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In Vitro et In Vivo l’évaluation d’activité Suppressive T, B et les cellules myéloïdes et des réponses humorales de receveurs de transplantation

Immunology and Infection

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Summary

Nous présentons ici un protocole visant à induire une tolérance à la transplantation et évaluer in vitro et in vivo la capacité suppressive des sous-ensembles distincts de cellules par le bénéficiaire et l’état immunitaire du receveur envers le donneur ou d’antigènes exogènes.

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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Abstract

La principale préoccupation dans la transplantation consiste à atteindre une tolérance spécifique par induction des cellules régulatrices. La compréhension des mécanismes de tolérance nécessite des modèles fiables. Nous décrivons ici des modèles de tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat, induite par le blocage des signaux de costimulation ou par stimulation de l’expression des molécules immunorégulatrices par transfert de gène. Chacun de ces modèles a permis d’en vivo génération de cellules régulatrices telles que les lymphocytes T régulateurs (Tregs), cellules régulatrices de B (Bregs) ou des cellules myéloïdes réglementaires (RegMCs). Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent deux protocoles complémentaires qui ont été utilisés pour identifier et définir l’activité de régulation cellulaire in vitro et in vivo pour déterminer leur responsabilité dans l’induction de la tolérance et le maintien. Tout d’abord, un essai in vitro suppressive avec ont permis l’identification rapide des cellules avec capacité suppressive de réponses immunes effectrices dans une façon dose-dépendante et peut être utilisé pour une analyse ultérieure comme mesure de cytokine ou la cytotoxicité. En second lieu, le transfert adoptif de cellules d’un bénéficiaire traité tolérant à un destinataire greffé récemment irradié, a mis en évidence les propriétés tolérogène de ces cellules dans le contrôle des réponses immunitaires greffon réalisé et/ou conversion de (nouveaux) cellules régulatrices qualifié de tolérance infectieuse). Ces méthodes ne se limitent pas aux cellules avec des marqueurs phénotypiques connus et peuvent être étendues à toute la population cellulaire. De plus, donateur a ordonné allospecificity des cellules régulatrices (un objectif important dans le domaine) peut être évaluée à l’aide de cellules du donneur tiers ou greffer soit in vitro ou in vivo. Enfin, pour déterminer la capacité tolérogène spécifique de ces cellules régulatrices, nous fournissons des protocoles visant à évaluer les réponses humorales anticorps anti-donateurs et la capacité du bénéficiaire à élaborer des réponses humorales contre des antigènes connus neufs ou anciens. Les modèles de tolérance décrite peuvent être utilisés pour caractériser les cellules régulatrices, afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs et immunorégulatrices molécules et peuvent être adaptés à d’autres modèles de transplantation ou de maladies auto-immunes chez rongeur ou humaine.

Introduction

Allogreffe cardiaque chez le rat est un modèle de greffe organe fiable pour évaluer les traitements d’induction de la tolérance, pour décrypter les mécanismes d’induction de la tolérance et de la maintenance et est susceptible d’induire des cellules régulatrices fonctionnellement compétents et dominantes. Les protocoles ci-dessous décrivent une entièrement incompatibilité transplantation cardiaque greffe d’un rat de donneur de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en rat destinataire 1 a Lewis (LEW.1A, RT1un). Dans cette combinaison de greffe, le rejet aigu se produit rapidement (dans environ 7 jours) et peut être facilement évaluée par greffon battant mesure par palpation de l’abdomen. Ici, nous vous proposons trois protocoles pour induire une tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat. Dans ces modèles, tolérance est induite et/ou maintenue par types de différentes cellules réglementaires. Tout d’abord, le blocage des interactions CD40-CD40L avec un adénovirus encodage CD40Ig (AdCD40Ig) induit par la génération de CD8+ Tregs capables d’induire la tolérance lorsque Moutschen transféré à destinataires greffées1. En outre, l’appauvrissement des CD8+ cellules (avec des anticorps anti-CD8α) destinataires traités AdCD40Ig générés Bregs et RegMCs2. Une analyse approfondie des CD8+ Tregs propriétés a mis en évidence le rôle essentiel de plusieurs molécules immunorégulatrices défini comme interleukin-34 (IL-34) et Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Tandis que la surexpression de IL-34 (avec un vecteur d’AAV) induite Tregs grâce à la génération de RegMCs, la surexpression de la FGL-2 induit Bregs, qui sous-tend le réseau complexe de cellules régulatrices.

Parce que le rejet chronique se développe lentement et est à long terme, une analyse approfondie est nécessaire pour distinguer la tolérance par rapport à un rejet chronique. Greffon est habituellement évaluée pour l’infiltration cellulaire, fibrose, épaississement des dépôts C4d vasculaire à mur et complément par immunohistologie7. Alors que l’histologie méthodes exigent des sacrifices d’animaux ou de greffe biopsie, nous décrivons ici une méthode simple pour évaluer les différentes caractéristiques des greffes allogéniques tolérés : l’émergence et la fonction des cellules régulatrices et les réponses d’anticorps spécifiques anti-donneur de sang échantillon par cytométrie en flux (ici, nous avons utilisé cellule activée par fluorescence (FACS) de tri).

Maintien de la tolérance à l’allogreffe après arrêt du traitement est généralement associée à l’induction de cellules régulatrices8. Au cours des dernières décennies, les études concentrent CD4+Tregs caractérisée à l’unanimité eux par les marqueurs clés Foxp3+, CD25hauteet CD1279,10,11. De même, plusieurs marqueurs ont été attribuées aux CD8+ Tregs, comme CD122+et CD28-, CD45RCfaible, PD1+et Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. pendant les années, l’expression de GITR CTLA4 et cytokines (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, GFL-2) ont été en outre associée à un Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Cependant, les populations de lymphocytes régulateurs émergents, tels que Bregs, RegMCs ou NKTregs, n’ont pas des marqueurs spécifiques pertinentes. En effet, les Bregs sont surtout signalés comme immatures CD24+ cellules, avec expression CD27 ambiguë et, parfois, la production d’IL-10, TGFβ ou granzyme B22,23,24. La complexité de la lignée cellulaire myéloïde exige une combinaison de plusieurs marqueurs de définir leur profil réglementaire ou proinflammatoires comme CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Enfin, certains marqueurs ont été signalés à identifier NKTregs comme CD11b+, CD27+, TGFβ+, mais autres études sont nécessaires pour plus loin phénotypiquement Décrivez-les27,28,29 ,30,31,32. Ainsi, les preuves d’activité suppressive sont tenus de légitimer davantage description phénotypique pour l’identification de nouveaux biomarqueurs, nouveau immunorégulatrices médiateurs et d’étendre la portée aux nouvelles thérapies cellulaires.

Nous vous proposons deux méthodes complémentaires afin d’évaluer l’activité suppressive des cellules. Tout d’abord, la méthode in vitro consistant en cultivant des cellules suppressives avec des cellules effectrices marqués T stimulés par les donneurs allogéniques cellules présentatrices (TTB) à différentes proportions pendant 6 jours, et analyser l’effecteur T la prolifération de cellules qui reflète l’immunodépression axée sur les donateurs. Cellules provenant de rats traités peuvent être comparés directement aux cellules de rats naïfs et non greffées chez les rats traités pour activité suppressive (ou à toute autre population de lymphocytes régulateurs), dans une gamme de rapports de suppresseur : effecteur. En outre, cette méthode ne requiert pas une transplantation, et on obtient des résultats dans les 6 jours. Deuxièmement, la méthode in vivo consiste à transférer les cellules réglementaires prévues d’un rat traité à un destinataire greffé récemment irradié. Bien que les cellules B des cellules, cellules myéloïdes ou T de rats naïfs non traités sont généralement incapables d’inhiber le rejet aigu et pour prolonger la survie du greffon à transfert adoptif, cellules avec activité suppressive potentialisée des traités-bénéficiaires ont ces attributs 1,2,3,4,33. Lymphopénie induite par l’irradiation du destinataire est recommandée de laisser des cellules Moutschen transférés sont pas affectés par l’homéostasie du sang et de maîtriser plus facilement la réponse immunitaire anti-donateur. Pour les deux méthodes, l’utilisation in vitro d’allogéniques tiers TTB ou en vivo transfert adoptif de suppressive cellules destinataires greffés avec un coeur de tiers permettent l’analyse de la spécificité anti-donateur. Considérant que la méthode en vivo nécessite un nombre important de cellules, mal représenté sous-populations de cellules peuvent être évaluées plus facilement pour l’activité suppressive en vitro33.

Humorale peut également être mesurée afin d’évaluer l’état de la tolérance et le contrôle de la production d’anticorps dirigés aux antigènes du donneur. En effet, la tolérance peut être caractérisée par l’absence de réponse humorale envers le donateur mais la conservation de la capacité pour les destinataires à développer une réponse humorale aux antigènes nouveaux et la préservation des réponses de la mémoire. Tout d’abord, le principe de la détection des alloanticorps repose sur la reconnaissance des cellules donneur par destinataires anticorps après incubation du type de cellules du donneur avec le sérum d’un bénéficiaire greffé. Deuxièmement, humorales réponses adressées à des antigènes exogènes peuvent être mises en recouvrement après la stimulation des receveurs tolérants à long terme avec Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) émulsionné avec adjuvant complet de Freund. La présence d’anticorps IgM et IgG spécifiques contre les antigènes peut être détectée 4 à 13 jours, respectivement, après vaccination, par l’Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. En troisième lieu, la préservation des réponses de la mémoire immunitaire peut être évaluée par l’injection de xénogéniques des globules rouges (hématies) -7 et + 3 jours de transplantation et de globules rouges de coloration avec le destinataire sérum prélevé à jours + 8 et + 17 suite à une transplantation. Toutes ces méthodes permettent l’identification des sous-types de l’immunoglobuline en utilisant des anticorps secondaires spécifiques et l’acquisition rapide des résultats en moins de 1,5 h par coloration de FACS ou quelques heures par ELISA.

Enfin, ces protocoles sont conçues pour la caractérisation des modèles de transplantation et peuvent être, dans une certaine mesure, appliquée aux modèles de maladie auto-immune. Les principes de la méthode est transposable à toutes les espèces.

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Protocol

Remarque : Tous les protocoles ici ont été approuvés par un Comité d’éthique et doivent être effectuées de façon stérile.

1. génération de tolérance dans un modèle d’allogreffe cardiaque chez le Rat

  1. Lew.1W procédure d’allogreffe LEW.1A
    1. Anesthésier un mâle donneur LEW.1W rat à l’aide d’inhalation isoflurane-O2 , additionnée de 1 % N2O après 5 min. Place l’animal en décubitus dorsal et désinfecter l’abdomen avec betadine pour effectuer une thoracotomie (c.-à-d., incision dans le espace pleural de la poitrine).
      1. Serrer la cave veine inférieure et supérieure, leur ligature et coupez-les. Couper l’artère pulmonaire et l’aorte, puis enregistrez le greffon au froid 0,9 % NaCl.
    2. Anesthésier un 250 g LEW.1A destinataire rat mâle (de 8 à 12 semaines) à l’aide d’inhalation isoflurane-O2 , additionnée de 1 % N2O après 5 min. Placez l’animal en décubitus dorsal et désinfecter l’abdomen avec betadine pour effectuer une laparotomie xyphopubic (c.-à-d., grande incision du processus xiphoïde à symphyse pubienne).
      1. Externaliser les intestins, de bloquer les vaisseaux sanguins abdominaux, d’effectuer une anastomose termino-latérale (c.-à-d., la connexion entre la fin d’un canal et le mur de l’autre) entre l’aorte de greffe et de l’aorte abdominale et la pulmonaire l’artère et la veine abdominale et supprimer colliers.
    3. Le plan musculaire et la peau de suture et une désinfection avec Bétadine.
    4. Injecter la nalbuphine (analgésique) 6 mg/kg par voie sous-cutanée (s.c.) et l’oxytétracycline (antibiotique) par voie intramusculaire (i.m.) et placer l’animal sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que l’animal se réveille. Injecter la buprénorphine (opioïde) (50 µg/kg) i.m. et meloxicam (anti-inflammatoire non stéroïdien) (0,3 mg/kg) s.c. le jour de la transplantation et un jour après.
  2. Induction de la tolérance par le blocage des interactions costimulation
    1. Suivez les étapes 1.1.1. à 1.1.2.
    2. Dans un quartier classé de A2 de l’animalerie, diluer 2 x 1010 particules infectieuses de AdCD40Ig (un adénovirus encodage CD40Ig, une molécule chimérique qui bloque l’interaction de CD40-CD40L) dans une solution de Ringer lactate pour atteindre un volume final de 150 µL et injecter en 3 points (3 x 50 µL) dans la paroi ventriculaire de l’apex de la prothèse.
    3. Suivez les étapes 1.1.3 à 1.1.4.
      Remarque : AdCD40Ig traitement peut être associé avec l’anti-CD8α anti-ICOS et anticorps d’anti-CD28 injections2,35,36.
  3. Induction de la tolérance par la surexpression d’une protéine recombinante
    1. Diluer 1 x 1012 génome viral du rat AAV recombinant IL34 dans une solution de Ringer lactate pour atteindre un volume final de 100 µL. anesthésier un rat LEW.1A de 150 g avec inhalation isoflurane-O2 et injecter par voie intraveineuse (i.v.) dans la veine du pénis.
    2. Un mois après l’injection de l’AAV-IL34, effectuer une greffe LEW.1W au bénéficiaire de LEW.1A selon le protocole 1.1.

2. in Vitro l’évaluation de l’activité Suppressive de cellules par des réactions de Lymphocytes mixtes (MLRs)

Remarque : L’activité Suppressive de cellules provenant de rats tolérants traités devrait être comparée avec la population équivalente de destinataires greffées syngéniques ou rats naïfs.

  1. Isolement de TTB allogéniques : les cellules dendritiques plasmacytoides (PDC)
    1. Anesthésier un rat mâle de donateurs naïf LEW.1W utiliser l’inhalation isoflurane-O2 , additionnée de 1 % N2O après 5 min. Placez l’animal en décubitus dorsal et désinfecter l’abdomen avec betadine pour effectuer une splénectomie. Enlever la rate en sectionnant les vaisseaux, épargner la rate en froid 1 X solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et suture de l’animal.
    2. Transférer la rate dans un plat, retirez 1 X PBS et perfuse avec 5 mL de la collagénase de 0,2 % D. Pour améliorer la digestion enzymatique, couper la rate en petits morceaux et laisser incuber 15 min à 37 ° C.
    3. Ajouter 500 µL de 0,1 M d’acide tétraacétique (EDTA), transférer les morceaux de la rate dans une passoire et écraser la rate avec piston d’une seringue dissocier les cellules. Transvaser dans un tube et laver les cellules avec 15 mL de solution 1 PBS X. Centrifuger 10 min à 430 x g. éliminer le surnageant.
    4. Pour éliminer les globules rouges et plaquettes, resuspendre le culot de splénocytes dans 10 mL d’une solution hypotonique et incuber 5 min à température ambiante (RT). Laver avec une solution de 1 PBS X et centrifuger 10 min à 190 x g. jeter le surnageant.
    5. Retirer les fibres de collagène en filtrant sur un filtre de tissu 100 µm. Compter les cellules pour ajuster la concentration cellulaire de 5 x 107 cellules/mL dans le sérum de veau foetal 1 X PBS/2% (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Remarque : Le nombre des splénocytes doit être entre 4 x 10,8 et 7 x 108 cellules.
    6. Enrichir pour les cellules d’intérêt par sélection négative avant le tri cellulaire. Incuber 15 min à 4 ° C avec 2 µg/mL purifié des anticorps spécifiques à cellules T (anti-TCRαβ, R7/3 clone et anti-TCRγδ, V65 clone), cellules de B (anti-CD45RA, OX33 clone) et les cellules NK (anti CD161, 3.2.3 clone), laver avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et centrifuger 10 min à 430 x g . Jeter le surnageant.
    7. Laver avec des billes magnétiques 3 fois avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Utilisez 3,5 splénocytes de6 perles/10 µL, laver en ajoutant 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, lieu pendant 1 min sur l’aimant et éliminer le surnageant. Répéter deux fois. Remettre en suspension les perles en 10 volumes de 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (par exemple, 35 perles µL est dilué dans 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Supprimer les cellules non désirées en mélangeant les splénocytes à billes magnétiques pendant 10 min à 4 ° C sous agitation, placer le tube sur l’aimant pendant 1 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter deux fois. Compter les cellules et ajuster la concentration en cellules à 5 x 107 cellules/mL dans 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Remarque : Le nombre de splénocytes enrichi devrait se situer entre 5 x 10,7 et 9 x 107.
    9. Colorer les cellules en utilisant des anticorps marqués pour trier plus de PDC : exclure les cellules T restantes (anti-TCRαβ, R7/3 clone) ou des cellules de B (anti-CD45RA, OX33 clone) et trier les CD4+ (anti-CD4, clone OX35) CD45R+ cellules (anti-CD45R, His24 clone). Perles de l’étiquette avec chaque Ab d’établir une matrice de compensation sur les FACS. Incuber 15 min à 4 ° C et laver avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 x 107 cellules/mL, filtre sur un filtre de tissu 60 µm et étiqueter les cellules mortes en ajoutant DAPI à une concentration finale de 0,1 µg/mL. Trier les cellules avec un trieur de cellules de gicleur de 70 µm, par blocage sur CD45RA TCRDAPICD4+CD45R+ , comme illustré à la Figure 1.
  2. Isolement de cellules effectrices T répondeur (CD4 + CD25 lymphocytes T )
    1. Récolter la rate d’un rat LEW.1A non traité non greffées naïf et enregistrez-le dans froid 1 X PBS.
    2. Transvaser la rate dans une passoire placée dans un plat et ajouter 10 mL de solution 1 PBS X. Écraser la rate avec piston d’une seringue dissocier les cellules. Transférer les cellules dans un tube de 50 mL, laver avec 1 X PBS et centrifuger 10 min à 430 x g. jeter le surnageant.
    3. Pour éliminer les globules rouges et plaquettes, resuspendre le culot de splénocytes dans 10 mL de solution hypotonique pendant 5 min à la droite, puis laver à 1 X PBS et centrifuger à 10 min x 190 g. éliminer le surnageant.
    4. Enlever les fibres de collagène en filtrant sur un filtre de tissu 100 µm. Compter les cellules pour ajuster la concentration en cellules à 5 x 107 cellules/mL dans 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Remarque : Le nombre des splénocytes doit être entre 3 x 10,8 et 5 x 108 cellules.
    5. Enrichir les cellules d’intérêt avant le tri. Incuber 15 min à 4 ° C avec 2 µg/mL purifié des anticorps spécifiques aux cellules CD8 (anti-CD8α, OX8 clone), cellules de B (anti-CD45RA, OX33 clone), les cellules NK (anti CD161, 3.2.3 clone), des cellules myéloïdes (CD11b/anti-c, OX42 clone), cellules de delta T gamma (anti-TCRγδ, V65 clone). Laver ensuite avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et centrifuger 10 min à 430 x g. éliminer le surnageant.
      Remarque : Pour trier des CD8 naturel+ Tregs de naïve rats en même temps que CD4+ cellules effectrices T, n’ajoutez pas d’anti-CD8α Ab au cours de l’appauvrissement de la couche.
    6. Laver les billes magnétiques 3 fois avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA comme indiqué au point 2.1.7.
    7. Supprimer les cellules indésirables en splénocytes de mélange avec les billes magnétiques pendant 10 min à 4 ° C sous agitation, puis placer le tube sur l’aimant pendant 1 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter deux fois. Compter les cellules et ajuster la concentration en cellules à 5 x 107 cellules/mL dans 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Remarque : Le nombre de splénocytes devrait se situer entre 5 x 10,7 et 8 x 107 cellules.
    8. Ajouter des anticorps étiquetés au tri CD4+CD25 lymphocytes T : anti-TCRαβ (clone de R7/3), anti-CD4 (clone OX35), anti-CD25 (clone OX39) et incuber pendant 15 min à 4 ° C. Pour trier simultanément CD8 +CD45RCfaible Tregs, ajouter anti-CD45RC Ab (clone OX22). Étiqueter les perles avec chaque Ab à mettre en place une matrice de compensation pour un traitement ultérieur sur la cytométrie en flux. Laver les cellules avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et éliminer le surnageant.
    9. Remettre en suspension les cellules à 5 x 107 cellules/mL, filtre sur un filtre de tissu 60 µm et étiqueter les cellules mortes en ajoutant DAPI à une concentration finale de 0,1 µg/mL. Trier les cellules avec un trieur de cellules de gicleur de 70 µm par blocage sur RCT DAPI +CD4+CD25 cellules comme les cellules de répondeur (et le cas échéant TCR DAPI +CD4CD45RCfaible que CD8+ Les cellules suppressives Tregs) comme illustré à la Figure 2.
  3. Isolement des cellules suppressives
    Remarque : Diviser la rate en deux parties aliquotes : trier un sur les cellules B, cellules myéloïdes et les cellules NK et l’autre sur les CD4+ et CD8+ CD45RCfaible T cells, pour évaluer leur fonction suppressive.
    Remarque : Pour le transfert de cellule adoptifs, enregistrer 1 x 108 splénocytes pour servir le contrôle positif de tolérance par transfert adoptif, si nécessaire.
    1. Tri des cellules B et les cellules NK cellules myéloïdes
      1. Suivre le protocole 2.1.1 à 2.1.5.
      2. Incuber 15 min à 4 ° C, 2 µg/ml de cellules T spécifiques non anticorps (anti-TCRαβ, R7/3 clone et anti-TCRγδ, V65 clone), laver avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et centrifuger 10 min à 430 x g. jeter le surnageant.
      3. Laver avec des billes magnétiques 3 fois avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA comme indiqué au point 2.1.7.
      4. Mélanger les splénocytes avec les billes magnétiques pour déloger les cellules indésirables et incuber pendant 10 min à 4 ° C sous agitation, puis placer le tube sur l’aimant pendant 1 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter deux fois. Compter les cellules et ajuster la concentration en cellules à 5 x 107 cellules/mL dans 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Ajouter des anticorps étiquetés pour les splénocytes de trier les cellules avec activité suppressive suspecte tels que les cellules myéloïdes (CD11b/anti-c, OX42 clone), cellules de B (anti-CD45RA, OX33 clone) ou cellules NK (anti-CD161, 3.2.3 clone). Étiqueter les perles avec chaque Ab d’établir une matrice de compensation sur les FACS. Incuber 15 min à 4 ° C et laver avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 x 107 cellules/mL, filtre sur un filtre de tissu 60 µm et étiqueter les cellules mortes en ajoutant DAPI à une concentration finale de 0,1 µg/mL. Trier les cellules avec un trieur de cellules de gicleur de 70 µm par blocage sur DAPICD11b/c+ pour cellules myéloïdes, CD45RA+ pour les cellules de B et CD161+ pour les cellules NK tel qu’illustré à la Figure 3.
    2. Tri des CD4 + et CD8 + CD45RC cellules basse T
      1. Suivre le protocole 2.2.1 à 2.2.4.
      2. Pour une sélection négative sur une colonne magnétique, incuber les cellules 15 min à 4 ° C avec 2 µg/mL purifié des anticorps spécifiques à cellules B (anti-CD45RA, OX33 clone), les cellules NK (anti CD161, 3.2.3 clone), des cellules myéloïdes (CD11b/anti-c, OX42 clone), gamma delta T () cellules anti-TCRγδ, V65 clone), lavez-les avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et centrifuger 10 min à 430 x g. jeter le surnageant.
      3. Laver les billes magnétiques 3 fois avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA comme indiqué au point 2.1.7.
      4. Supprimez les cellules indésirables en mélangeant les splénocytes à billes magnétiques pendant 10 min à 4 ° C sous agitation, puis placer le tube sur l’aimant pendant 1 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Répéter deux fois. Compter les cellules et ajuster la concentration en cellules à 5 x 107 cellules/mL dans 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Ajouter des anticorps étiquetés aux cellules à trier Tregs : anti-TCRαβ (clone de R7/3), anti-CD4 (clone OX35), anti-CD45RC (clone OX22). Étiqueter les perles avec chaque Ab d’établir une matrice de compensation sur les FACS. Incuber 15 min à 4 ° C et laver avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 x 107 cellules/mL, filtre sur un mouchoir en papier 60 µm et étiqueter les cellules mortes en ajoutant DAPI à une concentration finale de 0,1 µg/mL. Trier les cellules avec un trieur de cellules de gicleur de 70 µm par blocage sur DAPITCR+CD4 CD45RCfaible que CD4++Tregs et DAPITCR+CD4CD45RC faible que CD8+Tregs ( Figure 4).
        Remarque : L’anti-CD8α Ab (clone OX8) peut être utilisé au lieu de l’anti-CD4 Ab si les cellules T sont discriminés de CD4+non-T cellules par marquage anti-TCR. Un excès de CD4+Tregs doivent être triés en prévision de la mort cellulaire en raison de l’étiquetage de colorant de prolifération cellulaire (DPC).
  4. Carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) marquage des cellules de répondeur pour mesurer la prolifération
    1. Après la cellule de répondeur tri, laver deux fois par les cellules avec 1 X PBS.
    2. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 x 107 cellules/mL dans du PBS de X 1 et incuber à 0,5 µM CFSE pendant 5 min à la RT dans l’obscurité. Arrêter la réaction en ajoutant FCS à 1,5 fois le volume et centrifuger 10 min à x 430 g à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    3. Laver deux fois par les cellules avec milieu complet et compter les cellules non vides.
      Remarque : Attendez 30 % de la mort de cellules à cette étape.
  5. CPD étiquetage des CD4 + Tregs pour dosage suppressif sur CD4 + cellules effectrices
    Remarque : Cette étape est nécessaire pour discriminer les CD4 CFSE+Tregs de répondeur proliférant CFSE CD4+des lymphocytes T au jour 6 de co-culture de blocage sur les cellules CPD .
    1. Après CD4+ Tregs cell tri, laver deux fois par les cellules avec 1 X PBS.
    2. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 x 107 cellules/mL dans du PBS de X 1 et incuber 10 µm de CPD V450 pendant 20 min à ta dans l’obscurité.
    3. Laver deux fois par les cellules avec milieu complet et compter les cellules non vides.
      Remarque : Attendez 30 % de la mort de cellules à cette étape.
  6. Conseils pour la co-culture
    1. Utiliser la culture en support comprenant : milieu RPMI 1640 additionné de FCS (bêta-mercaptoéthanol (5 x 10-5 M), la pénicilline (100 U/mL), streptomycine (0,1 mg/mL), le pyruvate de sodium (1 mM), glutamine (2 mM), un tampon HEPES (1 mM), des acides aminés non essentiels (1 X), 10 %).
    2. Plaques en bas des cellules de culture en U de 96 puits.
    3. Ajouter des cellules dans l’ordre suivant : cellules suppressives, répondeur cellules et cellules allogéniques.
    4. Maintenir constant le nombre de cellules de T de répondeur et TTB allogéniques et tester plusieurs gamme de Tregs. Par exemple, le ratio 4:4:1, 5 x 104 cellules suppressives, 5 x 104 cellules de répondeur et 1,25 x 104 cellules allogéniques et ratio 2:4:1, 2, 5 x 104 cellules suppressives, 5 x 104 cellules de répondeur et 1,25 x 104 allogéniques cellules.
    5. Maintenir la proportion de 5 x 104 cellules de répondeur pour 200 µL de milieu/puits.
    6. Pour les contrôles, inclure quelques puits avec répondeur T cellules sans TTB allogéniques (témoin négatif) et répondeur T avec l’APC allogéniques sans cellules régulatrices (contrôle positif) pour CFSE gating au jour 6 (Voir l’étape 2.7.6).
  7. Coloration des FACS et analyse après 6 jours de co-culture
    Remarque : La prolifération des cellules effectrices peut être évaluée à plusieurs points dans le temps. Notez que la prolifération est exponentielle : avec l’augmentation de la division cellulaire, plus de différences entre les conditions suppressives et contrôle négatif peuvent être observées.
    1. Les cellules de transfert de l’U de 96 puits, plaques de fond à 96 puits V plaques de fond et centrifuger 1 min à 1 200 g à 4 ° C.
    2. Enregistrer le surnageant dans une nouvelle plaque à-20 ° C pour mesurer les niveaux de cytokine, si nécessaire.
    3. Laver les cellules avec 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA par puits et centrifuger 1 min à 1 200 g à 4 ° C.
    4. Ajouter des anticorps aux cellules à porte davantage sur les cellules de répondeur T : anti-TCRab (R7/3 clone) et anti-CD4 (clone OX35). Incuber 15 min à 4 ° C et laver deux fois avec 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA / puits. Jeter le surnageant.
    5. Ajouter 100 µL de DAPI dilué à 0,1 µg/mL dans du PBS de X 1 et lire la plaque avec un analyseur de FACS.
    6. Analyser le profil CFSE par blocage sur DAPI négatif (cellules vivantes) DPC négatif (non-CD4+Tregs) TCR+CD4+ cellules. Les cellules non stimulées répondeur ont maximale CFSE luminosité comme indiqué dans l’histogramme gauche de la Figure 5 bas. En présence de l’APCs allogéniques, les cellules de répondeur ont prolifération maximale et minimale CFSE luminosité (bas, milieu). En présence de TTB allogéniques et cellules régulatrices, les cellules effectrices ont prolifération moyenne et luminosité CFSE (bas, à droite).

3. in Vivo l’évaluation de l’activité Suppressive de cellules par transfert de cellules adoptifs dans un coeur greffé destinataire

Remarque : L’Irradiation est nécessaire pour éliminer les cellules de l’hôte et favorisent la prolifération et la greffe de cellules de donneur.

  1. Irradier les bénéficiaires de la greffe au début sur la veille de la greffe pour le receveur. Anesthésier les rats avec injection de i.m. de xylazine (8 mg/kg)-kétamine (80 mg/kg) et les irradier à une dose de 4,5 Gy avec des rayons X.
  2. Suivre le protocole 2.3 pour isoler des cellules d’intérêt.
    Remarque : Conservez 1 x 108 splénocytes pour servir de témoin positif de tolérance par transfert adoptif, si nécessaire.
  3. 12 h après l’irradiation (le jour avant la greffe, le soir), anesthésier les rats par inhalation de 4 % isoflurane-O2 et laisser infuser les cellules (5.0 x 10 cellules7 T, 3,0 x 10 cellules7 B, 3.0 x 107 cellules myéloïdes ou 1,50 x 108 i.v. de splénocytes comme contrôle positif de tolérance par transfert adoptif) dans la veine du pénis.
    Remarque : Le nombre de cellules nécessaires à la tolérance par transfert adoptif dépend de l’activité suppressive des cellules.
  4. Le lendemain, suivre le protocole 1.1 pour effectuer l’allogreffe. Évolutions de greffe par palpation à travers l’abdomen.

4. détection d’anticorps spécifiques de donateurs

NOTE : IgG réponses dirigées vers le donneur de greffe sont mesurés en incubant les cellules du donneur avec le sérum du receveur. Soustraire l’arrière-plan induite par la coloration directe des cellules de B LEW.1W en incubant les cellules avec du sérum LEW.1W syngénique.

  1. Récolter le sang des rats et centrifuger 15 min à 1 200 g à 4 ° C. Sauver le sérum. Sérum peut être conservé à-20 ° C ou utilisée immédiatement. Désactiver le complément dans les sérums en incubant pendant 30 minutes à 56 ° C.
  2. Récolter la rate d’un rat LEW.1W donneur et enregistrez-le dans froid 1 X PBS. Suivez les étapes 2.2.1. à 2.2.4. Ajouter 2 x 105 cellules/puits dans une plaque de fond de V de 96 puits. Centrifuger 1 min à 1 200 g à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  3. Diluer le sérum en série du 1/10 de 1/270 en 1 X PBS (4 dilutions par échantillon). Incuber les cellules pendant 1 h à 4 ° C et 25 µL de sérum dilué/puits. Anticiper le nombre de donateurs spécifiques IgG sous-types (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) des réponses immunitaires à analyser par échantillon (sous-types de IgG 1 sérum x 4 x 4 les dilutions). Laver les cellules avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et éliminer le surnageant.
  4. Incuber les cellules avec chaque sous-type d’IgG anti-rat souris Ab marqués au fluorochrome pendant 30 min à 4 ° C, un sous-type/puits.
    Remarque : Si marqués au fluorochrome anti-rat Ig Ab n’est pas disponible, il est possible d’utiliser des souris sans étiquette purifié anti-rat IgG sous-type Ab et un fluorochrome étiquetés secondaire anti-souris selon AB. sur les fluorochromes disponibles et la configuration de cytomètre, plusieurs sous-types d’IgG anti-rats peuvent être testées dans un puits avec les paramètres appropriés.
  5. Laver les cellules avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et éliminer le surnageant.
  6. Ajouter 100 µL de DAPI dilué à 0,1 µg/mL dans du PBS et lire la plaque avec un analyseur de FACS.
  7. Lire l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) du sous-type d’IgG anti-rat Qu'ab étiqueté fluorochrome sur toutes les cellules DAPI . Soustraire l’IFM obtenue avec du sérum LEW.1A naïf sur les cellules LEW.1W (coloration de fond, en bas à gauche) provenant de l’ITSM obtenu avec les sérums de chaque destinataire sur les cellules LEW.1W à la dilution correspondante (bas middle pour bénéficiaires de rejetants non traités qui afficher maximale MFI et bas droite pour traitée destinataires tolérantes qui affichent des IFM intermédiaire) (Figure 6).

5. évaluation de la réponse humorale aux antigènes exogènes (Naive et mémoire)

NOTE : Sérum de rats avant la transplantation, le traitement et la vaccination devrait servir des témoins négatifs des réponses humorales. Dans le cas contraire, des rats naïfs non immunisés peuvent être utilisés. Sérum de bénéficiaires immunocompétents, c.-à-d., transplantés exoantigen immunisés et rejetants des bénéficiaires, sont utilisés comme témoins positifs des réponses humorales.

  1. Capacité à élaborer une réponse humorale à un nouvel antigène (Figure 7)
    Remarque : Cette méthode est une quantification relative des réponses humorales car elle n’inclut pas une norme. Une quantification absolue de Ig serait possible en ajoutant une série de dilutions de rat IgG ou IgM anti-KLH Ab avec concentration connue à l’étape 5.1.6.
    1. Émulsionner 50 µg de KLH dans 200 µL d’adjuvant complet de Freund et injecter dans la queue de long-survivant/tolérance bénéficiaires, contrôle des bénéficiaires de rejetants non traitées, ou des rats naïfs comme contrôle positif des réponses humorales.
    2. Récolter des échantillons de sang à 4 et 13 jours après la vaccination et centrifuger 15 min à 1 200 g à 4 ° C. Enregistrer la phase supérieure, c’est le sérum. Récolter le sérum des rats non vaccinés pour un contrôle négatif. Sérum peut être congelé à-20 ° C jusqu'à ce que le test ELISA.
    3. Enduire les plaques ELISA (fond plat) avec 50 µL/puits KLH dilué à 10 µg/mL dans une solution de 1 PBS X nuit à 4 ° C. Assurez-vous que la solution de revêtement couvre tous les puits.
    4. Retirez l’excès KLH non revêtu par lavage. Pour laver, ajouter 150 µL/puits de tampon de lavage (1 X PBS contenant 0,1 % Tween) et flick.
    5. Liaison non-spécifique de bloc de l’Ig du destinataire en incubant pendant 1 h à 37 ° C avec 100 µL/puits de tampon de lavage contenant 10 % FCS. Laver une fois.
    6. Diluer le destinataire sera dans le tampon de lavage à partir de 1/40 à 1/512 en série, ajouter 50 µL/puits des doublons de la dilution en série de la plaque enduite et incuber pendant 2 h à 37 ° C. Conserver certains puits exempts de sérum de contrôle négatif. Laver deux fois.
    7. Ajouter 50 µL de 1 µg/mL de biotine conjugué anti-rat IgM Ab dans les puits contenant le sérum récoltés au jour 4 chez les receveurs ou 50 µL de conjugué Biotine anti-rat IgG dans les puits contenant le sérum récolté au jour 13 et incuber 1 h à 37 ° C. Laver deux fois.
    8. Ajouter 50 µL/puits de HRP conjugué streptavidine à 1 µg/mL pendant 45 min à 37 ° C. Laver 3 fois.
    9. Ajouter 50 µL de 3, 3′, 5, 5′-tétraméthylbenzidine (TMB) substrat pour < 30 min à ta et arrêter la réaction avec 25 ml d’acide sulfurique de 2 M lorsqu’il est positif, les contrôles sont saturés.
    10. Lire l’absorbance à 405 nm. Comparer la densité optique obtenue avec le sérum du bénéficiaire à celui obtenu avec le sérum de contrôle des rats naïfs.
  2. Évaluation de la capacité mémoire de réponse humorale (Figure 8)
    1. 7 jours avant la transplantation, injection i.v. 109 de RBCs xénogéniques dilué dans 800 µL de solution 1 PBS X dans les rats naïfs. Globules rouges peuvent être de mouton, de cheval ou de toute autre espèce.
    2. Effectuer la transplantation et d’administrer le traitement tolérogène.
    3. 3 jours après la greffe, injecter à nouveau i.v.109 RBC dilué dans 800 µL de solution de 1 PBS X chez les receveurs de greffe et les rats non greffées.
    4. Récolter sang échantillons 5 et 14 jours après la deuxième vaccination et centrifuger 15 min à 1 200 g à 4 ° C pour récupérer la phase supérieure de sérum. Sérum peut être conservé à-20 ° C ou utilisée immédiatement. Désactiver le complément dans le sérum de rat en incubant 30 min à 56 ° C avant utilisation.
    5. Ajouter 2 x 105 RBC/puits d’une plaque de fond de V de 96 puits. Centrifuger 1 min à 1 200 g à 4 ° C et éliminer le surnageant soigneusement par aspiration.
    6. En série, diluer le sérum 2 fois du 1/10 au 1/1280 en 1 X PBS (8 dilutions par échantillon). Incuber les cellules pendant 1 h à 4 ° C et 25 µL de sérum dilué/puits. Laver les cellules avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et éliminer le surnageant.
    7. Incuber les cellules avec la RBC-espèces adsorbées anti-rat IgG ou IgM sous-types étiquetés fluorochrome pendant 30 min à 4 ° C, un sous-type/puits. Évaluer le rat IgM et IgG anti-RBC dans le sérum récolté respectivement les 5 et 14 jours après la vaccination,. Laver les cellules avec 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA et éliminer le surnageant.
      Remarque : Si marqués au fluorochrome anti-rat Ig Ab n’est pas disponible, il est possible d’utiliser la souris sans étiquette purifié anti-rat IgG sous-type Ab et un fluorochrome étiquetés secondaire anti-souris Ab.
    8. Ajouter 100 µL de DAPI dilué à 0,1 µg/mL en solution 1 PBS X et d’analyser les cellules avec un analyseur de FACS.
    9. Représenter l’IFM en fonction de la dilution pour chaque groupe.

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Representative Results

L’évaluation de l’activité suppressive après tri des APC (Figure 1), les cellules de répondeur et Tregs simultanément (Figure 2), ou individuellement (Figure 4), et tout autres cellules régulatrices putatifs (Figure 3), peut être Done in vivo par injection directe des cellules régulatrices et in vitro par la mesure de luminosité CFSE (Figure 5). L’état de la réponse humorale du bénéficiaire envers le donateur (Figure 6) ou des antigènes exogènes (Figures 7 et 8) peut également être évaluée in vitro postvaccinales en vivo celle illustrée.

Figure 1
Figure 1 . Blocage de stratégie pour trier les PDC.
Les cellules ont été sélectionnées sur la taille de la morphologie et la granularité (SSC-A/FSC-A), les doublets étaient exclus par FSC-W/FSC-H et les paramètres de SSC-W/SSC-H, des cellules vivantes ont été sélectionnées par blocage sur DAPI cellules, et PDC ont été sélectionnés sur CD45RA TCRCD4 + CD45R+ expression. Pureté a été évaluée en ajoutant DAPI à cellules triées et en cours d’exécution sur la Trieuse cellules avec les paramètres de tri. Pureté d’une population triée rare (moins de 2 %) doit être supérieure à 95 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Blocage de stratégie de type CD4+CD25 cellules répondeur T et CD8+CD45RCfaible Tregs.
Les cellules ont été sélectionnées sur la morphologie, c'est-à-dire la taille et la granularité (SSC-A/FSC-A), les doublets étaient exclus par FSC-W/FSC-H et les paramètres de SSC-W/SSC-H, des cellules vivantes ont été sélectionnées par blocage sur DAPI cellules, et répondeur cellules ont été sélectionnées sur RCT + CD4+CD25 expression . CD8+Tregs ont été simultanément triés par blocage sur RCT+CD4CD45RC cellulesfaible . Pureté a été évaluée en ajoutant DAPI à cellules triées et en cours d’exécution sur la Trieuse cellules avec les paramètres de tri. Pureté doit être supérieure à 95 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Gating stratégie à cellules de type B, cellules myéloïdes et les cellules NK.
Les cellules ont été sélectionnées sur la taille de la morphologie et la granularité (SSC-A/FSC-A), les doublets étaient exclus par FSC-W/FSC-H et les paramètres de SSC-W/SSC-H, cellules vivantes ont été sélectionnées par blocage sur DAPI cellules, et cellules B ont été sélectionnés sur CD45RA+ expression, cellules myéloïdes sur expression CD11b/c+ et les cellules NK sur CD45RAforte expression de CD161 CD11b/c. Pureté a été évaluée en ajoutant DAPI à cellules triées et en cours d’exécution sur la Trieuse cellules avec les paramètres de tri. Pureté doit être supérieure à 95 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Blocage de stratégie de type CD8+CD45RCfaible et CD4+CD45RCfaible Tregs.
Les cellules ont été sélectionnées sur la taille de la morphologie et la granularité (SSC-A/FSC-A), les doublets étaient exclus par FSC-W/FSC-H et les paramètres de SSC-W/SSC-H, vécue de cellules ont été sélectionnées par blocage sur cellules DAPI et CD4+Tregs ont été sélectionnés sur RCT + CD4+CD45RCfaible expression et CD8+Tregs sur RCT+CD4CD45RCfaible expression. Pureté a été évaluée en ajoutant DAPI à cellules triées et en cours d’exécution sur la Trieuse cellules avec les paramètres de tri. Pureté doit être supérieure à 95 %. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Une analyse représentative de la in vitro dosage suppressive.
La prolifération des cellules répondeur a été analysée par sélection sur la taille de la morphologie et la granularité (SSC-A/FSC-A), exclusion des doublets de paramètres FSC-W/FSC-H et SSC-W/SSC-H, l’exclusion des cellules mortes et CD4+ Tregs par blocage sur DAPICPDV450 cellules, sélection de TCR+CD4+ cellules et l’analyse du profil CFSE. Le portail CFSE reposait sur des cellules non stimulées répondeur CFSE marqués. CFSEhaute cellules sont des cellules non-proliférantes et CFSEfaible sont des cellules avec ≥ 1 division. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 . Analyse représentative de la réponse des donateurs alloanticorps spécifiques.
Splénocytes du rat donneur sont incubées avec un éventail de sérum dilué inactivés par la chaleur de destinataires traités ou non traités ou de rats naïfs, puis avec anti-rat IgG-FITC. Allo-anticorps sont détectés par l’analyse des IMF de la FITC sur cellules DAPI z après exclusion de doublets SSC et FSC. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 . Principe de la méthode de détection anti-KLH.
Les bénéficiaires ont été immunisés à 120 jours après la transplantation avec KLH additionné de CFA, et des échantillons de sang ont été récoltés 4 à 13 jours après la vaccination. KLH protéines ont été enduits sur des plaques de bas à 96 puits et incubées avec les échantillons de sérum provenant de rats vaccinés. Biotinylé anti-rat de chèvre IgG ou IgM a permis la détection des anti-KLH Ab présent dans le sérum récoltés 4 ou 13 jours après la vaccination. Streptavidine couplé HRP a transformé le substrat TMB à un produit de couleur bleu qui vire au jaune lorsque la réaction est arrêtée par l’acide sulfurique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 . Schéma de la méthode de détection anti-RBC.
Bénéficiaires ont été immunisés à 7 jours avant et 3 jours après transplantation xénogénique des globules rouges (hématies), et des échantillons de sang ont été récoltés sur vaccinés jours bénéficiaires 5 et 14 après la dernière vaccination. Globules rouges sont incubées avec les échantillons de sérum provenant de rats vaccinés. Présence d’anticorps anti-globules rouges sur les globules rouges a été détectée par coloration avec anti-rat chèvre étiquetées IgG ou IgM anticorps et l’analyse de FACS Canto. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Transfert adoptif de splénocytes totales dans un receveur nouvellement greffé est un moyen efficace pour détecter la présence de cellules régulatrices induites ou potentialisée par un traitement. Hôte induite par l’irradiation transitoire lymphopénie favorise la survie des cellules après le transfert et la mise en place de la tolérance. En outre, irradiation sublétale laisse de temps pour les cellules avec propriétés tolérogène pour convertir les nouvelles cellules réglementaires au cours de la reconstitution immunitaire, un phénomène appelé tolérance infectieuses34. Habituellement, CD4 bien décrits CD25hauteFoxp3++CD127faible Tregs on étudiés tout d’abord lorsqu’on observe de tolérance. Toutefois, le transfert de la fraction négative (splénocytes appauvries en CD4+Tregs) permet parfois de prolongation au delà de la cellules régulatrices déjà connus et l’identification de nouvel cellulaire des populations1,2, 3,4. Dans la tolérance induite par le AdCD40Ig, le transfert de CD4+splénocytes de déplétion des cellules T a révélé la découverte de CD8 +CD45RCfaible Tregs1. En outre, des transferts successifs de CD8 total+ T de cellules et alors restreinte aux cellulesfaible CD45RC, ont montré la possibilité d’une telle méthode d’identifier progressivement une nouvelle population de cellules régulatrices. En outre, cette stratégie permet l’analyse de toutes les populations. En effet, nous avons montré que beaucoup de cellules régulatrices peuvent coexister et même probables, et que des mécanismes de compensation existe2,4. Chez les rats traités avec CD40Ig, appauvrissement de la couche de CD8+ cellules a permis l’émergence de cellules B et les cellules myéloïdes avec propriétés régulatrices et transféré la tolérance à l’allogreffe cardiaque chez le rat, selon le protocole décrit ci-dessus2. Dans un modèle de tolérance induite par la surexpression de IL34, les deux CD4+ et CD8+Tregs ont été en mesure de transférer4de tolérance.

Spécificité axée sur les donateurs de tolérance induite par le traitement peut être évaluée au niveau cellulaire et humorale. Tout d’abord, adoptif transfert de cellules régulatrices dans les receveurs d’une greffe de tierce partie ne réussira pas à transférer la tolérance si les cellules sont spécifiques à la premier donneur greffe33. Deuxième cellules suppressives doivent efficacement inhibe la prolifération des cellules intervenant dans la réponse à la stimulation par l’APC depuis le premier bailleur de fonds du greffon mais pas auprès d’une tierce partie donneur2. Enfin, les réponses humorales contre le donneur de la prothèse peuvent distinguer de production Ig totale chez le receveur en utilisant le protocole décrit ci-dessus. En outre, en cas de tolérance spécifique pour le premier donneur de greffe, destinataire devrait être en mesure de développer une nouvelle réponse humorale contre un greffon tiers secondaire, un antigène nouveau ou un ancien antigène connu16.

Traitement de collagénase D de la rate est préférable et conseillé pour extraire toutes les populations de cellules de l’organe. Enfin, quand le phénotype des cellules régulatrices est tellement serré que les cellules sont peu représentés (< 1 % des splénocytes), transfert de la fraction négative par rapport au transfert de la population totale peut aider à distinguer l’activité suppressive de ce petit population. Par exemple, les CD8 induite par le CD40Ig+Tregs spécifique d’un peptide allogénique pourrait être teinté à l’aide de tétramères de FACS mais leur faible nombre n’a pas permis de transfert adoptif positif33,38. Toutefois, un transfert adoptif de l’appauvri tétramères CD8+CD45RC cellulesfaible T n’a pas transféré de tolérance par rapport au total Tregs, soulignant le potentiel de cette sous-population. Ce résultat a été confirmé par une expérience suppressive in vitro . En effet, l’expérience suppressive était aussi une façon convaincante pour montrer la capacité des Tregs Du51 spécifiques pour supprimer les réponses immunitaires33.

Le protocole suppressif décrit ci-dessus est limité aux bénéficiaire effecteur CD4+T lymphocytes à PDC du donneur. Ce protocole peut être adapté par remplacement PDC par CDC ou total TTB, mais veiller à ce que les ratios de l’effecteur : stimulateur sont appropriées pour parvenir à une prolifération modérée gérable par les cellules suppressives. En effet, un taux de CD4+CD25T cellules : PDC doit être 4:1, alors qu’un taux de CD4+CD25 T cellules : CDC doit être de 8:1 et CD4+CD25 T cellules : TTB, 1:1 ou 1:2. Les rapports dépendent de l’alloreactivity entre le donneur et le receveur ; les rapports ci-dessus sont appropriés pour une combinaison de LEW.1W:LEW.1A avec un rejet aigu survenant au jour 7, mais la gamme des ratios de répondeur : stimulateur doit être testée avant le sacrifice des animaux. Enfin, CFSE est préférable à la thymidine pour analyser l’activité suppressive, pour des soucis de sécurité et de fiabilité. Toutefois, s’assurer que la distinction possible entre les cellules suppressives et répondeur cellules d’analyse CFSE au jour 6 si l’effecteur CD4+CD25 lymphocytes T sont remplacés par des splénocytes totales. De même, faire en sorte que les cellules T restantes entre les cellules de stimulateur ne peuvent proliférer après 35 Gy irradiation.

Conception de la coloration des FACS est basée sur la disponibilité des anticorps énumérés au tableau 3. Protocoles similaires peuvent être adaptées pour les modèles de souris, assurant la dénomination de cible (par exemple les cellules myéloïdes sont différemment décrits chez la souris et rat).

L’allogreffe cardiaque hétérotopique chez le rat est un modèle de transplantation d’organes solides avec grandes possibilités pour le suivi de résultats de greffe. Alors que le modèle d’allogreffe rénale se caractérisent par une mort subite du destinataire, palpation de la force de battement de la greffe cardiaque à travers la paroi abdominale informe du greffon evolution39,40. Une greffe de peau concomitante ou un deuxième greffon cardiaque peut être réalisé sur le destinataire d’une allogreffe cardiaque pour étudier la mémoire réponses41. En outre, biomoléculaire des outils techniques et biologiques ou chimiques pour épuisement des types spécifiques de cellules comme les cellules de B (IgM KO), cellules CD8 (anticorps anti-CD8α) ou des cellules myéloïdes (clodronate liposomes), sont des outils utiles pour mesurer l’importance de cette cellule les populations à induction ou d’entretien de la tolérance en fonction du temps après la transplantation qui appauvrissent la couche de traitement où est administrée au destinataire1,2,3,4.

À ce jour, le rat Bregs, cellules myéloïdes et CD8+Tregs ne sont pas bien décrits. Les protocoles d’induction de tolérance ci-dessus sont proposés comme référence pour la caractérisation des cellules régulatrices de rat1,2,3,4. Plus description phénotypique de ces cellules et la comparaison à d’autres modèles d’allotransplantation et autres espèces pourrait aider à discriminer les marqueurs d’un grand intérêt. En effet, Comparaison de Bregs de modèles murins de la tolérance et les patients tolérants sur le plan opérationnel mettre en évidence la prédominance de l’expression de marqueurs CD5 ou CD24 comme biomarqueurs du Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . Dans notre modèle de tolérance induite par le AdCD40Ig combinée à l’appauvrissement de la couche CD8α, CD24 est surexprimé par rapport aux cellules B dépourvues d’activité suppressive2. Haut débit numérique expression RNA séquençage de gènes a récemment émergé comme un outil innovant pour caractériser davantage de cellules régulatrices46.

Enfin, les protocoles pour détecter la présence de cellules régulatrices induites par un traitement tolérogène peuvent être adaptés à d’autres modèles. Ici, nous avons utilisé LEW.1W en LEW.1A combinaison d’allogreffe, caractérisée par un rejet du greffon dans environ 7 jours. La combinaison de l’inverti, qui a été décrite comme plus strictes et où le rejet aigu se produit plus vite et plus fort, peut être utilisée. Les modèles de maladies auto-immunes peuvent également bénéficier de notre expérience dans la transplantation pour décrypter les mécanismes d’induction de la tolérance aux traitements.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) qui fait partie du programme « Investissements d’avenir » Gouvernement Français géré par l’ANR (ANR-11-LABX-0016-01) et le projet IHU-Cesti, financé également par la » Investissements d’avenir » programme de gouvernement Français, géré par l’Agence Français de la recherche nationale (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la Région Pays de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

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References

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