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La exposición del cerdo del SNC para el análisis histológico: Un Manual para decapitación, Apertura cráneo, cerebro y Remoción

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Neuroscience

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Summary

El objetivo de este documento y vídeo de instrucción es describir cómo exponer y retirar el cerebro de cerdo y la glándula pituitaria postmortem en un estado intacto, adecuado para el análisis macroscópico e histológico posterior.

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Bjarkam, C. R., Orlowski, D., Tvilling, L., Bech, J., Glud, A. N., Sørensen, J. C. H. Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal. J. Vis. Exp. (122), e55511, doi:10.3791/55511 (2017).

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Abstract

Los cerdos se han vuelto cada vez más popular en la investigación traslacional animal grande neurociencia como un sustituto económicamente y éticamente factible primates no humanos. El tamaño del cerebro grande del cerdo permite el uso de generadores de imágenes cerebrales clínica convencionales y el uso directo y las pruebas de los procedimientos y equipos de neurocirugía de la clínica humana. Además análisis macroscópico e histológico, sin embargo, requiere la exposición postmortem del sistema de cerdo nervioso central (CNS) y la extracción del cerebro posterior. Esta no es una tarea fácil, ya que el cerdo CNS está encapsulada por una, estructura ósea del cráneo de espesor y la columna vertebral. El objetivo de este documento y vídeo de instrucción es describir cómo exponer y retirar el cerebro de cerdo postmortem y la glándula pituitaria en un estado intacto, adecuado para el análisis macroscópico e histológico posterior.

Introduction

Los estudios de neurociencia traslacional en cerdos se han vuelto cada vez más populares en las últimas dos décadas. El gran tamaño del cerebro de cerdo permite el uso de generadores de imágenes cerebrales clínica convencionales y el uso directo y las pruebas de los procedimientos neuroquirúrgicos y el equipo de la clínica humana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. En los últimos 20 años, cerdos, especialmente cerdos enanos (por ejemplo, Göttingen minipig), se han utilizado para examinar las modalidades de tratamiento neuromoduladores, como el trasplante de células madre; transfección vector viral; y la estimulación cerebral profunda dirigida hacia la enfermedad de Parkinson, la obesidad, la depresión y la enfermedad de Alzheimer 2, 6,= "xref"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Esto ha sido seguido por el desarrollo de enfoques estereotáxica y quirúrgicos para manipular el cerdo enano CNS 3, 18, 19, 20, 21. Los cambios del SNC instituidos se han evaluado en animales vivos usando imágenes del cerebro (PET 10, 13, 22, 24 y MR 23), cistometría 11, 12, 25, análisis de la marcha17, la evaluación neurológica 9, 17, y el examen postmortem base de la histología y análisis estereológico 14, 15, 17, 26, 27, 31. Sin embargo, el análisis post-mortem requiere la exposición y la eliminación del cerebro de cerdo, que no es una tarea fácil, como, cráneo óseo de espesor y un dural fibrosa que cubre rodean el cerebro de cerdo.

El objetivo de este documento y vídeo de instrucción es describir cómo el cerebro de cerdo postmortem y la pituitaria pueden estar expuestos y eliminados en un estado intacto en 15-20 min utilizando herramientas quirúrgicas no motorizados. El vídeo de instrucciones y las ilustraciones fotográficas muestran cerdos enanos varones (edad: 6 meses, el peso corporal: 20-25 kg) utilizados para un estudio anatómico de la glándula pituitaria cerdo enano.

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Protocol

anestesia Animal y euthanesia se realizó de acuerdo con "Principios de laboratorio cuidado de los animales" (NIH publicación No. 86-23, revisada 1985) y aprobada por el Consejo Danés de Ética de la Investigación Animal.

1. Instrumentos

  1. Recoge los instrumentos presentados en el video y que figuran en la Tabla de Materiales.

2. Decapitación

NOTA: La anestesia se indujo mediante una inyección intramuscular de 5 ml de midazolam (5 mg / ml) y 5 ml de ketamina (25 mg / ml). 5-10 min más tarde, cuando el animal estaba profundamente sedado, una vena de la oreja y se canuló una sobredosis letal (100 mg / kg de peso corporal) de pentobarbital sódico se administra por vía intravenosa (200 mg / ml). Para asegurar que el animal fue sacrificado por completo, el reflejo de dolor interdigital se ensayó como se muestra por Ettrup et al. (2011) 20. eutanasia completa se asegura como se describe enla declaración ética arriba y seguido por una perfusión transcardial con 5 L de solución salina isotónica, como se demuestra por Ettrup et al. (2011) 20. Todos los procedimientos se realizan demostrado postmortem, evitando la necesidad de las precauciones necesarias para la anestesia de bienestar a largo plazo y la supervivencia después del procedimiento.

  1. Decapitar al cerdo por un alto incisión cervical circular, usando un bisturí quirúrgico, justo debajo del ángulo mandibular (Figura 1A).
  2. Todavía con el bisturí quirúrgico, continuar la incisión anterior a través del tejido blando del cuello, incluyendo la laringe y el esófago, hasta que se alcanza la columna vertebral ósea, aproximadamente en el nivel de la unión craneocervical.
  3. Avanzar en el corte con un bisturí quirúrgico desde el lado anterior de la unión craneocervical, por encima del arco anterior del atlas, y a través de la membrana atlantooccipital anterior, exponiendo así el canal espinal y la médula espinal (Figura 1B). Al mismo tiempo pedir a un asistente para sacar el cuerpo del cerdo lejos de la cabeza de cerdo para facilitar el acceso entre la base del cráneo y la primera vértebra cervical.
  4. Continuar la incisión quirúrgica a través del saco dural y la médula espinal (Figura 1B). Tenga especial cuidado para asegurarse de que se logra una sección transversal completa de la médula espinal.
    NOTA: Si no se realiza el paso anterior puede dar lugar a la tracción no deseado en la médula espinal y el cerebro durante los siguientes pasos del proceso de decapitación.
  5. Con fuerza extender la unión cranocervical a nivel de sección (Figura 1C). Al mismo tiempo, utilizar el bisturí quirúrgico a la sección de los ligamentos atlantooccipitales restantes para liberar la articulación entre los cóndilos del occipital y el proceso articular superior de atlas. Separar la cabeza de cerdo del cuerpo.

Figura 1
Figura 1: Minipig decapitación. Incisión (A) del cuello (flecha, el ángulo mandibular). (B) incisión a través de los ligamentos atlantooccipitales y la médula espinal dura-rodeado (SC) en la unión craneocervical (C1, arco anterior del atlas; OC, cóndilo occipital). (C) La parte posterior de la articulación atlantooccipital es liberado por una extensión contundente (flechas) en el nivel de sección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Apertura cráneo

  1. Coloque la cabeza de cerdo sobre una mesa.
  2. Haga una incisión longitudinal dorsal con un bisturí quirúrgico a través de la piel y el tejido blando subyacente de la parte posterior de la boca, sobre el vértice de la cabeza, y hacia abajo a través de la parte posterior dela región occipital.
  3. Exponer la parte dorsal y posterior del cráneo mediante la eliminación de tejido blando situado en el lateral de la incisión inicial con un bisturí quirúrgico.
  4. Soltar el músculo temporal bilateralmente en el cráneo (Figura 2A) con un escalpelo quirúrgico. Asegúrese de que el hueso occipital posterior se limpian de tejido blando.
  5. Utilice la entrada posterior del foramen magnum para eliminar el hueso occipital con una Kerrison punzón y hueso rongeurs óseas y exponer el cerebelo dura-cubierta (Figura 2B).
  6. Volver a la cara anterior expuesta del cráneo y seleccione un punto de entrada en el hueso frontal, justo en frente de los ojos. En este punto, utilizar un cincel de hueso con un martillo para penetrar en el cráneo y entrar en el seno frontal (Figura 2C).
  7. Usar la medida del seno frontal para promover la eliminación dorsoposterior de la lámina cráneo exterior con un rongeur hueso o médula punzón y exponer el interior, delgadalámina cráneo óseo que cubre el cerebro (Figura 2D).
  8. Abrir suavemente el interior lámina cráneo óseo en sentido anterior con un martillo y un cincel de hueso para exponer el cerebro dura-cubierta (Figura 2E).
  9. Continuar la eliminación de hueso lateralmente usando un cincel de hueso y un rongeur hueso a través del hueso temporal y parietal a fin de liberar la parte dorsoposterior final del cráneo, situado entre las partes ya expuestas de la cerebro dura-cubierta y el cerebelo (Figura 2F).
    NOTA: A menudo es posible, durante el paso final de este procedimiento, para usar el cincel para romper el hueso del cráneo posterior restante de un lado, al igual que uno abre una puerta.

Figura 2
Figura 2: Minipig abertura cráneo. (A) La exposición de la dorsoposteriosuperficie del cráneo r, incluida la eliminación de la occipital y los músculos temporales. (B) La retirada del hueso occipital (CB, cerebelo dura-cubierto; OB, hueso occipital; OC, cóndilo occipital; y SC, médula espinal). (C) un martillo y un cincel de hueso se utilizan para penetrar en el cráneo anterior y para entrar en el seno frontal en el nivel de los ojos. (D) La medida del seno frontal (FS) se utiliza para eliminar el hueso del cráneo de espesor exterior (1), la exposición de una lámina fina de hueso interior (2) que cubre el cerebro. (E) La eliminación de la lámina delgada de hueso, dejando al descubierto el cerebro dura-cubierta (flecha). (F) Por último, un martillo y un cincel de hueso se utilizan para conectar lateralmente el de las aberturas del cráneo anterior y posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Cerebro RemovAlabama

  1. El uso de fórceps quirúrgicos para levantar la duramadre y crear una incisión cerca suave para el seno sagital superior venosa usando un bisturí quirúrgico fino (Figura 3A).
  2. Utilice micro-tijera o un cuchillo de duramadre a abrir más la duramadre que recubre la superficie dorsal del cerebro.
    NOTA: El cuidado especial debe ser tomado cuando la eliminación de la duramadre que corresponde a la tentorium cerebelar (Figura 3B), como la preservación de esta hoja dural evitará la extracción del cerebro posterior.
  3. Coloque la cabeza de cerdo verticalmente (Figura 3C).
  4. Utilice el cincel de hueso o un disector para liberar el cerebro ventroanterior mediante disección roma del bulbo olfatorio del suelo dura-cubierta de la cavidad craneal (Figura 3D).
  5. Utilice un bisturí quirúrgico bien a la sección del quiasma óptico expuesto (Figura 3E). Exponer y la sección del tallo hipofisario y los nervios oculomotores.
  6. Soltar el tronco cerebral ventral seccionando la LOnervios wer craneales (Figura 3F) con un bisturí quirúrgico fino. Asegúrese de que la tentorium cerebelosa dural se realizó una incisión por completo (Figura 3B), ya que esta hoja dural será lo contrario cortar a través del tronco cerebral durante el proceso de liberación.

figura 3
Figura 3: la extracción del cerebro Minipig. De apertura (A) Dural con fórceps quirúrgicos y un cuchillo duramadre. (B) Se debe tener cuidado para incidir completamente la hoja dural (flecha), situada entre el cerebro y el cerebelo. (C) La cabeza de cerdo se coloca verticalmente para una mejor visualización de las estructuras de la base del cráneo y para que la gravedad ayude en el desplazamiento previsto del cerebro. (D) un disector o un cincel de hueso se usa para aliviar el bulbo olfativo por la sección romo de la dura-covered base del cráneo. (E) La disección se continúa en una dirección posterior a lo largo de la base del cráneo para la exposición y el seccionamiento del quiasma óptico (flecha), tallo infundibular, y los nervios oculomotores. (F) La liberación cerebro se completa con la sección de los nervios craneales inferiores a medida que salen de la superficie ventral del tronco cerebral (III, el nervio oculomotor; IV, nervio troclear; V, nervio trigémino; y VI, ocular externo del nervio). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Eliminación de la hipófisis

  1. Identificar el tallo hipofisario y su hoja dural circundante (la sellae diapragma) en el suelo cráneo (Figura 4A).
  2. Incisión en el lateral de la hoja dural al tallo hipofisario usando un bisturí quirúrgico fino (Figura 4B).
  3. Utilice un disector para liberar el pozouitary y la saca de la fosa pituitaria (Figura 4C).

Figura 4
Figura 4: eliminación pituitaria Minipig. (A) La fosa pituitaria (*) se identifica en el suelo cráneo (1, bulbo olfatorio; 2, quiasma óptico, y PF, posterior fosa craneal). (B) La cubierta dural (diagphragm selar, (flecha)) se realiza una incisión lateralmente. (C) La pituitaria (flecha) se libera con un disector y sacó de la fosa pituitaria. Barra de escala (AC) = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

Para evitar que el material de tejido de la desecación, se recomienda para almacenar el cerebro eliminado y la hipófisis en una jarra llena de fijador o solución salina isotónica inmediatamente después que se ha realizado el análisis macroscópico. El material tejido puede ser almacenado en el fijador por año, mientras que el almacenamiento en solución salina isotónica, incluso en un refrigerador, dará lugar a la descomposición del tejido con el tiempo.

La pituitaria eliminado también puede estar directamente congelada por inmersión en seco 2-metilbutano líquido enfriada con hielo, mientras que el cerebro de cerdo intacta es demasiado grande para la congelación directa 28. En lugar de ello, se recomienda para cortar el cerebro de cerdo, como se ha demostrado previamente 28, en losas gruesas de tejido coronales paralelas 9-15 mm que se pueden congelar en toto y criostato-seccionaron en secciones de 40 micras de espesor 5, 18, 26, 28. Alternativamente, áreas específicas del cerebro pueden ser libres-diseccionaron del cerebro intacto eliminado o rodajas losa cerebro y sometidos a un procesamiento adicional histológico después de vibratome seccionamiento 30, parafina / incrustación metacrilato y micrótomo seccionamiento 6, 17, 27, o congelación y criostato seccionamiento 6, 14, 15, 25. En nuestro medio, los canales de cerdo son finalmente colocados en recipientes de plástico especificados y se almacenaron en una habitación de almacenamiento en frío dedicado hasta que son recogidos y transportados a una instalación degradantes biológica.

Con el uso de herramientas quirúrgicas no motorizados (tabla de materiales), la técnica descrita (Figuras 1 g> - 3) permite, en aproximadamente 15-20 minutos, la eliminación del cerebro de cerdo intacta (Figura 5AB), mientras que los nervios craneales cortadas y pituitaria permanecen conectados al suelo cráneo (Figura 4A). Del mismo modo, la pituitaria puede ser simplemente eliminado, intacta, después de retirar el cerebro suprayacente y liberando el diafragma selar dural (Figura 4 y 5C).

El cerebro y / o pituitaria resultante (Figura 5) pueden posteriormente ser sometidas a análisis macroscópico que, aparte de la inspección visual directa, pueden incluir mediciones de tamaño y volumen 31. Esto puede ser seguido por oriented seccionamiento en losas cerebrales más pequeños 28, 29 adecuado para el análisis químico y / o más histológico preparación, tinción y análisis microscópico 6,s = "xref"> 14, 15, 17, 25, 26, 27.

Figura 5
Figura 5: El cerebro minipig (A y B) y la hipófisis (C). (A) Brain, vista laterodorsal (BS, tronco cerebral; CB, cerebelo; y CRB, cerebro). (B) Brain, vista ventral (BS, tronco cerebral; CB, cerebelo; y CRB, cerebro). (C) de la hipófisis, vista posterior (AH, adenohipófisis y NH, neurohipófisis). Barra de escala (A y B) = 10 mm, (C) = 5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La mayoría de los estudios de neurociencia experimentales se llevan a cabo en las especies de animales pequeños, tales como ratones y ratas, donde el acceso al SNC se ve facilitada por una fina calavera y dural-espesor. Sin embargo, en los animales de experimentación más grandes como cerdos 1, 4, 8, ovejas 32, y primates no humanos, el espesor considerable de estas estructuras requiere el uso de instrumentos sólidos (tabla de materiales) y puntos de entrada apropiados para la eliminación de hueso del cráneo (figura 2). Se requieren conocimientos de restringir hojas durales (Figuras 3 y 4) antes de se puede acceder al SNC y extraerse de forma segura el cerebro.

Se recomienda dejar intacta la duramadre durante la extracción del hueso del cráneo, ya que esto va a proteger el cerebro subyacente del daño. Transcardial fijación anterior 20 puede endurecerse y del mismo modo SLIghtly reducir el tamaño del cerebro, lo que permite el proceso de eliminación dural hueso y para llevar a cabo con más facilidad y seguridad. Una característica especial del cráneo cerdo, en contraste con las ovejas y primates no humanos, es la expansión progresiva del seno frontal con la edad, que puede ser ventajoso en el proceso de eliminación de hueso del cráneo (Figura 2). La técnica presentada en consecuencia se puede utilizar en todas las especies animales grandes, pero sólo en los cerdos, especialmente aquellos mayores de 6 meses, se desarrollará el seno frontal suficiente para proporcionar ayuda en el proceso de eliminación de hueso del cráneo. Finalmente, seccionamiento completa de la médula espinal durante el proceso de decapitación (Figura 1B) y seccionamiento completa de la tentorium cerebelosa dural (Figura 3B) antes de la liberación cerebro final están absolutamente necesario a fin de evitar daños posteriores para el tronco cerebral.

En algunos estudios, puede ser ventajoso tener una parte de la médula espinal cervical rostral unido al cerebro.Esto se puede obtener mediante la colocación de la incisión decapitación inicial (Figura 1A) más caudalmente en el cuello, permitiendo el acceso a la médula espinal a través de un disco cervical intervertebral en lugar de la unión craneocervical, como se demuestra en el vídeo actual. La eliminación de hueso posterior entonces tendrá que empezar desde la lámina caudal expuesta. Aparte de esto, la técnica será similar, por lo que es importante recordar que la médula espinal debe ser seccionado por completo antes de la decapitación se completa con extensión contundente a nivel de sección (Figura 1). El procedimiento actual se demuestra en animales no fijadas, como el estudio de fondo real necesaria análisis por HPLC de la pituitaria derivada. Nótese, sin embargo, que la misma técnica exacta se utiliza en animales transcardially obsesionados con paraformaldehído 3, 5, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 31, aunque todos los procedimientos en tal caso deben llevarse a cabo bajo una buena ventilación proporcionada por una campana de humos 20. La elección de la disección nativa frente en -fixation toto y posterior disección por lo tanto puramente debe depender del procedimiento de post-procesamiento necesario (por ejemplo, la histología convencional, inmunohistoquímica, HPLC, y FISH) 32.

Como se discutió en los párrafos siguientes, hemos preferido utilizar herramientas quirúrgicas no motorizados. El cráneo de cerdos de edad por encima de 1-2 años puede, sin embargo, ser tan robusta que la eliminación cráneo con el instr demostradoumentos no es posible, lo que requiere el uso de instrumentos motorizados, tales como craniotomes, sierras oscilantes, y los taladros eléctricos 32. En ese caso, todavía se recomienda seguir los pasos protocolo indicado anteriormente, aprovechando de este modo los puntos de entrada cráneo de origen natural y el desarrollo seno frontal. El presentado el acceso anterior a la base del cráneo es elegante y fácil, pero la liberación romo descrita de los bulbos olfativos debe realizarse sin la guía visual directa (Figura 3D), en contraste con la más liberación posterior del cerebro (Figura 3EF). Por consiguiente, la parte ventral de los bulbos olfativos puede sufrir algún grado de daño incontrolado que sólo puede ser evitada, si es necesario, mediante la perforación de la base del cráneo anterior fuera ventral a las bombillas antes de que se inicie el proceso de liberación. Tenga en cuenta que la manipulación, especialmente de tejido cerebral no fijado durante la extracción cráneo, se ha indicado que resulte en la histologi Cal artefacto neurona oscuro, que puede conducir a conclusiones erróneas en los estudios neurotoxicológicos 33.

El proceso de eliminación de hueso del cráneo también puede realizarse con maquinaria como craniotomes, sierras oscilantes, y los taladros eléctricos 32. Estos pueden acelerar el proceso, sino que también aumenta el riesgo de daños a las estructuras neuronales subyacentes. Dicho equipo también puede ser costoso y más probable es que no esté disponible para la mayoría de los laboratorios. Por tanto, hemos preferido para demostrar el procedimiento actual utilizando equipo quirúrgico no motorizado (Tabla de Materiales) que es fácil de acceder y usar.

La técnica descrita e ilustrada será, cuando se utiliza correctamente, habilite la exposición y la eliminación del cerebro de cerdo postmortem, pituitaria, y / o la médula espinal cervical (Figura 5), resultando en piezas de tejido que están bien adaptados para su posterior análisis macroscópico"xref"> 5, 6, 19, 26, 31, el seccionamiento en losas cerebrales 28, y posterior análisis químico y / o procesamiento histológico 6, 14, 15, 16, 17, 25, 26, 27, 31.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen con gratitud la ayuda experta de la señora Trine W. Mikkelsen, la señora Lise M. de montaje, y el personal de Påskehøjgaard. El Consejo Danés de Investigación Médica, la Fundación Lundbeck, y la Fundación Novo Nordisk con el apoyo financiero del estudio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heavy Scalpel Handle #4 FST (Fine Science Tools) 10008-13 Good for skin incision and soft tissue removal
Non-Sterile Scalpel Blades #23 FST  10023-00
Scalpel Handle #7 FST  10007-12 Optimal for dural incision and precision work
Non-Sterile Scalpel Blades #11 FST  10011-00
Surgical Forceps FST  11024-18 The tip of the surgical forceps ensure a firm grip 
Kerrison Bone Punch Aesculap Neurosurgery FF713R Must be robust, bite size 3-5 mm
Bone Rongeur Aesculap Neurosurgery MD615 Must be robust, bite size 15 x 5 mm
Bone Rongeur Aesculap Neurosurgery FO551R Must be robust, bite size 25 x 15 mm 
Bone Chisel Lawton 67-0335 The size of the chisel head should not exceed 20 mm
Mallet (Hammer) Millarco 5624108 Weigth 300 g, length 30 cm, head hit area size 2 x 2 cm
Micro-Scissor FST  14002-14  
Dissector Aesculap Neurosurgery OL165R
Göttingen minipigs Ellegaard Göttingen Minipigs A/S, Denmark
Euthanimal pentobarbital
Ketamine Pfizer
Midazolam  Hameln Pharmaceuticals

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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