Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Biochemistry

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Summary

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

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Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

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Abstract

Las proteínas quinasas son capaces de gobernar a gran escala los cambios celulares en respuesta a complejas matrices de estímulos, y mucho esfuerzo se ha dirigido a descubrir los detalles alostéricos de su regulación. Las quinasas comprenden redes de señalización cuyos defectos son a menudo características de múltiples formas de cáncer y enfermedades relacionadas, haciendo que una plataforma de ensayo sea susceptible de manipulación de factores reguladores aguas arriba y validación de requerimientos de reacción críticos en la búsqueda de terapias mejoradas. Aquí, describimos un ensayo de quinasa básico que se puede adaptar fácilmente para adaptarse a preguntas experimentales específicas incluyendo, pero sin limitarse a, ensayar los efectos de agentes bioquímicos y farmacológicos, manipulaciones genéticas tales como mutación y deleción, así como condiciones de cultivo celular y tratamientos para investigar Mecanismos de señalización celular. Este ensayo utiliza [γ-32P] ATP radiomarcado, que permite comparaciones cuantitativas y visualización clara de los resultados, y puede ser modPara uso con quinasa inmunoprecipitada o recombinante, sustratos específicos o tipificados, en una amplia gama de condiciones de reacción.

Introduction

Las proteínas quinasas son sofisticadas enzimas críticas para la transmisión de señales celulares en respuestas apropiadas 1 . Dado su papel en el mantenimiento de la homeostasis y la prevención o promoción de estados de enfermedad [ 2] , los métodos bioquímicos para evaluar la actividad quinasa siguen siendo herramientas poderosas para delinear los detalles de la señalización eucariótica [ 3] . Aunque las estrategias que utilizan anticuerpos fosfo-específicos han sido altamente informativas en términos de medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento en el estado de señalización celular 4 , un ensayo de quinasa permite medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento directamente en términos de la actividad enzimática de una quinasa de interesar. Si bien existen varias opciones para ensayos similares que no utilizan materiales radiactivos 5 , seguimos dependiendo de este método para una cuantificación robusta de los resultados. AhíSon dos aplicaciones típicas de este ensayo, ambas valiosas por diferentes razones: el ensayo de quinasa inmunoprecipitada (IP) ( Figura 1 ) y el ensayo de proteína quinasa recombinante ( Figura 2 ).

El ensayo de IP quinasa es tremendamente útil para identificar factores capaces de activar proteínas quinasas específicas así como para calibrar condiciones de tratamiento inhibidor. Brevemente, se transfecta una cinasa marcada con epítopo de interés en células eucariotas cultivadas, se somete a una variedad de tratamientos, se inmunoprecipita y se determina la capacidad para incorporar fosfato radiomarcado en un sustrato modelo ( por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP)). IP kinasa también se puede realizar sin recurrir a la sobreexpresión, ya sea por inmunoprecipitación de proteínas endógenas o cualquier número de técnicas de edición del genoma. Debido a que los tratamientos se administran en cultivo, este método puede detectar estimulaciones transmitidas a través de múltiples factores ascendentesO vías paralelas por lectura in vitro . Una ventaja importante de este método es que no requiere conocimiento previo de factores directos de aguas arriba o aguas abajo o sitios de fosforilación en el mismo. Además, una vez que se han identificado sustratos específicos para una quinasa de interés, se puede usar el mismo protocolo de ensayo de quinasa con componentes recombinantes para medir actividad específica hacia sustratos naturales e identificar sitios específicos de fosforilación cuando se combinan con análisis de espectrometría de masas. Los sitios identificados de esta manera pueden validarse adicionalmente con ensayos de quinasa utilizando sustratos de sustrato. Por último, este método también puede usarse para detectar y medir la autofosforilación.

El protocolo proporcionado aquí asume un esquema de purificación de proteínas optimizado o un método de transfección para expresar una quinasa marcada por afinidad de interés en células cultivadas. Para exposiciones más detalladas de transfección, lisis, inmunoprecipitación y protOcols, sugerimos referirse a Cold Spring Harbor Protocolos 6 . Para obtener más información sobre el desarrollo del ensayo y la modificación, consulte la Fosforilación de Proteínas: Selected Methods in Enzymology 7 .

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Protocol

1. Recursos de purificación de quinasa y tubería general de inmunoprecipitación

NOTA: Las quinasas para uso con este ensayo pueden obtenerse a partir de inmunoprecipitados de células cultivadas o por medios recombinantes tales como la purificación marcada por afinidad 6 . A continuación se muestra un protocolo general para la inmunoprecipitación marcada con bandera que puede tener que ser modificada dependiendo de la quinasa de interés. Todo debe mantenerse en hielo cuando sea posible.

  1. Añadir 2 μl de anticuerpo de 1 mg / ml a 200 μl de lisados ​​celulares (generalmente ~ 1 mg / ml de concentración de proteína total) e incubar a 4 ° C durante 1 h mientras se balancea.
  2. Lavar las perlas de proteína Sepharose 2-3 veces con tampón de lisis (ver más abajo) girando brevemente a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg ("spin"), retirando el sobrenadante con una pipeta y resuspendiendo las perlas en tampón .
    1. Preparar tampón de lisis: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol al 10%, ortovanadato sódico 0,2 mM, fluoruro de sodio 100 mM, β-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 al 0,1% o NP-40 al 0,1%.
  3. Añadir 30 μL de suspensión al 50% de perlas de sepharosa de proteína A en tampón de lisis a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h mientras se mecían.
  4. Toque el centrifugado a 4 ° C para sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante.
  5. Lavar 3 veces con 1 mL de tampón de lavado de perlas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4).
  6. Lavar una vez con tampón de reacción 1x quinasa (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM). Retire la mayor cantidad posible de tampón sin retirar las perlas.

2. Inicialización de las reacciones quinasas

NOTA: Para los ensayos de quinasa IP, ~ 15 μl de perlas no suspendidas es una muestra inicial típica. Para los ensayos de proteína quinasa recombinante, las cantidades iniciales típicas oscilan entre 0,1 - 1,0 μg en 1-10 para 25-50 μL de volúmenes de reacción finales. Ajustar los volúmenes de la muestra de proteína recombinanteS sean iguales con el tampón en el que se almacenan antes de inicializar el ensayo. Cuando se usan altas cantidades de quinasa, incluyen una proteína portadora tal como BSA para ayudar a mantener la estabilidad de la proteína durante la duración del ensayo.

  1. Preparar el tampón de reacción 5x quinasa dado a continuación:
    HEPES 50 mM pH 8,0
    MgCl $ ₂ $ 50 mM
    Benzamidina 50 mM (inhibidor de proteasa)
    50 mM DTT (agente de reducción)
    250 mu M ATP (sin marcar, o "frío")
  2. Mantener las muestras de quinasa en hielo en tubos de 1,5 mL. Preparar la siguiente mezcla de reacción en tubos separados de 1,5 mL refrigerados:
    21 mu l de H _ { 2 } O
    6 mu l de tampón de reacción 5x quinasa
    1 mu l de ATP radiomarcado ("caliente")
    2 μl de sustrato (~ 5 mg / ml)
    NOTA: Para ensayos de quinasa recombinante, el volumen puede ajustarse para acomodar la proteína purificada. Calcular de tal manera que el volumen de reacción final sea de 30 μl. Utilice esta receta para preparar un maestromezcla. Tras la recepción del ATP marcado, diluir el stock de H 2 O a una actividad específica de 0,01 mCi / μl antes de añadir a la mezcla de reacción.
  3. Para inicializar el ensayo, añadir toda la mezcla de reacción a la muestra de quinasa e incubar la reacción a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependiendo de la actividad de la quinasa que se está analizando.
    NOTA: Cuando se trabaja con una quinasa cuya actividad no se ha ensayado previamente, realizar un curso de tiempo de actividad quinasa con intervalos de 5 minutos entre los puntos de tiempo.

3. Terminación de reacción y SDS-PAGE

  1. Parar la reacción poniendo en hielo y añadiendo 7,5 μL de tampón de muestras Laemmli 5x 6 .
  2. Calentar a 100 ° C durante 30 s a 2 min en bloque de calor.
  3. Toque el centrifugado y cargue 20 μL por pocillo en gel SDS-PAGE al 10-15%. Haga funcionar el gel lo suficiente como para separar la quinasa y el sustrato (típicamente 1 h a una potencia constante de 5 W) Asegúrese de mantener el aparato de gel protegido para limitar la exposición a 32
  4. Aquí, utilice aparatos de gel hechos en casa, pero los mini-geles estándar disponibles en el mercado son perfectamente adecuados. Utilice las dimensiones como sigue:
    Geles: 8 cm de ancho, 5,5 cm de longitud (resolución), 1,5 mm de espesor.
    Peines: 15 pozos, 1,5 mm de espesor, 2,9 mm de ancho, 16 mm de profundidad

4. Gel de tinción y secado

Precaución: Para todos los pasos, asegúrese de reducir la exposición personal a 32 P mediante el uso de blindaje radiactivo y el uso de equipo de protección personal. Para obtener más información sobre pasos específicos se incluyen algunas referencias útiles.

  1. Se retira el gel de las placas de vidrio / alúmina y se coloca en 50 ml de tinción Coomassie (ácido acético glacial al 10%, metanol al 50%, colorante R-250 al 0,25%) durante 1 h en un agitador orbital ajustado a 50 rpm. Para este paso utilizar un recipiente que es ligeramente más grande que el propio gel. 8
  2. Mueva el gel de la mancha a la solución de fijación (10% de acD, 20% de metanol) con el fin de des-manchar. Roca el gel en 600-700 mL de solución de fijación durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm. Colocar trozos de espuma o toallitas de laboratorio anudadas en el recipiente con el gel para absorber el colorante Coomassie 8 , 9 .
  3. Quitar el gel de la solución de fijación y remojar en 200 ml de metanol durante 1-2 minutos con agitación suave hasta que el gel se vuelve blanco lechoso. Esto ayudará a evitar el agrietamiento durante la etapa de secado.
  4. Humedezca una pieza de 14 cm x 14 cm de papel de filtro cualitativo con metanol y colóquela en un secador de vacío de gel de placas. Coloque el gel en el lado del papel de filtro hacia arriba.
  5. Cubra el gel con envoltura de plástico con cuidado para evitar las arrugas y burbujas de aire. Hacer funcionar la secadora durante 1,5 ha 80 ° C. Una vez que se ha alcanzado el vacío, abra la tapa y despliegue cualquier burbuja de aire si es necesario con un rodillo de goma blanda.

5. Autoradiograma y Cuentas de Centelleo

  1. EliminarEd y unir un marcador autorad, regla fosforescente o puntos al papel de filtro en el lado del gel. Si utiliza puntos asegúrese de que están en un patrón asimétrico. Esto alineará el gel con la película después de la exposición y el desarrollo.
  2. Utilice un contador Geiger para comprobar la intensidad de la señal. Para señales más débiles, la exposición a -70 ° C a -80 ° C con una pantalla intensificadora aumentará la densidad de la banda de película.
  3. En un cuarto oscuro, poner gel seco en un casete de película con película y una pantalla de intensificación en el siguiente orden de arriba a abajo: gel, película, pantalla intensificadora.
  4. Conecte la pantalla intensificadora a la tapa del cassette y tape el gel en su lugar para facilitar este paso. La pantalla intensificadora emite luz cuando es irradiada por las partículas beta de los 32 P. Estas emisiones de luz penetran la película más eficientemente que las partículas beta.
    1. Asegúrese de que la longitud de onda emitida desde la pantalla intensificadora correspondaEstanques a una longitud de onda la película es la más sensible a.
    2. Utilice un contador Geiger para determinar cuánto tiempo dejará la exposición para: si el recuento de cpm es ~ 100 o inferior, intente durante la noche a -70 ° C. Si la cuenta es de ~ 10.000, comenzar con una exposición de 1 hora y optimizar desde allí.
  5. Al final de la exposición quitar la película y se desarrollan en un médico / procesador de película de rayos X. Si la exposición se realizó entre -70 y -80 ° C, permita que el casete se caliente a temperatura ambiente para minimizar la condensación en la película o retirar la película inmediatamente antes de que las formas de condensación 10 .
  6. Colocar la película sobre el gel / papel de filtro secado y alinear la imagen del marcador / puntos con los marcadores / puntos en el gel seco. Marque en la película las bandas correspondientes a las normas de proteínas. Etiquetar los estándares de proteínas y los carriles de las reacciones son para referencia futura.
  7. Excise las bandas del gel que corresponden a las bandas de interés en la película y colocarlasEn 7 ml de viales de centelleo. Añadir 4 ml de líquido de centelleo y contar con contador de centelleo líquido. Confirme que el contador está configurado para supervisar la ventana de espectro de energía correcta para 32 P.
    NOTA: Asegúrese también de eliminar la banda correspondiente al sustrato del carril de control sin quinasa. Esto se usará para calcular la radiación de fondo que se restará de todos los recuentos de centelleo de la muestra.

6. Análisis de Resultados

NOTA: El autorradiograma proporciona una visualización cualitativa de los resultados. Para la cuantificación exacta, la incorporación de 32P se puede medir con un contador de centelleo. Los datos se expresan generalmente en términos de actividad relativa, como se muestra en la Figura 1B . Mientras se mantengan condiciones uniformes para todas las muestras, las mediciones relativas de la actividad específica son suficientes para comparar los tratamientos.

  1. Al calcular los valores de actividad específicos absolutos, realice un rigorOptimización de todas las condiciones de reacción, incluyendo las concentraciones de quinasa, sustrato y ATP fría, con el fin de asegurar un rango lineal de actividad a lo largo del tiempo ( por ejemplo, 2 x [kinasa] = 2 x actividad específica). Para quinasas con alta actividad específica, realizar ensayos con una mayor concentración de sustrato en caso de que la actividad quinasa esté limitada por la cantidad de sustrato.
  2. Calcular la actividad específica de la quinasa de interés en unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de quinasa.
    1. Reste los espacios en blanco de las cpm en las bandas contadas.
    2. (T / t 1/2 )] x 0,95 donde t es el número de días desde la fecha de referencia (debe ser proporcionada por el proveedor), t 1/2 es el número de días desde la fecha de referencia Vida media de 32 P, que es 14,3 días, y 0,95 refleja la eficacia del contador de centelleo. Ejemplo: si se utiliza ATP caliente con 28 días de antigüedad, el valor de decaimiento debe ser 0.245.
    3. Calc(Pmol) de ATP total en el ensayo (usualmente esto es igual a la cantidad de ATP frío en la reacción): volumen de ensayo (μL) x [ATP frío] (μM) = ATP total (pmoles). Ejemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
    4. Calcular cpm / pmol ATP: [μl de ATP caliente x (2,2 x 10 7 ) x factor de desintegración] / pmol de ATP frío.
      NOTA: El valor de 2,2 x 10 7 convierte 0,01 mCi / μl de ATP en cpm.
    5. Calcular la cantidad de quinasa en el ensayo en mg. Tanto para la quinasa recombinante como para las quinasas inmunoprecipitadas, los métodos estándar tales como los ensayos de BCA son adecuados para determinar las concentraciones de partida. Ejemplo: wtERK2 0.0002 μg / μL en una reacción de quinasa de 50 μl es 0,01 μg, o 1 x 10 -5 mg.
    6. Calcular el total de cpm en el ensayo. Reúna 30 μL de reacciones y corra 20 μL de cada reacción en un gel. Multiplicar las cpm contadas (después de la sustracción en blanco) por un factor del volumen total del ensayo / volumen cargado. Continuando con lo anteriorEjemplo, multiplique todos los conteos por 1,5 o 30/20.
    7. Calcular la actividad específica de la quinasa ensayada:
      Total cpm en el ensayo) / (cpm / pmol ATP) / (tiempo de ensayo en minutos) / (cantidad de quinasa en mg)
      NOTA: Dividiendo el valor anterior por 1.000 se obtiene la actividad específica en nanomoles / minuto / mg
  3. Calcular cuántos mols de fosfato se incorporan en un sustrato (siempre y cuando se conozca su peso molecular). Esto se usa para determinar el número de fosfositos en una proteína particular una vez que la reacción ha terminado.
    Total cpm en el ensayo) / (cpm / pmol ATP)] / (cantidad de sustrato en pmoles)

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Representative Results

WNK1 IP quinasa ensayos

La WNK1 marcada con Myc se transfectó en células HEK293 y se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-Myc [ 11] . El inmunoprecipitado mostró actividad quinasa hacia el sustrato modelo MBP así como hacia sí mismo ( Figura 1A ). WNK1 mutantes fueron luego probados para la actividad quinasa hacia MBP por el mismo método, esta vez empleando GST marcado construcciones ( Figura 1B ]. El análisis del comportamiento de la quinasa mutante con respecto al tipo salvaje reveló residuos críticos para la actividad óptima de WNK1.

Las células HEK293 se expusieron a un panel de tratamientos farmacológicos y bioquímicos. Utilizando un anticuerpo creado contra un péptido WNK1 N-terminal, se ensayó la actividad de quinasa WNK1 endógena inmunoprecipitada usando MBP como sustrato. El factor de crecimiento epidérmico (EGF), un activat conocidoO de la señalización de ERK1 / 2, el nocodazol, un fármaco que se dirige a la dinámica de los microtúbulos, la anisomicina, un inhibidor de la traducción eucariótica, y el ácido lisofosfatídico (LPA), un potente mitógeno, fueron incapaces de provocar un aumento robusto de la MBP fosforilada. En contraste, se demostró que NaCl era un regulador de la actividad de quinasa WNK1.

Ensayos de proteína quinasa recombinante ERK2

La rata ERK2 que portaba una etiqueta 6His N - terminal se expresó en células bacterianas y se purificó por afinidad con resina de níquel 12 . La proteína se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna MonoQ, en la que se ensayaron varias fracciones de elución para determinar la actividad de quinasa ( Figura 2A ). Debido a que ERK2 requiere fosforilación dual por MEK para alcanzar la máxima actividad quinasa, ERK2 purificado de bacterias en ausencia de MEK es en gran medida inactivo. Por lo tanto, con el fin de probar fracciones de recomBinant ERK2 para la actividad hacia MBP, una forma constitutivamente activa de MEK1 denominada MEK1R4F se incluyó en las reacciones de quinasa. Notablemente, MEKR4F no alberga alta actividad quinasa MBP ( Figura 2 ].

Utilizando un ensayo similar al mostrado en la Figura 2A , se usó una actividad de MBP quinasa para medir la actividad de mutantes de ERK2 recombinantes purificados a partir de cultivos bacterianos con respecto a la proteína de tipo salvaje ( Figura 2B ). Aunque ERK2 es capaz de fosforilar MBP cuando estimulado por MEKR4F, la mutación de la lisina catalítica (K52R) o una treonina proximal a los sitios canónicos de fosforilación dual (T188D y T188E) drásticamente abroga ERK2 actividad quinasa. ERK2-T188D y ERK2-T188E muestran la actividad de la cinasa marginal hacia un péptido pequeño y flexible ( Figura 2C ), sin embargo, son incapaces de fosforilar de forma robusta los substratos ERK2 conocidos Nup153 y PDX1 ( Figura 2 D).

Figura 1
Figura 1: Ensayos de quinasa de inmunoprecipitación de WNK1. ( A ) Se transfectaron células HEK293 con pCMV5-Myc sin un inserto o pCMV5-Myc-WNK1, las proteínas marcadas se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-Myc seguido por ensayos de quinasa usando MBP como sustrato. La autorradiografía se muestra a la izquierda, y una inmunotransferencia de los inmunoprecipitados a la derecha. ( B ) Se usaron diversas proteínas mutantes GST-WNK1 en ensayos de quinasa con MBP como sustrato; La fosforilación de MBP se expresa como actividad relativa al WNK1 de tipo salvaje. ( C ) La WNK1 endógena se inmunoprecipitó a partir de células HEK293 tratadas con diversos estímulos y se ensayó para la autofosforilación. Esta figura se modificó a partir de Xu et al. , 2000 11 .5504fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Ensayos de proteína quinasa recombinante de ERK2. ( A ) Se usaron fracciones ERK2 purificadas de una columna de intercambio aniónico MonoQ en un ensayo de quinasa con MBP en presencia o ausencia de MEK1R4F, un estimulador constitutivamente activo de la actividad de la quinasa ERK2. ( B ) Se ensayaron mutantes de ERK2 para determinar la actividad de quinasa en MBP. ( C ) Los mutantes de lazo de activación ERK2-T188D y ERK2-T188E muestran actividad de quinasa marginal hacia un sustrato péptido tipificado pequeño. ( D ) Comparación de las actividades de la quinasa ERK2 o T188D después de la activación por MEK1R4F con sustratos ERK2 conocidos nucleoporin-153 (Nup153) y homeobox 1 pancreático y duodenal (PDX1). Los sustratos fosforilados se indican mediante cuñas y fosforilaERK2 y T188 por asteriscos. Reimpreso (y modificado) con el permiso de McReynolds et al. , 2016 12 (Copyright 2016 American Chemical Society). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Las quinasas son una familia diversa de proteínas que han desarrollado una amplia funcionalidad en numerosos contextos, y los ensayos de quinasa han sido increíblemente útiles en el estudio de varias proteínas de señalización y han contribuido en gran medida a nuestra comprensión actual de la comunicación celular. En particular, se utilizó el mismo ensayo básico para caracterizar dos cinasas dispares a pesar de diferencias importantes en estructura y actividad. WNK1 contiene una bolsa catalítica atípica donde la lisina crítica se ha desplazado a una posición única y se sabe que desempeña papeles en la regulación de cotransportadores de cloruro de catión a través de ambas funciones de quinasa y andamiaje. Se sabe que la actividad quinasa de WNK1 tiene un número de rotación bajo, incluso en sus sustratos mejor caracterizados, la quinasa rica en alanina (SPAK) relacionada con SPS / STE20, relacionada con el estrés oxidativo 1 (OSR1) y proteína quinasa. Por el contrario, ERK2, junto con la estrechamente relacionada quinasa ERK1, muestra la actividad de la quinasa robusto cuando se activa 13 , 14 .

El aspecto más crítico del ensayo es el montaje de reacción. Con el fin de realizar mediciones exactas del punto de tiempo, se debe prestar especial atención a la inicialización de las reacciones de quinasa. Existen cuatro requisitos básicos para que se realice un ensayo de quinasa: quinasa, sustrato, ATP y un ión metálico. Para este protocolo, que se utiliza principalmente para quinasas eucariotas, MgCl _ { 2 } se utiliza como fuente de magnesio. Tanto la proteína quinasa recombinante como las preparaciones de IP quinasa típicamente contienen magnesio, haciendo que MgCl2 sea insuficiente como un iniciador de la reacción. Del mismo modo, la adición de ATP no marcado ("frío") antes de la adición de ATP marcada ("caliente") puede iniciar una reacción inadecuadamente temprana. Se recomienda la preparación de reacciones utilizando un tampón de reacción de quinasa concentrado que facilita la adición simultánea de MgCl

Aunque existe alguna distinción entre los ensayos de quinasa IP y los ensayos de proteína quinasa recombinante, tEl paradigma experimental común a ambos demuestra lo versátil que puede ser este ensayo. De hecho, hay casos en que pueden combinarse características de ambos tipos de ensayo de quinasa, al igual que con estudios sobre la ruta de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno / quinasa regulada por señal extracelular (MAPK / ERK). En esta vía, ERK1 / 2 se activan por doble fosforilación por el factor de entrada MAPK / ERK quinasa 1 (MEK1). Estudios anteriores han demostrado que mientras MEK1, así como un mutante constitutivamente activo denominado MEK1R4F, es capaz de activar ERK1 / 2, que alberga muy baja actividad hacia MBP. En consecuencia, ERK1 / 2 purificado a partir de células bacterianas muestran una actividad quinasa limitada hacia MBP a menos que se traten con MEK1R4F, creando una plataforma robusta para comparar la actividad quinasa de ERK1 / 2 de tipo salvaje a constructos mutantes, como se muestra en la Figura 2 . La inclusión de componentes inmunoprecipitados puede añadir aún más matices, destacando el ensayo de quinasa como un método altamente adaptable para sondar el nDe estas importantes moléculas de señalización.

Si bien algunos pueden encontrar que el trabajo con materiales radiactivos es engorroso, la trazabilidad cuantitativa del ensayo de quinasa radiomarcado es una de sus principales ventajas. Sin embargo, los recientes avances en los campos de la química natural del producto, genómica y espectrometría de masas han creado una demanda de ensayos de quinasa modificada Con lecturas más adecuadas para aplicaciones de alto rendimiento 15 . Debido a que estos ensayos aprovechan los diferentes materiales de etiquetado, se realizan compromisos en términos de exactitud, pero éstos pueden ser superados usando un ensayo radiomarcado para validar los resultados de la pantalla. A medida que nuestra comprensión de la proteína quinasa de señalización aumenta, sigue siendo claro que las técnicas capaces de descubrir los detalles de las funciones de la quinasa reguladora seguirá ayudando en el desarrollo de herramientas y terapias.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen a todos los miembros actuales y antiguos del laboratorio de Cobb por trabajos valiosos y discusiones, y Dionne Ware por asistencia administrativa. Estos estudios fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud Grant R37 DK34128 y Welch Foundation Grant I1243 a MHC

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8 x 10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8" x 10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8" x 10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

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References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26, (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366, (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16, (16), 7788-7794 (2008).
  6. Cold Spring Harbor Protocols. Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
  7. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121, (51), 12215 (1999).
  8. Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
  9. Autoradiography. Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
  10. Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. 3 edn, Humana Press. (2009).
  11. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275, (22), 16795-16801 (2000).
  12. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55, (12), 1909-1917 (2016).
  13. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4, (196), rs11 (2011).
  14. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  15. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18, (8), 444-455 (2016).

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