Author Produced

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la tolleranza nel trapianto e valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle sottopopolazioni cellulari distinti dal destinatario e lo stato immunitario del destinatario verso il donatore o antigeni esogeni.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La principale preoccupazione nel trapianto è raggiungere tolleranza specifica attraverso l'induzione di cellule regolatorie. La comprensione dei meccanismi di tolleranza richiede modelli affidabili. Qui, descriviamo modelli di tolleranza per l'allotrapianto cardiaco nel ratto, indotto dal blocco dei segnali di costimolazione o dal upregulation di molecole immunoregulatory attraverso il trasferimento genico. Ciascuno di questi modelli ha permesso la generazione in vivo delle cellule regolatorie come cellule T regolatorie (Treg), cellule regolatorie B (Bregs) o cellule mieloidi regolatorie (RegMCs). In questo manoscritto, descriviamo due protocolli complementari che sono stati utilizzati per identificare e definire le attività di regolamentazione delle cellule in vitro e in vivo per determinare la loro responsabilità nell'induzione della tolleranza e manutenzione. In primo luogo, un'analisi in vitro soppressiva ha permesso l'identificazione rapida delle cellule con capacità soppressiva sulle risposte immunitarie effettrici in un modo dipendente dalla dose e può essere utilizzata per ulteriori analisi come citochina misura o citotossicità. In secondo luogo, il trasferimento adottivo delle cellule da un destinatario trattato tollerante a un destinatario innestato appena irradiato, evidenziate le proprietà tollerogeniche di queste cellule nel controllo delle risposte immunitarie di innesto diretto e/o conversione di nuovo cellule regolatorie ( definito tolleranza infettiva). Questi metodi non sono limitati alle cellule con noti marcatori fenotipici e possono essere esteso a qualsiasi popolazione cellulare. Inoltre, il donatore diretto allospecificity delle cellule regolatorie (un obiettivo importante nel campo) può essere valutata utilizzando le cellule erogarici di terze parti o dell'innesto sia in vitro che in vivo. Infine, per determinare la capacità di tollerogeniche specifici di queste cellule regolatorie, forniamo protocolli per valutare le risposte umorali dell'anticorpo anti-donatore e la capacità del destinatario di sviluppare risposte umorali contro gli antigeni noti nuove o ex. I modelli di tolleranza descritto possono essere utilizzati per più ulteriormente caratterizzare cellule regolatorie, per identificare nuovi biomarcatori e molecole immunoregulatory e sono adattabili ad altri modelli di trapianto o malattie autoimmuni in roditore o umano.

Introduction

L'allotrapianto cardiaco nel ratto è un modello di trapianto di organo affidabile per valutare i trattamenti di induzione di tolleranza, a decifrare i meccanismi di induzione di tolleranza e di manutenzione e ha il potenziale di indurre cellule regolatorie funzionalmente competenti e dominante. I seguenti protocolli descrivono un completamente mancata corrispondenza heterotopic cardiaco innesto da un ratto di donatore 1W (LEW.1W, RT1u) di Lewis in un topo di Lewis 1A destinatario (LEW.1A, RT1un). In questa combinazione di innesto, rigetto acuto si verifica rapidamente (in circa 7 giorni) e può essere facilmente valutata tramite innesto battendo attraverso la palpazione dell'addome. Qui vi proponiamo tre protocolli per indurre la tolleranza per l'allotrapianto cardiaco nel ratto. In questi modelli, tolleranza è indotta e/o mantenuto da tipi differenti delle cellule normativo. Primo, il blocco di CD40-CD40L interazioni con un adenovirus codifica CD40Ig (AdCD40Ig) ha indotto la generazione di CD8+ Treg in grado di indurre tolleranza quando passivamente trasferiti a destinatari secondari innestate1. Inoltre, lo svuotamento di CD8+ di cellule (con gli anticorpi anti-CD8α) AdCD40Ig-trattati destinatari generati Bregs e RegMCs2. Analisi profonda dei CD8+ Treg proprietà ha evidenziato il ruolo chiave di parecchie molecole immunoregulatory definito come interleukin-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando che la sovraespressione di IL-34 (con un vettore AAV) indotto Treg attraverso la generazione di RegMCs, la sovraespressione di FGL-2 indotta Bregs, sottostante la complessa rete di cellule regolatorie.

Perché rigetto cronico si sviluppa lentamente ed è a lungo termine, per distinguere la tolleranza contro il rigetto cronico è necessaria un'analisi approfondita. Innesto di solito viene valutata per l'infiltrazione delle cellule, fibrosi, ispessimento della deposizione di C4d vascolare parete e complemento di immunohistology7. Mentre l'istologia metodi richiedono sacrificio animale o biopsia del trapianto, qui descriviamo un metodo semplice per valutare diverse caratteristiche del documento non autografo tollerato: l'emersione e la funzione delle cellule regolatorie e le risposte di anticorpi specifici anti-donatore di sangue campione di citometria a flusso (qui, abbiamo usato la fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)).

Manutenzione di tolleranza per il documento non autografo dopo l'arresto del trattamento è generalmente associato con l'induzione di cellule regolatorie8. Negli ultimi decenni, gli studi focalizzati su CD4+Treg caratterizzato all'unanimità li dagli indicatori chiavi Foxp3+, CD25altoe CD1279,10,11. Allo stesso modo, parecchi indicatori sono stati attribuiti a CD8+ Treg, come CD122+, CD28-, CD45RCbasso, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. nel corso degli anni, l'espressione di GITR, CTLA4 e citochine (IL-10, TGFβ, IL-34, IL 35, FGL-2) sono state inoltre associate a un Treg profilo3,4,6,13, 18,19,20,21. Tuttavia, la mancanza di popolazioni di cellule normativi emergenti, quali Bregs, RegMCs o NKTregs, marcatori specifici pertinenti. Infatti, Bregs per lo più vengono segnalati come immaturi CD24+ cellule, con espressione ambigua CD27 e, talvolta, produzione di IL-10, TGFβ o granzyme B22,23,24. La complessità del lineage delle cellule mieloidi richiede una combinazione di parecchi indicatori per definire il loro profilo normativo o proinflammatory quali CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Infine, sono stati segnalati alcuni marcatori per identificare NKTregs come CD11b+, CD27+, TGFβ+, ma ulteriori studi sono necessari per ulteriori fenotipico descriverli27,28,29 ,30,31,32. Così, evidenze di attività soppressiva sono tenute a legittimare ulteriormente Descrizione fenotipica per l'identificazione di nuovi biomarcatori, nuovi immunoregulatory mediatori e di estendere l'ambito di nuove terapie cellulari.

Vi proponiamo due metodi complementari per valutare l'attività soppressiva delle cellule. In primo luogo, il metodo in vitro costituito da coltura soppressiva delle cellule con le cellule T effettrici con etichetta stimolate dall'antigene donatore allogenico che presenta le cellule (APCs) a diversi rapporti in 6 giorni, e analizzando l'effettore proliferazione delle cellule di T che riflette il donatore-regia di soppressione immune. Le cellule dai ratti trattati possono essere paragonate direttamente alle cellule da ratti innestati non trattata per attività soppressiva (o per qualsiasi altra popolazione di cellula regolatrice) e ingenuo in una gamma di rapporti di soppressore: effettrici. Inoltre, questo metodo non richiede alcun trapianto, e si ottengono risultati entro 6 giorni. In secondo luogo, il metodo in vivo consiste nel trasferire le cellule regolatorie previste da un ratto trattato a un destinatario innestato appena irradiato. Mentre le cellule B, cellule mieloidi o T cellule da ratti non trattati ingenuo sono generalmente in grado di inibire il rigetto acuto e di prolungare la sopravvivenza dell'innesto su trasferimento adottivo, cellule con attività soppressiva ha rafforzato dal trattato-destinatari hanno questi attributi 1,2,3,4,33. Linfopenia indotta dall'irradiazione del destinatario è consigliata per consentire passivamente trasferite cellule di rimanere inalterato da omeostasi di sangue e di padroneggiare più facilmente le risposte immunitarie anti-donatore. Per entrambi i metodi, l'utilizzo in vitro di trapianto allogeneic APC o in vivo il trasferimento adottivo di soppressiva terzi celle in destinatari innestati con un cuore di terze parti consentono analisi della specificità anti-donatore. Considerando che il metodo in vivo richiede un sostanza numero di cellule, scarsamente rappresentato sottopopolazioni delle cellule possono essere valutate più facilmente per attività soppressiva in vitro33.

Le risposte umorali possono anche essere misurate per valutare lo stato di tolleranza e il controllo di risposte anticorpali diretti verso gli antigeni erogatori. Infatti, tolleranza possa essere caratterizzato da assenza di risposta umorale verso il donatore ma conservazione della capacità per i destinatari sviluppare nuovi antigeni risposta umorale e la preservazione delle risposte di memoria. In primo luogo, il principio di rilevamento alloanticorpo è basato sul riconoscimento delle cellule del donatore da destinatari anticorpi dopo incubazione del tipo di cellula del donatore con il siero da un destinatario innestato. In secondo luogo, umorale risposte dirette agli antigeni esogeni possono essere valutata dopo stimolazione dei destinatari tollerante a lungo termine con Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionato con adiuvante di Freund completo. La presenza di anticorpi IgM e IgG specifici contro gli antigeni possa essere rilevata 4 e 13 giorni, rispettivamente, a seguito di immunizzazione, con enzima Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. In terzo luogo, la conservazione delle risposte di memoria immunitaria può essere valutata tramite l'iniezione di xenogeniche globuli rossi (RBCs) ai giorni -7 e + 3 di trapianto e RBCs macchiatura con destinatario siero raccolto presso days + 8 e + 17 dopo trapianto. Tutti questi metodi consentono l'identificazione di sottotipi di immunoglobuline utilizzando specifici anticorpi secondari e rapida acquisizione di risultati in meno di 1,5 h di FACS macchiatura o un paio d'ore da ELISA.

Infine, questi protocolli sono progettati per la caratterizzazione di modelli di trapianto e possono essere, in qualche misura, applicata ai modelli di malattia autoimmune. I principi del metodo possono essere trasposta a tutte le specie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nota: Qui tutti i protocolli sono stati approvati da un comitato etico e devono essere eseguiti in modo sterile.

1. generazione di tolleranza in un modello di documento non autografo cardiaco nel ratto

  1. Lew.1W alla procedura dell'allotrapianto LEW.1A
    1. Anestetizzare un maschio donatore LEW.1W ratto usando l'inalazione isoflurane-O2 , completato con 1% N2O dopo 5 min posto l'animale in decubito dorsale e disinfettare l'addome con betadine per eseguire una toracotomia (cioè, incisione nella spazio pleurico del torace).
      1. Morsetto del inferiori e superiori vene cave, legatura loro e tagliarli. Quindi tagliare l'arteria polmonare e aorta e salvare l'innesto nel freddo 0,9% NaCl.
    2. Anestetizzare un 250 g LEW.1A destinatario del ratto maschio (di 8-12 settimane) usando l'inalazione isoflurane-O2 , completato con 1% N2O dopo 5 min posizionare l'animale in decubito dorsale e disinfettare l'addome con betadine per eseguire una laparotomia xyphopubic (cioè, grande incisione dal processo xifoideo alla sinfisi pubica).
      1. Esternalizzare l'intestino, bloccare i vasi sanguigni addominali, eseguire un'anastomosi termino-laterale (cioè, la connessione tra la fine di un canale e la parete di altro) tra l'aorta di innesto e l'aorta addominale e tra la polmonare arteria e l'addominale della vena cava e Rimuovi morsetti.
    3. Suturare il piano muscolare e la pelle e disinfettare con betadine.
    4. Iniettare nalbufina (analgesico) 6 mg/kg per via sottocutanea (s.c.) e ossitetraciclina (antibiotico) per via intramuscolare (i.m.) e mettere l'animale sotto una lampada di calore fino a quando l'animale si risveglia. Iniettare i.m. (50 µ g/kg) di buprenorfina (oppioidi) e meloxicam (antinfiammatorio non steroideo) (0,3 mg/kg) s.c. il giorno del trapianto e un giorno dopo.
  2. Induzione di tolleranza dal blocco del costimolazione interazioni
    1. Seguire i passaggi 1.1.1. a 1.1.2.
    2. In una zona classificata A2 della struttura animale, diluire 2 x 1010 particelle infettive di AdCD40Ig (un adenovirus codifica CD40Ig, una molecola chimerica che blocca le interazioni di CD40-CD40L) in soluzione di Ringer lattato raggiungere un volume finale di 150 µ l e iniettare in 3 punti (3 x 50 µ l) nella parete ventricolare dell'apice dell'innesto.
    3. Seguire i passaggi 1.1.3/1.1.4.
      Nota: AdCD40Ig trattamento può essere associato con anti-CD8α, anti-ICOS o anti-CD28 anticorpo iniezioni2,35,36.
  3. Induzione di tolleranza da sovraespressione di una proteina ricombinante
    1. Diluire 1 x 1012 genoma virale del ratto IL34-ricombinante AAV in soluzione di Ringer lattato per raggiungere un volume finale di 100 µ l. anestetizzare un ratto LEW.1A 150g con isoflurano-O2 inalazione e iniettare per via endovenosa (i.v.) nella vena del pene.
    2. Un mese dopo l'iniezione di AAV-IL34, eseguire un innesto LEW.1W sul destinatario LEW.1A secondo protocollo HTTP 1.1.

2. valutazione in Vitro delle cellule attività soppressiva di reazioni miste linfociti (MLRs)

Nota: Attività soppressiva delle cellule dai ratti trattati tollerante deve essere confrontato con la popolazione equivalente da syngeneic destinatari innestati o ratti ingenui.

  1. Isolamento di trapianto allogeneic APC: cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC)
    1. Anestetizzare un topo maschio LEW.1W ingenuo donatore mediante inalazione isoflurane-O2 , completato con 1% N2O dopo 5 min posizionare l'animale in decubito dorsale e disinfettare l'addome con betadine per eseguire una splenectomia. Rimuovere la milza di sezionare i vasi, salvare la milza in freddo 1x tampone fosfato salino (PBS) e suturare l'animale.
    2. Trasferire la milza in un piatto, rimuovere 1X PBS e irrorare con 5 mL di 0,2% collagenosi D. Per migliorare la digestione degli enzimi, tagliate la milza a pezzetti e incubare per 15 minuti a 37 ° C.
    3. Aggiungere 500 µ l di 0.1 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), trasferire i pezzi della milza in un setaccio e schiacciare la milza con pistone di una siringa per dissociare le cellule. Trasferire in una provetta e lavare le cellule con 15 mL di 1X PBS. Centrifuga 10 min a 430 x g. eliminare il supernatante.
    4. Per eliminare i globuli rossi e piastrine, risospendere il pellet di splenocyte in 10 mL di soluzione ipotonica e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (TA). Lavare con 1x PBS e centrifugare 10 min a 190 x g. gettare il surnatante.
    5. Rimuovere le fibre di collagene applicando un filtro basato su un filtro di tessuto 100 µm. Contare le celle per regolare la concentrazione di cellule a 5 x 107 cellule/mL in 1 X PBS/2% siero fetale del vitello (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Nota: Il numero degli splenocytes deve essere tra 4 x 108 e 7 x 108 cellule.
    6. Arricchire la selezione negativa prima dell'ordinamento delle cellule per le celle di interesse. Incubare per 15 minuti a 4 ° C con 2 µ g/mL purificato anticorpi specifici per le cellule di T (anti-TCRαβ, clone R7/3 e anti-TCRγδ, V65 clone), cellule di B (anti-CD45RA, OX33 clone) e cellule NK (anti CD161, 3.2.3 clonare), lavare con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e centrifugare 10 min a 430 x g . Scartare il surnatante.
    7. Lavare con biglie magnetiche 3 volte con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Utilizzare 3,5 µ l perline/106 splenocytes, lavare aggiungendo 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, luogo per 1 min sul magnete e scartare il surnatante. Ripetere due volte. Risospendere le sfere in 10 volumi di 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (ad esempio, 35 perle di µ l è diluito in 350 µ l 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Rimuovere le cellule indesiderate mescolando gli splenocytes con i branelli magnetici per 10 min a 4 ° C sotto agitazione, posizionare il tubo sul magnete per 1 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetere due volte. Contare le celle e regolare la concentrazione di cellule a 5 x 107 cellule/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: Il numero di splenocytes arricchito deve essere compreso tra 5 x 107 e 9 x 107.
    9. Macchia le celle utilizzando anticorpi contrassegnati per ulteriormente l'ordinamento del PDC: escludere le cellule di T restanti (anti-TCRαβ, clone R7/3) o cellule di B (anti-CD45RA, OX33 clone) e ordinare CD4+ (anti-CD4, clone OX35) CD45R+ (anti-CD45R, His24 clone) di cellule. Perle di etichetta con ogni Ab per stabilire una matrice di incremento retributivo il FACS. Incubare 15 min a 4 ° C e lavare con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL, filtro su un filtro di tessuto 60 µm ed etichettare le cellule morte aggiungendo DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 µ g/mL. Ordinare celle con un sorter delle cellule di 70 µm ugello, di gating su CD45RA TCRDAPICD4+CD45R+ come mostrato in Figura 1.
  2. Isolamento di cellule T effettrici risponditore (CD4 + CD25 cellule T )
    1. Raccogliere la milza da un ratto LEW.1A non trattata non innestate ingenuo e salvarlo nel freddo 1 X PBS.
    2. Trasferire la milza in un setaccio messo in un piatto e aggiungere 10 mL di 1X PBS. Schiacciare la milza con pistone di una siringa per dissociare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 50 mL, lavare con 1x PBS e centrifugare 10 min a 430 x g. gettare il surnatante.
    3. Per eliminare i globuli rossi e piastrine, risospendere il pellet di splenocyte in 10 mL di soluzione ipotonica per 5 min a RT, quindi lavare in 1 X PBS e centrifugare a 10 min x 190 g. eliminare il supernatante.
    4. Rimuovere le fibre di collagene applicando un filtro basato su un filtro di tessuto 100 µm. Contare le celle per regolare la concentrazione di cellule a 5 x 107 cellule/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: Il numero degli splenocytes dovrebbe essere tra 3 x 108 e 5 x 108 cellule.
    5. Arricchire le celle di interesse prima dell'ordinamento. Incubare per 15 minuti a 4 ° C con 2 µ g/mL purificato anticorpi specifici di cellule CD8 (anti-CD8α, OX8 clone), cellule di B (anti-CD45RA, OX33 clone), le cellule NK (anti CD161, 3.2.3 clonare), cellule mieloidi (anti-CD11b/c, OX42 clone), cellule di T delta gamma (anti-TCRγδ, V65 clone). Poi lavare con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e centrifuga 10 min a 430 x g. eliminare il supernatante.
      Nota: Per ordinare naturale CD8+ Treg da ingenuo ratti allo stesso tempo come CD4+ cellule T effettrici, non aggiungere anti-CD8α Ab durante lo svuotamento.
    6. Lavare le biglie magnetiche 3 volte con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA come descritto al punto 2.1.7.
    7. Rimuovere le cellule indesiderate mescolando splenocytes con i branelli magnetici per 10 min a 4 ° C sotto agitazione, quindi posizionare il tubo sul magnete per 1 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetere due volte. Contare le celle e regolare la concentrazione di cellule a 5 x 107 cellule/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Nota: Il numero di splenocytes deve essere compreso tra 5 x 107 e 8 x 107 cellule.
    8. Aggiungere anticorpi contrassegnati a tipo CD4+CD25 cellule T : anti-TCRαβ (R7/3 clone), anti-CD4 (OX35 clone), anti-CD25 (clone di OX39) e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Per ordinare contemporaneamente CD8+CD45RCbasso Treg, aggiungere anti-CD45RC Ab (clone di OX22). Etichetta perline con ogni Ab per impostare una matrice di incremento retributivo per l'ulteriore elaborazione in citometria a flusso. Lavare le cellule con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e scartare il surnatante.
    9. Risospendere le cellule a 5 x 107 cellule/mL, filtro su un filtro di tessuto 60 µm ed etichettare le cellule morte aggiungendo DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 µ g/mL. Ordinare le celle con un sorter delle cellule di 70 µm ugello di gating il TCR DAPI +CD4+CD25 cellule come cellule di risposta (e se necessario TCR DAPI +CD4CD45RCbasso come CD8+ Treg soppressive cellule) come mostrato nella Figura 2.
  3. Isolamento di cellule soppressive
    Nota: Dividere la milza in due aliquote: ordinare uno sulle cellule B, cellule mieloidi e le cellule NK e l'altra il CD4+ e CD8+ CD45RCbasso T cellule, per valutare la loro funzione soppressiva.
    Nota: Per il trasferimento adottivo delle cellule, salvare 1 x 108 splenocytes per servire come controllo positivo di tolleranza di trasferimento adottivo, se necessario.
    1. L'ordinamento delle cellule B, cellule mieloidi e cellule NK
      1. Seguire il protocollo 2.1.1 a 2.1.5.
      2. Incubare per 15 minuti a 4 ° C con 2 µ g/mL T cellula-specifico senza etichetta di anticorpi (anti-TCRαβ, clone R7/3 e anti-TCRγδ, V65 clone), lavare con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e centrifugare 10 min a 430 x g. gettare il surnatante.
      3. Lavare con biglie magnetiche 3 volte con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA come descritto al punto 2.1.7.
      4. Mescolare gli splenocytes con i branelli magnetici per rimuovere le cellule indesiderate e incubare per 10 min a 4 ° C sotto agitazione, poi posizionare il tubo sul magnete per 1 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetere due volte. Contare le celle e regolare la concentrazione di cellule a 5 x 107 cellule/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Aggiungere anticorpi contrassegnati splenocytes per ordinare celle con sospetta attività soppressiva come cellule mieloidi (anti-CD11b/c, OX42 clone), cellule di B (anti-CD45RA, OX33 clone) o cellule NK (anti-CD161, 3.2.3 clonare). Etichettare le perline con ogni Ab per stabilire una matrice di incremento retributivo il FACS. Incubare 15 min a 4 ° C e lavare con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL, filtro su un filtro di tessuto 60 µm ed etichettare le cellule morte aggiungendo DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 µ g/mL. Ordinare le celle con un sorter delle cellule di 70 µm ugello di gating il DAPICD11b/c+ per le cellule mieloidi, CD45RA+ per le cellule B e CD161+ per le cellule NK come mostrato nella Figura 3.
    2. L'ordinamento di CD4 + e CD8 + CD45RC basso T cellule
      1. Seguire il protocollo 2.2.1 a 2.2.4.
      2. Per selezione negativa su una colonna magnetica, incubare le cellule 15 min a 4 ° C con 2 µ g/mL purificato anticorpi specifici per le cellule B (anti-CD45RA, OX33 clone), le cellule NK (anti CD161, 3.2.3 clonare), cellule mieloidi (anti-CD11b/c, OX42 clone), gamma delta T cellule ( anti-TCRγδ, V65 clone), lavarli con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e centrifugare 10 min a 430 x g. gettare il surnatante.
      3. Lavare le biglie magnetiche 3 volte con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA come descritto al punto 2.1.7.
      4. Rimuovere le cellule indesiderate mescolando gli splenocytes con i branelli magnetici per 10 min a 4 ° C sotto agitazione, quindi posizionare il tubo sul magnete per 1 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta. Ripetere due volte. Contare le celle e regolare la concentrazione di cellule a 5 x 107 cellule/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Aggiungere con etichettati anticorpi alle cellule per ordinare Treg: anti-TCRαβ (clone R7/3), anti-CD4 (clone di OX35), anti-CD45RC (clone di OX22). Etichettare le perline con ogni Ab per stabilire una matrice di incremento retributivo il FACS. Incubare 15 min a 4 ° C e lavare con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 5 x 107 cellule/mL, filtro su un fazzoletto di carta 60 µm ed etichettare le cellule morte aggiungendo DAPI ad una concentrazione finale di 0,1 µ g/mL. Ordinare le celle con un sorter delle cellule di 70 µm ugello di gating il DAPITCR+CD4 CD45RCbasso come CD4++Treg e DAPITCR+CD4CD45RC basso come CD8+Treg ( Figura 4).
        Nota: L'Ab anti-CD8α (clone di OX8) può essere utilizzato invece l'Ab anti-CD4, se le cellule T sono discriminate da CD4+cellule non-T etichettando anti-TCR. Un eccesso di CD4+Treg devono essere ordinati in previsione della morte delle cellule dovuto l'etichettatura di tintura di proliferazione delle cellule (CPD).
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) etichettatura delle cellule di risposta per misurare la proliferazione
    1. Dopo l'ordinamento delle cellule di risponditore, lavare due volte le cellule con 1x PBS.
    2. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL in 1X PBS e incubare con 0,5 µM CFSE per 5 min a RT nel buio. Bloccare la reazione aggiungendo FCS a 1,5 X il volume e centrifugare 10 min a 430 x g a 4 ° C. Scartare il surnatante.
    3. Lavare due volte le cellule con terreno completo e contare le celle.
      Nota: Si aspettano 30% della morte di cellule in questa fase.
  5. CPD etichettatura dei CD4 + Treg per dosaggio soppressivo su CD4 + cellule effettrici
    Nota: Questo passaggio è necessario per discriminare CD4 CFSE+Treg dal risponditore proliferanti CFSE CD4+le cellule di T al giorno 6 di coculture di gating sulle cellule CPD .
    1. Dopo CD4+ Treg cella ordinamento, lavare due volte le cellule con 1x PBS.
    2. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL in 1X PBS e incubare con 10 µM di CPD V450 per 20 min a RT nel buio.
    3. Lavare due volte le cellule con terreno completo e contare le celle.
      Nota: Si aspettano 30% della morte di cellule in questa fase.
  6. Consigli per coculture
    1. Utilizzare impostazioni cultura in media composto da: medium RPMI 1640 completati con beta-mercaptoetanolo (5 x 10-5 M), penicillina (100 U/mL), streptomicina (0,1 mg/mL), piruvato di sodio (1 mM), glutammina (2 mM), tampone HEPES (1 mM), gli aminoacidi non essenziali (1x), FCS ( 10%).
    2. Cellule di cultura in U 96 pozzetti piastre di fondo.
    3. Aggiungere celle nel seguente ordine: soppressive cellule, cellule di risposta e cellule allogeniche.
    4. Mantenere costante il numero di cellule di risposta T e trapianto allogeneic APCs e testare un numero di serie di Treg. Per esempio, rapporto 4:4:1, 5 x 104 soppressiva cellule, cellule di risposta di 5 x 104 e 1,25 x 104 cellule allogeniche e rapporto di 2:4:1, 2.5 x 104 soppressiva cellule, cellule di risposta di 5 x 104 e 1,25 x 104 allogeniche cellule.
    5. Mantenere la proporzione di cellule di risposta di4 5 x 10 per 200 µ l per pozzetto medio.
    6. Per i controlli, includono alcuni pozzetti con cellule di risposta T senza trapianto allogeneic APC (controllo negativo) e cellule di risposta T con trapianto allogeneic APC senza cellule regolatorie (controllo positivo) per CFSE gating al giorno 6 (v. punto 2.7.6).
  7. FACS macchiatura e analisi dopo 6 giorni di coculture
    Nota: La proliferazione di cellule effettrici può essere valutata a intervalli di tempo diversi. Si noti che la proliferazione è esponenziale: divisione cellulare aumenta, più le differenze tra le condizioni soppressive e controllo negativo possono essere osservate.
    1. Trasferire le cellule dall'U 96 pozzetti piastre inferiori a V 96 pozzetti piastre di fondo e centrifugare 1min a 1.200 x g a 4 ° C.
    2. Salvare il surnatante in una nuova piastra a-20 ° C per misurare i livelli di citochine, se necessario.
    3. Lavare le cellule con 200 µ l 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA al pozzo e centrifuga 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    4. Aggiungere gli anticorpi alle cellule per ulteriori gate su cellule di risposta T: anti-TCRab (clone R7/3) e anti-CD4 (clone di OX35). Incubare 15 min a 4 ° C e lavare due volte con 200 µ l 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA per pozzetto. Scartare il surnatante.
    5. Aggiungere 100 µ l di DAPI diluito a 0,1 µ g/mL in 1X PBS e leggere la piastra con un analizzatore di FACS.
    6. Analizzare il profilo CFSE di gating su DAPI negativo (cellule vive) CPD negativo (non-CD4+Treg) TCR+CD4+ cellule. Le cellule non stimolate risponditore hanno massima CFSE luminosità come mostrato in Figura 5 istogramma sinistro di fondo. In presenza di trapianto allogeneic APC, le cellule di risponditore hanno proliferazione massima e minima luminosità CFSE (basso, medio). In presenza di APC allogeniche e cellule regolatorie, le cellule effettrici sono medie proliferazione e CFSE luminosità (in basso, a destra).

3. valutazione in Vivo dell'attività soppressiva cellule di trasferimento adottivo delle cellule in un cuore innestato destinatario

Nota: L'irradiazione è necessaria per eliminare cellule dell'ospite e favoriscono la proliferazione ed engraftment delle cellule dei donatori.

  1. Irradiare i destinatari dell'innesto presto il giorno prima l'innesto al presupposto del destinatario. Anestetizzare ratti con l'iniezione dei. m. di xilazina (8 mg/kg)-ketamina (80 mg/kg) e li irradiano ad una dose di 4,5 Gy con raggi X.
  2. Seguire il protocollo 2.3 per isolare le cellule di interesse.
    Nota: Salvare 1 x 108 splenocytes per servire come controllo positivo di tolleranza di trasferimento adottivo, se necessario.
  3. 12 h dopo irradiazione (il giorno prima l'innesto, la sera), anestetizzare i ratti da inalazione del 4% isoflurane-O2 e infondere le cellule (5,0 x 107 T cellule, 3.0 x 107 B cellule, 3.0 x 107 cellule mieloidi o 1,50 x 108 i.v. splenocytes come controllo positivo di tolleranza di trasferimento adottivo) nella vena del pene.
    Nota: Il numero di cellule necessarie per la tolleranza di trasferimento adottivo dipende l'attività soppressiva delle cellule.
  4. Il giorno successivo, seguire il protocollo HTTP 1.1 per eseguire il documento non autografo. Seguire innesto evoluzione tramite la palpazione attraverso l'addome.

4. donatore anticorpo specifico rilevamento

Nota: IgG risposte dirette verso il donatore dell'innesto sono misurate incubando le cellule del donatore con il siero del destinatario. Sottrarre lo sfondo indotto dalla macchiatura diretta delle cellule di B LEW.1W incubando le cellule con syngeneic del siero LEW.1W.

  1. Raccogliere il sangue dai ratti e centrifugare per 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Salvare il siero. Siero può essere conservato a-20 ° C o utilizzato immediatamente. Inattivare il complemento nei sieri incubando per 30 min a 56 ° C.
  2. Raccogliere la milza da un ratto LEW.1W donatore e salvarlo nel freddo 1 X PBS. La procedura 2.2.1. a 2.2.4. Aggiungere 2 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti V inferiore. Centrifugare 1 min a 1.200 x g a 4 ° C e scartare il surnatante.
  3. Diluire il siero in serie da 1/10 al 1/270/1X PBS (4 diluizioni/campione). Incubare le cellule per 1 h a 4 ° C con 25 µ l di siero diluito per pozzetto. Anticipare il numero delle risposte immunitarie di donatore-specific IgG sottotipi (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) per analizzare per campione (sottotipi di 1 siero x 4 diluizioni x 4 IgG). Lavare le cellule con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e scartare il surnatante.
  4. Incubare le cellule con ogni sottotipo di IgG di topo anti-ratto Ab fluorocromo-etichettati per 30 min a 4 ° C, un sottotipo/pozzetto.
    Nota: Se fluorocromo-etichetta anti-ratto Ig Ab non sono disponibile, è possibile utilizzare purificata del mouse senza etichetta anti-ratto IgG sottotipo Ab e un fluorocromo-etichetta secondario anti-mouse ab. Depending sul fluorocromi disponibili e la configurazione del citometro, diversi sottotipi di IgG anti-ratto possono essere testati in un pozzetto con le impostazioni appropriate.
  5. Lavare le cellule con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA due volte e scartare il surnatante.
  6. Aggiungere 100 µ l di DAPI diluito a 0,1 µ g/mL in PBS e leggere la piastra con un analizzatore di FACS.
  7. Leggere l'intensità media di fluorescenza (MFI) del sottotipo di IgG anti-ratto che AB etichettato con fluorocromo su tutte le celle DAPI . Sottrarre l'IFM ottenuto con ingenuo LEW.1A siero sulle cellule LEW.1W (colorazione di fondo, in basso a sinistra) da IFM ottenuti con i sieri da ogni destinatario sulle cellule LEW.1W alla diluizione corrispondente (basso al centro per i destinatari di rifiuto non trattati che visualizzare maximal MFI e inferiore destra per trattati destinatari tolleranti che visualizzano intermedio MFI) (Figura 6).

5. valutazione delle risposte umorali per antigeni esogeni (Naive e memoria)

Nota: Siero dai ratti prima di trapianto, il trattamento e l'immunizzazione deve essere utilizzato come controllo negativo di risposte umorali. In caso contrario, non immunizzati ingenuo ratti possono essere utilizzati. Siero da destinatari immunocompetenti, cioè, trapiantati exoantigen-immunizzati e rifiutando i destinatari, sono utilizzati come controlli positivi di risposte umorali.

  1. Capacità di sviluppare la risposta umorale ad un antigene nuovo (Figura 7)
    Nota: Questo metodo è una quantificazione relativa delle risposte umorali come non include uno standard. Una quantificazione assoluta di Ig sarebbe possibile con l'aggiunta di una serie di diluizioni del ratto IgG o IgM anti-KLH Ab con concentrazione nota nel passaggio 5.1.6.
    1. Emulsionare 50 µ g di KLH a 200 µ l di adiuvante di Freund completo e iniettare nella coda del lungo-sopravvivenza/tollerante destinatari, destinatari di rifiuto non trattati o ingenuo ratti di controllo come controllo positivo delle risposte umorali.
    2. Raccolta di campioni di sangue al 4 e 13 giorni dopo immunizzazione e centrifugare per 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Salvare la fase superiore che è il siero. Raccogliere il siero dai ratti non immunizzati per un controllo negativo. Siero può essere congelato a-20 ° C fino a quando il test ELISA.
    3. Cappotto di piastre ELISA (fondo piatto) con 50 µ l/pozzetto KLH diluito a 10 µ g/mL in 1X PBS durante la notte a 4 ° C. Assicurarsi che la soluzione di rivestimento copre tutti i pozzetti.
    4. Rimuovere la KLH non rivestito in eccesso mediante lavaggio. Per lavare, aggiungere 150 µ l/pozzetto di tampone di lavaggio (1x PBS contenente 0,1% Tween) e flick.
    5. Legame non specifico blocco di Ig del destinatario incubando per 1h a 37 ° C con 100 µ l/pozzetto di tampone di lavaggio contenente 10% FCS. Lavare una volta.
    6. Diluire i sieri destinatari nel tampone di lavaggio a partire da 1/40 a 1/512 in serie, aggiungere 50 µ l/pozzetto in duplicati della diluizione seriale alla piastra rivestita e incubare per 2 ore a 37 ° C. Mantenere alcuni pozzi liberi del siero per un controllo negativo. Lavare due volte.
    7. Aggiungere 50 µ l di 1 µ g/mL di coniugato con biotina anti-ratto IgM Ab in pozzetti contenenti siero raccolto al giorno 4 nei destinatari, o 50 µ l di coniugato con biotina anti-ratto IgG in pozzetti contenenti siero raccolto al giorno 13 e Incubare 1h a 37 ° C. Lavare due volte.
    8. Aggiungere 50 µ l/pozzetto di streptavidina coniugata HRP a 1 µ g/mL per 45 min a 37 ° C. Lavare 3 volte.
    9. Aggiungere 50 µ l di 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) substrato < 30 min a RT e interrompere la reazione con 25 µ l di acido solforico 2M quando positivo controlli sono saturi.
    10. Leggere l'assorbanza a 405 nm. Confrontare la densità ottica ottenuta con il siero del destinatario a quella ottenuta con il siero di controllo ratto ingenuo.
  2. Valutazione della capacità di memoria risposta umorale (Figura 8)
    1. 7 giorni prima del trapianto, iniettare i.v. 109 di RBCs xenogeniche diluito in 800 µ l di 1X PBS nei ratti ingenui. Globuli rossi possono essere da pecore, cavallo o qualsiasi altra specie.
    2. Eseguire il trapianto e amministrare il trattamento tollerogeniche.
    3. 3 giorni dopo l'innesto, iniettare nuovamente i.v.109 RBC diluito in 800 µ l di 1X PBS nel destinatari dell'innesto e ratti non innestato.
    4. Raccolto sangue campioni 5 e 14 giorni dopo la seconda immunizzazione e centrifugare per 15 min a 1.200 x g a 4 ° C per recuperare la fase superiore del siero. Siero può essere conservato a-20 ° C o utilizzato immediatamente. Inattivare il complemento nel siero di ratto incubando 30min a 56 ° C prima dell'uso.
    5. Aggiungere 2 x 105 RBC/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti V inferiore. Centrifugare 1 min a 1.200 x g a 4 ° C e scartare il surnatante con attenzione dall'aspirazione.
    6. In serie di diluire i sieri 2 volte dal 1/10 al 1/1280/1X PBS (8 diluizioni/campione). Incubare le cellule per 1 h a 4 ° C con 25 µ l di siero diluito per pozzetto. Lavare le cellule con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA e scartare il surnatante.
    7. Incubare le cellule con il RBC adsorbito specie anti-ratto IgG o IgM sottotipi etichettati con fluorocromo per 30 min a 4 ° C, un sottotipo/pozzetto. Valutare il ratto IgM e IgG anti-RBC nel siero raccolto 5 e i 14 giorni dopo l'immunizzazione, rispettivamente. Lavare le cellule con 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA due volte e scartare il surnatante.
      Nota: Se fluorocromo-etichetta anti-ratto Ig Ab non sono disponibile, è possibile utilizzare sottotipo di IgG anti-ratto purificata del mouse senza etichetta Ab e un fluorocromo-etichetta secondario anti-mouse Ab.
    8. Aggiungere 100 µ l di DAPI diluito a 0,1 µ g/mL in 1X PBS e analizzare le cellule con un analizzatore di FACS.
    9. Rappresentano l'IFM in funzione della diluizione per ogni gruppo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La valutazione dell'attività soppressiva seguendo l'ordinamento della APC (Figura 1), cellule di risposta e Treg simultaneamente (Figura 2), o singolarmente (Figura 4), e qualsiasi altre presunte cellule regolatorie (Figura 3), può essere fatto in vivo di iniezione diretta di cellule regolatorie e in vitro tramite la misura di luminosità CFSE (Figura 5). Lo stato della risposta umorale del destinatario verso il donatore (Figura 6) o antigeni esogeni (figure 7 e 8) può anche essere valutato in vitro in vivo immunizzazione come raffigurato di seguito.

Figure 1
Figura 1 . Gating strategia per ordinare PDC.
Le cellule sono state selezionate su morfologia dimensioni e granularità (SSC-A/FSC-A), doppiette sono stati esclusi dai parametri SSC-W/SSC-H e FSC-W/FSC-H, cellule vive sono state selezionate da gating il DAPI cellule, e PDC sono stati selezionati il CD45RA TCRCD4 + CD45R+ espressione. Purezza è stata valutata aggiunta DAPI a celle ordinate ed eseguendo il classificatore celle con i parametri di ordinamento. Purezza di una rara popolazione ordinata (meno del 2%) deve essere supera al 95%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Gating strategia di tipo CD4+CD25 risponditore T cellule e CD8+CD45RCbasso Treg.
Le cellule sono state selezionate sulla morfologia, cioè, dimensioni e granularità (SSC-A/FSC-A), doppiette sono stati esclusi dai parametri SSC-W/SSC-H e FSC-W/FSC-H, cellule vive sono state selezionate da gating il DAPI cellule, e cellule di risposta sono state selezionate il TCR + CD4+CD25 espressione . CD8+Treg sono stati ordinati contemporaneamente da gating il TCR+CD4 cellule dibasso CD45RC. Purezza è stata valutata aggiunta DAPI a celle ordinate ed eseguendo il classificatore celle con i parametri di ordinamento. Purezza deve essere supera al 95%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Strategia di cellule di tipo B, le cellule mieloidi e cellule NK di gating.
Le cellule sono state selezionate su morfologia dimensioni e granularità (SSC-A/FSC-A), doppietti sono stati esclusi dai parametri SSC-W/SSC-H e FSC-W/FSC-H, cellule viventi sono state selezionate da gating il DAPI cellule, e le cellule B sono state selezionate il CD45RA+ espressione, le cellule mieloidi sull'espressione di CD11b/c+ e cellule NK su CD45RA CD161 CD11b/calta espressione. Purezza è stata valutata aggiunta DAPI a celle ordinate ed eseguendo il classificatore celle con i parametri di ordinamento. Purezza deve essere supera al 95%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Gating strategia Ordina CD8+CD45RCbasso e CD4+CD45RCbasso Treg.
Le cellule sono state selezionate su morfologia dimensioni e granularità (SSC-A/FSC-A), doppiette sono stati esclusi dai parametri SSC-W/SSC-H e FSC-W/FSC-H, vissute cellule sono state selezionate da gating sulle cellule DAPI e CD4+Treg sono stati selezionati il TCR + CD4+CD45RCbassa espressione e CD8+Treg il TCR+CD4CD45RCbassa espressione. Purezza è stata valutata aggiunta DAPI a celle ordinate ed eseguendo il classificatore celle con i parametri di ordinamento. Purezza deve essere supera al 95%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Analisi rappresentativa del in vitro dosaggio soppressivo.
La proliferazione delle cellule responder è stata analizzata tramite selezione su morfologia dimensioni e granularità (SSC-A/FSC-A), l'esclusione di doppietti dai parametri FSC-W/FSC-H e SSC-W/SSC-H, esclusione di cellule morte e CD4+ Treg di gating il DAPICPDV450 cellule, selezione di TCR+CD4+ cellule e l'analisi del profilo CFSE. Il cancello CFSE si basava sulle cellule non stimolate con etichetta CFSE risponditore. CFSEalte cellule sono cellule non proliferanti e CFSEbasso sono cellule con ≥ 1 divisione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 . Analisi rappresentativa della risposta specifica alloanticorpo donatore.
Splenocytes dal ratto dei donatori sono stati incubati con una gamma di siero diluito inattivati da destinatari trattati o non trattati o da ingenuo rat e poi con IgG anti-ratto-FITC. Gli alloanticorpi vengono rilevati analizzando MFI di FITC sulle cellule di DAPI z dopo l'esclusione di doppietti SSC e FSC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 . Principio del metodo di rilevamento anti-KLH.
I destinatari sono stati immunizzati 120 giorni dopo trapianto con KLH completati con CFA, ed i campioni di sangue sono stati raccolti 4 e 13 giorni dopo immunizzazione. KLH proteine erano rivestiti su piastre di pozzi di 96-piatto fondo e incubati con campioni di siero dei topi immunizzati. Anti-ratto di biotinylated capra IgG o IgM ha permesso la rilevazione di Ab anti-KLH presenti nel siero raccolto 4 o 13 giorni dopo immunizzazione. HRP-accoppiato streptavidina trasformato il substrato TMB in un prodotto colorato blu che diventa giallo quando la reazione è stata bloccata con acido solforico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8 . Schema del metodo di rilevamento anti-RBC.
I destinatari sono stati immunizzati 7 giorni prima e 3 giorni dopo il trapianto con xenogeniche globuli rossi (RBC) e campioni di sangue sono stati raccolti da immunizzati giorni destinatari 5 e 14 dopo l'ultima immunizzazione. Globuli rossi sono stati incubati con campioni di siero dei topi immunizzati. Presenza di anticorpi anti-globuli rossi su globuli rossi è stata rilevata dalla macchiatura con capra con etichetta anti-ratto IgG o IgM anticorpi e analisi FACS Canto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trasferimento adottivo di totale splenocytes in un destinatario appena innestato è un modo efficace per rilevare la presenza di cellule regolatorie indotta o rafforzato da un trattamento. Linfopenia transitoria indotta per irradiazione di host promuove la sopravvivenza delle cellule dopo il trasferimento e l'istituzione di tolleranza. Inoltre, irradiazione subletale lascia tempo per cellule con proprietà tollerogeniche per convertire in nuove cellule regolatorie durante la ricostituzione immunitaria, un fenomeno chiamato tolleranza infettive34. Solitamente, ben descritto CD4 CD25altoFoxp3++CD127basso Treg sono studiati in primo luogo quando la tolleranza è osservata. Tuttavia, trasferimento della frazione negativa (splenocytes impoverito in CD4+Treg) permette a volte di estensione oltre il già note cellule regolatorie e l'identificazione di nuova cellula popolazioni1,2, 3,4. In tolleranza indotta dal AdCD40Ig, il trasferimento di CD4+T cellule-vuotati splenocytes ha rivelato la scoperta di CD8+CD45RCbasso Treg1. Inoltre, successivo trasferimento di CD8 totale+ T cellule e quindi limitato abasso CD45RC cellule, ha mostrate il potenziale di tale metodo per identificare progressivamente una nuova popolazione di cellule regolatorie. Inoltre, questa strategia permette l'analisi di tutte le popolazioni. Infatti, abbiamo dimostrato che molte cellule regolatorie possono coesistere e sono anche probabile, e che i meccanismi compensativi esiste2,4. In ratti trattati con CD40Ig, lo svuotamento di CD8+ cellule ha permesso l'emersione delle cellule di B e cellule mieloidi con proprietà regolarici e trasferito la tolleranza per l'allotrapianto cardiaco nel ratto secondo il protocollo descritto sopra2. In un modello di tolleranza indotta dall'iperespressione di IL34, entrambi CD4+ e CD8+Treg sono stati in grado di trasferire tolleranza4.

Specificità di donatore-regia di tolleranza indotta dal trattamento possono essere valutati a livello cellulare e umorale. Trasferimento adottivo, primo delle cellule regolatorie in destinatari di un innesto di terze parti non riuscirà a trasferimento tolleranza se le cellule sono specifiche per il primo donatore innesto33. Seconda, soppressive cellule in modo efficiente dovrebbero inibire la proliferazione delle cellule di risposta in risposta a stimolazione dall'APC dal donatore primo dell'innesto ma non da un terzo partito donatore2. Infine, le risposte umorali contro il donatore dell'innesto possono essere distinti dalla produzione di Ig totale nel destinatario utilizzando il protocollo descritto in precedenza. Inoltre, in caso di tolleranza specifica per il primo donatore di innesto, destinatario dovrebbe essere in grado di sviluppare una nuova risposta umorale contro un antigene noto ex16, un nuovo antigene o un innesto secondario di terze parti.

Trattamento di collagenasi D della milza è comodo e consigliabile per estrarre tutte le popolazioni di cellule dall'organo. Infine, quando il fenotipo delle cellule regolatorie è così stretto che le cellule sono scarsamente rappresentate (< 1% degli splenocytes), trasferimento della frazione negativa rispetto al trasferimento della popolazione totale può aiutare a distinguere l'attività soppressiva di questo piccolo popolazione. Ad esempio, CD40Ig-indotto CD8+Treg specifiche ad un peptide allogenico potrebbe essere FACS macchiato utilizzando tetrameri ma il loro numero basso non ha permesso il trasferimento adottivo positivo33,38. Tuttavia, il trasferimento adottivo del CD8 tetramero-vuotati+CD45RCbasso T cellule non hanno trasferito la tolleranza rispetto al totale Treg, evidenziando il potenziale di questa sottopopolazione. Questo risultato è stato confermato da un esperimento in vitro soppressiva. Infatti, l'esperimento soppressiva era anche un modo convincente per mostrare la capacità di Treg Du51 specifiche per sopprimere le risposte immunitarie33.

Il protocollo soppressivo descritto sopra è limitato ai destinatari effettrici CD4+risposte delle cellule T a PDC dal donatore. Questo protocollo può essere adattato da sostituzione PDC di cDCs o APCs totale, ma garantendo che i rapporti dell'effettore: stimolatore sono adatto a realizzare una proliferazione moderata gestibile dalle cellule soppressive. Infatti, un rapporto di CD4+CD25T cellule: PDC dovrebbe essere 4:1, mentre un rapporto di CD4+CD25 T cellule: cDCs dovrebbe essere 8:1 e CD4+CD25 T cellule: APC, 1:1 o 1:2. I rapporti dipendono il alloreactivity tra il donatore e il ricevente; i rapporti di cui sopra sono adatti per una combinazione di LEW.1W:LEW.1A con un rifiuto acuto che si verificano al giorno 7, ma la gamma di rapporti di risponditore: stimolatore deve essere testata prima del sacrificio degli animali. Infine, CFSE è preferito di timidina per analizzare l'attività soppressiva, per le preoccupazioni di sicurezza e affidabilità. Tuttavia, garantire la possibile distinzione tra cellule soppressive e risponditore cellule per l'analisi CFSE al giorno 6 se l'effettore CD4+CD25 T cellule vengono sostituiti dagli splenocytes totale. Allo stesso modo, garantire che le cellule di T restanti fra le cellule di stimolatore non possono proliferare segue 35 Gy irradiazione.

Design della colorazione FACS è basato sulla disponibilità di anticorpi riportati nella tabella 3. Protocolli simili possono essere adattati per i modelli di topi, assicurando la denominazione di destinazione (ad esempio cellule mieloidi sono differenzialmente descritte nel topo e nel ratto).

Il documento non autografo cardiaco heterotopic nel ratto è un modello di trapianto di organo solido con grandi opportunità per il monitoraggio del risultato di innesto. Mentre il modello di documento non autografo renale sono caratterizzati da una morte improvvisa del destinatario, palpazione della forza imbattibile del trapianto cardiaco attraverso la parete addominale informa dell'evoluzione dell'innesto39,40. Un innesto di pelle concomitante o un secondo trapianto cardiaco può essere realizzato sul destinatario l'allotrapianto cardiaco per studiare a memoria le risposte41. Inoltre, strumenti di ingegneria e biologiche o chimiche biomolecolari per lo svuotamento di tipi cellulari specifici come le cellule di B (IgM KO), cellule CD8 (anticorpi anti-CD8α) o cellule mieloidi (clodronate liposomi), sono strumenti utili per misurare l'importanza di tale cella popolazioni a induzione o il mantenimento della tolleranza a seconda del periodo post trapianto dove che impoveriscono lo strato di trattamento viene somministrato al destinatario1,2,3,4.

Ad oggi, rat Bregs, cellule mieloidi e CD8+Treg non sono ben descritti. I protocolli di induzione della tolleranza sopra sono proposti come riferimento per la caratterizzazione di cellule regolatorie ratto1,2,3,4. Ulteriore descrizione fenotipica di queste cellule e confronto ad altri modelli del allotransplantation e altre specie poteva aiutare a discriminare i marcatori di grande interesse. Infatti, confronto di Bregs da modelli murini di tolleranza e operativamente tolleranti pazienti evidenziano la predominanza di espressione di CD5 o CD24 marcatore come biomarcatori del Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . Nel nostro modello di tolleranza indotta da AdCD40Ig combinato con svuotamento CD8α, CD24 overexpressed rispetto alle cellule di B carente attività soppressiva2. Sequenziamento di RNA di alta prestazioni digitale gene espressione recentemente emerso come uno strumento innovativo per più ulteriormente caratterizzare le cellule regolatorie46.

Infine, protocolli per rilevare la presenza di cellule regolatorie indotta da un trattamento tollerogeniche possono essere adattati ad altri modelli. Qui abbiamo usato LEW.1W in LEW.1A combinazione di allotrapianto, caratterizzata da un rifiuto dell'innesto in circa 7 giorni. La combinazione di inversione, che è stato descritto come più rigorose e dove il rigetto acuto accade più veloce e più forte, può essere utilizzata. Dalla nostra esperienza nel trapianto per decifrare i meccanismi di induzione di tolleranza con trattamenti a disposizione anche modelli di malattia autoimmune.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Quest'opera è stata realizzata nell'ambito del progetto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) che è parte del programma di governo francese "Investissements d'Avenir" gestito da ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e dal progetto IHU-Cesti finanziato anche dal " Programma di governo francese di investissements d'Avenir", gestito da Francese Nazionale Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Il progetto di IHU-Cesti è anche supportato da Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117, (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195, (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10, (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125, (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185, (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13, (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2, (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4, (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203, (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155, (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14, (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15, (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350, (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16, (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2, (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41, (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3, (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174, (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12, (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5, (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78, (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99, (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12, (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20, (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53, (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7, (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207, (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22, (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124, (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168, (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80, (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179, (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259, (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31, (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19, (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22, (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29, (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195, (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117, (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120, (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120, (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101, (2), 219-221 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics