Dosage de l'activité des protéines kinase avec ATP radiomarqué

Biochemistry

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Summary

Les protéines kinases sont des enzymes de signalisation hautement évoluées et des échafaudages qui sont essentiels pour la transduction du signal inter et intracellulaire. Nous présentons un protocole pour mesurer l'activité de la kinase par l'utilisation d'adénosine triphosphate radiomarqué ([γ- 32 P] ATP), une méthode fiable pour faciliter l'élucidation de la régulation de la signalisation cellulaire.

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Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

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Abstract

Les protéines kinases sont capables de gouverner les changements cellulaires à grande échelle en réponse à des séries complexes de stimuli, et beaucoup d'efforts ont été dédiés à la découverte des détails allostériques de leur réglementation. Les kinases comprennent des réseaux de signalisation dont les défauts sont souvent caractéristiques de multiples formes de cancer et de maladies apparentées, ce qui rend possible une manipulation des facteurs de régulation en amont et la validation des exigences de réaction critiques pour la recherche de thérapies améliorées. Ici, nous décrivons un dosage basique de la kinase qui peut être facilement adapté aux questions expérimentales spécifiques, y compris, mais sans s'y limiter, le test des effets des agents biochimiques et pharmacologiques, des manipulations génétiques telles que la mutation et la suppression, ainsi que les conditions de culture cellulaire et les traitements pour sonder Mécanismes de signalisation cellulaire. Ce dosage utilise l'ATP [γ- 32 P] radiomarqué, qui permet des comparaisons quantitatives et une visualisation claire des résultats, et peut être modPour utilisation avec de la kinase immunoprécipitée ou recombinante, des substrats spécifiques ou typés, dans toute une large gamme de conditions de réaction.

Introduction

Les protéines kinases sont des enzymes sophistiquées critiques pour la transmission de signaux cellulaires en réponses appropriées 1 . Étant donné leur rôle dans le maintien de l'homéostasie et la prévention ou la promotion des états pathologiques 2 , les méthodes biochimiques pour évaluer l'activité kinase continuent d'être des outils puissants pour délimiter les particularités de la signalisation eucaryote 3 . Bien que les stratégies utilisant des anticorps spécifiques de phospho aient été très informatives en termes de mesure des effets de différentes conditions de traitement sur l'état de signalisation cellulaire 4 , un dosage de kinase permet de mesurer directement les effets de différentes conditions de traitement en termes d'activité enzymatique d'une kinase de intérêt. Bien qu'il existe plusieurs options pour des analyses similaires qui n'utilisent pas de matières radioactives 5 , nous continuons de compter sur cette méthode pour une quantification robuste des résultats. LàSont deux applications typiques de ce dosage, à la fois précieuses pour différentes raisons: l'essai immunoprécipité (IP) kinase ( figure 1 ) et le dosage recombinant de la protéine kinase ( figure 2 ).

Le test de la kinase IP est extrêmement utile pour identifier les facteurs capables d'activer des protéines kinases spécifiques ainsi que d'évaluer les conditions de traitement inhibiteur. En bref, une kinase marquée par un epitope d'intérêt est transfectée dans des cellules eucaryotes cultivées, soumise à une variété de traitements, immunoprécipitée et testée pour pouvoir incorporer un phosphate radiomarqué dans un substrat modèle ( par exemple, une protéine basique de myéline (MBP)). Le test de la kinase IP peut également être effectué sans recourir à une surexpression, soit par immunoprécipitation de protéines endogènes, soit par n'importe quel nombre de techniques de modification du génome. Parce que les traitements sont administrés en culture, cette méthode peut détecter les stimulations transmises par plusieurs facteurs en amontOu des chemins parallèles par lecture in vitro . L'un des principaux avantages de cette méthode est qu'il ne nécessite pas une connaissance préalable des facteurs directs en amont ou en aval ou des sites de phosphorylation. En outre, une fois que des substrats spécifiques pour une kinase d'intérêt ont été identifiés, le même protocole de dosage de kinase peut être utilisé avec des composants recombinants pour mesurer une activité spécifique vis-à-vis des substrats naturels et identifier des sites de phosphorylation spécifiques lorsqu'ils sont combinés avec une analyse par spectrométrie de masse. Les sites identifiés de cette manière peuvent encore être validés avec des dosages de kinase en utilisant des mutants de substrat. Enfin, cette méthode peut également être utilisée pour détecter et mesurer l'autophosphorylation.

Le protocole fourni ici suppose soit un schéma de purification de protéine optimisé, soit un procédé de transfection pour exprimer une kinase marquée par une affinité intéressant dans des cellules cultivées. Pour des expositions plus détaillées de la transfection, de la lyse, de l'immunoprécipitation et de la purification des protéines protOcols, nous suggérons de se référer aux protocoles Cold Spring Harbor 6 . Pour plus d'informations sur le développement et la modification des analyses, veuillez consulter la Phosphorylation des protéines: Méthodes choisies en Enzymologie 7 .

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Protocol

1. Ressources de purification de la kinase et pipeline général d'immunoprécipitation

NOTE: Les kinases à utiliser avec ce dosage peuvent provenir d'immunoprécipités de cellules cultivées ou par des moyens recombinants tels que l'épuration par affinité 6 . Ci-dessous est un protocole général pour l'immunoprécipitation marquée par un drapeau qui peut devoir être modifié en fonction de la kinase d'intérêt. Tout devrait être conservé sur la glace si possible.

  1. Ajouter 2 μL d'anticorps de 1 mg / mL à 200 μL de lysats cellulaires (habituellement ~ 1 mg / mL de concentration totale de protéines) et incuber à 4 ° C pendant 1 h tout en basculant.
  2. Se laver les grains de protéine A sepharose 2-3 fois avec un tampon de lyse (voir ci-dessous) en faisant tourner brièvement à 4 ° C pendant 30 s à 1 min à 5 000 xg ("essorage tactile"), en enlevant le surnageant avec une pipette et en remettant des billes en tampon .
    1. Préparer un tampon de lyse: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl 2 1,5 mM, EGTA 1 mM, 10% de glycerol, 0,3 mM d'orthovanadate de sodium, 100 mM de fluorure de sodium, 50 mM de β-glycérophosphate, 0,1% de Triton X 100 ou 0,1% de NP-40.
  3. Ajouter 30 μL de bouillie à 50% de billes de sepharose protéine A dans un tampon de lyse à des lysats; Incuber à 4 ° C pendant 1 h tout en basculant.
  4. Faire tourner à 4 ° C pour rallumer les perles et enlever le surnageant.
  5. Laver 3 fois avec 1 ml de tampon de lavage de talons (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4).
  6. Laver une fois avec un tampon de réaction 1x kinase (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Retirez autant de tampon que possible sans enlever les perles.

2. Initialisation des réactions de la kinase

NOTE: Pour les tests de kinase IP, ~ 15 μL de perles non suspendues est un échantillon de départ typique. Pour les tests de protéine kinase recombinants, les quantités de départ typiques vont de 0,1 à 1,0 μg en 1 à 10 pour 25-50 μL de volumes de réaction finale. Ajuster les volumes d'échantillon de protéines recombinantesS pour être égal avec le tampon qu'ils sont stockés avant d'initialiser l'analyse. Lors de l'utilisation de quantités élevées de kinase, inclure une protéine porteuse telle que la BSA pour faciliter le maintien de la stabilité des protéines pendant la durée de l'essai.

  1. Préparer le tampon de réaction 5x kinase donné ci-dessous:
    HEPES 50 mM pH 8,0
    50 mM de MgCl 2
    50 mM de Benzamidine (inhibiteur de protéase)
    50 mM de DTT (agent de réduction)
    ATP 250 μM (non étiqueté ou "froid")
  2. Conserver les échantillons de kinase sur de la glace dans des tubes de 1,5 mL. Préparer le mélange réactionnel suivant dans des tubes séparés et réfrigérés de 1,5 mL:
    21 μL H 2 O
    6 μL de tampon de réaction kinase 5x
    1 μL d'ATP radiomarqué ("chaud")
    2 μL de substrat (~ 5 mg / mL)
    NOTE: Pour les dosages de kinase recombinante, le volume peut être ajusté pour s'adapter à la protéine purifiée. Calculez que le volume de réaction final soit de 30 μL. Utilisez cette recette pour préparer un maîtremélanger. Après réception de l'ATP marqué, diluer le stock dans H 2 O à une activité spécifique de 0,01 mCi / μL avant d'ajouter au mélange réactionnel.
  3. Pour initialiser le dosage, ajouter tout le mélange réactionnel à l'échantillon de kinase et incuber la réaction à 30 ° C pendant 5 min à 1 h en fonction de l'activité de la kinase à analyser.
    REMARQUE: lorsque vous travaillez avec une kinase dont l'activité n'a pas été préalablement analysée, effectuez un temps d'activité kinase avec des intervalles de 5 minutes entre les points de temps.

3. Résiliation de réaction et SDS-PAGE

  1. Arrêter la réaction en mettant de la glace et en ajoutant 7,5 μL de tampon 5 d'échantillon de Laemmli 6 .
  2. Chauffer à 100 ° C pendant 30 s à 2 min dans un bloc de chaleur.
  3. Faire tourner et charger 20 μL par puits sur un gel SDS-PAGE à 10-15%. Exécutez le gel assez longtemps pour séparer la kinase et le substrat (typiquement 1 h à une puissance constante de 5 W) Assurez-vous de garder l'appareil gel protégé pour limiter l'exposition à 32
  4. Ici, utilisez des appareils de gel maison, mais les mini-gels standard disponibles dans le commerce sont parfaitement adaptés. Utilisez les dimensions comme suit:
    Gels: 8 cm de largeur, 5,5 cm de longueur (résolution), 1,5 mm d'épaisseur.
    Combs: 15 puits, épaisseur 1,5 mm, largeur 2,9 mm, profondeur 16 mm

4. Coloration et séchage du gel

Attention: pour toutes les étapes, assurez-vous de réduire l'exposition personnelle à 32 P en utilisant un blindage radioactif et portant un équipement de protection individuelle. Pour plus d'informations sur les étapes spécifiques, des références utiles sont incluses.

  1. Retirez le gel des plaques de verre et d'alumine et placez dans 50 mL de colorant Coomassie (10% d'acide acétique glacial, 50% de méthanol, 0,25% de colorant R-250) pendant 1 h sur un agitateur orbitaire réglé à 50 tours par minute. Pour cette étape, utilisez un conteneur légèrement plus grand que le gel lui-même. 8
  2. Déplacez le gel de la solution à la solution de fixation (10% d'acide acétique glacialD, 20% de méthanol) afin de décocher. Faire passer le gel dans 600 à 700 ml de solution de fixation pendant une nuit sur un agitateur orbital à 50 tr / min. Placez des morceaux de mousse ou des lingettes de laboratoire nouées dans le récipient avec le gel pour absorber le colorant Coomassie 8 , 9 .
  3. Retirer le gel de la solution de fixation et tremper dans 200 ml de methanol pendant 1-2 minutes avec une agitation douce jusqu'à ce que le gel devienne blanc laiteux. Cela aidera à prévenir les fissures pendant l'étape de séchage.
  4. Mouillez un papier filtrant qualitatif de 14 cm x 14 cm avec du methanol et placez-le sur un séchoir à vide en gel de dalle. Posez le gel sur le papier filtre face avant vers le haut.
  5. Couvrez soigneusement le gel avec une enveloppe en plastique pour éviter les rides et les bulles d'air. Faites fonctionner la sécheuse pendant 1,5 h à 80 ° C. Une fois que le vide a été atteint, ouvrir le couvercle et déployer toutes les bulles d'air si nécessaire avec un frein en caoutchouc doux.

5. Autoradiogramme et chiffres de scintillation

  1. Retirer driEt fixez un marqueur autorad, une règle phosphorescente ou des points au papier filtre sur le côté du gel. Si vous utilisez des points, assurez-vous qu'ils sont dans un motif asymétrique. Cela alignera le gel avec le film après l'exposition et le développement.
  2. Utilisez un compteur Geiger pour vérifier l'intensité du signal. Pour une exposition plus faible aux signaux à -70 ° C à -80 ° C avec un écran intensifiant, la densité de la bande de film augmentera.
  3. Dans une pièce noire, placez un gel séché dans une cassette de film avec un film et un écran intensifiant dans l'ordre suivant de haut en bas: gel, film, écran intensifiant.
  4. Fixez l'écran intensifiant sur le couvercle de la cassette et tapez le gel en place pour faciliter cette étape. L'écran intensif émet de la lumière lorsqu'il est irradié par les particules bêta des 32 P. Ces émissions lumineuses pénètrent le film plus efficacement que les particules bêta.
    1. Assurez-vous que la longueur d'onde émis par l'écran intensif correspondDes étangs à une longueur d'onde dont le film est le plus sensible.
    2. Utilisez un compteur Geiger pour déterminer combien de temps laisser l'exposition pour: si le nombre de cpm est de ~ 100 ou moins, essayez la nuit à -70 ° C. Si le nombre est de ~ 10 000, commencez par une exposition de 1 heure et optimisez-vous à partir de là.
  5. À la fin de l'exposition, retirez le film et développez-le dans un processeur médical / film de rayons X. Si l'exposition a été effectuée à -70 à -80 ° C, soit permettre à la cassette de se réchauffer à température ambiante pour minimiser la condensation sur le film ou enlever le film immédiatement avant la formation de condensation 10 .
  6. Posez le film sur le gel / papier filtre séché et alignez l'image du marqueur / points avec les marqueurs / points sur le gel séché. Marquez sur le film les bandes correspondant aux normes de protéines. Étiquetez les normes de protéines et quelles voies les réactions sont destinées à une référence ultérieure.
  7. Accise les bandes du gel qui correspondent aux bandes d'intérêt sur le film et placez-lesDans des flacons de scintillation de 7 mL. Ajouter 4 mL de fluide scintillant et compter avec un compteur à scintillation liquide. Confirmez que le compteur est configuré pour surveiller la fenêtre de spectre d'énergie correcte pour 32 P.
    REMARQUE: Assurez-vous également d'acciser la bande correspondant au substrat de la voie de contrôle sans kinase. Ceci sera utilisé pour calculer le rayonnement de fond qui sera soustrait de tous les comptes de scintillation d'échantillons.

6. Analyse des résultats

NOTE: L'autoradiogramme fournit une visualisation qualitative des résultats. Pour une quantification précise, l'incorporation de 32 P peut être mesurée avec un compteur à scintillation. Les données sont généralement exprimées en termes d'activité relative, comme le montre la figure 1B . Tant que des conditions uniformes sont maintenues pour tous les échantillons, les mesures relatives de l'activité spécifique sont suffisantes pour comparer les traitements.

  1. Lors du calcul des valeurs d'activité spécifique absolue, effectuer une rigueurOptimisation de toutes les conditions de réaction, y compris les concentrations de kinase, de substrat et d'ATP froide, afin d'assurer une gamme d'activité linéaire sur une durée ( p. Ex. 2 x [kinase] = 2 x activité spécifique). Pour les kinases ayant une activité spécifique élevée, effectuer des analyses avec une concentration accrue du substrat dans le cas où l'activité kinase est limitée par la quantité de substrat.
  2. Calculer l'activité spécifique de kinase d'intérêt dans des unités de nanomoles phosphate transférées par minute par mg de kinase.
    1. Soustraire les blancs du cpm dans les bandes comptées.
    2. Calculer la désintégration de l'ATP chaud: [(1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0,95 où t est le nombre de jours depuis la date de référence (devrait être fourni par le fournisseur), t 1/2 est le Demi-vie de 32 P, soit 14,3 jours, et 0,95 reflète l'efficacité du compteur de scintillation. Exemple: si vous utilisez un ATP chaud de 28 jours, la valeur de désintégration devrait être de 0,245.
    3. CalcUlate les picomoles (pmol) de l'ATP total dans le dosage (habituellement ceci est égal à la quantité d'ATP froid dans la réaction): volume d'analyse (μL) x [ATP froid] (μM) = ATP total (pmoles). Exemple: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
    4. Calculer cpm / pmol ATP: [μL d'ATP x chaud (2,2 x 10 7 ) x facteur de désintégration] / pmol d'ATP froid.
      NOTE: La valeur de 2,2 x 10 7 convertit 0,01 mCi / μL d'ATP en cpm.
    5. Calculer la quantité de kinase dans le dosage en mg. Pour la kinase recombinante et les kinases immunoprécipitées, des procédés classiques tels que les dosages BCA conviennent pour déterminer les concentrations de départ. Exemple: wtERK2 0,0002 μg / μL dans une réaction de 50 μL de kinase est de 0,01 μg, ou 1 x 10 -5 mg.
    6. Calculez les cpm totales dans le dosage. Assembler 30 μL de réactions et exécuter 20 μL de chaque réaction sur un gel. Multipliez le cpm compté (après soustraction vierge) par un facteur de volume / volume d'analyse total chargé. Poursuivre ce qui précèdeExemple, multipliez tous les chiffres par 1,5 ou 30/20.
    7. Calculer l'activité spécifique de la kinase analysée:
      Cpm total dans le dosage) / (cpm / pmol ATP) / (temps de dosage en minutes) / (quantité de kinase en mg)
      REMARQUE: diviser la valeur ci-dessus en 1000 donne l'activité spécifique en nanomoles / minute / mg
  3. Calculer combien de moles de phosphate sont incorporées dans un substrat (tant que sa masse moléculaire est connue). Ceci est utilisé pour déterminer le nombre de phosphosites sur une protéine particulière une fois la réaction terminée.
    Cpm total dans le dosage) / (cpm / pmol ATP)] / (quantité de substrat en pmol)

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Representative Results

WNK1 tests de kinase IP

Le WNK1 marqué par Myc a été transfecté dans des cellules HEK293 et ​​immunoprécipité avec un anticorps anti-Myc 11 . L'immunoprécipité montre une activité kinase vers le substrat modèle MBP ainsi que vers lui-même ( figure 1A ). Les mutants WNKl ont ensuite été testés pour l'activité kinase vers le MBP par la même méthode, employant cette fois des constructions marquées par GST ( Figure 1B ). Analyse du comportement de la kinase mutante par rapport aux résidus révélés de type sauvage critiques pour une activité WNK1 optimale.

Les cellules HEK293 ont été exposées à un panel de traitements pharmacologiques et biochimiques. En utilisant un anticorps dirigé contre un peptide N-terminal WNK1, l'activité endothélique WNK1 kinase immunoprécipitée a été testée en utilisant du MBP comme substrat. Le facteur de croissance épidermique (EGF), une activité connueOu de la signalisation ERK1 / 2, le nocodazole, un médicament qui cible la dynamique des microtubules, l'anisomycine, un inhibiteur de la traduction eucaryote et l'acide lysophosphatidique (LPA), un mitogène puissant, n'ont tous pas pu générer une augmentation robuste de la MBP phosphorylée. En revanche, on a démontré que le NaCl était un régulateur de l'activité kinase WNK1.

ERK2 essais de protéines kinase recombinantes

Rat ERK2 portant un N-terminal 6. Cette étiquette a été exprimée dans des cellules bactériennes et purifiée par affinité avec de la résine de nickel 12 . La protéine a encore été purifiée par Chromatographie d'échange d'ions sur une colonne MonoQ, dans laquelle plusieurs fractions d'élution ont été testées pour l'activité kinase ( Figure 2A ). Parce que ERK2 nécessite une double phosphorylation par MEK pour atteindre une activité kinase maximale, ERK2 purifié à partir de bactéries en l'absence de MEK est largement inactif. Par conséquent, afin de tester les fractions de recomBinant ERK2 pour l'activité vers MBP, une forme constitutivement active de MEK1 appelée MEK1R4F a été incluse dans les réactions kinase. Notamment, MEKR4F n'entretient pas d'activité kinase élevée sur MBP ( Figure 2 ).

En utilisant un dosage similaire à celui représenté sur la figure 2A , une activité MBP kinase a été utilisée pour mesurer l'activité de mutants ERK2 recombinants purifiés à partir de cultures bactériennes par rapport à la protéine de type sauvage ( figure 2B ). Bien que ERK2 soit capable de phosphoryler le MBP lorsqu'il est stimulé par MEKR4F, la mutation de la lysine catalytique (K52R) ou d'une thréonine proximale aux sites canoniques de phosphorylation double (T188D et T188E) abroge radicalement l'activité de la kinase ERK2. ERK2-T188D et ERK2-T188E affichent l'activité de la kinase marginale vers un petit peptide flexible ( Figure 2C ), mais ils ne peuvent pas phosphoryler vigoureusement les substrats ERK2 connus Nup153 et PDX1 ( Figure 2 D).

Figure 1
Figure 1: Dosages de la kinase immunoprécipitation de WNK1. ( A ) Les cellules HEK293 ont été transfectées avec pCMV5-Myc sans insert ou pCMV5-Myc-WNK1, des protéines marquées ont été immunoprécipitées avec l'anticorps anti-Myc suivi de dosages de kinase en utilisant du MBP comme substrat. L'autoradiographie est montrée à gauche, et un immuno-transfert des immunoprécipités à droite. ( B ) Diverses protéines mutantes GST-WNKl ont été utilisées dans des dosages de kinase avec du MBP comme substrat; La phosphorylation de MBP est exprimée en activité par rapport au WNK1 de type sauvage. ( C ) Le WNK1 endogène a été immunoprécipité à partir de cellules HEK293 traitées avec divers stimuli et testé pour l'autophosphorylation. Ce chiffre a été modifié de Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Dosages recombinants de la protéine kinase de ERK2. ( A ) Des fractions ERK2 purifiées à partir d'une colonne d'échange d'anions MonoQ ont été utilisées dans un dosage de kinase avec MBP en présence ou en l'absence de MEK1R4F, un stimulateur constitutivement actif de l'activité de la kinase ERK2. ( B ) Les mutants ERK2 ont été testés pour l'activité kinase sur MBP. ( C ) Les mutants de boucle d'activation ERK2-T188D et ERK2-T188E affichent une activité kinase marginale vers un substrat peptidique typique. ( D ) Comparaison des activités kinase ERK2 ou T188D suite à l'activation par MEK1R4F avec des substrats ERK2 connus nucléoporine-153 (Nup153) et le Homeobox 1 pancréatique et duodénal (PDX1). Les substrats phosphorylés sont désignés par des cales et des phosphorylesTed ERK2 et T188 par des astérisques. Réimprimé (et modifié) avec la permission de McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les kinases sont une famille variée de protéines qui ont développé une fonctionnalité étendue dans de nombreux contextes, et les analyses de kinase ont été incroyablement utiles dans l'étude de plusieurs protéines de signalisation et ont largement contribué à notre compréhension actuelle de la communication cellulaire. Notamment, le même dosage de base a été utilisé pour caractériser deux kinases disparates en dépit de grandes différences de structure et d'activité. La kinase WNK1 contient une poche catalytique atypique où la lysine critique s'est déplacée vers une position unique et est connue pour jouer un rôle dans la régulation des cotransporteurs de chlorure de cations à la fois à la kinase et aux fonctions d'échafaudage. L'activité kinase de WNK1 est connue pour avoir un faible nombre de chiffre d'affaires, même sur ses substrats les mieux caractérisés, les protéines kinases stimulant le stress oxydatif 1 (OSR1) et SPS / STE20 liées à la rinite riche en alanine riche (SPAK). En revanche, ERK2, avec la kinase ERK1 étroitement liée, affiche une activité kinase robuste lorsqu'il est activé 13 , 14 .

L'aspect le plus critique du dosage est l'assemblage de réaction. Afin de réaliser des mesures précises du point de temps, il faut prendre soin de l'initiation des réactions kinase. Il existe quatre exigences de base pour un essai de kinase: kinase, substrat, ATP et un ion métallique. Pour ce protocole, qui est principalement utilisé pour les kinases eucaryotes, le MgCl 2 est utilisé comme source de magnésium. Les préparations de la protéine kinase recombinante et de la kinase IP contiennent généralement du magnésium, rendant le MgCl 2 insuffisant en tant que démarreur de réaction. De même, l'ajout d'ATP non marqué ("froid") avant l'ajout d'ATP marqué ("chaud") peut initier une réaction de manière inappropriée tôt. Nous recommandons de préparer des réactions en utilisant un tampon de réaction de kinase concentré qui facilite l'addition simultanée de MgCl

Bien qu'il existe une certaine distinction entre les dosages de kinase IP et les dosages recombinants de protéines kinase, tLe paradigme expérimental commun aux deux témoigne de la polyvalence de ce dosage. En effet, il existe des cas où des caractéristiques des deux types de dosage de la kinase peuvent être mélangées, comme c'est le cas avec les études sur la voie de signalisation kinase à base de protéines kinase / extracellulaire activée par mitogène (MAPK / ERK). Dans cette voie, ERK1 / 2 est activé par double phosphorylation par le facteur amont MAPK / ERK kinase 1 (MEK1). Des études antérieures ont montré que si MEK1, ainsi qu'un mutant constitutivement actif appelé MEK1R4F, est en mesure d'activer ERK1 / 2, il possède une très faible activité vers le MBP. Par conséquent, ERK1 / 2 purifié à partir de cellules bactériennes affiche une activité kinase limitée vers le MBP à moins d'être traité avec MEK1R4F, créant une plate-forme robuste pour comparer l'activité kinase des modèles ERK1 / 2 de type sauvage aux constructions mutantes, comme le montre la figure 2 . L'inclusion de composants immunoprécipités peut ajouter encore plus de nuances, mettant en évidence le dosage de la kinase en tant que méthode hautement adaptable pour sonder la nDe ces importantes molécules de signalisation.

Bien que certains trouvent que le travail avec des matières radioactives est lourd, la traçabilité quantitative du dosage de la kinase radiomarquée est l'un de ses principaux avantages. Cependant, les progrès récents dans les domaines de la chimie des produits naturels, de la génomique et de la spectrométrie de masse ont créé une demande pour des dosages de kinase modifiés Avec des lectures plus adaptables aux applications à haut débit 15 . Étant donné que ces analyses profitent de différents matériaux d'étiquetage, des compromis sont réalisés en termes de précision, mais ceux-ci peuvent être résolus en utilisant un dosage radiomarqué pour valider les résultats de l'écran. Au fur et à mesure que notre compréhension de la signalisation de la protéine kinase augmente, il reste clair que les techniques permettant de déterminer les particularités des fonctions de régulation de la kinase continueront d'aider au développement d'outils et de thérapies.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient tous les membres actuels et anciens du laboratoire Cobb pour des travaux et des discussions précieux, et Dionne Ware pour l'assistance administrative. Ces études ont été appuyées par les National Institutes of Health Grant R37 DK34128 et Welch Foundation Grant I1243 au MHC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26, (22), 3100-3112 (2007).
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