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In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

Immunology and Infection

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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Abstract

La principal preocupación en el trasplante es lograr tolerancia específica a través de la inducción de células reguladoras. La comprensión de los mecanismos de tolerancia requiere modelos confiables. Aquí, describimos los modelos de la tolerancia al aloinjerto cardiaco de rata, inducido por el bloqueo de señales de coestimulación o upregulation de moléculas inmunorreguladoras a través de la transferencia de genes. Cada uno de estos modelos permite en vivo la generación de células reguladoras como las células T reguladoras (Tregs), las células B reguladoras (Bregs) o células mieloides reglamentarias (RegMCs). En este manuscrito, Describimos dos protocolos complementarios que se han utilizado para identificar y definir la actividad reguladora celular in vitro e in vivo para determinar su responsabilidad en la inducción de la tolerancia y mantenimiento. En primer lugar, un ensayo represivo en vitro permite la identificación rápida de las células con capacidad supresora de la respuesta inmune efectora una manera dosis dependiente y puede ser utilizado para otros análisis como medición de citocinas o citotoxicidad. En segundo lugar, la transferencia adoptiva de células desde un recipiente tratado tolerante a un destinatario injertado recién irradiado, destacó las propiedades tolerogénicas de estas células en el control de las respuestas inmunes del injerto dirigida o conversión (nuevo) las células reguladoras había llamado tolerancia infecciosa). Estos métodos no están restringidos a las células con marcadores fenotípicos conocidos y pueden ser extendidos a cualquier población de la célula. Además, donante dirigido allospecificity de células reguladoras (una meta importante en el campo) puede evaluarse mediante el uso de células de donante tercero o injerto in vitro o en vivo. Finalmente, para determinar la capacidad de tolerogénicas específicos de estas células reguladoras, le ofrecemos protocolos para evaluar las respuestas de anticuerpos humorales de anti- donantes y la capacidad del destinatario para desarrollar la respuesta humoral contra antígenos conocidos nuevo o antiguo. Los modelos de tolerancia descrito pueden ser utilizados para caracterizar las células reguladoras, para identificar nuevos biomarcadores y moléculas inmunoreguladoras y son adaptables a otros modelos de trasplante o enfermedades autoinmunes en roedores o humanos.

Introduction

Aloinjerto cardiaco de rata es un modelo de trasplante de órgano confiable para evaluar tratamientos de inducción de tolerancia, para descifrar los mecanismos de inducción de la tolerancia y el mantenimiento y tiene el potencial para inducir las células reguladoras funcionalmente competentes y dominantes. Los protocolos a continuación describen un completamente desajuste heterotópico cardíaco injerto de una rata de donantes de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en una rata de receptores 1A de Lewis (LEW.1A, RT1una). En esta combinación de injerto, el rechazo agudo se produce rápidamente (en cerca de 7 días) y puede evaluarse fácilmente por injerto a medida a través de la palpación del abdomen. Aquí proponemos tres protocolos para inducir la tolerancia para el aloinjerto cardiaco de rata. En estos modelos, tolerancia es inducida o mantenida por tipos de células reguladoras diferentes. En primer lugar, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L con un adenovirus codificación CD40Ig (AdCD40Ig) inducida por la generación de CD8+ Tregs capaces de inducir tolerancia cuando eventualmente transferido a recipientes injertada secundaria1. Además, el agotamiento de CD8 células+ (con anticuerpos anti-CD8α) en los receptores tratados con AdCD40Ig generados Bregs y RegMCs2. Análisis profundo de CD8+ Tregs propiedades destacan el papel clave de varias moléculas inmunoreguladoras definidas como interleucina-34 (IL-34) y Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Mientras que la sobreexpresión de IL-34 (con un vector AAV) inducida por Tregs a través de la generación de RegMCs, la sobreexpresión de FGL-2 inducida por Bregs, subyacente a la compleja red de células reguladoras.

Porque rechazo crónico se desarrolla lentamente y es a largo plazo, un análisis en profundidad es necesaria para distinguir la tolerancia frente a rechazo crónico. Injerto generalmente se evalúa por la infiltración celular, fibrosis, engrosamiento de la deposición de C4d vascular de la pared y complemento por immunohistology7. Mientras que la histología métodos requieren el sacrificio de animales o biopsia de injerto, aquí describimos un método simple para evaluar diversas características de aloinjerto tolerado: la aparición y función de las células reguladoras y las respuestas de anticuerpos específicos anti-donantes de sangre muestra mediante citometría de flujo (aquí hemos utilizado celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación).

Mantenimiento de la tolerancia a los aloinjertos tras detención del tratamiento es generalmente asociado con la inducción de células reguladoras8. En las últimas décadas, los estudios se centraron en CD4+Tregs caracterizado por unanimidad ellos por los principales marcadores Foxp3+,altade CD25 y CD1279,10,11. Del mismo modo, varios marcadores fueron atribuidos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28-, CD45RCbaja, PD1+y Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre los años, la expresión de GITR, CTLA4 y citocinas (IL-10, TGFβ, IL-34, 35 IL, FGL-2) se asocian además a un Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. Sin embargo, nuevas poblaciones de células reguladoras, como Bregs, RegMCs, NKTregs, carecen de marcadores específicos pertinentes. De hecho, Bregs divulgan sobre todo como inmaduros CD24+ de las células, con la expresión ambigua de CD27 y a veces la producción de IL-10 y TGFβ granzima B22,23,24. La complejidad del linaje celular mieloide requiere una combinación de varios marcadores para definir su perfil regulatorio o proinflamatorias tales como el CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Por último, se han divulgado algunos marcadores para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, pero más estudios son necesarios más fenotípicamente describirlos27,28,29 ,30,31,32. Por lo tanto, se requieren evidencias de actividad supresora legitimar aún más la descripción fenotípica para la identificación de nuevos biomarcadores, nuevos mediadores inmunoreguladoras y ampliar el alcance a nuevas terapias con células madre.

Proponemos dos métodos complementarios para evaluar la actividad supresora de las células. En primer lugar, el método en vitro consta de prevencion células con células de etiqueta efectoras T estimuladas por antígenos alogénicos de donante que presenta las células (APCs) en diferentes proporciones durante 6 días de cultivo, y analizando el efector proliferación de la célula de T que refleja supresión inmune dirigida por el donante. Las células procedentes de ratas tratadas pueden compararse directamente a las células ingenuas ratas y ratas injertadas no tratadas para la actividad represiva (o a cualquier otra población de células reguladoras), en una gama de cocientes del supresor: efector. Además, este método no requiere ningún trasplante, y se obtienen resultados dentro de 6 días. En segundo lugar, el método en vivo consiste en transferir las células reguladoras previstas de una rata tratada a un destinatario injertado recién irradiado. Mientras que las células B, células mieloides o T las células de las ratas no tratadas ingenuo generalmente no para inhibir el rechazo agudo y prolongar la supervivencia del injerto a transferencia adoptiva, las células con actividad supresora potenciada de receptores tratados tienen estos atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia inducida por la irradiación del destinatario se recomienda permitir eventualmente transferidas células siguen siendo inafectadas por la homeostasis de la sangre y dominar más fácilmente las respuestas inmunes de los donantes. Para ambos métodos, la utilización en vitro de allogeneic de terceros APC o en vivo la transferencia adoptiva de prevencion las células en los receptores injertados con un corazón de terceros permiten análisis de la especificidad de los donante. Considerando que el método en vivo requiere un número considerable de células, poco representado las subpoblaciones de células pueden evaluarse más fácilmente actividad supresora en vitro33.

Respuesta humoral también puede ser medido para evaluar el estado de la tolerancia y el control de las respuestas de anticuerpos dirigidos a los antígenos del donante. De hecho, la tolerancia se caracteriza por la ausencia de la respuesta humoral hacia el donante sino la conservación de la capacidad de los beneficiarios a desarrollar la respuesta humoral a antígenos nuevos y preservación de las respuestas de memoria. En primer lugar, el principio de la detección del aloanticuerpo se basa en el reconocimiento de las células del donante por receptores anticuerpos tras incubación del tipo de la célula donante con el suero del receptor injertado. Segunda respuestas humorales a antígenos exógenos pueden ser evaluados después del estímulo de receptores tolerantes a largo plazo con hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura (KLH) emulsionado con completa adyuvante de Freund de. La presencia de anticuerpos IgM e IgG específicos contra los antígenos puede detectarse los días 4 y 13, respectivamente, después de la inmunización, con ensayo de inmunosorbente vinculado enzima (ELISA)34. En tercer lugar, la preservación de la respuesta inmune de memoria puede ser evaluada por la inyección de xenogeneicos de glóbulos rojos (gr) a -7 y + 3 días del trasplante y la tinción con destinatario suero de recolectadas en días + 8 y + 17 después del trasplante de glóbulos rojos. Todos estos métodos permiten la identificación de subtipos de inmunoglobulinas mediante anticuerpos específicos de la secundarios y adquisición rápida de los resultados en menos de 1,5 h por la FACS coloración o unas horas por ELISA.

Finalmente, estos protocolos están diseñados para la caracterización de los modelos de trasplante y pueden ser, en cierta medida, aplicada a los modelos de enfermedad autoinmune. Los principios del método pueden transponerse a todas las especies.

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Protocol

Nota: Todos los protocolos han sido aprobados por un Comité de ética y deben realizarse de forma estéril.

1 generación de tolerancia en un modelo de aloinjerto cardiaco de rata

  1. Lew.1W LEW.1A procedimiento de aloinjerto
    1. Anestesiar un varón donante LEW.1W rata mediante inhalación isoflurane-O2 , suplida con 1% N2O después de 5 minutos lugar el animal en decúbito dorsal y desinfecta el abdomen con betadine para llevar a cabo una toracotomía (es decir, incisión en el espacio pleural del tórax).
      1. El inferior y superior venas cavas del agujero de la abrazadera, les ligadura y cortarlas. Luego la arteria pulmonar y la aorta y salvar el injerto en frío 0,9% NaCl.
    2. Anestesiar una 250 g masculino LEW.1A receptor rata (de 8 a 12 semanas) con inhalación isoflurane-O2 , suplementada con 1% N2O después de 5 minutos colocar el animal en decúbito dorsal y desinfecta el abdomen con betadine para llevar a cabo una laparotomía xyphopubic (es decir, incisión grande del proceso xifoides a la sínfisis del pubis).
      1. Extraer los intestinos, los vasos sanguíneos abdominales de la abrazadera, realizar una anastomosis termino-lateral (es decir, conexión entre el extremo de un canal y la pared del otro) entre la aorta del injerto y la aorta abdominal y la pulmonar arteria y abdominal de la vena cava y retire las abrazaderas.
    3. Suturar el plano muscular y la piel y desinfectar con betadine.
    4. Inyectar este medicamento (analgésico) 6 mg/kg por vía subcutánea (s.c.) y oxitetraciclina (antibiótico) por vía intramuscular (i.m.) y colocar al animal bajo una lámpara de calor hasta que el animal se despierta. Inyección i.m. (50 μg/kg) de buprenorfina (opioides) y meloxicam (droga antiinflamatoria nonsteroidal) (0,3 mg/kg) s.c. el día del trasplante y un día después.
  2. Inducción de tolerancia por el bloqueo de las interacciones coestimuladoras
    1. Siga los pasos 1.1.1. a 1.1.2.
    2. En una zona clasificada de A2 de la instalación animal, diluir 2 x 1010 partículas infecciosas de AdCD40Ig (un adenovirus codificación CD40Ig, una molécula quimérica que bloquea la interacción CD40-CD40L) en solución de lactato de Ringer para llegar a un volumen final de 150 μL e inyectar en 3 puntos (3 x 50 μL) de la pared ventricular del ápice del injerto.
    3. Siga los pasos de 1.1.3 a 1.1.4.
      Nota: AdCD40Ig tratamiento puede asociarse con anti-CD8α anti-ICOS y anti-CD28 anticuerpo inyecciones2,35,36.
  3. Inducción de tolerancia por la sobreexpresión de una proteína recombinante
    1. Diluir 1 x 1012 viral genoma de rata AAV recombinante IL34 en solución de lactato de Ringer para llegar a un volumen final de 100 μl. anestesiar una rata LEW.1A de 150 g con inhalación isoflurano O2 e inyectar por vía intravenosa (i.v.) en la vena del pene.
    2. Un mes después de la inyección de IL34 AAV, realizar un injerto LEW.1W en el LEW.1A receptor según protocolo 1.1.

2. evaluación in Vitro de actividad supresora de las células por reacciones mixtas de linfocitos (MLRs)

Nota: Actividad supresora de las células de las ratas tolerantes a tratados debe ser comparado con la población equivalente de destinatarios injertados syngeneic o ratas de ingenuo.

  1. Aislamiento de allogeneic APC: células dendríticas de plasmacytoid (PDC)
    1. Anestesiar el macho LEW.1W ingenuo donantes rata mediante inhalación isoflurane-O2 , suplementada con 1% N2O después de 5 minutos colocar el animal en decúbito dorsal y desinfecta el abdomen con betadine para realizar una esplenectomía. Extirpar el bazo por transecting los vasos, excepto el bazo en frío 1 X solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el animal de la sutura.
    2. Transferencia del bazo en un plato, quitar 1 X PBS y perfusión con 5 mL de 0.2% colagenasa D. Para mejorar la digestión de la enzima, corte del bazo en pequeños trozos e incubar 15 min a 37 ° C.
    3. Agregar 500 μl de 0,1 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA), transfiera las piezas de bazo en un colador y aplastar el bazo con el émbolo de una jeringa para disociar las células. Transferir a un tubo y las células con 15 mL de 1 X PBS. Centrifugar 10 min a 430 x g. eliminar el sobrenadante.
    4. Para eliminar los glóbulos rojos y plaquetas, Resuspender el precipitado de splenocyte en una solución hipotónica 10 mL e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT). Lave con 1 X PBS y centrifugar 10 min a 190 x g. descartar el sobrenadante.
    5. Quitar las fibras de colágeno por filtración en un filtro de tejido 100 μm. Contar las celdas para ajustar la concentración celular de 5 x 107 células/mL en suero de ternera fetal de 1 X PBS/2% (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos debe ser entre 4 x 108 y 7 x 108 células.
    6. Enriquecer las células de interés por selección negativa antes de la clasificación de la célula. Incubar 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL purificada anticuerpos específicos contra las células T (anti-TCRαβ, R7/3 clon y anti-TCRγδ, V65 clon), las células de B (anti-CD45RA, clon de OX33) y las células NK (anti CD161, 3.2.3 clon), lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a 430 x g . Deseche el sobrenadante.
    7. Lave con granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Uso de 3,5 μl granos/106 esplenocitos, lavar añadiendo 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, lugar para 1 minuto en el imán y descarte el sobrenadante. Repetir dos veces. Resuspender los granos en 10 volúmenes de 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (por ejemplo, 35 granos μl se diluye en 350 μl X PBS/2% FCS/0,5 1 mM EDTA).
    8. Eliminar las células no deseadas por los esplenocitos de mezcla con los granos magnéticos durante 10 min a 4 ° C bajo agitación, coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos enriquecido debe estar comprendida entre 5 x 107 y 9 x 107.
    9. Mancha las células usando anticuerpos marcados para más selección de PDC: excluir las células de T restantes (anti-TCRαβ, clon de R7/3) o las células de B (anti-CD45RA, OX33 clon) y tipo CD4+ (anti-CD4, clon OX35) CD45R+ las células (anti-CD45R, clon de His24). Abalorios de etiqueta con cada Ab a establecer una matriz de compensación en FACS. Incubar 15 min a 4 ° C y lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Resuspender las células a una concentración de 5 x 107 células/mL, filtro en un filtro de tejido 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla, por compuerta en DAPIdel TCR CD45RACD4+CD45R+ como se muestra en la figura 1.
  2. Aislamiento de células efectoras T de respuesta (CD4 + CD25 células de T de )
    1. Cosecha el bazo de una rata LEW.1A no tratadas no injertadas ingenuo y guardar en frío 1 X PBS.
    2. Transferencia del bazo en un tamiz que se coloca en un plato y añadir 10 mL de 1 X PBS. Aplastar el bazo con el émbolo de una jeringa para disociar las células. Transferencia de las células en un tubo de 50 mL, lave con 1 X PBS y centrifugar 10 min a x 430 g. descartar el sobrenadante.
    3. Para eliminar los glóbulos rojos y plaquetas, Resuspender el precipitado de splenocyte en 10 mL de solución hipotónica durante 5 min a temperatura ambiente, luego lavar de 1 X PBS y centrifugar a 10 min x 190 g. eliminar el sobrenadante.
    4. Quitar las fibras de colágeno por filtración en un filtro de tejido 100 μm. Contar las celdas para ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos debe ser entre 3 x 108 y 5 x 108 células.
    5. Enriquecer las células de interés antes de la clasificación. Incubar 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL purificada anticuerpos específicos a las células CD8 (anti-CD8α, OX8 clon), las células de B (anti-CD45RA, clon de OX33), las células NK (anti CD161, 3.2.3 clon), las células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clon), gamma delta T células (anti-TCRγδ, V65 clon). Luego lavar con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a 430 x g. eliminar el sobrenadante.
      Nota: Para ordenar los CD8 natural+ Tregs de ingenuo ratas al mismo tiempo como CD4+ células efectoras T, no añadir anti-CD8α Ab durante el agotamiento.
    6. Lavar los granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA como se describe en el paso 2.1.7.
    7. Quitar las células indeseadas por esplenocitos de mezcla con los granos magnéticos durante 10 min a 4 ° C bajo agitación, luego coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: El número de esplenocitos debe estar comprendida entre 5 x 107 y 8 x 107 células.
    8. Añadir anticuerpos etiquetados a tipo CD4+CD25 células de T de : anti-TCRαβ (R7/3 clon), anti CD4 (OX35 clon), anti-CD25 (OX39 clone) e incubar 15 min a 4 ° C. Al mismo tiempo ordenar CD8+CD45RCbaja Tregs, añadir anti-CD45RC Ab (OX22 clone). Etiqueta de granos con cada Ab para crear una matriz de compensación para su posterior procesamiento por citometría de flujo. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y descarte el sobrenadante.
    9. Resuspender las células 5 x 107 células/mL, filtro en un filtro de tejido 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla por compuerta en el TCR de DAPI +CD4+CD25 las células como las células de la respuesta (y si es necesario TCR DAPI +CD4CD45RCbaja como CD8+ Las represivas células Tregs) como se muestra en la figura 2.
  3. Aislamiento de células PREVENCION
    Nota: Divida el bazo en dos alícuotas: ordenar una de las células B, células mieloides y las células NK y la otra en CD4+ y CD8 células+ CD45RCbaja T, para evaluar su función supresora.
    Nota: Para la transferencia adoptiva de células, guardar 1 x 108 esplenocitos para servir como control positivo de tolerancia por transferencia adoptiva, si es necesario.
    1. Clasificación de las células B, células mieloides y las células NK
      1. Seguir protocolo 2.1.1 a 2.1.5.
      2. Incubar 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL de células T específicas sin etiqueta anticuerpos (anti-TCRαβ, R7/3 clon y anti-TCRγδ, V65 clon), lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a x 430 g. descartar el sobrenadante.
      3. Lave con granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA como se describe en el paso 2.1.7.
      4. Los esplenocitos se mezclan con los granos magnéticos para eliminar las células no deseadas e incubar 10 min a 4 ° C bajo agitación, luego coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Añadir anticuerpos etiquetados a los esplenocitos ordenar celdas con presunta actividad supresora como células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clon), las células de B (anti-CD45RA, OX33 clon) o las células NK (anti-CD161, 3.2.3 clon). Etiqueta las cuentas con cada Ab a establecer una matriz de compensación en FACS. Incubar 15 min a 4 ° C y lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspender las células a una concentración de 5 x 107 células/mL, filtro en un filtro de tejido 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla compuerta en CD11b DAPI/c+ para las células mieloides, CD45RA+ para las células de B y CD161+ para las células NK como se muestra en la figura 3.
    2. Clasificación de CD4 + y CD8 + CD45RC baja T células
      1. Seguir protocolo de 2.2.1 a 2.2.4.
      2. Para la selección negativa en una columna magnética, incubar las células 15 min a 4 ° C con 2 μg/mL purificada anticuerpos específicos contra células B (anti-CD45RA, clon de OX33), las células NK (anti CD161, 3.2.3 clon), las células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clon), gamma () células delta T anti-TCRγδ, V65 clon), lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y centrifugar 10 min a x 430 g. descartar el sobrenadante.
      3. Lavar los granos magnéticos 3 veces con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA como se describe en el paso 2.1.7.
      4. Quitar las células indeseadas por los esplenocitos de mezcla con los granos magnéticos durante 10 min a 4 ° C bajo agitación, luego coloque el tubo en el imán durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Repetir dos veces. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 x 107 células/mL en 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Añadir etiqueta anticuerpos a las células Tregs de ordenar: anti-TCRαβ (R7/3 clon), anti-CD4 (OX35 clon), anti-CD45RC (OX22 clone). Etiqueta las cuentas con cada Ab a establecer una matriz de compensación en FACS. Incubar 15 min a 4 ° C y lave con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Resuspender las células a una concentración de 5 x 107 células/mL, filtro en un pañuelo de papel 60 μm y las células muertas de la etiqueta mediante la adición de DAPI a una concentración final de 0.1 μg/mL. Ordenar las células con un clasificador de células 70 μm boquilla compuerta en DAPITCR+CD4+CD45RCbaja CD4+Tregs y DAPITCR+CD4CD45RC baja como CD8+Tregs ( figura 4).
        Nota: El anti-CD8α Ab (OX8 clon) puede utilizarse en lugar de la Ab anti-CD4 si son discriminadas las células de T de CD4+las células T no por anti-TCR etiquetado. Un exceso de CD4+Tregs debe ordenarse en anticipación de la muerte celular debido a la etiqueta del tinte de proliferación celular (CPD).
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE) etiquetado de células responder para medir proliferación
    1. Después de la clasificación de la célula de responder, Lave dos veces las células con 1 X PBS.
    2. Resuspender las células a una concentración de 1 x 107 células/mL de 1 X PBS e incubar con 0,5 μm CFSE por 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Detener la reacción agregando FCS a 1.5 X el volumen y centrifugar 10 min a 430 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    3. Lavar dos veces las células con el medio completo y contar las células.
      Nota: Espera 30% de la muerte de las células en este paso.
  5. Etiquetado de CPD de CD4 + Tregs para ensayo represivo en CD4 + células efectoras
    Nota: Este paso es necesario para discriminar CFSECD4+Tregs de respondedor proliferación CFSE CD4+las células T en el día 6 de cocultivo de compuerta en las células del CPD .
    1. Después de CD4+ Tregs célula clasificación, Lave dos veces las células con 1 X PBS.
    2. Resuspender las células a una concentración de 1 x 107 células/mL de 1 X PBS e incubar con 10 μm de CPD V450 por 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    3. Lavar dos veces las células con el medio completo y contar las células.
      Nota: Espera 30% de la muerte de las células en este paso.
  6. Consejo de cocultivo
    1. Utilizar la cultura en medio que comprende: Medio RPMI 1640 suplementado con beta-mercaptoetanol (5 x 10-5 M), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (0.1 mg/mL), piruvato de sodio (1 mM), glutamina (2 mM), buffer HEPES (1 mM), aminoácidos no esenciales (1 X), FCS ( 10%).
    2. Células en cultivo en U de 96 pozos de fondo las placas.
    3. Añadir las células en el orden siguiente: células represivas, respondedor células y células alogénicas.
    4. Mantener constante el número de células de la respuesta T y APC allogeneic y probar un número de rango de Tregs. Por ejemplo, de cociente 4:4:1, 5 x 104 células de prevencion, 5 x 104 células de respondedor y 1.25 x 104 células allogeneic cociente 2:4:1, 2,5 x 104 células de prevencion, 5 x 104 células de respondedor y 1.25 x 104 alogénico células.
    5. Mantener la proporción de 5 x 104 células de responder para 200 medio μL/pocillo.
    6. Para los controles, incluyen unos pocillos con células responder T sin trasplante allogeneic CPA (control negativo) y células de la respuesta T con APC allogeneic sin células reguladoras (control positivo) para CFSE gating en día 6 (ver paso 2.7.6.).
  7. FACS de tinción y análisis después de 6 días de cocultivo
    Nota: La proliferación de las células efectoras puede ser evaluada en varios puntos del tiempo. Tenga en cuenta que la proliferación es exponencial: aumenta la división celular, se observan más diferencias entre las condiciones de prevencion y control negativo.
    1. Transferencia de las células de la U de 96 pocillos las placas inferiores a 96 pocillos V las placas del fondo y centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    2. Guarde el sobrenadante en una nueva placa a-20 ° C para la medición de niveles del cytokine, si es necesario.
    3. Lavar las células con 200 μL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA bien y centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    4. Añadir anticuerpos a las células a más lejos de la puerta en las células de la respuesta T: anti-TCRab (R7/3 clon) y anti-CD4 (OX35 clon). Incubar 15 min a 4 ° C y lavar dos veces con 200 μL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA por pozo. Deseche el sobrenadante.
    5. Añadir 100 μl de DAPI diluido al 0.1 μg/mL de 1 X PBS y leer la placa con un analizador de FACS.
    6. Analizar el perfil de la CFSE mediante compuerta en negativo DAPI (células vivas) CPD negativo (no-CD4+Tregs) TCR+CD4+ las células. Responder sin estimular células tiene brillo CFSE máxima como se muestra en la figura 5 histograma izquierdo de abajo. En presencia de APCs alogénicos, las células de responder tienen proliferación máxima y mínima luminosidad CFSE (abajo, centro). En presencia de allogeneic APCs y células reguladoras, las células efectoras tienen proliferación medio y brillo CFSE (inferior derecha).

3. evaluación in Vivo de la actividad supresora de las células por transferencia celular adoptiva en un corazón injertado destinatario

Nota: La irradiación es necesaria para eliminar las células del huésped y favorecen la proliferación y el engraftment de la célula donante.

  1. Irradiar a los receptores de injerto temprano en el día antes del injerto al requisito del destinatario. Anestesiar ratas con inyección i.m. de xilacina (8 mg/kg)-ketamina (80 mg/kg) e irradiar en una dosis de 4.5 Gy con rayos X.
  2. Seguir protocolo 2.3 para aislar las células de interés.
    Nota: Guardar 1 x 108 esplenocitos para servir como un control positivo de tolerancia por transferencia adoptiva, si es necesario.
  3. 12 h después de la irradiación (el día antes de la prótesis, en la noche), anestesiar las ratas por inhalación de 4% de isoflurano O2 e infunden las células (5.0 x 10 células de7 T, 3.0 x 10 células7 B, 3.0 x 107 de células mieloides o 1.50 x 108 i.v. de esplenocitos como control positivo de tolerancia por transferencia adoptiva) en la vena del pene.
    Nota: El número de células que exija la transferencia adoptiva de la tolerancia depende de la actividad supresora de las células.
  4. Al día siguiente, seguir protocolo 1.1 realizar el aloinjerto. Seguir evolución de injerto por palpación a través del abdomen.

4. detección de anticuerpos específicos de donante

Nota: IgG respuestas dirigidas hacia el donante del injerto se miden por incubación de las células del donante con suero del receptor. Restar el fondo inducido por coloración directa de las células B LEW.1W por incubar las células con el suero LEW.1W syngeneic.

  1. Cosecha de sangre de las ratas y centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Guardar el suero. Suero se puede almacenar a-20 ° C o utilizar inmediatamente. Inactivar el complemento en los sueros por incubación durante 30 min a 56 ° C.
  2. Cosecha el bazo de una rata LEW.1W del donante y se puede guardar en frío 1 X PBS. Siga los pasos de 2.2.1. a 2.2.4. Añadir 2 x 105 células/pocillo de una placa de 96 pocillos V inferior. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C y descarte el sobrenadante.
  3. Diluir los sueros en serie de 1/10 a 1/270 de 1 X PBS (4 diluciones/muestra). Incube las células por 1 h a 4 ° C con 25 μl de suero diluido/pozo. Anticipar el número de donantes específicos IgG subtipos (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) las respuestas inmunitarias a analizar por muestra (subtipos de IgG de 1 suero x 4 diluciones x 4). Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y descarte el sobrenadante.
  4. Incubar las células con cada subtipo de IgG de ratón anti-rata Ab marcado con fluorocromo durante 30 min a 4 ° C, un subtipo/pozo.
    Nota: Si marcado con fluorocromo anti-rata Ig Ab está disponible, es posible usar subtipo de IgG purificada sin etiqueta ratón anti-rata Ab y un marcado con fluorocromo secundaria anti-ratón AB dependiendo en los fluorocromos disponibles y configuración del citómetro, varios subtipos de IgG anti-ratas pueden probarse en un pozo con ajustes apropiados.
  5. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA dos veces y desechar el sobrenadante.
  6. Añadir 100 μl de DAPI diluido al 0.1 μg/mL en PBS y leer la placa con un analizador de FACS.
  7. Leer la intensidad de fluorescencia media (IFM) de subtipo de IgG de anti-rata Ab marcado con fluorocromo en todas las células DAPI . Restar la IMF obtenida con ingenua LEW.1A suero de las células LEW.1W (tinción de fondo, abajo a la izquierda) de la IMF obtenida con el suero de cada receptor en las células LEW.1W en la dilución correspondiente (abajo media rechaza los destinatarios que pantalla máxima MFI y la parte inferior derecha por tratados destinatarios tolerantes que MFI intermedio) (figura 6).

5. evaluación de la respuesta Humoral a antígenos exógenos (Naive y memoria)

Nota: Puede usarse el suero de las ratas antes del trasplante, el tratamiento y la inmunización como controles negativos de las respuestas humorales. De lo contrario, se pueden utilizar ratas ingenuas no inmunizados. El suero de los receptores inmunocompetentes, es decir, trasplantado los receptores vacunados exoantigen y rechaza, se utilizan como controles positivos de las respuestas humorales.

  1. Capacidad para desarrollar la respuesta humoral a un nuevo antígeno (figura 7)
    Nota: Este método es una cuantificación relativa de las respuestas humorales como no incluye una norma. Una cuantificación absoluta de Ig sería posible mediante la adición de una gama de diluciones de rat IgG o IgM anti-KLH Ab con concentración conocida de paso 5.1.6.
    1. Emulsionar 50 μg de KLH en 200 μL de completa adyuvante de Freund de e inyectar en la cola de largo sobrevivir/tolerantes a destinatarios, destinatarios rechaza sin tratar, o ingenuo ratas de control como control positivo de las respuestas humorales.
    2. Recoger muestras de sangre a los 4 y 13 días después de la inmunización y centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. La fase superior es el suero. El suero de las ratas no inmunizados para un control negativo de la cosecha. Suero puede congelarse a-20 ° C hasta el ensayo de ELISA.
    3. Capa de placas de ELISA (fondo plano) con 50 μL/pocillo KLH diluido a 10 μg/mL de 1 X PBS durante la noche a 4 ° C. Asegúrese de que la solución de capa cubre todos los pozos.
    4. Retirar el exceso sin recubrimiento KLH por lavado. Para lavar, añadir 150 μL/pocillo del tampón de lavado (PBS de X 1 que contiene 0,1% Tween) y flick.
    5. Unión inespecífica de bloque de Ig del destinatario por incubar durante 1 h a 37 ° C con 100 μL/pocillo del tampón de lavado que contiene 10% FCS. Una vez lavado.
    6. Diluir el suero receptor en tampón de lavado a partir de 1/40 a 1/512 en serie, añadir 50 μL/pocillo de duplicados de la dilución serial a la placa de cubierta e incubar por 2 h a 37 ° C. Mantenga algunos pozos libres de suero de control negativo. Lavar dos veces.
    7. Añadir 50 μl de 1 μg/mL de conjugado con biotina anti-rata IgM Ab en los pocillos que contienen el suero cosechado en el día 4 en recipientes, o 50 μl de conjugado con biotina anti-rat IgG en los pocillos que contienen el suero cosechado en el día 13 e incubar 1 h a 37 ° C. Lavar dos veces.
    8. Añadir 50 μL/pocillo del conjugado HRP-estreptavidina en 1 μg/mL durante 45 min a 37 ° C. Lavar 3 veces.
    9. Añadir 50 μl de 3, 3′, 5, 5-tetrametilbenzidina (TMB) sustrato para < 30 min a temperatura ambiente y detener la reacción con 25 μl de ácido sulfúrico de 2 M cuando están saturados los controles positivos.
    10. Leer la absorbancia a 405 nm. Comparar la densidad óptica obtenida con el suero del receptor al que obtuvo con el suero de control de ratas de ingenuo.
  2. Evaluación de la capacidad de respuesta humoral memoria (figura 8)
    1. 7 días antes del trasplante, inyectar i.v. 109 de xenogeneicos gr diluido en 800 μl de 1 X PBS a las ratas de ingenuo. Los glóbulos rojos pueden ser de oveja, caballo o cualquier otra especie.
    2. Realizar el trasplante y administrar el tratamiento de tolerogénicas.
    3. 3 días después del injerto, inyecte nuevo i.v.109 RBC diluido en 800 μl de 1 X PBS en los receptores de injerto y las ratas no injertado.
    4. Cosecha sangre muestras 5 y 14 días después de la segunda inmunización y centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C para recuperar la fase superior del suero. Suero se puede almacenar a-20 ° C o utilizar inmediatamente. Inactivar el complemento en el suero de rata por Incubar 30 min a 56 ° C antes de usar.
    5. Añadir 2 x 105 RBC/pozo de una placa de 96 pocillos V inferior. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C y eliminar cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.
    6. En serie diluir los sueros 2 de 1/10 a 1/1280 de 1 X PBS (8 diluciones/muestra). Incube las células por 1 h a 4 ° C con 25 μl de suero diluido/pozo. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA y descarte el sobrenadante.
    7. Incubar las células con la RBC especies adsorbidas anti-rata IgG o IgM subtipos marcados con fluorocromo durante 30 min a 4 ° C, un subtipo/pozo. Evaluar la rata de IgM e IgG anti-RBC en suero cosechada respectivamente 5 y 14 días después de la inmunización,. Lavar las células con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA dos veces y desechar el sobrenadante.
      Nota: Si marcado con fluorocromo anti-rata Ig Ab está disponible, es posible utilizar subtipo de IgG purificada sin etiqueta ratón anti-rata Ab y un marcado con fluorocromo secundaria anti-ratón Ab.
    8. Añada 100 μl de DAPI diluido al 0.1 μg/mL de 1 X PBS y analizar las células con un analizador de FACS.
    9. Representar a la IMF en función de la dilución para cada grupo.

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Representative Results

La evaluación de la actividad represiva tras la clasificación de la APC (figura 1), células de la respuesta y Tregs simultáneamente (figura 2), o individualmente (figura 4), y cualquier otras células reguladoras putativos (figura 3), puede ser hecho en vivo por la inyección directa de células reguladoras y en vitro por la medida del brillo de la CFSE (figura 5). El estado de la respuesta humoral del receptor hacia el donante (figura 6) o antígenos exógenos (figuras 7 y 8) también puede ser evaluado en vitro después de la inmunización en vivo como representado.

Figure 1
Figura 1 . Gating estrategia para ordenar PDC.
Se seleccionaron células morfología tamaño y granularidad (SSC/FSC-A-A), dobletes fueron excluidos por SSC-W/SSC-H parámetros y FSC-FSC-W/H, células vivas fueron seleccionadas por compuerta en DAPI las células, y PDC fueron seleccionado en CD45RA TCRCD4 + CD45R+ expresión. Pureza se evaluó añadiendo DAPI a las células clasificadas y corriendo en el clasificador de la célula con los parámetros de clasificación. Pureza de una población ordenada rara (menos del 2%) debe ser mayor al 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Bloquear la estrategia de tipo CD4+CD25 las células de la respuesta T y CD8CD45RCbaja + Tregs.
Las células fueron seleccionadas en la morfología, es decir, tamaño y granularidad (SSC/FSC-A-A), dobletes fueron excluidos por FSC-FSC-W/H y parámetros SSC-W/SSC-H, células vivas fueron seleccionadas por compuerta en DAPI las células, y células de responder fueron seleccionadas en TCR + CD4+CD25 expresión. CD8+Tregs han sido simultáneamente ordenados por compuerta en TCR+CD4CD45RCbajo las células. Pureza se evaluó añadiendo DAPI a las células clasificadas y corriendo en el clasificador de la célula con los parámetros de clasificación. Pureza debe ser mayor al 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Bloquear la estrategia de las células de tipo B, células mieloides y las células NK.
Se seleccionaron células morfología tamaño y granularidad (SSC/FSC-A-A), dobletes fueron excluidos por FSC-FSC-W/H y parámetros SSC-W/SSC-H, células vivas fueron seleccionadas por compuerta en DAPI las células, y las células de B fueron seleccionadas en CD45RA+ expresión, las células mieloides en la expresión de CD11b/c+ y las células NK en CD45RA CD161 CD11b/calta expresión. Pureza se evaluó añadiendo DAPI a las células clasificadas y corriendo en el clasificador de la célula con los parámetros de clasificación. Pureza debe ser mayor al 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . Bloquear la estrategia de tipo CD8+CD45RCbajo y CD4+CD45RCbajo Tregs.
Se seleccionaron células morfología tamaño y granularidad (SSC/FSC-A-A), dobletes fueron excluidos por SSC-W/SSC-H parámetros y FSC-FSC-W/H, vivió las células fueron seleccionadas por que bloquean las células DAPI y CD4+Tregs se seleccionaron en TCR + CD4+CD45RCbaja expresión y CD8+Tregs en TCR+CD4CD45RCbaja expresión. Pureza se evaluó añadiendo DAPI a las células clasificadas y corriendo en el clasificador de la célula con los parámetros de clasificación. Pureza debe ser mayor al 95%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Análisis representativo de la en vitro ensayo represivo.
La proliferación de células de respuesta se analizó por selección en morfología tamaño y granularidad (SSC-FSC-A/A), exclusión de Dobletes por parámetros FSC-FSC-W/H y SSC-W/SSC-H, la exclusión de las células muertas y CD4+ Tregs por compuerta en DAPICPDV450 células, selección de TCR+CD4+ las células y análisis del perfil de CFSE. La puerta de la CFSE se basó en las células sin estimular respuesta marcada con la CFSE. Las célulasalta CFSE son células no proliferantes y CFSEbaja son células con ≥ 1 división. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 . Análisis representativo de la respuesta de aloanticuerpo específico de donantes.
Esplenocitos de la rata donante se incubaron con una gama de suero diluido inactivadas por calor de los recipientes tratados o sin tratados o de ingenua rata y luego con anti-rat IgG-FITC. Aloanticuerpos son detectados mediante el análisis de MFI de la FITC en células DAPI z después de la exclusión de Dobletes SSC y el FSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 . Principio del método de detección de anti-KLH.
Los destinatarios fueron vacunados 120 días después de trasplante con KLH complementado con CFA, y muestras de sangre se cosecharon 4 y 13 días después de la inmunización. Proteínas KLH se revestido en placas de fondo plano de 96 pozos y se incubaron con muestras de suero de ratas inmunizadas. Biotinilado cabra anti-rata IgG o IgM permitida la detección de AC anti-KLH presente en suero cosecha 4 o 13 días después de la inmunización. Estreptavidina acoplado a HRP transforma el sustrato TMB para un producto de color azul que se vuelve amarillo cuando la reacción se detiene con ácido sulfúrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 . Esquema del método de detección de anti-RBC.
Los destinatarios fueron vacunados 7 días antes y 3 días después de trasplante de xenogeneicos células de sangre rojas (RBCs), y las muestras de sangre fueron extraídas inmunizados días destinatarios 5 y 14 después de la última inmunización. Glóbulos rojos se incubaron muestras de suero de ratas inmunizadas. Se detectó presencia de anticuerpos anti-gr en los hematíes mediante tinción con etiquetado cabra anti-rata IgG o anticuerpos IgM y análisis FACS Canto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Transferencia adoptiva de esplenocitos totales en un destinatario recién injertado es una manera eficiente de detectar la presencia de células reguladoras inducidas o potenciada por un tratamiento. Linfopenia transitoria inducida por la irradiación de host promueve supervivencia de la célula después de la transferencia y establecimiento de la tolerancia. Por otra parte, el letal irradiación deja tiempo para las células con propiedades tolerogénicas para convertir a las nuevas células reguladoras durante la reconstitución inmune, un fenómeno llamado tolerancia infecciosa34. Generalmente, bien descrito CD4 CD25altaFoxp3++CD127baja Tregs se estudian primero cuando la tolerancia se observa. Sin embargo, la transferencia de la fracción negativa (esplenocitos empobrecido en CD4+Tregs) permite a veces extensión más allá de las ya conocidas células reguladoras e identificación de celular nuevo de poblaciones1,2, 3,4. En la tolerancia inducida por la AdCD40Ig, la transferencia de CD4+T agota las células esplenocitos revelaron el descubrimiento de CD8 CD45RCbaja Tregs1+. Además, sucesiva transferencia de CD8 total+ T las células y entonces restringida a las célulasbajo CD45RC, demostradas el potencial de este método para identificar progresivamente una nueva población de células reguladoras. Por otra parte, esta estrategia permite el análisis de todas las poblaciones. De hecho, hemos demostrado que muchas células reguladoras pueden coexistir y son incluso probables, y que mecanismos de compensación existe2,4. En ratas tratadas con CD40Ig, agotamiento de los CD8+ células permitió la aparición de las células B y células mieloides con propiedades reguladoras y transferir tolerancia para el aloinjerto cardiaco en rata según el protocolo descrito por encima de2. En un modelo de tolerancia inducida por la sobreexpresión de IL34, ambos CD4+ y CD8+Tregs fueron capaces de transferir tolerancia4.

Especificidad dirigida por donantes de tolerancia inducida por el tratamiento puede ser evaluada a nivel celular y humoral. Primera transferencia adoptiva de células reguladoras en receptores de un injerto de terceros no tendrán éxito en la transferencia de tolerancia si las células son específicas de los primeros donantes del injerto33. En segundo lugar, PREVENCION células eficientemente deben inhibir la proliferación de las células de respuesta en respuesta a la estimulación por los vehículos blindados de la primera donante del injerto pero no de una tercera parte de donantes2. Finalmente, las respuestas humorales contra el donante del injerto pueden distinguirse de la total producción de Ig en el destinatario mediante el protocolo descrito. Además, en un caso de tolerancia específica para el primer donante del injerto, receptor debe ser capaz de desarrollar una nueva respuesta humoral contra un injerto de tercero de secundario, un antígeno nuevo o un antígeno conocido ex16.

Colagenasa D tratamiento del bazo es preferida y recomendable para extraer todas las poblaciones de la célula del órgano. Por último, cuando el fenotipo de las células reguladoras está tan apretado que las células están pobremente representadas (< 1% de esplenocitos), transferencia de la fracción negativa respecto a la transferencia de la población total puede ayudar a distinguir la actividad represiva de este pequeño población. Por ejemplo, inducido por la CD40Ig CD8+Tregs específico a un péptido alogénico puede ser FACS tiñen según tetrámeros pero su escaso número no permite transferencia adoptiva positiva33,38. Sin embargo, transferencia adoptiva de las CD8 tetrámero-agotado+CD45RCbaja T células no transferir tolerancia en comparación a Tregs total, destacando el potencial de esta subpoblación. Este resultado fue confirmado por un experimento represivo en vitro . De hecho, el experimento represivo fue también un modo convincente para demostrar la capacidad de Tregs Du51 específicas para suprimir las respuestas inmunitarias33.

El protocolo PREVENCION descrito está restringido a efector receptor CD4+las respuestas de la célula de T a PDC del donante. Este protocolo puede ser adaptado por sustitución de PDC por CDC o APCs total, pero asegurando que los efector: estimulador son apropiados lograr una moderada proliferación manejable por las células represivas. De hecho, una proporción de CD4+CD25 células de T de: PDC debe ser 4:1, mientras que un cociente de CD4+CD25 células de T de : CDC deben ser 8:1 y CD4+CD25 células de T de : APC, 1:1 o 1:2. Las proporciones dependen de la Alorreactividad entre donante y receptor; los cocientes anteriores son apropiados para una combinación de LEW.1W:LEW.1A con un rechazo agudo que ocurre en el día 7, pero el rango de proporciones de respuesta: estimulador debe analizarse antes del sacrificio de los animales. Por último, CFSE es preferible a la timidina para analizar la actividad represiva, por preocupaciones de seguridad y fiabilidad. Sin embargo, asegurar la distinción posible entre las células prevencion y respuesta a las células para el análisis de la CFSE en día 6 Si el efector CD4+CD25 T células son reemplazadas por esplenocitos totales. Asimismo, asegúrese de que las células de T restantes entre las células del estimulador no pueden proliferar después de 35 Gy irradiación.

Diseño de la FACS de tinción se basa en la disponibilidad de anticuerpos específicos listados en la tabla 3. Protocolos similares pueden ser adaptados para los modelos de ratones, asegurando la denominación de destino (por ejemplo las células mieloides son diferencialmente descritas en ratón y rata).

El aloinjerto cardiaco heterotópico en rata es un modelo de trasplante de órganos sólidos con grandes oportunidades para el control de resultado de injerto. Mientras que el modelo de aloinjertos renales se caracterizan por una muerte repentina del destinatario, palpación de la fuerza del golpe del injerto cardiaco a través de la pared abdominal informa de la evolución de injerto39,40. Un injerto de piel concomitante o un segundo injerto cardiaco se puede observar en el receptor del aloinjerto cardiaco para estudiar de memoria las respuestas41. Además, biomolecular ingeniería y biológicos o químicos las herramientas para agotamiento de determinados tipos de células como linfocitos B (IgM KO), las células CD8 (anticuerpos anti-CD8α) o células mieloides (liposomas de clodronato), son herramientas útiles para medir la importancia de dicha célula poblaciones en inducción o mantenimiento de la tolerancia dependiendo de la época post trasplante donde que agotan el tratamiento se administra al receptor1,2,3,4.

A la fecha, la rata Bregs, células mieloides y CD8+Tregs no están bien descritas. Los protocolos de inducción de la tolerancia anterior se proponen como referencia para la caracterización de rata células reguladoras1,2,3,4. Más descripción fenotípica de estas células y comparación con otros modelos de allotransplantation y otras especies podría ayudar a discriminar los marcadores de gran interés. De hecho, comparación de Bregs de modelos de ratón de la tolerancia y operacionalmente tolerantes pacientes destacar el predominio de expresión marcador CD5 o CD24 como biomarcadores de Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . En nuestro modelo de tolerancia inducida por AdCD40Ig combinado con CD8α agotamiento, CD24 es overexpressed en comparación con las células de B que carecen de actividad supresora2. Secuenciación de alto rendimiento digital gene expresión RNA recientemente emergido como una herramienta innovadora para caracterizar las células reguladoras46.

Por último, los protocolos para detectar la presencia de células reguladoras inducidas por un tratamiento de tolerogénicas se pueden adaptar a otros modelos. Aquí utilizamos el LEW.1W en LEW.1A de la combinación del aloinjerto, caracterizado por un rechazo del injerto en unos 7 días. Puede utilizarse la combinación de invertir, que ha sido descrito como más estrictas y donde el rechazo agudo ocurre más rápido y fuerte. Modelos de enfermedad autoinmune también pueden beneficiarse de nuestra experiencia en el trasplante para descifrar los mecanismos de inducción de la tolerancia con los tratamientos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue realizado en el contexto del proyecto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que es parte del programa de gobierno francés "Investissements Avenir" administrado por la ANR (ANR-11-LABX-0016-01) y por el proyecto IHU-Cesti financiado también por el " Programa de gobierno francés investissements Avenir", gestionado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

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