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इन विट्रो में और टी, बी और माइलॉयड कोशिकाओं की दमन गतिविधि और प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से विनोदी प्रतिक्रियाओं के Vivo आकलन में

Immunology and Infection

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Summary

यहाँ, हम प्रत्यारोपण में सहिष्णुता प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है, और इन विट्रो में आकलन और vivo में प्राप्तकर्ता से अलग सेल सबसेट की दमन क्षमता और दाता या exogenous एंटीजन की ओर प्राप्तकर्ता की प्रतिरक्षा स्थिति.

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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Abstract

प्रत्यारोपण में मुख्य चिंता विनियामक कोशिकाओं के प्रेरण के माध्यम से विशिष्ट सहिष्णुता को प्राप्त करने के लिए है । सहिष्णुता तंत्र की समझ विश्वसनीय मॉडलों की आवश्यकता है । यहां, हम चूहे में कार्डियक allograft के लिए सहिष्णुता के मॉडल का वर्णन, costimulation संकेतों की नाकाबंदी द्वारा प्रेरित या जीन हस्तांतरण के माध्यम से immunoregulatory अणुओं के विनियमन द्वारा । इन मॉडलों में से प्रत्येक में vivo उत्पादन विनियामक कोशिकाओं जैसे नियामक टी कोशिकाओं (Tregs), विनियामक बी सेल (Bregs) या विनियामक माइलॉयड कोशिकाओं (RegMCs) की अनुमति दी । इस पांडुलिपि में, हम दो पूरक प्रोटोकॉल है कि पहचान और इन विट्रो में परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है का वर्णन और vivo विनियामक सेल गतिविधि में सहिष्णुता प्रेरण और रखरखाव में अपनी जिंमेदारी का निर्धारण करने के लिए सबसे पहले, एक इन विट्रो दमन परख एक खुराक निर्भर तरीके में प्रभाव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर दमन क्षमता के साथ कोशिकाओं की तेजी से पहचान की अनुमति दी, और cytokine माप या cytotoxicity के रूप में आगे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । दूसरा, एक नव विकिरणित भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता को एक सहिष्णु इलाज प्राप्तकर्ता से कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण, भ्रष्टाचार को नियंत्रित करने में इन कोशिकाओं के tolerogenic गुणों पर प्रकाश डाला प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का निर्देशन किया और/ संक्रामक सहिष्णुता का कार्यकाल) । इन पद्धतियों ज्ञात phenotypic मार्करों के साथ कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है और किसी भी सेल जनसंख्या के लिए बढ़ाया जा सकता है । इसके अलावा, दाता विनियामक कोशिकाओं के allospecificity निर्देशित (क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण लक्ष्य) तृतीय पक्ष दाता कोशिकाओं या या तो इन विट्रो में या vivo मेंभ्रष्टाचार का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, इन विनियामक कक्षों की विशिष्ट tolerogenic क्षमता का निर्धारण करने के लिए, हम नए या पूर्व ज्ञात एंटीजन के विरुद्ध विनोदी प्रतिक्रियाओं को विकसित करने के लिए विनोदी विरोधी दाता एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं और प्राप्तकर्ता की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । वर्णित सहिष्णुता के मॉडल को आगे विनियामक कोशिकाओं की विशेषता इस्तेमाल किया जा सकता है, नए मार्क्स की पहचान करने के लिए, और immunoregulatory अणुओं, और अंय प्रत्यारोपण मॉडल या मूषक या मानव में स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए अनुकूलनीय हैं ।

Introduction

चूहे में कार्डियक allograft सहिष्णुता प्रेरण उपचार का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय अंग प्रत्यारोपण मॉडल है, सहिष्णुता प्रेरण और रखरखाव के तंत्र को समझने के लिए, और कार्यात्मक रूप से सक्षम और प्रमुख नियामक कोशिकाओं को प्रेरित करने की क्षमता है । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल एक लुईस 1W दाता चूहा (LEW. 1W, RT1यू) एक लुईस 1a प्राप्तकर्ता चूहे (LEW. 1a, RT1) में से एक पूरी तरह से बेमेल heterotopic हृदय भ्रष्टाचार का वर्णन । इस भ्रष्टाचार संयोजन में तीव्र अस्वीकृति तेजी से होता है (के बारे में 7 दिनों में) और आसानी से पेट की टटोलने का कार्य के माध्यम से भ्रष्टाचार की धड़कन माप द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ हम तीन प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करने के लिए चूहे में कार्डियक allograft के लिए सहिष्णुता प्रेरित. इन मॉडलों में, सहिष्णुता प्रेरित और/या अलग विनियामक सेल प्रकार के द्वारा बनाए रखा है । सबसे पहले, CD40 के अवरुद्ध-एक एडीनोवायरस एंकोडिंग CD40Ig के साथ CD40L बातचीत (AdCD40Ig) सीडी की पीढ़ी प्रेरित जब Tregs माध्यमिक भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ताओं को हस्तांतरित 1सहनशीलता उत्प्रेरण में सक्षम adoptively । इसके अलावा, सीडी+ कोशिकाओं की कमी (विरोधी CD8α एंटीबॉडी के साथ) AdCD40Ig-इलाज प्राप्तकर्ताओं में Bregs और RegMCs2उत्पंन । सीडी+ Tregs गुण के दीप विश्लेषण interleukin के रूप में परिभाषित कई immunoregulatory अणुओं की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला-३४ (IL-३४) और Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . IL-३४ के व्यक्त (एक AAV वेक्टर के साथ) जबकि RegMCs, FGL के एक्सप्रेस-2 प्रेरित Bregs की पीढ़ी के माध्यम से प्रेरित Tregs, विनियामक कोशिकाओं के जटिल नेटवर्क अंतर्निहित ।

क्योंकि पुरानी अस्वीकृति धीरे विकसित करता है और दीर्घकालिक है, एक में गहराई से विश्लेषण के लिए सहिष्णुता बनाम पुरानी अस्वीकृति भेद की आवश्यकता है । भ्रष्टाचार आमतौर पर सेल घुसपैठ, फाइब्रोसिस, संवहनी दीवार की और अधिक मोटा होना के लिए मूल्यांकन किया गया है और immunohistology द्वारा C4d जमाव पूरक7। जबकि प्रोटोकॉल तरीकों पशु बलिदान या भ्रष्टाचार बायोप्सी की आवश्यकता होती है, यहां हम एक सरल विधि का वर्णन करने के लिए अलग सुविधाओं का आकलन बर्दाश्त allograft: उद्भव और समारोह विनियामक कोशिकाओं और विरोधी दाता विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं रक्त से फ्लो cytometry द्वारा नमूना (यहाँ, हम प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का इस्तेमाल किया).

उपचार की गिरफ्तारी के बाद allograft के लिए सहिष्णुता का रखरखाव आम तौर पर विनियामक कोशिकाओं की प्रेरण8के साथ जुड़ा हुआ है । पिछले दशकों में, सीडी पर ध्यान केंद्रित अध्ययन+Tregs सर्वसंमति से उंहें प्रमुख मार्करों द्वारा विशेषता Foxp3+, CD25उच्च, और CD127-9,10,11। इसी प्रकार, कई मार्करों को सीडी+ Tregs, जैसे CD122+, CD28-, CD45RCकम, PD1+, और Helios+ 1,12,13,14 को जिम्मेदार ठहराया गया , 15 , 16 , 17. वर्षों से, GITR, CTLA4, और साइटोकिंस (il-10, TGFβ, il-३४, il-३५, FGL-2) की अभिव्यक्ति इसके अतिरिक्त एक Treg प्रोफ़ाइल3,4,6,13के लिए जुड़े थे, 18,19,20,21. हालांकि, उभरते विनियामक कोशिका आबादी, जैसे Bregs, RegMCs, या NKTregs, प्रासंगिक विशिष्ट मार्करों की कमी है । दरअसल, Bregs ज्यादातर अपरिपक्व CD24+ कोशिकाओं के रूप में सूचित कर रहे हैं, अस्पष्ट CD27 अभिव्यक्ति और कई बार आईएल के उत्पादन के साथ-10, TGFβ, या granzyme बी22,23,24. माइलॉयड कोशिका वंश की जटिलता कई मार्करों के संयोजन जैसे CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a, या CD16325,26के रूप में अपने विनियामक या भड़काऊ प्रोफ़ाइल को परिभाषित करने की आवश्यकता है । अंत में, कुछ मार्करों CD11b+, CD27+, TGFβ+जैसे NKTregs की पहचान करने के लिए सूचित किया गया है, लेकिन अधिक अध्ययन करने के लिए आगे की जरूरत है phenotypically उन्हें वर्णन27,28,29 ,30,31,३२. इस प्रकार, दमन गतिविधि के सबूत नए immunoregulatory मध्यस्थों की पहचान के लिए आगे phenotypic विवरण वैध करने के लिए, और नए सेल चिकित्सा के लिए गुंजाइश का विस्तार करने के लिए आवश्यक हैं ।

हम दो पूरक विधियों का प्रस्ताव कोशिकाओं के दमन गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए । सबसे पहले, इन विट्रो विधि के साथ संवर्धन दमन कोशिकाओं के होते है लेबल के प्रभाव से प्रेरित टी कोशिकाओं allogeneic दाता प्रतिजन प्रस्तुत करने से उत्तेजित कोशिकाओं (APCs) पर विभिंन अनुपात में 6 दिन, और प्रभाव टी सेल प्रसार का विश्लेषण है कि दाता-निर्देशित प्रतिरक्षा दमन को दर्शाता है । इलाज चूहों से कोशिकाओं को सीधे की तुलना में भोली चूहों और गैर-व्यवहारीय गतिविधि के लिए (या किसी भी अंय विनियामक सेल जनसंख्या के लिए चूहों), दमन की एक श्रेणी में: प्रभाव अनुपात में किया जा सकता है । इसके अलावा, इस विधि किसी भी प्रत्यारोपण की आवश्यकता नहीं है, और परिणाम 6 दिनों के भीतर प्राप्त कर रहे हैं । दूसरा, vivo में विधि एक इलाज चूहे से एक नए विकिरणित भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता के लिए लक्षित विनियामक कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के होते हैं । जबकि बी कोशिकाओं, माइलॉयड कोशिकाओं या गैर से टी कोशिकाओं-भोले चूहों का इलाज आम तौर पर तीव्र अस्वीकृति को बाधित करने में असमर्थ हैं और दत्तक ग्रहण स्थानांतरण पर भ्रष्टाचार अस्तित्व को लंबा करने के लिए, उपचार प्राप्तकर्ताओं से potentiated दमन गतिविधि के साथ कोशिकाओं को इन विशेषताओं है 1,2,3,4,३३. प्राप्तकर्ता के विकिरण से प्रेरित Lymphopenia adoptively हस्तांतरित कोशिकाओं को रक्त homeostasis से अप्रभावित रहने के लिए और अधिक आसानी से विरोधी दाता प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं गुरु की अनुमति के लिए सिफारिश की है । दोनों तरीकों के लिए, allogeneic तीसरे पक्ष के APCs या vivo में दमन कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण में एक तीसरे पक्ष के दिल के साथ भ्रष्टाचार विरोधी दाता विशिष्टता के विश्लेषण की अनुमति के इन विट्रो उपयोग । जबकि vivo में विधि कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या की आवश्यकता है, खराब प्रतिनिधित्व सेल उपजनसंख्या और अधिक आसानी से इन विट्रो३३में दमन गतिविधि के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।

विनोदी प्रतिक्रियाएं भी सहिष्णुता की स्थिति और दाता एंटीजन को निर्देशित एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के नियंत्रण का आकलन करने के लिए मापा जा सकता है । दरअसल, सहिष्णुता दाता लेकिन प्राप्तकर्ताओं के लिए नए एंटीजन और स्मृति प्रतिक्रियाओं के संरक्षण के लिए विनोदी प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए क्षमता के संरक्षण की ओर विनोदी प्रतिक्रिया के अभाव की विशेषता हो सकती है । सबसे पहले, alloantibody का पता लगाने के सिद्धांत एक भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता से सीरम के साथ दाता कोशिका प्रकार के प्राप्तकर्ता एंटीबॉडी निंनलिखित की मशीन द्वारा दाता कोशिकाओं की मांयता पर आधारित है । दूसरा, exogenous एंटीजन को निर्देशित विनोदी प्रतिक्रियाओं कीहोल Limpet Hemocyanin (KLH) सीफाइड के साथ पूरा Freund के सहायक के साथ दीर्घकालिक सहिष्णु प्राप्तकर्ताओं की उत्तेजना के बाद मूल्यांकन किया जा सकता है । एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट आईजीएम और आईजीजी एंटीबॉडी की उपस्थिति 4 और 13 दिन का पता लगाया जा सकता है, क्रमशः, प्रतिरक्षण के बाद, एंजाइम से जुड़े ImmunoSorbent परख (एलिसा)३४। तीसरा, प्रतिरक्षा स्मृति प्रतिक्रियाओं के संरक्षण के दिनों में xenogeneic लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) के इंजेक्शन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता-7 और प्रत्यारोपण के 3 + और प्राप्तकर्ता सीरम के साथ दाग कोशिकाओं दिनों में एकत्र + 8 और + 17 निंनलिखित ट्रांसप्लांटेशन । इन सभी तरीकों विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके immunoglobulin उपप्रकार की पहचान के लिए अनुमति देते हैं, और FACS धुंधला या एलिसा द्वारा कुछ ही घंटों से कम १.५ ज में परिणामों के तेजी से अधिग्रहण ।

अंत में, इन प्रोटोकॉल प्रत्यारोपण मॉडल के लक्षण वर्णन के लिए डिजाइन किए हैं, और हो सकता है, कुछ हद तक, स्व-प्रतिरक्षित रोग मॉडल के लिए लागू किया । विधि के सिद्धांतों को सभी प्रजातियों में स्थानांतरित किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: सभी प्रोटोकॉल यहां एक नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और एक बाँझ तरीके से किया जाना चाहिए ।

1. चूहे में कार्डियक Allograft के एक मॉडल में सहिष्णुता की पीढ़ी

  1. LEW. 1W to LEW. 1a allograft सामा
    1. Anesthetize एक दाता नर LEW. 1W चूहे का प्रयोग isoflurane-o2 साँस लेना, 5 मिनट के बाद 1% N2o के साथ पूरक. पृष्ठीय decubitus में पशु रखें, और betadine एक thoracotomy प्रदर्शन करने के लिए के साथ पेट को संक्रमित (यानी, में चीरा छाती की फुफ्फुस अंतरिक्ष) ।
      1. अवर और सुपीरियर venae cavae दबाना, उंहें संयुक्ताक्षर, और उंहें काट । फिर फेफड़े की धमनी और महाधमनी में कटौती और ठंड ०.९% NaCl में भ्रष्टाचार को बचाने के ।
    2. Anesthetize एक २५० g नर LEW. 1a प्राप्तकर्ता चूहा (8-12 सप्ताह के) isoflurane-o2 साँस लेना, 5 मिनट के बाद 1% N2के साथ पूरक का उपयोग कर. पृष्ठीय decubitus में पशु प्लेस, और betadine के साथ पेट को संक्रमित एक xyphopubic laparotomy प्रदर्शन करने के लिए (यानी, असिरूप प्रक्रिया से जघन symphysis के लिए बड़ा चीरा).
      1. आंतों Externalize, उदर रक्त वाहिकाओं दबाना, एक termino पार्श्व सम्मिलन प्रदर्शन (यानी, एक चैनल के अंत के बीच संबंध और अंय की दीवार) भ्रष्टाचार महाधमनी और उदर महाधमनी के बीच और फेफड़े के बीच धमनी और पेट वेना कावा, और clamps हटा दें ।
    3. पेशी विमान और त्वचा टांका, और betadine साथ संक्रमित ।
    4. सुई nalbuphine (एनाल्जेसिक) 6 मिलीग्राम/कम से कम (एस॰सी॰) और ओक्षयत्टे्रास्यकलने (एंटीबायोटिक) पेशी (आइएमएस), और जानवर जागता है जब तक एक गर्मी लैंप के नीचे जानवर जगह है । इंजेक्षन buprenorphine (opioid) (५० µ g/kg) आइएमएस और meloxicam (गैर-स्टेरॉयड विरोधी भड़काऊ दवा) (०.३ mg/रोपाई के दिन एस॰सी॰ और एक दिन बाद ।
  2. costimulatory बातचीत की नाकेबंदी से सहिष्णुता की प्रेरण
    1. 1.1.1 चरणों का पालन करें । 1.1.2 तक ।
    2. पशु सुविधा के एक वर्गीकृत A2 क्षेत्र में, पतला 2 x 1010 संक्रामक कणों के AdCD40Ig (एक एडीनोवायरस एंकोडिंग CD40Ig, एक chimeric अणु है कि ब्लॉक CD40-CD40L बातचीत) रिंगर स्तनपान समाधान में १५० µ के एक अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए l और भ्रष्टाचार के शीर्ष की वेंट्रिकुलर दीवार में 3 अंक (3 x ५० µ l) में सुई ।
    3. 1.1.3 से 1.1.4 चरणों का पालन करें ।
      नोट: AdCD40Ig उपचार एंटी-CD8α, एंटी-िकोस, या एंटी-CD28 एंटीबॉडी इंजेक्शन2,३५,३६के साथ संबद्ध किया जा सकता है ।
  3. एक संयोजक प्रोटीन का इजहार द्वारा सहिष्णुता की प्रेरण
    1. पतला 1 एक्स 1012 वायरल जीनोम चूहे की IL34-संयोजक AAV रिंगर स्तनपान कराने के समाधान में १०० के एक अंतिम खंड तक पहुंचने के लिए µ एल Anesthetize एक १५० g LEW. 1a isoflurane के साथ चूहा-हे2 साँस लेना और नसों में सुई (i.v.) शिश्न नस में ।
    2. एक महीने के बाद AAV-IL34 इंजेक्शन, प्रोटोकॉल १.१ के अनुसार LEW. 1a प्राप्तकर्ता पर एक LEW. 1W भ्रष्टाचार करते हैं ।

2. इन विट्रो में कोशिकाओं के आकलन मिश्रित लिम्फोसाइटों प्रतिक्रियाओं (एमएलआर) द्वारा दमन गतिविधि

नोट: इलाज सहिष्णु चूहों से कोशिकाओं की दमन गतिविधि syngeneic भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ताओं या भोली चूहों से समकक्ष आबादी के साथ तुलना की जानी चाहिए.

  1. अलगाव of allogeneic APCs: plasmacytoid वृक्ष cells (पीडीसी)
    1. Anesthetize एक पुरुष LEW. 1W भोली दाता चूहे का उपयोग isoflurane-o2 साँस लेना, 5 मिनट के बाद 1% N2के साथ पूरक. पृष्ठीय decubitus में पशु रखें, और betadine एक splenectomy प्रदर्शन करने के लिए पेट को संक्रमित । तिल्ली transecting, ठंड 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) में तिल्ली बचाने के लिए और पशु टांका द्वारा प्लीहा निकालें ।
    2. एक डिश में तिल्ली स्थानांतरण, 1x पंजाबियों और perfuse ०.२% collagenase डी की 5 मिलीलीटर के साथ हटा दें । एंजाइम पाचन में सुधार करने के लिए, तिल्ली छोटे टुकड़ों में कटौती और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन ।
    3. जोड़ें ०.१ एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के ५०० µ एल, एक छलनी में तिल्ली के टुकड़े हस्तांतरण और एक सिरिंज के पिस्टन के साथ तिल्ली क्रश कोशिकाओं अलग. एक ट्यूब में स्थानांतरण और 1x पंजाबियों की 15 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । ४३० x जी पर 10 मिनट के केंद्रापसारक supernatant त्यागें ।
    4. कोशिकाओं और प्लेटलेट्स को खत्म करने के लिए, 10 मिलीलीटर hypotonic समाधान में splenocyte गोली reसस्पेंड और कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट की मशीन । 1x पंजाबियों के साथ धो और १९० x g पर 10 मिनट के केंद्रापसारक supernatant त्यागें ।
    5. एक १०० µm ऊतक फिल्टर पर फ़िल्टरिंग द्वारा कोलेजन फाइबर निकालें । सेल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए कोशिकाओं को 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल में 1x पंजाबस/2% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS)/0.5 mM EDTA ।
      नोट: splenocytes की संख्या 4 x 108 और 7 x 108 कक्षों के बीच होनी चाहिए ।
    6. सेल छंटाई से पहले नकारात्मक चयन द्वारा ब्याज की कोशिकाओं के लिए समृद्ध । 2 µ जी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन/एमएल शुद्ध एंटीबॉडी टी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट (anti-TCRαβ, R7/3 क्लोन, और विरोधी TCRγδ, V65 क्लोन), बी कोशिकाओं (विरोधी CD45RA, OX33 क्लोन), और NK कोशिकाओं (विरोधी CD161, 3.2.3 क्लोन), 1x पंजाबियों के साथ धो/2% FCS/0.5 mM EDTA और केंद्रापसारक 10 मिनट में ४३० x जी . supernatant को त्यागें ।
    7. 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ 3 बार चुंबकीय मोतियों के साथ धो लें । ३.५ µ l मोती का प्रयोग करें/106 splenocytes, 30 एमएल 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA, चुंबक पर 1 मिनट के लिए जगह जोड़कर धो लें, और supernatant त्यागें । दोहराएं दो बार । FCS/0.5 mm EDTA (उदाहरण के लिए, ३५ µ l मोती ३५० µ l 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mm EDTA) में पतला है 1x पंजाब के 10 संस्करणों में मोतियों को पुनर्निलंबित ।
    8. आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ splenocytes मिश्रण से अवांछित कोशिकाओं को हटाने, 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह है और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । दोहराएं दो बार । कोशिकाओं की गणना और 5 एक्स 107 कोशिकाओं/एमएल में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
      नोट: समृद्ध splenocytes संख्या 5 x 107 और 9 x 107के बीच सीमा चाहिए ।
    9. पीडीसी की छंटाई के लिए लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर कोशिकाओं दाग: शेष टी कोशिकाओं (anti-TCRαβ, R7/3 क्लोन) या बी कोशिकाओं (anti-CD45RA, OX33 क्लोन), और सॉर्ट सीडी+ (anti-सीडी, OX35 क्लोन) CD45R+ कोशिकाओं (anti-CD45R, His24 क्लोन) को छोड़ दें । लेबल प्रत्येक अटल बिहारी के साथ मोती FACS पर एक मुआवजा मैट्रिक्स की स्थापना । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन और 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लो ।
    10. 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल, एक ६० µm ऊतक फिल्टर पर फिल्टर के एक एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पेंड, और ०.१ µ जी की एक अंतिम एकाग्रता पर DAPI जोड़ने के द्वारा और लेबल मृत कोशिकाओं को. एक ७० µm नोजल सेल सॉर्टर के साथ सॉर्ट कोशिकाओं, DAPI पर गेटिंग द्वारा-TCR-CD45RA-सीडी+CD45R+ के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया है ।
  2. उत्तरदाता प्रभावक t कोशिकाओं का आइसोलेशन (सीडी + CD25 - t कक्ष)
    1. एक गैर इलाज गैर-भ्रष्टाचारी भोली LEW. 1a चूहा से तिल्ली फसल और ठंड 1x पंजाबियों में इसे बचाने के लिए ।
    2. एक डिश में रखा छलनी में तिल्ली हस्तांतरण और 1x पंजाबियों के 10 मिलीलीटर जोड़ें । कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सिरिंज के पिस्टन के साथ तिल्ली क्रश. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण, 1x पंजाबियों के साथ धोने और ४३० एक्स जी में 10 मिनट के केंद्रापसारक supernatant त्यागें ।
    3. कोशिकाओं और प्लेटलेट्स को खत्म करने के लिए, आरटी में 5 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर hypotonic समाधान में splenocyte गोली reसस्पेंड, तो 1x पंजाब में धोने और 10 मिनट १९० एक्स जी पर केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    4. एक १०० µm ऊतक फिल्टर पर फ़िल्टरिंग द्वारा कोलेजन फाइबर निकालें । सेल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए कोशिकाओं की गणना 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल में 1x पंजाब/2% FCS/0.5 mM EDTA ।
      नोट: splenocytes की संख्या 3 x 108 और 5 x 108 कोशिकाओं के बीच होनी चाहिए ।
    5. छंटाई से पहले ब्याज की कोशिकाओं को समृद्ध । 2 µ जी/एमएल सीडी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन (anti-CD8α, OX8 क्लोन), बी कोशिकाओं (विरोधी CD45RA, OX33 क्लोन), NK कोशिकाओं (विरोधी CD161, 3.2.3 क्लोन), माइलॉयड कोशिकाओं (विरोधी CD11b/सी, OX42 क्लोन), गामा डेल्टा टी कोशिकाओं (विरोधी TCRγδ, V65 क्लोन) । तो फिर 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो और ४३० x g पर 10 मिनट के केंद्रापसारक supernatant त्यागें ।
      नोट: सीडी+ प्रभाव टी कोशिकाओं के रूप में एक ही समय में भोली चूहों से प्राकृतिक सीडी+ Tregs सॉर्ट करने के लिए, कमी के दौरान विरोधी CD8α एबी जोड़ नहीं है.
    6. चरण 2.1.7 में वर्णित के रूप में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ चुंबकीय मोती 3 बार धो लें ।
    7. आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ splenocytes मिश्रण से अवांछित कोशिकाओं को निकालें, तो 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह है और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । दोहराएं दो बार । कोशिकाओं की गणना और 5 एक्स 107 कोशिकाओं/एमएल में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
      नोट: splenocytes संख्या 5 x 107 और 8 x 107 कक्षों के बीच श्रेणी होनी चाहिए ।
    8. सीडी को क्रमबद्ध करने के लिए लेबल एंटीबॉडी जोड़ें+CD25- टी कोशिकाओं: विरोधी TCRαβ (R7/3 क्लोन), विरोधी सीडी (OX35 क्लोन), विरोधी CD25 (OX39 क्लोन) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन । इसके साथ-साथ सॉर्ट करने के लिए सीडी+CD45RCकम Tregs, एंटी-CD45RC Ab (OX22 क्लोन) जोड़ें । प्रत्येक अटल बिहारी के साथ लेबल मोती प्रवाह cytometry पर आगे की प्रक्रिया के लिए एक मुआवजा मैट्रिक्स स्थापित करने के लिए । सेल को 1x पंजाबन/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लें और supernatant को त्याग दें ।
    9. 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल, एक ६० µm ऊतक फिल्टर पर फिल्टर, और ०.१ µ g/एमएल की अंतिम एकाग्रता पर DAPI जोड़कर लेबल मृत कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं को reसस्पेंड । DAPI पर गेटिंग द्वारा ७० µm नोजल सेल सॉर्टर के साथ कक्षों को क्रमबद्ध करें -TCR+सीडी+CD25- कक्ष उत्तरदाता कक्षों के रूप में (और यदि आवश्यक हो तो DAPI -TCR+सीडी-CD45RC के रूप मेंकम सीडी+ Tregs शमन कक्ष) जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है ।
  3. दमन कोशिकाओं का अलगाव
    नोट: दो aliquots में तिल्ली विभाजित: बी कोशिकाओं पर एक तरह, माइलॉयड कोशिकाओं, और NK कोशिकाओं, और सीडी पर अन्य+ और सीडी+ CD45RCकम टी कोशिकाओं, उनके दमन समारोह का आकलन करने के लिए.
    नोट: adoption सेल स्थानांतरण के लिए, बचाने के लिए 1 एक्स 108 splenocytes को अपनाने के हस्तांतरण द्वारा सहिष्णुता के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, यदि आवश्यक हो ।
    1. बी कोशिकाओं, माइलॉयड कोशिकाओं, और NK कोशिकाओं की छंटाई
      1. 2.1.5 के लिए प्रोटोकॉल 2.1.1 का पालन करें ।
      2. 2 µ g/एमएल टी सेल के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन विशिष्ट unलेबल्ड एंटीबॉडी (विरोधी TCRαβ, R7/3 क्लोन, और विरोधी TCRγδ, V65 क्लोन), 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लें और ४३० x g पर 10 मिनट के लिए supernatant को छोड़ें ।
      3. चरण 2.1.7 में वर्णित के रूप में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ 3 बार चुंबकीय मोतियों के साथ धो लें ।
      4. चुंबकीय मोतियों के साथ splenocytes मिश्रण करने के लिए अवांछित कोशिकाओं को हटाने और आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए गर्मी, तो 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह है और एक नया ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । दोहराएं दो बार । कोशिकाओं की गणना और 5 एक्स 107 कोशिकाओं/एमएल में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
      5. ऐसे माइलॉयड कोशिकाओं (anti-CD11b/सी, OX42 क्लोन), बी कोशिकाओं (विरोधी CD45RA, OX33 क्लोन), या NK कोशिकाओं (विरोधी CD161, 3.2.3 क्लोन) के रूप में संदिग्ध दमन गतिविधि के साथ कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने के लिए splenocytes को लेबल एंटीबॉडी जोड़ें । लेबल प्रत्येक एबी के साथ मोतियों की FACS पर एक मुआवजा मैट्रिक्स की स्थापना । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन और 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लो ।
      6. 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल, एक ६० µm ऊतक फिल्टर पर फिल्टर के एक एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पेंड, और ०.१ µ जी की एक अंतिम एकाग्रता पर DAPI जोड़ने के द्वारा और लेबल मृत कोशिकाओं को. ७० µm नोक सेल सॉर्टर के साथ गेटिंग द्वारा DAPI-CD11b+ पर माइलॉयड कोशिकाओं के लिए, CD45RA+ बी कोशिकाओं के लिए, और CD161+ के रूप में चित्रा 3में दिखाए गए के रूप में NK कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें ।
    2. सीडी + और सीडी + CD45RC कम टी कोशिकाओं की छंटाई
      1. 2.2.4 के लिए 2.2.1 प्रोटोकॉल का पालन करें ।
      2. एक चुंबकीय स्तंभ पर नकारात्मक चयन के लिए, कोशिकाओं को 2 µ जी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन/एमएल शुद्ध एंटीबॉडी बी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट (anti-CD45RA, OX33 क्लोन), NK कोशिकाओं (विरोधी CD161, 3.2.3 क्लोन), माइलॉयड कोशिकाओं (विरोधी CD11b/सी, OX42 क्लोन), गामा डेल्टा टी कोशिकाओं ( विरोधी TCRγδ, V65 क्लोन), उंहें 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धोने और ४३० x जी पर 10 मिनट के केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
      3. चरण 2.1.7 में वर्णित के रूप में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ चुंबकीय मोती 3 बार धो लें ।
      4. आंदोलन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ splenocytes मिश्रण से अवांछित कोशिकाओं को निकालें, तो 1 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब जगह है और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । दोहराएं दो बार । कोशिकाओं की गणना और 5 एक्स 107 कोशिकाओं/एमएल में 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
      5. Tregs सॉर्ट करने के लिए कक्षों में लेबल किए गए एंटीबॉडी जोड़ें: anti-TCRαβ (R7/3 क्लोन), एंटी-सीडी (OX35 क्लोन), एंटी-CD45RC (OX22 क्लोन) । लेबल प्रत्येक एबी के साथ मोतियों की FACS पर एक मुआवजा मैट्रिक्स की स्थापना । 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन और 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लो ।
      6. 5 x 107 कोशिकाओं/एमएल, एक ६० µm ऊतक पर फिल्टर के एक एकाग्रता पर कोशिकाओं reसस्पेंड, और ०.१ µ g/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता पर DAPI जोड़ने के द्वारा लेबल मृत कोशिकाओं । कक्षों को ७० µm नोजल सेल के साथ सॉर्ट करें सॉर्टर पर गेटिंग द्वारा DAPI-TCR+सीडी+CD45RCकम यथा सीडी+Tregs और DAPI-TCR+सीडी-CD45RC सीडी+Tregs ( चित्रा 4) के रूप में कम
        नोट: एंटी-CD8α एबी (OX8 क्लोन) के बजाय एंटी-सीडी एबी का इस्तेमाल किया जा सकता है अगर टी सेल एंटी-TCR लेबलिंग द्वारा सीडी+नॉन-टी कोशिकाओं से भेदभाव किया जाता है । सीडी+Tregs की एक अतिरिक्त कोशिका प्रसार डाई (सीपीडी) लेबलिंग के कारण कोशिका मृत्यु की प्रत्याशा में हल किया जाना चाहिए.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) उत्तरदाता कोशिकाओं के लेबलिंग प्रसार को मापने के लिए
    1. उत्तरदाता कक्ष सॉर्ट करने के बाद, 1x पंजाबियों के साथ दो बार कक्षों को धोएं ।
    2. 1x पंजाब में 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित और अंधेरे में आरटी में 5 मिनट के लिए ०.५ µ एम CFSE के साथ मशीन । 1.5 x वॉल्यूम पर FCS जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ४३० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें ।
    3. पूर्ण माध्यम से कक्षों को दो बार धोएं, और कक्षों की गणना करें ।
      नोट: इस कदम पर कोशिकाओं मृत्यु के 30% की उंमीद है ।
  5. सीडी + प्रभाव कोशिकाओं पर दमन परख के लिए सीडी + Tregs के सीपीडी लेबलिंग
    नोट: इस चरण में भेदभाव करने के लिए आवश्यक है CFSE-सीडी+Tregs से CFSE- proliferating उत्तरदाता सीडी+T कोशिकाओं coculture के दिन 6 पर गेटिंग द्वारा सीपीडी- कोशिकाओं पर.
    1. सीडी+ Tregs सेल छंटाई के बाद, 1x पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
    2. 1x पंजाब में 1 x 107 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और अंधेरे में आर टी पर 20 मिनट के लिए सीपीडी V450 के 10 µ एम के साथ मशीन ।
    3. पूर्ण माध्यम से कक्षों को दो बार धोएं, और कक्षों की गणना करें ।
      नोट: इस कदम पर कोशिकाओं मृत्यु के 30% की उंमीद है ।
  6. coculture के लिए सलाह
    1. माध्यम में संस्कृति का प्रयोग करें शामिल: RPMI १६४० मध्यम बीटा के साथ पूरक-mercaptoethanol (5 एक्स 10-5 एम), पेनिसिलिन (१०० यू/एमएल), streptomycin (०.१ मिलीग्राम/एमएल), सोडियम पाइरूवेट (1 मिमी), glutamine (2 मिमी), HEPES बफर (1 मिमी), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (1x), FCS ( 10%) ।
    2. ९६ में संस्कृति कोशिकाओं-अच्छी तरह से यू नीचे प्लेटें ।
    3. निंन क्रम में कक्ष जोड़ें: रोकें कक्ष, उत्तरदाता कक्ष, और allogeneic कक्ष ।
    4. उत्तरदाता टी कोशिकाओं और allogeneic APCs की लगातार संख्या रखें और Tregs संख्या की एक श्रेणी का परीक्षण करें । उदाहरण के लिए, अनुपात 4:4:1, 5 x 104 दमन कोशिकाओं, 5 x 104 उत्तरदाता कोशिकाओं, और १.२५ x 104 allogeneic कोशिकाओं, और अनुपात 2:4:1, २.५ x 104 दमन कोशिकाओं, 5 x 104 उत्तरदाता कोशिकाओं, और १.२५ x 104 allogeneic कोशिकाओं.
    5. २०० µ के लिए 5 x 104 उत्तरदाता कक्षों के अनुपात को बनाए रखें l मध्यम/
    6. नियंत्रण के लिए, allogeneic APCs बिना उत्तरदाता टी कोशिकाओं के साथ कुछ कुओं शामिल हैं (नकारात्मक नियंत्रण) और allogeneic APCs के साथ उत्तरदाता टी कोशिकाओं विनियामक कोशिकाओं के बिना (सकारात्मक नियंत्रण) CFSE गेटिंग के लिए दिन में 6 (देखें चरण 2.7.6.).
  7. coculture के 6 दिनों के बाद FACS धुंधला और विश्लेषण
    नोट: प्रभाव कोशिकाओं के प्रसार के कई समय बिंदुओं पर मूल्यांकन किया जा सकता है । ध्यान दें कि प्रसार घातांक है: कक्ष विभाजन के रूप में, दमन स्थितियों और नकारात्मक नियंत्रण के बीच अधिक अंतर देखा जा सकता है ।
    1. ९६-अच्छी तरह से यू नीचे प्लेटों से ९६-अच्छी तरह से V नीचे प्लेटों और 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x जी में 1 मिनट के केंद्रापसारक से कोशिकाओं स्थानांतरण ।
    2. cytokine स्तर को मापने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर एक नई थाली में supernatant सहेजें, अगर जरूरत है ।
    3. २०० µ l 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ कोशिकाओं को अच्छी तरह से धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    4. उत्तरदाता टी कोशिकाओं पर आगे गेट करने के लिए कोशिकाओं के लिए एंटीबॉडी जोड़ें: anti-TCRab (R7/3 क्लोन) और विरोधी सीडी (OX35 क्लोन) । 4 ° c पर 15 मिनट की मशीन और २०० µ एल 1x पंजाबियों/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ अच्छी तरह से दो बार धो लो । supernatant को त्यागें ।
    5. 1x पंजाब में ०.१ µ g/mL में पतला DAPI के १०० µ l जोड़ें और एक FACS विश्लेषक के साथ थाली पढ़ें ।
    6. DAPI ऋणात्मक (लाइव सेल) सीपीडी ऋणात्मक (non-सीडी+Tregs) TCR+सीडी+ कोशिकाओं पर गेटिंग करके CFSE प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करें. उत्तेजित उत्तरदाता कक्षों में अधिकतम CFSE चमक होती है जैसा कि चित्रा 5 नीचे बाएं हिस्टोग्राम में दिखाया गया है । allogeneic APCs की उपस्थिति में, उत्तरदाता कोशिकाओं में अधिक से अधिक प्रसार और न्यूनतम CFSE चमक (नीचे, मध्य) है । allogeneic APCs और विनियामक कोशिकाओं की उपस्थिति में, प्रभाव कोशिकाओं मध्यम प्रसार और CFSE चमक (नीचे, सही) है ।

3. एक दिल में दत्तक सेल हस्तांतरण द्वारा कोशिकाओं को दबा गतिविधि के Vivo आकलन में भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता

नोट: विकिरण मेजबान कोशिकाओं को खत्म करने और दाता सेल engraftment और प्रसार एहसान करने के लिए की जरूरत है ।

  1. विकीर्ण भ्रष्टाचार के पहले दिन पर जल्दी ही प्राप्तकर्ता को पूर्व शर्त के लिए प्राप्तकर्ताओं । Anesthetize चूहों के साथ आई. एम. इंजेक्शन ऑफ xylazine (८ मिलीग्राम/-ketamine (८० मिलीग्राम/) और उन्हें एक्स किरणों के साथ ४.५ Gy की एक खुराक पर विकीर्ण.
  2. ब्याज की कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल २.३ का पालन करें ।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो दत्तक अंतरण द्वारा सहिष्णुता के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए 1 x 108 splenocytes को सहेजें ।
  3. विकिरण के बाद 12 ज (भ्रष्टाचार के पहले दिन, शाम में), 4% isoflurane-O2 और कोशिकाओं (५.० x 107 टी कोशिकाओं, ३.० x 107 बी कोशिकाओं, ३.० x 107 माइलॉयड कोशिकाओं, या १.५० x 108 की साँस लेना द्वारा चूहों anesthetize दत्तक हस्तांतरण द्वारा सहिष्णुता के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में splenocytes) शिश्न नस में i.v..
    नोट: adoption स्थानांतरण द्वारा सहिष्णुता के लिए आवश्यक कक्षों की संख्या कक्षों की दमन गतिविधि पर निर्भर करती है ।
  4. अगले दिन, allograft करने के लिए प्रोटोकॉल १.१ का पालन करें । पेट के माध्यम से टटोलने का कार्य द्वारा भ्रष्टाचार विकास का पालन करें ।

4. दाता विशिष्ट एंटीबॉडी डिटेक्शन

नोट: भ्रष्टाचार दाता की ओर निर्देशित आईजीजी प्रतिक्रियाओं प्राप्तकर्ता के सीरम के साथ दाता से कोशिकाओं को मशीन द्वारा मापा जाता है । syngeneic LEW. 1W सीरम के साथ कोशिकाओं को मशीन द्वारा LEW. 1W बी कोशिकाओं के प्रत्यक्ष धुंधला द्वारा प्रेरित पृष्ठभूमि घटाना.

  1. चूहों से फसल रक्त और 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर 15 मिनट के केंद्रापसारक । सीरम बचाओ । सीरम-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत इस्तेमाल किया । ५६ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन द्वारा सीरा में पूरक निष्क्रिय ।
  2. एक दाता LEW. 1W चूहे से तिल्ली फसल और यह कोल्ड 1x पंजाबियों में बचाने के लिए । 2.2.1 चरणों का पालन करें । ते 2.2.4. एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे थाली में 2 x 105 कोशिकाओं को जोड़ें/ 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर 1 मिनट के केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
  3. सीरा प्रश्नपत्र को 1/10 से 1/270 1x पंजाबियों में पतला करें (4 कमजोर पड़ने के नमूने/ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए कोशिकाओं को पतला सीरम के 25 µ l के साथ मशीन/ दाता की संख्या की आशा-विशिष्ट आईजीजी उपप्रकार (आईजीजी, IgG1, IgG2a, IgG2b) प्रति नमूना विश्लेषण करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं (1 सीरम एक्स 4 कमजोर पड़ने एक्स 4 आईजीजी उपप्रकार). सेल को 1x पंजाबन/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लें और supernatant को त्याग दें ।
  4. प्रत्येक माउस विरोधी चूहे आईजीजी उपप्रकार एबी fluorochrome-4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए लेबल के साथ कोशिकाओं की मशीन, एक उपप्रकार/
    नोट: यदि fluorochrome-लेबल विरोधी चूहे ़ एबी उपलब्ध नहीं हैं, यह संभव है कि शुद्ध लेबल माउस विरोधी चूहा आईजीजी उपप्रकार एबी और एक fluorochrome-माध्यमिक विरोधी माउस एबी लेबल का उपयोग करें । उपलब्ध fluorochromes और cytometer कॉंफ़िगरेशन के आधार पर, कई विरोधी चूहे आईजीजी उपप्रकार उचित सेटिंग्स के साथ एक अच्छी तरह से परीक्षण किया जा सकता है ।
  5. सेल को 1x पंजाबन/2% FCS/0.5 mM EDTA दो बार धो लें और supernatant को त्याग दें ।
  6. पंजाब में ०.१ µ g/एमएल में पतला DAPI के १०० µ एल जोड़ें और एक FACS विश्लेषक के साथ थाली पढ़ें ।
  7. सभी DAPI- कक्षों पर fluorochrome के साथ लेबल किए गए एंटी-रैट आईजीजी उपप्रकार एबी का माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) पढ़ें । LEW. 1W कोशिकाओं पर भोली LEW. 1a सीरम के साथ प्राप्त mfi घटाना (पृष्ठभूमि धुंधला, नीचे बाएं) mfi से LEW. 1W कोशिकाओं पर इसी कमजोर पड़ने पर प्रत्येक प्राप्तकर्ता से सीरा के साथ प्राप्त की अनुपचारित अस्वीकार प्राप्तकर्ताओं के लिए (नीचे मध्य) कि मध्यस्थ mfi प्रदर्शन है कि इलाज सहिष्णु प्राप्तकर्ताओं के लिए अधिक से अधिक MFI और नीचे सही प्रदर्शित करें) (चित्र 6) ।

5. Exogenous एंटीजन (नादान और स्मृति) के लिए विनोदी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन

नोट: प्रत्यारोपण से पहले चूहों से सीरम, उपचार, और प्रतिरक्षण विनोदी प्रतिक्रियाओं के नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अन्यथा गैर प्रतिरक्षित भोले चूहों का प्रयोग किया जा सकता है । असुरक्षित प्राप्तकर्ताओं, यानी, प्रत्यारोपित exoantigen-प्रतिरक्षित और प्राप्तकर्ताओं को अस्वीकार से सीरम, विनोदी प्रतिक्रियाओं के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है ।

  1. एक नए प्रतिजन के लिए विनोदी प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए क्षमता (चित्रा 7)
    नोट: यह विधि विनोदी प्रतिक्रियाओं के एक रिश्तेदार ठहराव के रूप में यह एक मानक शामिल नहीं है । एक निरपेक्ष ़ ठहराव कदम 5.1.6 में ज्ञात एकाग्रता के साथ चूहे आईजीजी या आईजीएम विरोधी KLH एबी के कमजोर पड़ने की एक सीमा को जोड़कर संभव होगा ।
    1. पायसी ५० के २०० में KLH के µ जी पूरा Freund के सहायक और लंबे समय से जीवित/सहिष्णु प्राप्तकर्ताओं की पूंछ में सुई, अनुपचारित खारिज प्राप्तकर्ताओं, या भोली चूहों विनोदी प्रतिक्रियाओं के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में पर नियंत्रण ।
    2. 4 और 13 दिनों में प्रतिरक्षण के बाद फसल रक्त के नमूनों, और 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर 15 मिनट के केंद्रापसारक । ऊपरी चरण है कि सीरम है बचाओ । एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए गैर प्रतिरक्षित चूहों से सीरम फसल. सीरम एलिसा परख तक-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है ।
    3. कोट एलिसा प्लेटें (फ्लैट नीचे) के साथ ५० µ एल/अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1x पंजाब में 10 µ g/एमएल में पतला KLH । सुनिश्चित करें कि कोटिंग समाधान सभी कुओं को शामिल किया गया है ।
    4. अतिरिक्त कोट धोने से KLH निकालें । धोने के लिए, जोड़ें १५० µ एल/खैर धोने बफर (1x ०.१% के बीच युक्त) और झटका ।
    5. ब्लॉक विशेष रूप से प्राप्तकर्ता के ़ के 1 ज के लिए ३७ ° c के साथ मशीन द्वारा १०० µ एल के साथ/धो 10% FCS युक्त बफर के । एक बार धो लें ।
    6. प्रश्नपत्र को धो बफ़र में प्राप्तकर्ता सीरा पतला 1/40 से शुरू 1/512, जोड़ें ५० µ एल/अच्छी तरह से लेपित प्लेट को धारावाहिक कमजोर पड़ने के डुप्लिकेट में, और 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । कुछ कुओं एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए सीरम से मुक्त रखें । दो बार धो लें ।
    7. जोड़ें ५० µ एल के 1 µ g/एमएल के बायोटिन-संयुग्मित विरोधी चूहे आईजीएम एबी में 4 प्राप्तकर्ताओं में दिन में काटा सीरम युक्त कुओं में, या ५० µ एल के बायोटिन-संयुग्मित विरोधी चूहे आईजीजी 13 दिन में काटा सीरम युक्त कुओं में, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज मशीन । दो बार धो लें ।
    8. जोड़ें ५० µ एल/एचआरपी-संयुग्मित streptavidin के 1 µ जी/एमएल पर ४५ मिनट के लिए ३७ ° c । 3 बार धो लें ।
    9. जोड़ें ५० µ 3, 3 ', 5, 5 ' के एल-Tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट पर < 30 मिनट के लिए और सकारात्मक नियंत्रण संतृप्त कर रहे हैं जब 2 मीटर सल्फर एसिड की 25 µ एल के साथ प्रतिक्रिया बंद करो.
    10. ४०५ एनएम में अवशोषक पढ़ें । ऑप्टिकल एक भोली चूहे नियंत्रण सीरम के साथ प्राप्त करने के लिए प्राप्तकर्ता के सीरम के साथ प्राप्त घनत्व की तुलना करें ।
  2. स्मृति का आकलन विनोदी प्रतिक्रिया क्षमता (चित्र 8)
    1. प्रत्यारोपण से पहले 7 दिन, xenogeneic कोशिकाओं के 109 i.v. इंजेक्षन भोले चूहों में 1x पंजाबियों के ८०० µ एल में पतला । कोशिकाओं भेड़, घोड़ा या किसी अन्य प्रजाति से हो सकता है ।
    2. प्रत्यारोपण प्रदर्शन और tolerogenic उपचार प्रशासन ।
    3. 3 दिन के बाद भ्रष्टाचार, फिर से इंजेक्षन i. v .109 आरबीसी भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ताओं और गैर-भ्रष्टाचारी चूहों में 1x पंजाबियों के ८०० µ एल में पतला ।
    4. फसल रक्त के नमूने 5 और 14 दिन द्वितीय प्रतिरक्षण के बाद और १,२०० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के ऊपरी सीरम चरण को पुनर्प्राप्त करने के लिए । सीरम-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है या तुरंत इस्तेमाल किया । उपयोग करने से पहले ५६ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की मशीन द्वारा चूहे सीरा में पूरक निष्क्रिय ।
    5. एक ९६-अच्छी तरह से वी नीचे थाली के 2 एक्स 105 आरबीसी/ 4 डिग्री सेल्सियस पर १,२०० x g पर 1 मिनट के केंद्रापसारक और आकांक्षा द्वारा ध्यान supernatant त्यागें ।
    6. प्रश्नपत्र पतला सीरा 2-1/10 से 1/1280 1x पंजाब में (8 कमजोर पड़ने के नमूने/ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए कोशिकाओं को पतला सीरम के 25 µ l के साथ मशीन/ सेल को 1x पंजाबन/2% FCS/0.5 mM EDTA के साथ धो लें और supernatant को त्याग दें ।
    7. आरबीसी प्रजातियों के साथ कोशिकाओं मशीन-adsorbed विरोधी चूहे आईजीजी या आईजीएम उपप्रकार 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए fluorochrome के साथ लेबल, एक उपप्रकार/ आईजीएम और आईजीजी एंटी आरबीसी सीरम कटाई में 5 और 14 दिनों के बाद प्रतिरक्षण का आकलन, क्रमशः सेल को 1x पंजाबन/2% FCS/0.5 mM EDTA दो बार धो लें और supernatant को त्याग दें ।
      नोट: यदि fluorochrome-लेबल विरोधी चूहे ़ अटल बिहारी उपलब्ध नहीं हैं, यह शुद्ध unलेबल्ड माउस विरोधी चूहा आईजीजी उपप्रकार एबी और एक fluorochrome-माध्यमिक विरोधी माउस एबी लेबल का उपयोग करने के लिए संभव है ।
    8. DAPI के १०० µ l जोड़ें ०.१ µ g/mL में 1x पंजाब में पतला और एक FACS विश्लेषक के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण ।
    9. प्रत्येक समूह के लिए कमजोर पड़ने के एक समारोह के रूप में MFI प्रतिनिधित्व करते हैं ।

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Representative Results

APCs (चित्रा 1), उत्तरदाता कोशिकाओं और Tregs एक साथ (चित्रा 2), या व्यक्तिगत रूप से (चित्रा 4), और किसी भी अन्य ख्यात विनियामक कोशिकाओं (चित्रा 3), हो सकता है की छंटाई के बाद दमन गतिविधि का आकलन vivo में विनियामक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा और इन विट्रो में CFSE चमक (चित्रा 5) के माप द्वारा किया । दाता (चित्रा 6) या exogenous एंटीजन (आंकड़े 7 और 8) की ओर प्राप्तकर्ता के विनोदी प्रतिक्रिया की स्थिति का भी vivo प्रतिरक्षण के रूप में चित्रित करने के बाद इन विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है.

Figure 1
चित्र 1 . पीडीसी सॉर्ट करने के लिए गेटिंग रणनीति.
कक्ष आकृति विज्ञान आकार और दानेदार (SSC-a/FSC-a) पर चयनित किए गए थे, दोहरी को FSC-w/FSC-h और ssc-w/ssc-h पैरामीटर द्वारा बाहर रखा गया था, DAPI- कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा जीवित कोशिकाओं का चयन किया गया था, और पीडीसी पर TCR-CD45RA चुना गया था-सीडी + CD45R+ व्यंजक । शुद्धता को सॉर्ट किए गए कक्षों में DAPI जोड़कर और सॉर्टिंग पैरामीटर्स के साथ कक्ष सॉर्टर पर चल कर मूल्यांकन किया गया था । एक दुर्लभ क्रमबद्ध जनसंख्या की पवित्रता (से कम 2%) ९५% से अधिक होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . गेटिंग रणनीति सॉर्ट करने के लिए सीडी+CD25- उत्तरदाता टी कोशिकाओं और सीडी+CD45RCकम Tregs ।
आकृति विज्ञान, यानी, पर कक्षों का चयन किया गया आकार और दानेदार (ssc-a/FSC-a), दोहरी को FSC-w/FSC-h और ssc-w/ssc-h पैरामीटर द्वारा बहिष्कृत कर दिया गया था, गेटिंग के साथ लाइव कक्षों का चयन कर लिया गया था, पर DAPI- कक्ष, और उत्तरदाता कक्ष TCR पर चयनित किए गए थे + सीडी+CD25- अभिव्यक्ति । सीडी+Tregs एक साथ TCR+सीडी-CD45RCकम कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा क्रमबद्ध किया गया है । शुद्धता को सॉर्ट किए गए कक्षों में DAPI जोड़कर और सॉर्टिंग पैरामीटर्स के साथ कक्ष सॉर्टर पर चल कर मूल्यांकन किया गया था । शुद्धता ९५% से अधिक होनी चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : गेटिंग रणनीति बी कोशिकाओं, माइलॉयड कोशिकाओं, और NK कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए ।
कक्ष आकृति विज्ञान आकार और दानेदार (SSC-a/FSC-a) पर चयनित किए गए थे, दोहरी FSC-w/FSC-h और ssc-w/ssc-h पैरामीटर द्वारा बाहर रखा गया था, जीवित कोशिकाओं DAPI पर गेटिंग द्वारा चयनित किया गया था- कोशिकाओं, और बी कोशिकाओं CD45RA+ अभिव्यक्ति पर चुना गया, CD11b पर माइलॉयड कोशिकाओं/सी+ अभिव्यक्ति, और NK कोशिकाओं पर CD45RA-CD11b/CD161उच्च अभिव्यक्ति । शुद्धता को सॉर्ट किए गए कक्षों में DAPI जोड़कर और सॉर्टिंग पैरामीटर्स के साथ कक्ष सॉर्टर पर चल कर मूल्यांकन किया गया था । शुद्धता ९५% से अधिक होनी चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . गेटिंग रणनीति को क्रमबद्ध करने के लिए सीडी+CD45RCकम और सीडी+CD45RCकम Tregs.
कक्ष आकृति विज्ञान आकार और दानेदार (SSC-a/FSC-a) पर चयनित किए गए थे, दोहरी को FSC-w/FSC-h और ssc-w/ssc-h पैरामीटर द्वारा बहिष्कृत कर दिया गया था, जिए गए कक्षों को गेटिंग द्वारा DAPI- कोशिकाओं पर चुना गया था, और सीडी+Tregs को TCR पर चुना गया था + सीडी+CD45RCकम अभिव्यक्ति र सीडी+Tregs पर TCR+सीडी-CD45RCकम अभिव्यक्ति । शुद्धता को सॉर्ट किए गए कक्षों में DAPI जोड़कर और सॉर्टिंग पैरामीटर्स के साथ कक्ष सॉर्टर पर चल कर मूल्यांकन किया गया था । शुद्धता ९५% से अधिक होनी चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . इन विट्रो दमन परख के प्रतिनिधि विश्लेषण ।
उत्तरदाता कक्ष प्रसार आकृति विज्ञान आकार और दानेदार (SSC-a/FSC-a) पर चयन द्वारा विश्लेषण किया गया था, FSC-w/FSC-h और ssc-w/ssc-h पैरामीटर, मृत कोशिकाओं का अपवर्जन और सीडी+ Tregs द्वारा गेटिंग-DAPI पर दोहरी का बहिष्करण - कोशिकाओं, TCR का चयन+सीडी+ कोशिकाओं, और CFSE प्रोफ़ाइल विश्लेषण. CFSE गेट उत्तेजित CFSE-लेबल उत्तरदाता कोशिकाओं पर आधारित था । CFSEउच्च कोशिकाओं गैर proliferating कोशिकाओं रहे हैं और CFSEकम ≥ 1 विभाजन के साथ कोशिकाओं रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . दाता विशिष्ट alloantibody प्रतिक्रिया के प्रतिनिधि विश्लेषण ।
दाता चूहे से Splenocytes इलाज या अनुपचारित प्राप्तकर्ताओं से या भोली चूहे से पतला गर्मी-निष्क्रिय सीरम की एक सीमा के साथ मशीन थे, और फिर विरोधी चूहे आईजीजी-FITC के साथ । Alloantibodies एसएससी और FSC दोहरी अपवर्जन के बाद DAPI- z कोशिकाओं पर FITC के MFI विश्लेषण से पता चला रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . एंटी-KLH डिटेक्शन पद्धति का सिद्धांत ।
प्राप्तकर्ता KLH के साथ पूरकता के साथ प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षित १२० दिन थे, और रक्त के नमूने 4 और 13 दिनों के प्रतिरक्षण के बाद काटा गया था । KLH प्रोटीन ९६ पर लेपित-फ्लैट नीचे वेल्स प्लेटें थे, और प्रतिरक्षित चूहों से सीरम नमूने के साथ मशीन । Biotinylated बकरी विरोधी चूहा आईजीजी या आईजीएम विरोधी KLH एबी के सीरम काटा में वर्तमान की पहचान की जांच 4 या 13 दिनों के बाद प्रतिरक्षण । एचआरपी-युग्मित streptavidin एक नीले रंग का उत्पाद है कि पीली बदल जाता है जब प्रतिक्रिया सल्फर एसिड के साथ बंद कर दिया गया था TMB सब्सट्रेट बदल दिया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 . एंटी आरबीसी जांच पद्धति की योजना ।
प्राप्तकर्ताओं प्रतिरक्षित थे 7 दिन पहले और 3 दिन xenogeneic लाल रक्त कोशिकाओं (कोशिकाओं) के साथ प्रत्यारोपण के बाद, और रक्त के नमूने प्रतिरक्षित प्राप्तकर्ताओं से काटा गया 5 और 14 दिनों के बाद पिछले प्रतिरक्षण. कोशिकाओं प्रतिरक्षित चूहों से सीरम नमूने के साथ मशीन थे । कोशिकाओं पर विरोधी कोशिकाओं एंटीबॉडी की उपस्थिति लेबल बकरी विरोधी चूहे आईजीजी या आईजीएम एंटीबॉडी और FACS सर्ग विश्लेषण के साथ दाग से पता चला था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक नव भ्रष्टाचारी प्राप्तकर्ता में कुल splenocytes के दत्तक हस्तांतरण एक कारगर तरीका है एक उपचार द्वारा प्रेरित या potentiated विनियामक कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए है । मेजबान विकिरण प्रेरित क्षणिक lymphopenia स्थानांतरण और सहिष्णुता की स्थापना के बाद सेल अस्तित्व को बढ़ावा देता है । इसके अलावा, उप घातक विकिरण tolerogenic गुणों के साथ कोशिकाओं को प्रतिरक्षा पुनर्गठन के दौरान नई नियामक कोशिकाओं में बदलने के लिए समय बचता है, एक घटना संक्रामक सहिष्णुता३४कहा जाता है । आमतौर पर, अच्छी तरह से वर्णित सीडी+CD25उच्चFoxp3+CD127कम Tregs पहले अध्ययन किया जाता है जब सहिष्णुता मनाया जाता है । हालांकि, नकारात्मक अंश के हस्तांतरण (सीडी+Tregs में समाप्त splenocytes) पहले से ही ज्ञात नियामक कोशिकाओं और नए सेल की पहचान से परे विस्तार की अनुमति देता है आबादी1,2, 3,4. AdCD40Ig-प्रेरित सहिष्णुता में, सीडी+टी कोशिकाओं के हस्तांतरण-घट splenocytes सीडी+CD45RCकम Tregs1की खोज का पता चला । इसके अलावा, कुल सीडी+ टी कोशिकाओं के क्रमिक हस्तांतरण, और फिरकम कोशिकाओं CD45RC करने के लिए प्रतिबंधित, इस तरह एक विधि की क्षमता को उत्तरोत्तर नियामक कोशिकाओं की एक नई आबादी की पहचान दिखाई । इसके अलावा, इस रणनीति सभी आबादी का विश्लेषण की अनुमति देता है । दरअसल, हमें पता चला है कि कई विनियामक कोशिकाओं के एक साथ रह सकते है और भी संभावित है, और है कि क्षतिपूरक तंत्र2,4मौजूद है । चूहों में CD40Ig के साथ इलाज किया, सीडी की कमी+ कोशिकाओं विनियामक गुणों के साथ बी कोशिकाओं और माइलॉयड कोशिकाओं के उद्भव की अनुमति दी, और चूहे में कार्डियक allograft को हस्तांतरित सहिष्णुता प्रोटोकॉल के अनुसार2ऊपर वर्णित है । IL34 के प्रति व्यक्त से प्रेरित सहिष्णुता के एक मॉडल में, दोनों सीडी+ और सीडी+Tregs सहिष्णुता4हस्तांतरण करने में सक्षम थे ।

दाता-निर्देशित विशिष्टता के उपचार प्रेरित सहिष्णुता सेलुलर और विनोदी स्तर पर मूल्यांकन किया जा सकता है । पहला, एक तीसरे पक्ष के भ्रष्टाचार के प्राप्तकर्ताओं में विनियामक कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण अगर कोशिकाओं को पहले दाता भ्रष्टाचार३३के लिए विशिष्ट है सहिष्णुता स्थानांतरित करने में सफल नहीं होगा । दूसरा, दमन कोशिकाओं कुशलतापूर्वक भ्रष्टाचार के पहले दाता से नहीं बल्कि एक तीसरे पक्ष के दाता से APCs से उत्तेजना के जवाब में उत्तरदाता कोशिकाओं के प्रसार को रोकना चाहिए2। अंत में, भ्रष्टाचार के दाता के खिलाफ विनोदी प्रतिक्रियाओं के ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्तकर्ता में कुल ़ उत्पादन से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । इसके अलावा, पहले भ्रष्टाचार दाता के लिए विशिष्ट सहिष्णुता के मामले में, प्राप्तकर्ता एक माध्यमिक तीसरे पक्ष भ्रष्टाचार, एक नया प्रतिजन, या एक पूर्व ज्ञात प्रतिजन16के खिलाफ एक नया विनोदी प्रतिक्रिया विकसित करने में सक्षम होना चाहिए ।

तिल्ली के Collagenase डी उपचार अंग से सभी कोशिका आबादी को निकालने के लिए पसंद है और सलाह दी जाती है । अंत में, जब विनियामक कक्षों की phenotype इतनी टाइट होती है कि कोशिकाएं खराब होती हैं (< 1% of splenocytes), तो कुल जनसंख्या के अंतरण की तुलना में नकारात्मक अंश का अंतरण इस छोटे की दमन गतिविधि को पहचानने में मदद कर सकता है आबादी. उदाहरण के लिए, CD40Ig-प्रेरित सीडी+Tregs एक allogeneic पेप्टाइड के लिए विशिष्ट FACS का उपयोग करते हुए दाग tetramers हो सकता है लेकिन उनकी कम संख्या सकारात्मक adoption स्थानांतरण३३,३८की अनुमति नहीं थी । हालांकि, tetramer-घट सीडी+CD45RCकम टी कोशिकाओं के दत्तक अंतरण ने कुल Tregs की तुलना में सहिष्णुता का अंतरण नहीं किया, इस उपजनसंख्या की क्षमता पर प्रकाश डाला. यह परिणाम एक इन विट्रो दमन प्रयोग द्वारा पुष्टि की गई । दरअसल, दमन प्रयोग भी एक कायल तरीका Du51-विशिष्ट Tregs की क्षमता दिखाने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाने था३३

ऊपर वर्णित दमन प्रोटोकॉल प्राप्तकर्ता प्रभाव सीडी+T कक्ष प्रत्युत्तरों को दाता से पीडीसी करने के लिए प्रतिबंधित है । इस प्रोटोकॉल cDCs या कुल APCs द्वारा पीडीसी की जगह द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन यह सुनिश्चित करना है कि प्रभाव: उत्तेजित अनुपात एक उदारवादी दमन कोशिकाओं द्वारा प्रबंधनीय प्रसार को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त हैं । दरअसल, सीडी+CD25-टी कोशिकाओं का अनुपात: पीडीसी 4:1 होना चाहिए, जबकि सीडी+CD25- टी कोशिकाओं का अनुपात: cDCs 8:1 होना चाहिए, और सीडी+CD25- टी कोशिकाओं: APCs, 1:1 या 1:2. अनुपात दाता और प्राप्तकर्ता के बीच alloreactivity पर निर्भर करता है; उपरोक्त अनुपात एक LEW के लिए उपयुक्त हैं । 1W: एक तीव्र अस्वीकृति के साथ दिन में होने वाली LEW. 1a संयोजन 7, लेकिन उत्तरदाता की सीमा: उत्तेजक अनुपात जानवरों की बलि से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए. अंत में, CFSE सुरक्षा और विश्वसनीयता चिंताओं के लिए, दमन गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए thymidine को पसंद किया जाता है । हालांकि, 6 दिन में CFSE विश्लेषण के लिए दमन कोशिकाओं और उत्तरदाता कोशिकाओं के बीच संभव अंतर सुनिश्चित करें यदि प्रभाव सीडी+CD25- T कोशिकाओं कुल splenocytes द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं । इसी प्रकार, यह सुनिश्चित करें कि शेष टी कोशिकाओं के बीच उत्तेजित करने वाले कोशिकाओं ३५ Gy विकिरण निंनलिखित पैदा नहीं कर सकते ।

FACS धुंधला के डिजाइन तालिका 3में सूचीबद्ध एंटीबॉडी की उपलब्धता पर आधारित है । इसी तरह के प्रोटोकॉल चूहों मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लक्ष्य मजहब सुनिश्चित करने (उदाहरण माइलॉयड कोशिकाओं के लिए अंतर माउस और चूहे में वर्णित हैं) ।

चूहे में heterotopic कार्डिएक allograft भ्रष्टाचार के परिणाम की निगरानी के लिए महान अवसर के साथ एक ठोस अंग प्रत्यारोपण मॉडल है । जबकि गुर्दे allograft मॉडल प्राप्तकर्ता की अचानक मौत की विशेषता है, पेट की दीवार के माध्यम से हृदय भ्रष्टाचार की मारो ताकत का टटोलने का कार्य भ्रष्टाचार विकास३९,४०के बारे में बताते हैं । एक सहवर्ती त्वचा भ्रष्टाचार या एक दूसरे कार्डियक भ्रष्टाचार हृदय allograft प्राप्तकर्ता पर महसूस किया जा सकता है स्मृति प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए४१। इसके अलावा, जैव आणविक इंजीनियरिंग और बी कोशिकाओं की तरह विशिष्ट कोशिका प्रकार की कमी के लिए जैविक या रासायनिक उपकरण (आईजीएम KO), सीडी कोशिकाओं (एंटी CD8α एंटीबॉडी), या माइलॉयड कोशिकाओं (clodronate liposomes), इस तरह के सेल के महत्व को मापने के लिए उपयोगी उपकरण हैं प्रेरण या समय के बाद ट्रांसप्लांटेशन जहां उपचार समाप्त प्राप्तकर्ता1,2,3,4के लिए प्रशासित किया जाता है के आधार पर सहिष्णुता के रखरखाव में आबादी ।

तारीख करने के लिए, चूहे Bregs, माइलॉयड कोशिकाओं, और सीडी+Tregs अच्छी तरह से वर्णित नहीं हैं । ऊपर सहिष्णुता प्रेरण के प्रोटोकॉल चूहे विनियामक कोशिकाओं1,2,3,4के लक्षण वर्णन के लिए संदर्भ के रूप में प्रस्तावित कर रहे हैं । इन कोशिकाओं और allotransplantation और अंय प्रजातियों के अंय मॉडलों के लिए तुलना के आगे phenotypic विवरण महान ब्याज की भेदभाव मार्करों के लिए मदद कर सकता है । दरअसल, सहिष्णुता और संचालन सहिष्णु रोगियों के माउस मॉडल से Bregs की तुलना Bregs के CD5 या CD24 मार्कर अभिव्यक्ति की प्रबलता पर प्रकाश डाला3,23,24, ४२ , ४३ , ४४ , ४५ . CD8α कमी के साथ संयुक्त AdCD40Ig द्वारा प्रेरित सहिष्णुता के हमारे मॉडल में, CD24 दमन गतिविधि के अभाव बी कोशिकाओं की तुलना में व्यक्त किया जाता है2. उच्च प्रवाह डिजिटल जीन की अभिव्यक्ति आरएनए अनुक्रमण हाल ही में एक अभिनव उपकरण के रूप में उभरा करने के लिए आगे विनियामक कोशिकाओं४६विशेषताएं ।

अंत में, प्रोटोकॉल एक tolerogenic उपचार द्वारा प्रेरित विनियामक कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने के लिए अंय मॉडलों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यहाँ हम allograft के LEW. 1a संयोजन में LEW. 1W इस्तेमाल किया, के बारे में 7 दिनों में एक भ्रष्टाचार अस्वीकृति की विशेषता. उलटा संयोजन है, जो और अधिक कठोर के रूप में वर्णित किया गया है और जहां तीव्र अस्वीकृति तेजी से और मजबूत होता है, इस्तेमाल किया जा सकता है । स्व-प्रतिरक्षित रोग मॉडल भी उपचार के साथ सहिष्णुता प्रेरण के तंत्र को समझने के लिए प्रत्यारोपण में हमारे अनुभव से लाभ उठा सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम Labex इगो परियोजना (n ° ANR-11-LABX-0016-01) के संदर्भ में महसूस किया गया जो "Investissements d'Avenir" फ्रेंच सरकार द्वारा प्रबंधित कार्यक्रम का हिस्सा है ANR (ANR-11-LABX-0016-01) और इहु-Cesti द्वारा वित्त पोषित परियोजना द्वारा भी " Investissements d'Avenir "फ्रांसीसी सरकारी कार्यक्रम, फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) द्वारा प्रबंधित (ANR-10-IBHU-005) । इहु-Cesti परियोजना भी नांत Métropole द्वारा समर्थित है और Région de la लॉयर भुगतान करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

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References

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