट्स के साथ मार्कर / डॉट्स की छवि को संरेखित करें। फिल्म पर निशान प्रोटीन मानकों के अनुरूप बैंड। प्रोटीन मानकों को लेबल करें और भविष्य में संदर्भ के लिए कौन-सी प्रतिक्रियाएं हैं
  7. फिल्म पर ब्याज के बैंड के अनुरूप जेल से बैंड का आबकारी करें और उन्हें जगह दें7 एमएल सिलेंटीशन शीशियों में तरल जगमगाहट का 4 एमएल जोड़ें और तरल जगमगाहट काउंटर के साथ गणना करें। पुष्टि करें कि काउंटर 32 पी के लिए सही ऊर्जा स्पेक्ट्रम विंडो की निगरानी करने के लिए तैयार है।
    नोट: नॉन-किनेज नियंत्रण लेन से सब्सट्रेट करने के लिए बैंड को एक्साइज करना भी सुनिश्चित करें। इसका उपयोग पृष्ठभूमि विकिरण की गणना करने के लिए किया जाएगा जो कि सभी नमूना बिच्छू संख्याओं से घटाया जाएगा।

6. परिणाम का विश्लेषण

नोट: आटोराडियोियोग परिणामों के गुणात्मक दृश्य प्रदान करता है। सटीक मात्रा के लिए, 32 पी निगमन को एक चमकदार काउंटर से मापा जा सकता है। डेटा आमतौर पर सापेक्ष गतिविधि के संदर्भ में व्यक्त किया जाता है, जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है जब तक सभी नमूनों के लिए वर्दी स्थिति बनाए रखी जाती है, तब तक विशिष्ट गतिविधि के सापेक्ष माप उपचार की तुलना करने के लिए पर्याप्त हैं।

  1. पूर्ण विशिष्ट गतिविधि मानों की गणना करते समय, कठोरता का पालन करेंएक समय के पाठ्यक्रम ( जैसे 2 एक्स [किनेस] = 2 एक्स विशिष्ट गतिविधि) पर एक रेखीय श्रेणी की गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए, सभी रिएक्शन स्थितियों के कंस, सब्सट्रेट, और ठंडे एटीपी सांद्रता सहित सभी प्रतिक्रिया परिस्थितियों का अनुकूलन। उच्च विशिष्ट गतिविधि वाले परिजनों के लिए, वृद्धि हुई सब्सट्रेट एकाग्रता के साथ एनावेस करें क्योंकि केस की गतिविधि सब्सट्रेट की मात्रा से सीमित होती है।
  2. नैनोमॉल्स फॉस्फेट की प्रति यूनिट प्रति मिलीग्राम कीनेज की इकाइयों में रुचि के किनेज की विशिष्ट गतिविधि की गणना करें।
    1. गिनती के बैंड में सीपीएम से रिक्त स्थान घटाएं।
    2. गर्म एटीपी के क्षय की गणना: [(1/2) ^ (टी / टी 1/2 )] x 0.95 जहां टी संदर्भ की तारीख से (दिनों की संख्या) विक्रेता द्वारा प्रदान किया जाना चाहिए, टी 1/2 है 32 पी का आधा जीवन, जो 14.3 दिन है, और 0.95 है जिन्दा काउंटर की दक्षता को दर्शाता है। उदाहरण: यदि गर्म एटीपी का उपयोग करना 28 दिन पुराना है, तो क्षय मूल्य 0.245 होना चाहिए।
    3. कैल्कपरख में कुल एटीपी (आमतौर पर यह प्रतिक्रिया में ठंडा एटीपी की मात्रा के बराबर है) के पीकोमोल (पीएमओएल) को ulate करें: परख मात्रा (μL) x [ठंडा एटीपी] (माइक्रोन) = कुल एटीपी (पमोल) उदाहरण: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
    4. Cpm / pmol एटीपी की गणना करें: [गर्म एटीपी एक्स (2.2 x 10 7 ) एक्स क्षय फैक्टर के μL) / ठंडा एटीपी के pmol।
      नोट: 2.2 x 10 7 का मान सीपीएम से 0.01 एमसीआई / μ एल एटीपी को धर्मान्तरित करता है।
    5. मिलीग्राम में परख में कीनेज की मात्रा की गणना करें पुनः संयोजक केनेज और immunoprecipitated kinases दोनों के लिए, बीसीए assays जैसे मानक तरीकों प्रारंभिक सांद्रता निर्धारित करने के लिए उपयुक्त हैं। उदाहरण: एक 50 μL किनेज प्रतिक्रिया में wtERK2 0.0002 μg / μL 0.01 माइक्रोग्राम या 1 एक्स 10 -5 मिलीग्राम है।
    6. परख में कुल सीपीएम की गणना करें। 30 μL प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करें और एक जेल पर प्रत्येक प्रतिक्रिया से 20 μL चलाएं। कुल परख मात्रा / लोड की गई मात्रा के कारक द्वारा सीपीएम गिना (रिक्त घटाव के बाद)। उपरोक्त जारीउदाहरण के लिए, सभी मामलों की संख्या 1.5 से बढ़ो, या 30/20
    7. Assayed kinase की विशिष्ट गतिविधि की गणना करें:
      परख में कुल सीपीएम) / (सीपीएम / पीएमओएल एटीपी) / (मिनट में परख समय) / (मिलीग्राम में किनेज की मात्रा)
      नोट: उपर्युक्त मूल्य को 1,000 से बढ़ाकर नैनोमोल्स / मिनिट / मिलीग्राम में विशिष्ट गतिविधि पैदा होती है
  3. गणना करें कि फॉस्फेट के कितने mols को सब्सट्रेट में शामिल किया जाता है (जब तक कि इसके आणविक वजन ज्ञात होते हैं)। यह एक विशेष प्रोटीन पर फॉस्फोसाइट्स की संख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जब प्रतिक्रिया पूरी हो जाती है।
    परख में कुल सीपीएम) / (सीपीएम / पीएमओएल एटीपी)] / (पीमोल में सब्सट्रेट की मात्रा)

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Representative Results

डब्लूएनके 1 आईपी किनेज एशेज

Myc- टैग WNK1 HEK293 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था और एक एंटी-माईक एंटीबॉडी 11 के साथ immunoprecipitated था। मॉडल सब्सट्रेट एमबीपी के साथ-साथ स्वयं की तरफ इशारा करते हुए कीनेज की गतिविधि को प्रदर्शित करता है ( चित्रा 1 ए )। डब्लूएनके 1 म्यूटेंट तब उसी पद्धति से एमबीपी की दिशा में कीनेज़ गतिविधि के लिए परीक्षण किया गया, इस बार जीएसटी टैग टैग निर्माण ( चित्रा 1 बी ) को नियोजित किया गया। जंगली प्रकार के मुताबिक उत्परिवर्ती किनेज़ व्यवहार का विश्लेषण, इष्टतम WNK1 गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण अवशेषों का पता चला है।

HEK293 कोशिकाएं औषधीय और जैव रासायनिक उपचार के एक पैनल के सामने आई थीं। डब्लूएनके 1 एन-टर्मिनल पेप्टाइड के खिलाफ उठाए गए एक एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए एमबीपी का प्रयोग सब्सट्रेट के रूप में इम्युनोपीडेटेड अंतर्जात डब्ल्यूएनके 1 किनेज गतिविधि पर किया गया। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ), एक ज्ञात सक्रियताया एआरके 1/2 सिग्नलिंग, नोकोडाज़ोल, माइक्रोट्यूबल डायनेमिक्स, एनिसोमायसिन, यूकेरियोटिक अनुवाद के अवरोध करने वाला एक ड्रग, और लसोफोस्फेटिडीक एसिड (एलपीए), एक शक्तिशाली मिटोजेन, फॉस्फोरिलेटेड एमबीपी में मजबूत वृद्धि हासिल करने में असमर्थ थे। इसके विपरीत, NaCl को WNK1 कीनेज गतिविधि का नियामक माना गया था।

ईआरके 2 पुनः संयोजक प्रोटीन कीनेज assays

चूहा ERK2 एक एन टर्मिनल 6His टैग असर बैक्टीरिया कोशिकाओं और निकल 12 राल के साथ शुद्ध आत्मीयता में व्यक्त किया गया था। एक मोनोक्यूम स्तंभ पर आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन को शुद्ध किया गया था, जिसमें कई एल्यूशन भिन्नता कीज़ गतिविधि ( चित्रा 2 ए ) के लिए परीक्षण किया गया था। चूंकि एमईके की अनुपस्थिति में ईआरके 2 को एमईके द्वारा अधिक से अधिक कीनेज गतिविधि तक पहुंचने के लिए दोहरे फास्फोरियम की आवश्यकता होती है, बैक्टीरिया से शुद्ध ईआरके 2 काफी हद तक निष्क्रिय है। इसलिए, रीकॉम के अंश जांचने के लिएएमबीपी की दिशा में गतिविधि के लिए बिनेंट ईआरके 2, MEK1R4F नामक एक MEK1 का एक सक्रिय रूप से सक्रिय रूप किनीज प्रतिक्रियाओं में शामिल किया गया था विशेष रूप से, एमईकेआर 4 एफ एमबीपी पर उच्च कैनेज़ गतिविधि ( चित्रा 2 ) बंदरगाह नहीं करता है।

चित्रा 2 ए में दिखाए गए चित्र के समान एक परख का प्रयोग करना, एक एमबीपी कीनेस गतिविधि का इस्तेमाल रेकाबिनेंट ईआरके 2 म्यूटेंट की क्रियाकलापों को मापने के लिए किया गया था जो कि बेल्टटीपी प्रोटीन ( चित्रा 2 बी ) के सापेक्ष जीवाणु संस्कृतियों से शुद्ध होता है। यद्यपि एमईकेआर 4 एफ द्वारा उत्तेजित जब ईआरके 2 एमबीपी को फॉस्फोरिलेट करने में सक्षम होता है, तो दोहरे फास्फोरेटेशन (टी 188 डी और टी 188 ई) की कैनोओलिक साइटों में उत्प्रेरक लाइसिन (के 52 आर) या त्रिकोण को बदलकर नाटकीय रूप से ईआरके 2 कीनेस गतिविधि को रद्द कर दिया जाता है। ERK2-T188D और ERK2-T188E एक छोटे, लचीला पेप्टाइड ( चित्रा 2C ) की ओर सीमांत किनेज गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, तथापि, वे ज्ञात ERK2 सबस्ट्रेट्स Nup153 और PDX1 ( चित्रा 2) को मजबूत रूप से फास्फोरेट करने में असमर्थ हैं डी)

आकृति 1
चित्रा 1: डब्ल्यूएनके 1 के इम्यूनोप्रेजिएशन किनाज एसेल्स ( ) HEK293 कोशिकाओं या तो पीसीएमवी 5-माइक के साथ एक डालें या पीसीएमवी 5-माइक-डब्लूएनके 1 के बिना ट्रांसफ़ेक्ट किया गया, टैग प्रोटीन एंटी-माइक्स एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated थे और इसके बाद एमबीपी का उपयोग सब्सट्रेट के रूप में किया गया। आटोराडियोोग्राफी बाईं तरफ दिखायी जाती है, और सही पर immunoprecipitates का एक immunoblot। ( बी ) विभिन्न जीएसटी-डब्लूएनके 1 उत्परिवर्तित प्रोटीन का उपयोग एमबीपी के साथ किनेज एशेज में सब्सट्रेट के रूप में किया गया था; एमबीपी फास्फोरायलेशन को Wildtype WNK1 से संबंधित गतिविधि के रूप में व्यक्त किया गया है। ( सी ) अंतर्जात WNK1 विभिन्न उत्तेजनाओं के साथ इलाज की गई HEK293 कोशिकाओं से immunoprecipitated था और autophosphorylation के लिए assayed। यह आंकड़ा जू एट अल से संशोधित किया गया था , 2000 115504fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: ईआरके 2 के पुनः संयोजक प्रोटीन किनेज assays। ( ) एक मोनोक्यू एयन एक्सचेंज कॉलम से शुद्ध ईआरके 2 अंश एमबीपी के साथ एक किनेज परख में MEK1R4F की मौजूदगी या अनुपस्थिति में ईआरके 2 कीनेज गतिविधि की एक सक्रिय सक्रिय उत्तेजक औजार में इस्तेमाल किया गया था। ( बी ) एमआरपी पर कीनाज गतिविधि के लिए ईआरके 2 म्यूटेंट का परीक्षण किया गया। ( सी ) एक्टिवेशन लूप म्यूटेंट ERK2-T188D और ERK2-T188E सीमांत किनेज गतिविधि को एक छोटे से टाइप पेप्टाइड सब्सट्रेट की ओर ले जाता है। ( डी ) ERK2 या T188D कीनेज गतिविधियों की तुलना MEK1R4F द्वारा सक्रिय ERK2 substrates nucleoporin-153 (Nup153) और अग्नाशयी और डुओडानल होमबोक्स 1 (PDX1) के साथ सक्रियण के बाद। फास्फोरिलेटेड सब्स्ट्रेट्स को वेजेस और फॉस्फोरीला द्वारा चिह्नित किया गया हैएस्टरिस्क द्वारा टेड ईआरके 2 और टी 188 McReynolds एट अल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित (और संशोधित) , 2016 12 (कॉपीराइट 2016 अमेरिकी केमिकल सोसायटी)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

किनेसेस प्रोटीन के एक विविध परिवार हैं, जिन्होंने कई संदर्भों में व्यापक कार्यक्षमता विकसित की है, और कई सिग्नल प्रोटीनों का अध्ययन करने के लिए किनेज अभिकरण अविश्वसनीय रूप से उपयोगी हैं और सेलुलर संचार की हमारी वर्तमान समझ में काफी योगदान दिया है। विशेष रूप से, संरचना और गतिविधि में बड़े अंतर के बावजूद, दो अलग-अलग परिस्थितियों के चित्रण में एक ही बुनियादी परख का उपयोग किया गया था। डब्लूएनके 1 किनेज़ में एक असामान्य उत्प्रेरक जेब होता है जहां महत्वपूर्ण लाइसिन को एक अनूठी स्थिति में स्थानांतरित कर दिया जाता है और यह किनेस-क्लोराइड कोट्रैंसपोर्टरों के विनियमन में दोनों कीज़ और मचान कार्यों के माध्यम से भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। डब्लूएनके 1 की किनेज की गतिविधि कम टर्नओवर संख्या के बारे में जानी जाती है, यहां तक ​​कि इसके सर्वोत्तम-विशेषताओं वाले सब्सट्रेट्स पर भी, प्रोटीन काइनास ऑक्सीडेटिव तनाव जवाबदेह 1 (ओएसआर 1) और एसपीएस / एसटीई 20-संबंधित प्रोलिन एलानिन-अमीर किनाज (एसपीएपी)। इसके विपरीत, ईआरके 2, निकटता से संबंधित केनेज ईआरके 1 के साथ, जब सक्रिय होता है तो मजबूत किनेज गतिविधि दिखाती है 13 , 14 में एक सौ से अधिक substrates के लिए phosphorylate के लिए जाना जाता है।

परख के सबसे महत्वपूर्ण पहलू प्रतिक्रिया विधानसभा है। सटीक समय बिंदु माप बनाने के लिए, कीनेज़ प्रतिक्रियाओं को आरंभ करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। आगे बढ़ने के लिए किनीज परख के लिए चार बुनियादी आवश्यकताएं हैं: किनास, सब्सट्रेट, एटीपी, और धातु आयन। इस प्रोटोकॉल के लिए, जो मुख्य रूप से यूकेरियोटिक किनासेस के लिए उपयोग किया जाता है, एमजीसीएल 2 को मैग्नीशियम के स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है। पुनः संयोजक प्रोटीन कीनाज़ और आईपी किनेज की तैयारी दोनों में आम तौर पर मैग्नीशियम होता है, एमजीसीएल 2 को प्रतिक्रिया स्टार्टर के रूप में अपर्याप्त होता है। इसी तरह, लेबल वाले ("गर्म") एटीपी से पहले अनलिबैलेड ("सर्दी") एटीपी को जोड़ने के बाद भी प्रतिक्रिया शुरू हो सकती है। हम एक केंद्रित किनेज रिएक्शन बफर का उपयोग करते हुए प्रतिक्रियाओं की तैयारी करने की सलाह देते हैं जो कि एमजीएलएल के साथ-साथ जोड़ों को सुविधाजनक बनाता है

यद्यपि आईपी किनेज एलेसेस और पुनः संयोजक प्रोटीन किनेज एसेल्स के बीच कुछ अंतर है, टीवह दोनों के लिए आम तौर पर प्रायोगिक प्रतिमान दर्शाता है कि यह परख कितना बहुमुखी हो सकती है। दरअसल, उदाहरण हैं जब दोनों कीज़ परख प्रकारों की विशेषताएं मिश्रित हो सकती हैं, जैसे कि मिटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज / एक्सीसुलुलर सिग्नल-विनियमित किनेज (एमएपीके / ईआरके) सिग्नलिंग मार्ग पर अध्ययन के साथ। इस मार्ग में, ईआरके 1/2 को अपस्ट्रीम कारक एमएपीके / ईआरके किनेस 1 (एमईके 1) द्वारा दोहरे-फास्फोरिलेशन द्वारा सक्रिय किया गया है। पिछला अध्ययनों से पता चला है कि एमईके 1, साथ ही एमईके 1 आर 4 एफ करारित रूप से सक्रिय रूप से सक्रिय उत्परिवर्ती, ईआरके 1/2 को सक्रिय करने में सक्षम है, यह एमबीपी की दिशा में बहुत ही कम गतिविधि का रखरखाव करता है। नतीजतन, बैक्टीरिया कोशिकाओं से शुद्ध ईआरके 1/2 एमबीपी की दिशा में सीमित कीनेज गतिविधि को प्रदर्शित करता है, जब तक कि एमईके 1 आर 4 एफ के साथ इलाज न किया जाए, चित्रा 2 में दिखाए गए अनुसार, जंगली रूप ERK1 / 2 की जंगली गतिविधि की तुलना करने के लिए एक मजबूत मंच बनाने के लिए। Immunoprecipitated घटकों का समावेश भी अधिक बारीकियों को जोड़ सकते हैं, बहुसंख्यक एन की जांच करने के लिए उच्च अनुकूलनीय विधि के रूप में कीनेज परख को उजागर करते हुएइन महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं का पता लगाना

हालांकि कुछ रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करना कठिन हो सकते हैं, रेडियोलैबैड कीनेज परख की मात्रात्मक परिशोधन इसके प्रमुख लाभों में से एक है। हालांकि, प्राकृतिक उत्पाद रसायन विज्ञान, जीनोमिक्स और जन स्पेक्ट्रोमेट्री के क्षेत्र में हालिया प्रगति ने संशोधित किनेज एशेज के लिए एक मांग बनाई है पढ़ने के साथ उच्च थ्रूपूट अनुप्रयोगों के लिए और अधिक योग्य है 15 चूंकि इन assays विभिन्न लेबलिंग सामग्री का लाभ लेते हैं, समझौता सटीकता के संदर्भ में किया जाता है, लेकिन ये स्क्रीन परिणामों को मान्य करने के लिए एक रेडियोलैबैड परख का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। प्रोटीन कीनेज की सिग्नल बढ़ने की हमारी समझ के रूप में, यह स्पष्ट है कि किनेज विनियामक कार्यों के विवरणों को छेड़ने में सक्षम तकनीक उपकरण और चिकित्सा के विकास में सहायता जारी रखेगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक मूल्यवान काम और चर्चा के लिए कोब्ब प्रयोगशाला के सभी वर्तमान और पूर्व सदस्यों का धन्यवाद करते हैं, और प्रशासनिक सहायता के लिए डायोन वेयर इन अध्ययनों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R37 DK34128 और वेल्च फाउंडेशन ग्रांट I1243 MHC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

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References

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