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In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Immunology and Infection

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Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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Abstract

Das Hauptanliegen der Transplantation ist, spezifische Toleranz durch Induktion von regulatorischen Zellen zu erreichen. Das Verständnis der Mechanismen der Toleranz erfordert zuverlässige Modelle. Hier beschreiben wir Modelle der Toleranz gegenüber cardiac Allograft in Ratte, induziert durch Blockade der Costimulation Signale oder durch Hochregulation von immunregulatorische Molekülen durch Gentransfer. Jedes dieser Modelle erlaubt in Vivo Generierung von regulatorischen Zellen wie regulatorische T-Zellen (Tregs), regulatorische B-Zellen (Bregs) oder regulatorische myeloische Zellen (RegMCs). In diesem Manuskript beschreiben wir zwei zusätzliche Protokolle, die verwendet wurden, um zu identifizieren und definieren in Vitro und in Vivo -regulatorischen Zell-Aktivität zu bestimmen, ihre Verantwortung in der Toleranzinduktion und Wartung. Erstens ein in-vitro- suppressive Assay erlaubt schnelle Identifizierung von Zellen mit suppressive Kapazität auf Effektor Immunantworten in einer Dosis-abhängigen Weise und kann für weitere Analysen wie Cytokine Messung oder Zytotoxizität verwendet werden. Zweitens markiert die Adoptiveltern Übertragung von Zellen von einem toleranten behandelten Empfänger an einen neu bestrahlten veredelte Empfänger der tolerogene Eigenschaften dieser Zellen im Transplantat gerichtet Immunantworten zu kontrollieren bzw. Umwandlung von neuen regulatorischen Zellen ( infektiöse Toleranz bezeichnet). Diese Methoden beschränken sich nicht auf Zellen mit bekannten phänotypische Markierungen und können auf jede Zellenbevölkerung ausgedehnt werden. Darüber hinaus gerichtet Spender Allospecificity der regulatorischen Zellen (ein wichtiges Ziel im Feld) mithilfe Dritter Spenderzellen beurteilt werden können oder in Vitro oder in Vivo-Transplantat. Schließlich, um die spezifischen tolerogene Kapazität dieser regulatorischen Zellen zu bestimmen, bieten wir Protokolle zur Beurteilung der humoralen Anti-Spender Antikörperantworten und die Fähigkeit des Empfängers, humorale Reaktionen gegen neue oder ehemalige bekannte Antigene entwickeln. Die Modelle der Toleranz beschrieben können verwendet werden, um weitere regulatorische Zellen zur Ermittlung neuer Biomarker und immunregulatorische Moleküle, charakterisieren und sind anpassungsfähig an andere Transplantation Modelle oder Autoimmunerkrankungen in Nagetier oder menschliche.

Introduction

Cardiac Allograft in Ratte ist ein zuverlässiger Organ Transplantation Modell zur Bewertung der Toleranz-Induktion-Behandlungen, um die Mechanismen der Toleranzinduktion und Wartung, zu entschlüsseln und hat das Potenzial, funktionell zuständigen und dominante regulatorische Zellen induzieren. Die folgenden Protokolle beschreiben eine voll Missverhältnis heterotopisch kardiale Transplantat von Lewis 1W Spender Ratte (LEW.1W, RT1u) in eine Lewis 1A Empfänger Ratte (LEW.1A, RT1ein). In dieser Kombination Transplantat akuten Abstoßung tritt schnell (in ca. 7 Tage) und von Graft schlagen Messung durch Abtasten des Bauches leicht beurteilt werden kann. Hier schlagen wir drei Protokolle, um die Toleranz gegenüber der cardiac Allograft in Ratte zu induzieren. In diesen Modellen ist Toleranz induzierte bzw. von verschiedenen regulatorischen Zelltypen gepflegt. Erstens die Blockierung des CD40-CD40L Interaktionen mit einer Codierung CD40Ig Adenovirus (AdCD40Ig) induziert die Generation der CD8+ Tregs fähig induzierende Toleranz bei adoptively auf sekundäre veredelte Empfänger1übertragen. Darüber hinaus Erschöpfung der CD8+ Zellen (mit Anti-CD8α Antikörper) in AdCD40Ig behandelt Empfänger erzeugt Bregs und RegMCs2. Tiefenanalyse der CD8+ Tregs Eigenschaften die Schlüsselrolle der mehrere immunregulatorische Moleküle definiert als Interleukin-34 (IL-34) und Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 hervorgehoben . Während Überexpression des IL-34 (mit AAV-Vektor) Tregs durch Generierung von RegMCs induziert, induzierte Überexpression des FGL-2 Bregs, das komplexe Netzwerk von regulatorischen Zellen zugrunde.

Da chronische Ablehnung entwickelt sich langsam und langfristig ist, ist eine eingehende Analyse erforderlich, um Toleranz gegen chronische Ablehnung zu unterscheiden. Transplantat bemisst sich in der Regel für Zelle Infiltration, Fibrose, Verdickung der vaskulären Wand und Ergänzung C4d-Abscheidung von Immunhistologie7. Während Histologie Methoden Tieropfer erfordern oder Biopsie-Transplantat, hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Bestimmung der unterschiedlichen Merkmale der tolerierten Allograft: die Entstehung und Funktion der regulatorischen Zellen und die spezifischen Antikörper Anti-Spender-Antworten aus Blut Probe durch Durchflusszytometrie (Wir verwendeten hier, Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS)).

Wartung der Toleranz gegenüber der Allograft nach Verhaftung der Behandlung ist in der Regel verbunden mit der Induktion von regulatorischen Zellen8. In den letzten Jahrzehnten Studien konzentrierten sich auf CD4+Tregs einstimmig charakterisiert sie durch die wichtigsten Marker Foxp3+, CD25hochund CD1279,10,11. In ähnlicher Weise mehrere Markierungen wurden CD8 zugeschrieben+ Tregs, wie CD122+, CD28-, CD45RCniedrig, PD1+, und Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. im Laufe der Jahre Ausdruck von GITR, CTLA4 und Zytokine (IL-10, IL-35, TGFβ, IL-34 FGL-2) wurden zusätzlich mit einem Treg Profil3,4,6,13, verbunden 18,19,20,21. Aufstrebenden regulatorischen Zell-Populationen, z. B. Bregs, RegMCs oder NKTregs, fehlen aber entsprechende spezifische Marker. In der Tat, Bregs sind meist als Unreife CD24 berichtet+ Zellen mit zweideutigen CD27 Ausdruck und manchmal Produktion von IL-10 und TGFβ Granzym B22,23,24. Die Komplexität der myeloischen Zellen Linie erfordert eine Kombination von mehreren Marker definieren ihre behördlichen oder proinflammatorischen Profil z. B. CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a oder CD16325,26. Zu guter Letzt einige Marker gemeldet wurden, um NKTregs wie CD11b zu identifizieren+, CD27+, TGFβ+, aber weitere Studien sind erforderlich, um weitere phänotypisch27,28,29 beschreiben ,30,31,32. So Beweise suppressive Aktivität sind erforderlich, um weiteren phänotypischen Beschreibung für die Identifizierung neuer Biomarker, legitimieren neue immunregulatorische Vermittler und Ausweitung des Anwendungsbereichs auf neue Zelltherapien.

Wir schlagen zwei komplementäre Methoden um die suppressive Aktivität der Zellen zu bewerten. Erstens die in-vitro- Methode besteht darin, unterdrückende Zellen mit beschrifteten T-Effektorzellen angeregt durch allogene Spender antigenpräsentierende Zellen (APCs) bei unterschiedlichen Verhältnissen in 6 Tagen Kultivierung und Analyse der Effektor T Zell-Proliferation, unter der Regie von Spender Immunsuppression widerspiegelt. Zellen von behandelten Ratten können direkt mit Zellen von naiven Ratten und unbehandelten veredelte Ratten für suppressive Aktivität (oder andere regulatorische Zell-Population), in einer Reihe von Suppressor: Effektor Verhältnisse verglichen werden. Darüber hinaus diese Methode erfordert kein Transplantation, und Ergebnisse sind innerhalb von 6 Tagen. Zweitens besteht die in-Vivo -Methode die beabsichtigten regulatorischen Zellen von einer behandelten Ratte an einen neu bestrahlten veredelte Empfänger übertragen. Während B-Zellen, myeloische Zellen oder T-Zellen aus unbehandelten naiv Ratten sind in der Regel nicht in der Lage, akuten Abstoßung zu hemmen und Transplantat-Überleben bei Adoptiveltern Übertragung zu verlängern, Zellen mit potenzierten suppressive Aktivität von behandelt-Empfänger haben diese Attribute 1,2,3,4,33. Lymphopenie induziert durch Bestrahlung des Empfängers wird empfohlen, adoptively übertragene Zellen, Blut Homöostase unberührt und die Anti-Spender-Immunantworten leichter meistern können. Für beide Methoden, die in-vitro- Nutzung der allogenen APCs oder in Vivo Adoptiv Übertragung von suppressive Dritter ermöglichen Zellen zu Empfängern veredelt mit einem Drittanbieter-Herzen Analyse der Spezifität Anti-Spender. Die in-Vivo -Methode erfordert eine beträchtliche Anzahl von Zellen, schlecht vertreten können Zelle Subpopulationen leichter suppressive Aktivität in Vitro33bewertet werden.

Humorale Reaktionen können auch gemessen werden, um den Zustand der Toleranz und der Kontrolle der gerichtete Antikörperreaktionen auf Spender Antigene zu beurteilen. In der Tat kann Toleranz keine humorale Antwort in Richtung der Spender aber Erhaltung der Kapazität für die Empfänger, humorale Antwort auf neue Antigene entwickeln und Bewahrung der Erinnerung Reaktionen charakterisiert werden. Erstens basiert das Prinzip der Alloantibody-Erkennung auf Anerkennung der Spenderzellen durch Empfänger Antikörper nach Inkubation der Spender Zelltyp mit Serum von einem veredelten Empfänger. Zweite, humorale Reaktionen auf exogene Antigene gerichtet können bewertet folgende Stimulation der langfristigen tolerant Empfänger mit Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) mit kompletten Freund der adjuvanten emulgiert werden. Das Vorhandensein von IgM und IgG Antikörper gegen Antigene kann 4 und 13 Tage, bzw. nach Immunisierung mit Enzym verknüpften Immunosorbentprobe Assay (ELISA)34nachgewiesen werden. Drittens kann die Erhaltung des Immunsystems Speicher Antworten am Tage-7 und + 3 Transplantation und Erythrozyten Färbung mit Empfänger Serum am Tage gesammelt + 8 und + 17 nach Transplantation durch Injektion von xenogene roten Blutkörperchen (Erythrozyten) beurteilt werden. Alle diese Methoden erlauben die Identifizierung von Immunglobulin-Subtypen mit spezifischen Sekundärantikörper und schnelle Erfassung der Ergebnisse in weniger als 1,5 h von FACS Färbung oder ein paar Stunden von ELISA.

Schließlich diese Protokolle sind für die Charakterisierung der Transplantation Modelle konzipiert und können in gewisser Hinsicht auf Autoimmunerkrankung Modelle angewendet. Die Prinzipien der Methode können auf alle Arten umgesetzt werden.

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Protocol

Hinweis: Alle Protokolle hier von einer Ethikkommission genehmigt worden und sollte in einer sterilen Weise durchgeführt werden.

1. Generation der Toleranz in einem Modell der Cardiac Allograft in Ratte

  1. Lew.1W LEW.1A Allograft Verfahren
    1. Ein Spender-Männchen LEW.1W Ratte mit Isofluran-O2 einatmen, ergänzt mit 1 % N2O nach 5 min Platz das Tier in dorsaler Dekubitus und desinfizieren Sie den Bauch mit Betadine, führen Sie eine Thorakotomie zu betäuben (d.h., Schnitt in die Pleuraraum der Brust).
      1. Klemmen Sie die minderwertigen und überlegenen Gian Zanichelli, ligature sie und schneiden Sie sie. Dann schneiden Sie die Lungenarterie und der Aorta und speichern das Transplantat in kalten 0,9 % NaCl.
    2. Eine 250 g männliche LEW.1A Empfänger Ratte (von 8-12 Wochen) mit Isofluran-O2 einatmen, ergänzt mit 1 % N2O nach 5 min. das Tier in dorsaler Dekubitus und desinfizieren den Bauch mit Betadine auszuführenden Xyphopubic Laparotomie zu betäuben (d.h., großer Schnitt aus dem Xiphoid Prozess zur Schambeinfuge).
      1. Externalisieren Sie den Darm zu, Klemmen Sie die Abdominal-Blutgefäße, führen Sie eine Termino-seitliche Anastomose (d.h., Verbindung zwischen dem Ende eines Kanals und der Wand des anderen) zwischen der Transplantat-Aorta und der Bauchschlagader und der pulmonalen Arterie und der abdominalen Vena Cava und Klammern entfernen.
    3. Naht der muskulären Ebene und Haut, und mit Betadine desinfizieren.
    4. Spritzen Nalbuphine (Analgetikum) 6 mg/kg subkutan (s.c.) und Oxytetracycline (Antibiotikum) intramuskulär (i.m.), und legen Sie das Tier unter einer Wärmelampe, bis das Tier erwacht. Buprenorphin (Opioid) (50 µg/kg) i.m. und Meloxicam (nicht-steroidale entzündungshemmende Arzneimittel) zu injizieren (0,3 mg/kg) s.c. Tag der Transplantation und einen Tag nach.
  2. Induktion der Toleranz durch Blockade der costimulatory Interaktionen
    1. Führen Sie die Schritte 1.1.1. auf 1.1.2.
    2. Verdünnen Sie in einem klassifizierten A2 die Tierstation 2 x 1010 infektiöse Partikel des AdCD40Ig (ein Adenovirus Codierung CD40Ig, ein chimärer Molekül, blockiert die CD40-CD40L-Wechselwirkungen) im Ringer Laktat-Lösung zu einem Endvolumen von 150 µL erreichen und Spritzen in 3 Punkte (3 x 50 µL) in der Ventrikelwand von der Spitze des Transplantats.
    3. Führen Sie die Schritte 1.1.3 bis 1.1.4.
      Hinweis: AdCD40Ig Behandlung kann Anti-CD8α, Anti-ICOS oder Anti-CD28 Antikörper-Injektionen2,35,36zugeordnet sein.
  3. Induktion der Toleranz durch Überexpression eines rekombinanten Proteins
    1. Verdünnen Sie 1 x 1012 virale Genom Ratte IL34-rekombinanten AAV in Ringer Laktat-Lösung zu einem Endvolumen von 100 µL. 150 g LEW.1A Ratte mit Isofluran-O2 -Inhalation zu betäuben und Spritzen intravenös (i.v.) in der penile Ader.
    2. Führen Sie einen Monat nach der AAV-IL34 Injektion, eine LEW.1W Transplantat auf der LEW.1A-Empfänger laut Protokoll 1.1.

2. in-vitro- Beurteilung der Zellen Suppressive Aktivität von gemischten Lymphozyten Reaktionen (MLRs)

Hinweis: Suppressive Aktivität der Zellen von behandelten tolerant Ratten sollte mit der entsprechenden Bevölkerung von Phänomen veredelte Empfänger oder naiv Ratten verglichen werden.

  1. Isolierung der allogenen APCs: plasmazytoide dendritische Zellen (pDCs)
    1. Eine männliche LEW.1W naiv Spender Ratte mit Isofluran-O2 einatmen, ergänzt mit 1 % N2O nach 5 min. das Tier in dorsaler Dekubitus und desinfizieren den Bauch mit Betadine eine Splenektomie durchführen zu betäuben. Die Milz zu entfernen, indem Sie zu den Schiffen, die Milz in kalten 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) speichern und Naht das Tier.
    2. Übertragen Sie die Milz in eine Schüssel, entfernen Sie 1 X PBS zu und mit 5 mL 0,2 % Kollagenase D. durchspülen Um das Enzym Verdauung zu verbessern, die Milz in kleine Stücke schneiden und 15 min bei 37 ° c inkubieren
    3. Fügen Sie 500 µL 0.1 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA hinzu), übertragen Sie die Milz-Stücke in ein Sieb und zerquetschen Sie die Milz mit einer Spritze Kolben, die Zellen zu trennen. Transfer in ein Rohr und die Zellen mit 15 mL 1 X PBS waschen. Zentrifuge 10 min bei 430 X g. verwerfen den überstand.
    4. Erythrozyten und Thrombozyten zu beseitigen, Aufschwemmen Sie Splenocyte Pellet in 10 mL Hypotonische Lösung und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur (RT). Mit 1 X PBS waschen und 10 min bei 190 X g. verwerfen des Überstands zentrifugieren.
    5. Entfernen Sie Kollagenfasern durch Filterung auf einem 100 µm Gewebe Filter. Zählen der Zellen, um Zelle Konzentration bis 5 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS/2% fetalen Kälberserum (FCS) / 0,5 mM EDTA einzustellen.
      Hinweis: Die Anzahl der Splenocyten sollte zwischen 4 x 108 und 7 x 108 Zellen.
    6. Für Zellen des Interesses durch negative Auslese vor Zellsortierung bereichern. Inkubieren Sie 15 min bei 4 ° C mit 2 µg/mL gereinigt Antikörper spezifisch für T-Zellen (Anti-TCRαβ, R7/3 Klon und Anti-TCRγδ, V65 Klon), B-Zellen (Anti-CD45RA, OX33-Klon) und NK-Zellen (anti-CD161, 3.2.3 Klonen), waschen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA und 10 min bei 430 X g Zentrifugieren . Verwerfen Sie den überstand.
    7. Waschen Sie mit magnetischen Beads 3 Mal mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. 3,5 µL Perlen/106 Splenocyten, durch Zugabe von 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, Platz für 1 min auf den Magneten waschen und verwerfen des Überstands. Zweimal wiederholen. Aufschwemmen der Perlen in 10 Bänden von 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (z. B. 35 µL Perlen wird in 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA verdünnt).
    8. Entfernen Sie unerwünschte Zellen durch die Vermischung der Splenocyten mit magnetischen Beads für 10 min bei 4 ° C unter Rühren, platzieren Sie das Rohr auf den Magneten für 1 min und übertragen Sie überstand auf einen neuen Schlauch. Zweimal wiederholen. Zählen der Zellen und passen Sie die Zellkonzentration bis 5 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Hinweis: Die angereicherten Splenocyten Anzahl sollte zwischen 5 x 107 und 9 x 107liegen.
    9. Flecken auf die Zellen mittels beschriftete Antikörper für die weitere Sortierung des pDCs: restlichen T-Zellen (Anti-TCRαβ, R7/3 Klon) oder B-Zellen (Anti-CD45RA, OX33 Klon) ausschließen, und sortieren Sie CD4+ (Anti-CD4, OX35 Klon) CD45R+ Zellen (Anti-CD45R, His24-Klon). Label-Perlen mit jedem Ab, eine Vergütungsmatrix auf FACS zu etablieren. 15 min bei 4 ° C inkubieren und waschen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/mL, Filter auf einem 60 µm Gewebe Filter, und beschriften Sie tote Zellen, indem DAPI auf eine Endkonzentration von 0,1 µg/mL. Anspritzung auf DAPITCR CD45RA Zellen mit einem 70 µm Düse Zelle Sorter sortiertCD4+CD45R+ wie in Abbildung 1dargestellt.
  2. Isolierung der Responder-Effektor T-Zellen (CD4 + CD25 -T-Zellen)
    1. Die Milz von einer unbehandelten nicht gepfropft naiv LEW.1A Ratte zu ernten und speichern Sie es in kalten 1 X PBS.
    2. Übertragen der Milz in ein Sieb in eine Schüssel gelegt und 10 mL 1 X PBS. Zerdrücken Sie die Milz mit einer Spritze Kolben, die Zellen zu trennen. Übertragen Sie die Zellen in ein 50 mL-Tube, mit 1 X PBS waschen Sie und Zentrifugieren Sie 10 min bei 430 X g. verwerfen des Überstands.
    3. Zu beseitigen, Erythrozyten und Blutplättchen, Aufschwemmen Splenocyte Pellet in 10 mL Hypotonische Lösung für 5 min bei RT, entsorgen Sie dann waschen in 1 X PBS und Zentrifuge bei 10 min 190 X g. überstand.
    4. Entfernen Sie die Kollagenfasern durch Filterung auf einem 100 µm Gewebe Filter. Zählen der Zellen, um die Zellkonzentration bis 5 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA anpassen.
      Hinweis: Die Anzahl der Splenocyten sollte zwischen 3 x 10-8 und 5 x 108 Zellen.
    5. Bereichern Sie die Zellen von Interesse vor dem sortieren. 15 min bei 4 ° C mit 2 µg/mL gereinigt Antikörper spezifisch für NK-Zellen, CD8-Zellen (Anti-CD8α, OX8 Klon), B-Zellen (Anti-CD45RA, OX33 Klon) inkubieren (anti-CD161, 3.2.3 Klonen), myeloische Zellen (Anti-CD11b/c, OX42-Klon), Gamma-Delta T-Zellen (Anti-TCRγδ, V65 Klon). Dann waschen Sie mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA und Zentrifuge 10 min bei 430 X g. Entsorgen des Überstands.
      Hinweis: Sortieren Sie natürliche CD8 Ratten+ Tregs aus naiv zugleich als CD4+ T Effektorzellen, fügen Sie keine Anti-CD8α Ab während der Erschöpfung.
    6. Waschen Sie die magnetische Beads 3 Mal mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA wie in Schritt 2.1.7 beschrieben.
    7. Entfernen Sie die unerwünschten Zellen durch das Mischen von Splenocyten mit magnetischen Beads für 10 min bei 4 ° C unter Rühren, dann legen Sie das Rohr auf den Magneten für 1 min und übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch. Zweimal wiederholen. Zählen der Zellen und passen Sie die Zellkonzentration bis 5 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      Hinweis: Die Splenocyten Zahl sollte zwischen 5 x 107 und 8 x 107 Zellen liegen.
    8. Fügen Sie beschriftete Antikörper gegen CD4 Art+CD25 -T-Zellen: Anti-TCRαβ (R7/3 Klon), anti-CD4 (OX35-Klon), Anti-CD25 (OX39-Klon) und 15 min bei 4 ° c inkubieren CD8 gleichzeitig sortieren+CD45RCniedrigen Tregs, Anti-CD45RC Ab (OX22-Klon) hinzufügen. Beschriften Sie Perlen mit jedem Ab, um eine Vergütungsmatrix für die Weiterverarbeitung auf Durchflusszytometrie einzurichten. Waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA und verwerfen Sie den überstand.
    9. Aufschwemmen Sie Zellen bis 5 x 107 Zellen/mL, Filter auf einem 60 µm Gewebe Filter, und beschriften Sie tote Zellen, indem DAPI auf eine Endkonzentration von 0,1 µg/mL. Anspritzung auf DAPI TCR+CD4 Zellen mit einem 70 µm Düse Zelle Sorter sortiert+CD25 Zellen als Responder Zellen (und ggf. DAPI TCR+CD4CD45RCniedrig wie CD8+ Suppressive Tregszellen) wie in Abbildung 2dargestellt.
  3. Isolation von unterdrückenden Zellen
    Hinweis: Teilen Sie die Milz in zwei Aliquote: Sortieren einer auf B-Zellen, myeloische Zellen und NK-Zellen und die andere auf CD4+ und CD8+ CD45RCniedrigen T Zellen, ihre suppressive Funktion zu beurteilen.
    Hinweis: Für Adoptiveltern Zelltransfer speichern Sie 1 x 10-8 -Splenocyten, als die positive Kontrolle der Toleranz von Adoptiveltern Transfer zu dienen, wenn nötig.
    1. Sortierung von B-Zellen, myeloische Zellen und NK-Zellen
      1. Folgen Sie 2.1.1 bis 2.1.5 Protokoll.
      2. 15 min bei 4 ° C mit 2 µg/mL T-Zell-spezifische Antikörper (Anti-TCRαβ, R7/3 Klon und Anti-TCRγδ, V65 Klon), waschen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA unmarkiertem brüten und 10 min bei 430 X g. verwerfen des Überstands zentrifugieren.
      3. Waschen Sie mit magnetischen Beads 3 Mal mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA wie in Schritt 2.1.7 beschrieben.
      4. Mischen Sie die Splenocyten mit magnetischen Beads entfernen unerwünschte Zellen und inkubieren Sie für 10 min bei 4 ° C unter schütteln, dann legen Sie das Rohr auf den Magneten für 1 min und den Überstand auf einen neuen Schlauch übertragen. Zweimal wiederholen. Zählen der Zellen und passen Sie die Zellkonzentration bis 5 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Hinzufügen der Splenocyten Zellen mit vermuteten suppressive Aktivität z. B. myeloische Zellen (Anti-CD11b/c, OX42-Klon), B-Zellen (Anti-CD45RA, OX33 Klon) oder NK-Zellen sortieren beschriftete Antikörper (Anti-CD161 3.2.3 Klonen). Beschriften Sie die Perlen mit jedem Ab, eine Vergütungsmatrix auf FACS zu etablieren. 15 min bei 4 ° C inkubieren und waschen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/mL, Filter auf einem 60 µm Gewebe Filter, und beschriften Sie tote Zellen, indem DAPI auf eine Endkonzentration von 0,1 µg/mL. Die Zellen mit einem 70 µm Düse Zelle Sorter sortiert Anspritzung auf DAPICD11b/c+ für myeloische Zellen CD45RA+ für B-Zellen und CD161+ für NK-Zellen, wie in Abbildung 3dargestellt.
    2. Sortierung der CD4 + und CD8 + CD45RC niedrigen T-Zellen
      1. Folgen Sie 2.2.1 bis 2.2.4 Protokoll.
      2. Für negative Selektion auf einer magnetischen Spalte, brüten die Zellen 15 min bei 4 ° C mit 2 µg/mL gereinigt Antikörper spezifisch für B-Zellen (Anti-CD45RA, OX33-Klon), NK-Zellen (anti-CD161, 3.2.3 Klonen), myeloische Zellen (Anti-CD11b/c, OX42-Klon), Gamma Delta T Zellen ( Anti-TCRγδ, V65 Klon), waschen Sie sie mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA und 10 min bei 430 X g. verwerfen des Überstands zentrifugieren.
      3. Waschen Sie die magnetische Beads 3 Mal mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA wie in Schritt 2.1.7 beschrieben.
      4. Entfernen Sie die unerwünschten Zellen durch die Vermischung der Splenocyten mit magnetischen Beads für 10 min bei 4 ° C unter schütteln, dann legen Sie das Rohr auf den Magneten für 1 min und übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch. Zweimal wiederholen. Zählen der Zellen und passen Sie die Zellkonzentration bis 5 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Die Zellen sortieren Tregs beschriftete Antikörper hinzufügen: Anti-TCRαβ (R7/3 Klon), Anti-CD4 (OX35-Klon), Anti-CD45RC (OX22-Klon). Beschriften Sie die Perlen mit jedem Ab, eine Vergütungsmatrix auf FACS zu etablieren. 15 min bei 4 ° C inkubieren und waschen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Aufschwemmen der Zellen in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/mL, Filter auf 60 µm Gewebe, und beschriften Sie tote Zellen, indem DAPI auf eine Endkonzentration von 0,1 µg/mL. Die Zellen mit einem 70 µm Düse Zelle Sorter sortiert Anspritzung auf DAPITCR+CD4 CD45RCniedrigen CD4++Tregs und DAPITCR+CD4CD45RC niedrig wie CD8+Tregs ( Abbildung 4).
        Hinweis: Anti-CD8α Ab (OX8 Klon) kann verwendet werden, anstelle der Anti-CD4-Ab wenn T-Zellen vom CD4 diskriminiert werden+-T-Zellen durch Anti-TCR zu beschriften. Ein Übermaß an CD4+Tregs in Erwartung des Zelltods aufgrund der Cell Proliferation Farbstoff (CPD) Markierung sortiert werden soll.
  4. Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Kennzeichnung der Responder Zellen um Verbreitung zu messen
    1. Waschen Sie nach Responder Zelle sortieren zweimal die Zellen mit 1 X PBS.
    2. Aufschwemmen Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS und inkubieren Sie mit 0,5 µM CFSE für 5 min bei RT in der Dunkelheit. Stoppen der Reaktions durch Zugabe von FCS bei 1,5 X die Lautstärke und Zentrifugieren 10 min bei 430 X g bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
    3. Waschen Sie zweimal die Zellen mit kompletten Medium, und zählen Sie die Zellen zu.
      Hinweis: Erwarten Sie 30 % der Zellen Tod bei diesem Schritt.
  5. CPD Kennzeichnung von CD4 + Tregs für suppressive Assay auf CD4 + Effektorzellen
    Hinweis: Dieser Schritt ist erforderlich, CFSE-CD4 zu unterscheiden+Tregs aus CFSE- wuchernden Responder CD4+T-Zellen am 6. Tag des Coculture von Anspritzung auf CPD Zellen.
    1. Nach CD4+ Tregs Zelle sortieren, waschen zweimal die Zellen mit 1 X PBS.
    2. Aufschwemmen Sie die Zellen in einer Konzentration von 1 x 107 Zellen/mL in 1 X PBS und inkubieren Sie mit 10 µM von CPD-V450 für 20 min bei RT in der Dunkelheit.
    3. Waschen Sie zweimal die Zellen mit kompletten Medium, und zählen Sie die Zellen zu.
      Hinweis: Erwarten Sie 30 % der Zellen Tod bei diesem Schritt.
  6. Beratung für coculture
    1. Verwenden Sie Kultur im mittleren bestehend aus: RPMI 1640 Medium ergänzt mit Beta-Mercaptoethanol (5 x 10-5 M), Penicillin (100 U/mL), Streptomycin (0,1 mg/mL), Natrium Pyruvat (1 mM), Glutamin (2 mM), HEPES-Puffer (1 mM), nicht-essentiellen Aminosäuren (1 X), FCS () 10 %).
    2. Zellkulturen in 96-Well U unten Platten.
    3. Addieren von Zellen in der folgenden Reihenfolge: suppressive Zellen, Responder Zellen und allogenen Zellen.
    4. Konstant zu halten die Anzahl der Responder T-Zellen und allogene APCs und eine Reihe von Tregs Prüfnummer. Zum Beispiel Verhältnis 4:4:1, 5 x 104 suppressive Zellen, 5 x 104 Responder Zellen und 1,25 x 104 allogenen Zellen und Verhältnis 2:4:1, 2,5 x 104 suppressive Zellen, 5 x 104 Responder Zellen und 1,25 x 104 allogene Zellen.
    5. Pflegen Sie den Anteil der 5 x 104 Responder Zellen für 200 µL Medium/gut.
    6. Enthalten Sie für Steuerelemente ein paar Brunnen mit Responder T ohne allogene APCs (Negativkontrolle) und Responder T-Zellen mit allogenen APCs ohne regulatorischen Zellen (Positivkontrolle) für CFSE Anspritzung am Tag 6 (siehe Schritt 2.7.6.).
  7. FACS Färbung und Analyse nach 6 Tagen von coculture
    Hinweis: Die Verbreitung von Effektorzellen kann zu mehreren Zeitpunkten beurteilt werden. Beachten Sie, dass die Verbreitung exponential ist: zunehmender Zellteilung mehr Unterschiede zwischen den unterdrückenden Bedingungen und Negativkontrolle beobachtet werden.
    1. Übertragen Sie die Zellen aus der 96-Well-U Unterplatten bis 96-Well V unten Platten und Zentrifugieren 1 min bei 1.200 x g bei 4 ° c
    2. Speichern Sie den Überstand in eine neue Platte bei-20 ° C für die Messung von Zytokin Ebenen, bei Bedarf.
    3. Waschen Sie die Zellen mit 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA pro Brunnen und Zentrifuge 1 min bei 1.200 x g bei 4 ° C.
    4. Die Zellen weiter auf Responder T Zellen Tor Antikörper hinzufügen: Anti-TCRab (R7/3 Klon) und Anti-CD4 (OX35-Klon). 15 min bei 4 ° C inkubieren und zweimal mit 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA pro gut waschen. Verwerfen Sie den überstand.
    5. Fügen Sie 100 µL DAPI bei 0,1 µg/mL in 1 X PBS verdünnt und lesen Sie die Platte mit einem FACS-Analysator.
    6. Analysieren Sie das CFSE--Profil durch Anspritzung auf DAPI negativ (lebende Zellen) CPD negativ (nicht-CD4-+Tregs) TCR+CD4+ Zellen. Unstimulierte Responder Zellen haben maximalen CFSE-Helligkeit, wie in Abbildung 5 unten links Histogramm dargestellt. In Anwesenheit von allogenen APCs haben die Responder-Zellen maximale Verbreitung und minimale CFSE-Helligkeit (unten, Mitte). Im Beisein von allogenen APCs und regulatorischen Zellen haben die Effektorzellen mittlerer Proliferation und CFSE-Helligkeit (rechts unten).

3. in Vivo Beurteilung der Zellen Suppressive Aktivität von Adoptiveltern Zelltransfer in ein Herz verpflanzt Empfänger

Hinweis: Bestrahlung ist erforderlich zur Beseitigung der Wirtszellen und bevorzugen Spender Zelle Engraftment und Verbreitung.

  1. Die Transplantat-Empfänger früh am Tag vor der Transplantation zur Voraussetzung des Empfängers zu bestrahlen. Betäuben Sie Ratten mit. i.m Injektion von Xylazin (8 mg/kg)-Ketamin (80 mg/kg) und bei einer Dosis von 4,5 Gy mit Röntgenstrahlen zu bestrahlen.
  2. Führen Sie Protokoll 2.3 Zellen von Interesse zu isolieren.
    Hinweis: Speichern Sie 1 x 10-8 -Splenocyten, als Positivkontrolle der Toleranz von Adoptiveltern Transfer zu dienen, wenn nötig.
  3. 12 h nach der Bestrahlung (der Tag vor der Transplantation am Abend), die Ratten durch das Einatmen von 4 % Isofluran-O2 zu betäuben und Tränken der Zellen (5,0 x 107 T-Zellen, 3,0 x 107 B-Zellen, 3,0 x 107 myeloische Zellen oder 1,50 x 108 Splenocyten als die positive Kontrolle der Toleranz von Adoptiveltern Transfer) i.v. in der penile Ader.
    Hinweis: Die Anzahl der Zellen erforderlich für Toleranz durch Adoptiveltern Übertragung hängt die suppressive Aktivität der Zellen.
  4. Folgen Sie am nächsten Tag Protokoll 1.1 der Allograft durchführen. Folgen Sie Transplantat Entwicklung durch Abtasten durch den Unterleib.

(4) Spender bestimmten Antikörpernachweis

Hinweis: IgG Reaktionen in Richtung der Transplantat-Spender durch Inkubation der Zellen vom Spender mit Serum des Empfängers gemessen werden. Subtrahieren Sie den Hintergrund durch direkte Anfärbung der LEW.1W B-Zellen durch Inkubation der Zellen mit Phänomen LEW.1W Serum induziert.

  1. Ernten Sie Blut von den Ratten zu und Zentrifugieren Sie 15 min bei 1.200 x g bei 4 ° C. Speichern Sie das Serum. Serum kann bei-20 ° C gelagert oder sofort verwendet werden. Inaktivieren Sie die Ergänzung im Sera durch Inkubation für 30 min bei 56 ° c
  2. Die Milz von einer Spenderin LEW.1W Ratte zu ernten und speichern Sie es in kalten 1 X PBS. Folgen Sie den Schritten 2.2.1. zu 2.2.4. Fügen Sie 2 x 105 Zellen/gut in eine 96-Well-V-Bodenplatte. 1 min bei 1.200 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
  3. Der Sera seriell vom 1/10 bis 1/270 in 1 X PBS verdünnen (4 Verdünnungen/Probe). Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 4 ° C mit 25 µL verdünnter Serum/gut. Rechnen Sie die Anzahl der Spender-spezifische IgG-Subtypen (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) Immunantworten pro Probe (1 Serum X 4 Verdünnungen X 4 IgG Subtypen) zu analysieren. Waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA und verwerfen Sie den überstand.
  4. Inkubieren Sie die Zellen mit jeder Maus Anti-Ratte IgG Subtyp Ab Fluorochrom für 30 min bei 4 ° C, ein Subtyp/gut beschriftet.
    Hinweis: Wenn Fluorochrom-markierte Anti-Ratte Ig Ab nicht verfügbar sind, ist es möglich, gereinigten unbeschriftete Maus Anti-Ratte IgG Subtyp Ab und Fluorochrom-markierte sekundären Anti-Maus ab je auf die verfügbaren Fluorochromes und Cytometer Konfiguration verwenden, mehrere Anti-Ratte IgG Subtypen können in einen Brunnen mit entsprechenden Einstellungen getestet werden.
  5. Die Zellen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA zweimal waschen und entsorgen des Überstands.
  6. Fügen Sie 100 µL DAPI 0,1 µg/ml in PBS verdünnt und lesen Sie die Platte mit einem FACS-Analysator.
  7. Lesen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von Anti-Ratte IgG Subtyp Ab mit Fluorochrom auf alle DAPI Zellen beschriftet. Subtrahieren Sie die MFI mit naiven LEW.1A Serum auf die LEW.1W Zellen (Hintergrundfärbung, unten links) aus der MFI jeden Empfänger auf die LEW.1W Zellen in der entsprechenden Verdünnung mit dem Sera gewonnenen gewonnen (unten Mitte für unbehandelte Ablehnung Empfänger, maximale MFI und unten rechts für behandelten tolerant Empfänger, die zwischen MFI anzeigen anzeigen) (Abbildung 6).

5. Bewertung der humorale Reaktion auf exogene Antigene (Naive und Speicher)

Hinweis: Serum von Ratten vor der Transplantation, Behandlung und Impfung sollte als Negativkontrollen humorale Reaktionen verwendet werden. Andernfalls können nicht immunisiert naiv Ratten verwendet werden. Serum von immunkompetenten Empfänger, d. h., transplantierten Exoantigen geimpft und zurückweisender Empfänger dienen als Positivkontrollen humorale Reaktionen.

  1. Humorale Antwort auf ein neues Antigen (Abbildung 7) zu entwickeln
    Hinweis: Diese Methode ist eine relative Quantifizierung der humorale Reaktionen wie einen Standard nicht enthalten ist. Eine absolute Quantifizierung der Ig wäre durch Hinzufügen einer Reihe von Verdünnungen der Ratte IgG oder IgM Anti-KLH Ab mit bekannter Konzentration in Schritt 5.1.6 möglich.
    1. Emulgieren 50 µg der KLH in 200 µL kompletten Freund der adjuvanten und Spritzen in das Heck des lang-überleben/tolerant Empfänger, unbehandelte Ablehnung Empfänger oder naiv Ratten als Positivkontrolle humorale Reaktionen zu kontrollieren.
    2. Ernten Sie Blutproben 4 und 13 Tage nach der Impfung zu und Zentrifugieren Sie 15 min bei 1.200 x g bei 4 ° C. Speichern Sie die obere Phase ist, dass das Serum. Das Serum von nicht immunisierten Ratten für eine Negativkontrolle zu ernten. Serum kann bis die ELISA-Assay bei-20 ° C eingefroren werden.
    3. Mantel von ELISA-Platten (Flachboden) mit 50 µL/Well KLH verdünnt auf 10 µg/mL in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° c Sicherstellen Sie, dass die Beschichtungslösung deckt alle Brunnen.
    4. Entfernen Sie die überschüssige unbeschichteten KLH durch Waschen. Zum Waschen hinzufügen 150 µL/Well Waschpuffer (1 X PBS mit 0,1 % Tween) und Flick.
    5. Block unspezifische Bindung des Empfängers Ig durch Inkubation für 1 h bei 37 ° C mit 100 µL/Well Waschpuffer mit 10 % FCS. Einmal waschen.
    6. Seriell verdünnen Sie der Empfänger Sera in Waschpuffer ab 1/40 bis 1/512, fügen Sie 50 µL/Well in Duplikate der serielle Verdünnung auf die beschichtete Platte hinzu und 2 h bei 37 ° c inkubieren Halten Sie einige Brunnen frei von Serum für eine Negativkontrolle. Zweimal waschen.
    7. Fügen Sie 50 µL von 1 µg/mL Biotin-konjugierten Anti-Ratte IgM Ab in Brunnen, enthält das Serum am 4. Tag bei den Empfängern oder 50 µL Biotin-konjugierten Anti-Ratte IgG in Brunnen, enthält das Serum, geerntet am 13. Tag geerntet und 1 h bei 37 ° c inkubieren Zweimal waschen.
    8. Hinzufügen von 50 µL/Well des HRP-konjugierten Streptavidin bei 1 µg/mL für 45 min bei 37 ° C. Waschen Sie 3 Mal.
    9. Fügen Sie 50 µL 3, 3′, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) Substrat für < 30 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion mit 25 µL 2 M Schwefelsäure wenn positive Kontrollen gesättigt sind.
    10. Lesen Sie die Absorption bei 405 nm. Vergleichen Sie die optische Dichte mit Serum des Empfängers zu erhalten mit dem naiven Ratte Kontrollserum erhalten.
  2. Bewertung der humorale Antwort Speicherkapazität (Abbildung 8)
    1. Spritzen Sie 7 Tage vor der Transplantation, i.v. 109 xenogene RBCs in die naiv-Ratten in 800 µL 1 X PBS verdünnt. Erythrozyten können vom Schaf, Pferd oder irgendeiner anderen Sorte sein.
    2. Die Transplantation durchführen und Verwalten der tolerogene Behandlung.
    3. Spritzen Sie 3 Tage nach der Transplantation wieder i.v.109 RBC in 800 µL 1 X PBS im Transplantat-Empfänger und nicht gepfropft Ratten verdünnt.
    4. Ernten Sie Blut Proben 5 und 14 Tage nach der zweiten Impfung und Zentrifuge 15 min bei 1.200 x g bei 4 ° C an die oberen Serum-Phase zu erholen. Serum kann bei-20 ° C gelagert oder sofort verwendet werden. Die Ergänzung im Ratte Sera durch Inkubation 30 min bei 56 ° C vor der Verwendung zu inaktivieren.
    5. Fügen Sie 2 x 105 RBC/Well eine 96-Well-V-Bodenplatte. 1 min bei 1.200 x g bei 4 ° C zentrifugiert und entsorgen des Überstands sorgfältig durch Absaugen.
    6. Der Sera 2-Fach seriell zu verdünnen von 1/10 bis 1/1280 in 1 X PBS (8 Verdünnungen/Probe). Inkubieren Sie die Zellen für 1 h bei 4 ° C mit 25 µL verdünnter Serum/gut. Waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA und verwerfen Sie den überstand.
    7. Inkubation der Zellen mit der RBC Arten adsorbiert Anti-Ratte IgG oder IgM-Subtypen mit Fluorochrom für 30 min bei 4 ° C, ein Subtyp/gut beschriftet. Beurteilen Sie die Ratte IgM und IgG Anti-RBC im Serum bzw. geerntet von 5 bis 14 Tage nach der Immunisierung,. Die Zellen mit 1 X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA zweimal waschen und entsorgen des Überstands.
      Hinweis: Wenn Fluorochrom-markierte Anti-Ratte Ig Ab nicht verfügbar sind, ist es möglich, gereinigten unbeschriftete Maus Anti-Ratte IgG Subtyp Ab und ein Fluorochrom-markierte sekundären Anti-Maus Ab.
    8. Fügen Sie 100 µL DAPI bei 0,1 µg/mL in 1 X PBS verdünnt und analysieren Sie die Zellen mit einem FACS-Analyzer zu.
    9. Darstellen Sie die MFI als eine Funktion der Verdünnung für jede Gruppe.

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Representative Results

Die Beurteilung der suppressive Aktivität nach Sortierung der APCs (Abbildung 1) und Tregs Responder Zellen gleichzeitig (Abbildung 2) oder einzeln (Abbildung 4), und alle anderen vermeintlichen regulatorischen Zellen (Abbildung 3), kann fertig in Vivo durch direkte Injektion der regulatorischen Zellen und in-vitro- Messung der CFSE-Helligkeit (Abbildung 5). Der Status der humorale Antwort des Empfängers gegenüber dem Spender (Abbildung 6) oder exogene Antigene (Abbildungen 7 und 8) kann auch beurteilt in Vitro nach in-Vivo -Immunisierung als dargestellt werden.

Figure 1
Abbildung 1 . Anspritzung Strategie um pDCs sortieren.
Zellen wurden auf Morphologie Größe und Granularität (SSC-A/FSC-A) ausgewählt, Dubletten wurden durch FSC-W/FSC-H und SSC-W/SSC-H Parameter ausgeschlossen, lebenden Zellen wurden von Anspritzung auf DAPI Zellen, und pDCs wurden auf TCRCD45RACD4 + CD45R+ Ausdruck. Reinheit wurde durch sortierten Zellen DAPI hinzu und läuft auf der Zelle Sorter mit der Sortierparameter beurteilt. Reinheit einer seltenen sortierten Bevölkerung (weniger als 2 %) sollte größer als 95 % sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 . Anspritzung Strategie zur Art CD4+CD25 Responder T-Zellen und CD8+CD45RCniedrigen Tregs.
Zellen wurden ausgewählt nach Morphologie, d.h. Größe und Granularität (SSC-A/FSC-A), Dubletten wurden durch FSC-W/FSC-H und SSC-W/SSC-H Parameter ausgeschlossen, lebenden Zellen wurden von Anspritzung auf DAPI Zellen, und Responder Zellen wurden auf TCR ausgewählt + CD4+CD25 Ausdruck . CD8+Tregs durch gating auf TCR+CD4-CD45RCniedrigen Zellen gleichzeitig gelöst. Reinheit wurde durch sortierten Zellen DAPI hinzu und läuft auf der Zelle Sorter mit der Sortierparameter beurteilt. Reinheit sollte größer als 95 % sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Strategie, Art B-Zellen, myeloische Zellen und NK-Zellen gating.
Zellen wurden auf Morphologie Größe und Granularität (SSC-A/FSC-A) ausgewählt, Dubletten wurden durch FSC-W/FSC-H und SSC-W/SSC-H Parameter ausgeschlossen, lebende Zellen wurden von Anspritzung auf DAPI Zellen, und B-Zellen wurden auf CD45RA ausgewählt+ Ausdruck, myeloische Zellen auf CD11b/c+ Ausdruck und NK-Zellen auf CD45RACD11b/c CD161hohe Expression. Reinheit wurde durch sortierten Zellen DAPI hinzu und läuft auf der Zelle Sorter mit der Sortierparameter beurteilt. Reinheit sollte größer als 95 % sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 . Anspritzung Strategie zur Art CD8+CD45RCniedrige und CD4+CD45RCniedrigen Tregs.
Zellen wurden auf Morphologie Größe und Granularität (SSC-A/FSC-A) ausgewählt, Dubletten durch FSC-W/FSC-H und SSC-W/SSC-H Parameter ausgeschlossen waren, lebte Zellen wurden von Anspritzung auf DAPI -Zellen und CD4+Tregs wurden auf TCR ausgewählt + CD4+CD45RCgeringe Expression und CD8+Tregs auf TCR+CD4CD45RCgeringe Expression. Reinheit wurde durch sortierten Zellen DAPI hinzu und läuft auf der Zelle Sorter mit der Sortierparameter beurteilt. Reinheit sollte größer als 95 % sein. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 . Repräsentative Analyse der in Vitro suppressive Assay.
Die Responder-Zellproliferation wurde durch Selektion auf Morphologie Größe und Granularität (SSC-A/FSC-A), Ausschluss von Dubletten durch Parameter FSC-W/FSC-H "und" SSC-W/SSC-H, Ausschluss von abgestorbenen Zellen und CD4 analysiert+ Tregs durch Anspritzung auf DAPICPDV450 Zellen, Auswahl an TCR+CD4+ Zellen und CFSE--Profil-Analyse. Das CFSE--Tor basierte auf unstimulierte CFSE-beschriftet Responder Zellen. Hohe CFSE-sind nicht wuchernden Zellen und CFSE-niedrig sind Zellen mit ≥ 1 Division. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 . Repräsentative Analyse der Reaktion der Geber-spezifische Alloantibody.
Splenocyten von der Spender-Ratte wurden mit einer Reihe von verdünnten Hitze-inaktivierten Serum aus behandelten oder unbehandelten Empfänger oder naiv Ratte, und dann mit Anti-Ratte IgG-FITC inkubiert. Alloantibodies werden durch die Analyse von MFI der IRB auf DAPI Z Zellen nach Ausschluss von SSC und FSC Dubletten erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7 . Prinzip des Nachweisverfahrens Anti-KLH.
Immunisierten 120 Tage nach Transplantation mit KLH mit CFA ergänzt und Blutproben wurden 4 und 13 Tage nach der Immunisierung geerntet wurden. KLH-Proteine wurden auf 96-flach Boden Brunnen Platten beschichtet und mit Serumproben von immunisierten Ratten inkubiert. Biotinylierte Ziege Anti-Ratte IgG oder IgM erlaubt die Detektion von Anti-KLH Ab im Serum geerntet 4 oder 13 Tage nach der Impfung. HRP-gekoppelte Streptavidin verwandelt das TMB-Substrat zu einer blauen farbigen Produkt, das gelb dargestellt wird, wenn die Reaktion mit Schwefelsäure gestoppt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 8
Abbildung 8 . Schema des Anti-RBC Nachweisverfahrens.
Empfänger waren immunisierten 7 Tage vor und 3 Tage nach Transplantation mit xenogene roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und Blutproben wurden geerntet vom Empfänger 5 und 14 Tage nach der letzten Impfung immunisiert. Erythrozyten wurden mit Serumproben von immunisierten Ratten inkubiert. Anti-Erythrozyten-Antikörper auf die Erythrozyten wurde vom Färben mit beschrifteten Ziege Anti-Ratte IgG oder IgM-Antikörper und Canto FACS Analyse erkannt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Adoptiveltern Übertragung des gesamten Splenocyten in einen neu verpflanzten Empfänger ist eine effiziente Möglichkeit, das Vorhandensein von regulatorischen Zellen induziert oder durch eine Behandlung potenzierte erkennen. Host Bestrahlung-induzierte vorübergehende Lymphopenie fördert Zelle Überleben nach der Übertragung und Etablierung der Toleranz. Darüber hinaus lässt subletale Bestrahlung Zeit für Zellen mit tolerogene Eigenschaften zum neuen regulatorischen Zellen während Immunrekonstitution, ein Phänomen namens infektiöse Toleranz34konvertieren. In der Regel gut beschriebene CD4 CD25hoheFoxp3++CD127niedrige Tregs werden zunächst untersucht, wenn Toleranz eingehalten wird. Aber der negativen Fraktion übertragen (Splenocyten in CD4 erschöpft+Tregs) erlaubt manchmal Verlängerung über die bereits bekannten regulatorischen Zellen und Identifizierung von neuen Zelle Bevölkerungen1,2, 3,4. AdCD40Ig-induzierte Toleranz, die Übertragung von CD4+T Zellen erschöpft Splenocyten ergab die Entdeckung der CD8 CD45RCniedrigen Tregs1+. Darüber hinaus sukzessive Übertragung des gesamten CD8+ T Zellen und dann aufniedrigen Zellen CD45RC, zeigte das Potential einer solchen Methode schrittweise eine neue Population von regulatorischen Zellen identifizieren beschränkt. Darüber hinaus ermöglicht diese Strategie Analyse von allen Bevölkerungsgruppen. In der Tat haben wir gezeigt, dass viele regulatorische Zellen nebeneinander existieren können und sind sogar wahrscheinlich und Kompensationsmechanismen gibt es2,4. Bei Ratten mit CD40Ig, Erschöpfung der CD8 behandelt+ Zellen erlaubt die Entstehung von B-Zellen und myeloische Zellen mit regulatorischen Eigenschaften und Toleranz gegenüber der cardiac Allograft in Ratte nach dem Protokoll beschriebenen2übertragen. In einem Modell der Toleranz durch Überexpression des IL34, beide CD4 induziert+ und CD8+Tregs konnten Toleranz4übertragen.

Unter der Regie von Spender Spezifität der Behandlung-induzierte Toleranz kann zelluläre und humorale Ebene beurteilt werden. Erstens die Adoptiveltern Übertragung von regulatorischen Zellen zu Empfängern von einer Drittanbieter-Transplantat wird nicht gelingen, Toleranz zu übertragen, wenn die Zellen an den ersten Geber Transplantat33spezifisch sind. Zweite, unterdrückende Zellen sollten effizient hemmen die Vermehrung der Responder Zellen als Reaktion auf die Stimulation durch die APCs vom ersten Spender des Transplantats aber nicht von einer dritten Partei Spender2. Schließlich können humorale Reaktionen gegen den Spender des Transplantats von Ig Gesamtproduktion in den Empfänger mithilfe des Protokolls, die oben beschriebenen unterscheiden. Darüber hinaus sollte in einem Fall von bestimmten Toleranz gegenüber der ersten Transplantat-Spender, Empfänger eine neue humorale Antwort gegen eine sekundäre Drittanbieter-Graft, ein neues Antigen oder eine ehemalige bekannte Antigen16entwickeln zu können.

Kollagenase D Behandlung der Milz ist bevorzugte und ratsam, alle Zell-Populationen von der Orgel zu extrahieren. Schließlich, wenn der Phänotyp der regulatorischen Zellen ist so eng, dass die Zellen sind schwach vertreten (< 1 % des Splenocyten), Übertragung von den negativen Anteil im Vergleich zu der Übertragung der Gesamtbevölkerung kann helfen die suppressive Aktivität von diesem kleinen unterscheiden Bevölkerung. Z. B. CD40Ig-induzierten CD8+Tregs spezifisch für eine allogene Peptid kann gebeizt mit Tetramers FACS ihre geringe Anzahl erlaubte aber keine positiven Adoptiv Transfer33,38. Jedoch Adoptiv Übertragung von Tetramer erschöpft CD8+CD45RCniedrigen T-Zellen nicht Toleranz gegenüber zu total Tregs, Hervorhebung das Potenzial diese Subpopulation übertragen. Dieses Ergebnis wurde durch ein in-vitro- suppressive Experiment bestätigt. In der Tat war die suppressive Experiment auch überzeugend zu zeigen, die Kapazität des Du51-spezifischen Tregs Immunantworten33zu unterdrücken.

Die unterdrückende Protokoll beschriebenen beschränkt sich auf Empfänger Effektor CD4+T-Zell-Antworten auf pDCs vom Spender. Dieses Protokoll kann angepasst werden, indem pDCs durch cDCs oder total APCs zu ersetzen, sondern um sicherzustellen, dass die Effektor: Stimulator Verhältnisse geeignet, eine mäßige Verbreitung überschaubar durch die unterdrückenden Zellen zu erreichen sind. In der Tat ein Verhältnis von CD4+CD25T Zellen: pDCs sollte 4:1, während ein Verhältnis von CD4+CD25 T Zellen: cDCs soll 8:1 und CD4+CD25 T Zellen: APCs, 1:1 oder 1:2. Die Verhältnisse richten sich nach der Alloreactivity zwischen Spender und Empfänger; die oben genannten Kennzahlen eignen sich für eine LEW.1W:LEW.1A Kombination mit einer akuten Abstoßung auftreten am 7. Tag, aber das Spektrum der Responder: Stimulator Verhältnisse sollten getestet werden, bevor das Opfer von Tieren. Zu guter Letzt ist CFSE bevorzugt, Thymidin suppressive Aktivität, für Sicherheit und Zuverlässigkeit zu analysieren. Jedoch sorgen die mögliche Unterscheidung zwischen suppressive Zellen und Responder Zellen für die CFSE-Analyse am 6. Tag, wenn der Effektor CD4+CD25 -T-Zellen werden durch insgesamt Splenocyten ersetzt. In ähnlicher Weise sicherstellen Sie, dass die restlichen T-Zellen unter Stimulator Zellen vermehren können nicht nach 35 Gy Bestrahlung.

Design der FACS Färbung basiert auf der Verfügbarkeit von Antikörpern, die in Tabelle 3aufgeführt. Ähnliche Protokolle können für Mäuse Modelle, Gewährleistung Ziel Bezeichnung (z. B. myeloische Zellen sind differentiell beschrieben bei Maus und Ratte) angepasst werden.

Die heterotopisch cardiac Allograft in Ratte ist ein solides Organ Transplantation Modell mit tollen Möglichkeiten für das Transplantat Ergebnis monitoring. Während renal Allograft Modell zeichnen sich durch einen plötzlichen Tod des Empfängers, informiert Palpation der beat Stärke des kardialen Transplantats durch die Bauchdecke des Transplantats Evolution39,40. Eine damit einhergehende Hauttransplantation oder eine zweite kardiale Transplantat kann auf der cardiac Allograft Empfänger Speicher Antworten41studieren realisiert werden. Darüber hinaus sind Biomolecular engineering und biologischen oder chemischen Werkzeuge für Abbau der spezifischen Zelltypen wie (IgM KO) B-Zellen, CD8-Zellen (Anti-CD8α Antikörper) oder myeloische Zellen (Clodronat Liposomen), nützliche Tools, wie wichtig es ist, dass diese Zelle zu messen Populationen in Induktion oder Wartung der Toleranz abhängig von der Zeit post Transplantation wo der abbauende Behandlung an die Empfänger1,2,3,4verabreicht wird.

Datum, Ratte, Bregs, myeloische Zellen und CD8+Tregs sind nicht gut beschrieben. Die Protokolle der Toleranzinduktion oben sind als Referenz für die Charakterisierung der Ratte regulatorischen Zellen1,2,3,4vorgeschlagen. Weiter könnte phänotypischen Beschreibung dieser Zellen und im Vergleich zu anderen Modellen der Allotransplantation und andere Arten helfen, um Markierungen von großem Interesse zu diskriminieren. In der Tat, Vergleich der Bregs von Mausmodellen von Toleranz und operativ toleranten Patienten hervorheben Vorherrschaft der CD5 oder CD24 Marker-Ausdruck als Biomarker der Bregs3,23,24, 42 , 43 , 44 , 45 . In unserem Modell der Toleranz, die durch AdCD40Ig verbunden mit Erschöpfung der CD8α induziert ist CD24 im Vergleich zu B-Zellen fehlt suppressive Aktivität2überexprimiert. Hoher Durchsatz digitale Ausdruck RNA Gensequenzierung entstanden vor kurzem als innovatives Instrument zur weiteren regulatorischen Zellen46charakterisieren.

Zu guter Letzt können Protokolle zum Nachweis der regulatorischen Zellen induziert durch eine tolerogene Behandlung auf andere Modelle angepasst werden. Hier haben wir LEW.1W in LEW.1A Kombination von Allograft, zeichnet sich durch ein Transplantat Ablehnung in etwa 7 Tage. Die Invert-Kombination, die wurde beschrieben als eine strengere und dem akuten Abstoßung geschieht schneller und stärker, kann verwendet werden. Autoimmunerkrankung Modelle profitieren auch von unserer Erfahrung in der Transplantationsmedizin für die Entschlüsselung der Mechanismen der Toleranzinduktion mit Behandlungen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde realisiert im Rahmen des Projekts Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) ist Teil des Programms "Investissements Avenir" französische Regierung verwaltet durch die ANR (ANR-11-LABX-0016-01) und die IHU-Cesti Projekt auch durch die " Investissements Avenir"französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

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