ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי וכמותי של גרגר גרגר הלחץ בתאי יונקים לאחר התאים מאותגרים עם חיידקים ומספר לחצים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מנת לחקור את התגובה גרגר הלחץ הסלולר במגוון רחב של אינטראקציות מארח חיידקי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הדמיה פלואורסצנטית של רכיבים סלולריים היא כלי יעיל לחקור אינטראקציות מארח פתוגן. פתוגנים יכולים להשפיע על מאפיינים שונים של תאים נגועים, כולל אולטרה אולטרה, ארגון רשת cytoskeletal, כמו גם תהליכים סלולריים כגון גרגר מתח (SG) היווצרות. האפיון של כמה פתוגנים לחתר תהליכים מארח הוא חלק חשוב ואינטגרלי של השדה הפתוגנזה. בעוד שפנוטיפים משתנים עשויים להיות גלויים לעין, הניתוח המדויק של ההבדלים האיכותיים והכמותיים במבנים הסלולאריים הנגרמים על ידי אתגר הפתוגן הוא הכרחי להגדרת הבדלים משמעותיים בין דגימות ניסוייות ובקרה. גיבוש SG הוא תגובת מתח משמרת אבולוציונית המוביל לתגובות אנטי ויראליות ונחקרה זמן רב תוך שימוש בזיהומים ויראליים 1 . גיבוש SG משפיע גם מפלי איתות עשוי להיות conseq אחרים עדיין לא ידוע2 . אפיון תגובה זו ללחץ לפתוגנים, מלבד וירוסים, כגון פתוגנים חיידקיים, הוא כיום תחום מחקר חדש. לעת עתה, ניתוח כמותי ואיכותי של היווצרות SG עדיין לא נעשה שימוש שגרתי, גם במערכות ויראלי. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה עבור גרימת ואפיון SG המבנה בתאי נגוע ובתאים נגועים פתוגן חיידקי cytosolic, אשר משפיע על היווצרות של SG בתגובה למתח אקסוגני שונים. ניתוח של היווצרות SG והרכב מושגת באמצעות מספר סמנים שונים SG גלאי נקודה התוספת של ICY, כלי ניתוח קוד פתוח התמונה.

Introduction

ויזואליזציה של אינטראקציות בין מחוללי מארח-פתוגן ברמה התאית היא שיטה רבת עוצמה להשגת תובנות לגבי אסטרטגיות פתוגניות ולזיהוי מסלולים סלולריים מרכזיים. ואכן, פתוגנים יכולים לשמש כלים כדי לאתר מטרות או מבנים סלולריים חשובים, כמו פתוגנים התפתחו כדי לחתור התהליכים הסלולר המרכזי כאסטרטגיה ההישרדות שלהם או התפשטות. ויזואליזציה של רכיבים סלולריים יכולה להיות מושגת על ידי רקומביננטי להביע fluorescently מתויג חלבונים מארח. בעוד זה מאפשר ניתוח בזמן אמת, הדור של שורות תאים עם ספציפית מתויג חלבונים מארח הוא מאוד מייגע עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. יותר נוח הוא זיהוי של גורמים סלולריים באמצעות נוגדנים ספציפיים, כי גורמים מרובים המארח ניתן לנתח בו זמנית ואחד אינו מוגבל לסוג תא מסוים. החיסרון הוא רק תצוגת סטטי ניתן ללכוד כמו ניתוח immunofluorescence מחייב fixat תא המארחיוֹן. עם זאת, יתרון חשוב של הדמיה immunofluorescence היא שזה בקלות משאיל את עצמו הן ניתוח איכותי וכמותי. זה בתורו יכול לשמש כדי להשיג הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית כדי לספק תובנות חדשות אינטראקציות מארח פתוגן.

ניתוח פלורסנט תוכניות ניתוח הם כלי ניתוחי רב עוצמה לביצוע 3D ו 4 D ניתוח. עם זאת, העלות הגבוהה של התוכנה ותחזוקה שלה לעשות שיטות המבוססות על תוכנות קוד פתוח חינם יותר אטרקטיבי. ניתוח תמונה זהיר באמצעות ביו ניתוח תוכנה הוא בעל ערך כפי שהוא מבסס ניתוח ויזואלי, כאשר הקצאת משמעות סטטיסטית, מגביר את הביטחון בנכונות פנוטיפ נתון. בעבר, SGs נותחו באמצעות תוכנת ImageJ חינם, אשר מחייב זיהוי ידני של SGS 4 בודדים. כאן אנו מספקים פרוטוקול אינדוקציה וניתוח של SG SG הסלולר בהקשר של bacזיהומים טרליים באמצעות קוד פתוח חופשי ניתוח תמונה תוכנה ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). תוכנת ניתוח ביו התמונה יש מובנית גלאי נקודה תוכנית כי הוא מתאים מאוד לניתוח SG. זה מאפשר כוונון עדין של תהליך זיהוי אוטומטי באזורים ספציפיים של ריבית (ROIs). זה מתגבר על הצורך בניתוח ידני של SGs הפרט מסיר הטיה הדגימה.

רבים סביבתיים מדגיש לגרום היווצרות של SGS, שהם שלב cytosolic צפופה שלב, מבנים שאינם קרום של 0.2 - 5 מיקרומטר בקוטר 5 , 6 . תגובה סלולרית זו נשמרת בצורה אבולוציונית בשמרים, בצמחים וביונקים, והיא מתרחשת כאשר תרגום החלבון העולמי מעוכב. זה כרוך צבירה של מתחמי היזום התרגום נתקע לתוך SGs, אשר נחשבים מקומות החזקת עבור mRNAs translationally-inactive, המאפשר תרגום סלקטיבי של קבוצת משנה של mRNAs הסלולר.עם הסרת הלחץ, SGs לפזר את שיעורי הגלובלית של סינתזת החלבון לחדש. SGs מורכבים תרגום התארכות גורמים הארכה, חלבונים המעורבים RNA מטבוליזם, RNA מחייב חלבונים, כמו גם חלבונים פיגומים וגורמים המעורבים תא המארח איתות 2 , למרות ההרכב המדויק יכול להשתנות בהתאם ללחץ מוחל. גורמים סביבתיים אשר מעוררים היווצרות SG כוללים רעב חומצות אמינו, קרינה UV, הלם חום, הלם אוסמוטי, מתח reticulum endoplasmic, היפוקסיה וזיהום ויראלי 2 , 7 , 8 . התקדמות רבה נעשתה בהבנת האופן בו וירוסים מעוררים וגם מערערים את מבנה ה- SG, בעוד שרק מעט ידוע עדיין על האופן שבו פתוגנים אחרים, כגון פתוגנים, חיידקים פטרייתיים או פרוטוזנים, משפיעים על תגובת המתחים הסלולרית 1 , 7 .

שיגLla flexneri הוא גרם שלילי pathulative cytosolic הפתוגן של בני האדם ואת הגורם הסיבתי של שלשולים חמורים או shigellosis. Shigellosis הוא נטל בריאות הציבור העיקרי ומוביל 28,000 מקרי מוות בשנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 של 9 , 10 . ס flexeneri מדביק את אפיתל הקולוני ומתפשט תא לתא ידי חטיפת המרכיבים cytoskeletal של המארח 11 , 12 . זיהום של אפיתל תומך שכפול של ס flexeneri בתוך cytosol אבל מקרופאגים נגועים למות דרך תהליך דלקתיות המוות הנקרא pyroptosis. זיהום מוביל לגיוס מסיבי של נויטרופילים ודלקת חמורה המלווה בחום, מתח חמצוני והרס רקמות. לכן, בעוד תאים נגועים כפופים ללחצים פנימיים המושרה על ידי זיהום, כגון הפרעות Golgi, מתח genotoxic ו סידור מחדש של cytoskeletalS, תאים נגועים הם גם נתון ללחץ סביבתי עקב תהליך דלקתי.

אפיון ההשפעה של זיהום S. flexneri על היכולת של תאים להגיב על מדגיש סביבתי באמצעות מספר סמנים SG הוכיח כי זיהום מוביל הבדלים איכותיים כמותיים הרכב SG 3 . עם זאת, מעט ידוע על פתוגנים חיידקים אחרים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה של זיהום של תאים המארח עם הפתוגן cytosolic S. flexneri , הדגשת תאים עם מדגיש סביבתי שונים, תיוג של רכיבי SG, ואת ניתוח כמותי וכמותי של SG הרכב והרכב בהקשר של נגוע ותאים שאינם נגועים. שיטה זו מיושמת באופן נרחב פתוגנים חיידקים אחרים. בנוסף, ניתוח התמונה של היווצרות SG עשוי לשמש זיהומים על ידי וירוסים או פתוגנים אחרים. זה יכול לשמש כדי לנתח SGהיווצרות זיהום או השפעת זיהום על היווצרות SG בתגובה ללחץ אקסוגני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת חיידקים ותאים מארחים

  1. העברה 12 או 14 מ"מ מכסה זכוכית מחליק גם 24 או 12 צלחות היטב, בהתאמה, עם פינצטה סטרילית, לספור אחד לכל תנאי הניסוי. לעקר אלה על ידי טיפול UV ברדס תרבות רקמה במשך 15 דקות.
    הערה: לכלול בארות בקרה לאתגר חיידקי עבור אינדוקציה SG ידי מדדים אקסוגניים.
  2. לקבלת צלחת 24 גם עם coverslips 12 מ"מ, זרע 1 x 10 5 תאים יונקים ( למשל, תאים הלה) על coverslips; לחץ על coverslips למטה עם קצה פיפטה סטרילית. בואו תאים לדבוק לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 תרבות רקמה חממה בינוני בינוני מתאים לכל סוג התא.
    הערה: תאים צלחת כך מפגש של תאים הוא בין 40-60% למחרת.
    1. עבור תאים Hella, דגירה ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם לא חיוניים חומצות אמינו (NEAA) ו 10% decomplemented עוברית עגל בסרום (FCS).Decomplement FCS ידי חימום במשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס אמבט מים, מסתחרר את הסרום פעם אחת אחרי 15 דקות.
  3. כדי לפצח את החיידקים, השתמש קצה פיפטה סטרילית להסיר כמות קטנה ממלאי גליצריול חיידקי (20% גליצרול) מאוחסנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס ומניחים אותו על צלחת שכותרתו. השתמש בלולאה סטרילית להפיץ את החיידקים על כ 10% של הצלחת. השתמש לולאה סטרילית חדשה לגרור אותו דרך למרוח לעשות 3 שורות מקבילות, חצי צלחת ארוכה. פס דרך שורות אלה מכסה את שאר הצלחת. דגירה צלחת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
    1. בחר מושבה חיידקים אחת ( למשל, ס 'flexneri ) מהצלחת טרי- out. הימנע עבודה עם מושבות חיידקים מעל 1 בשבוע.
    2. עבור ס. Flexneri זן M90T, לחסן מושבה אדומה מ טרי מפוספס החוצה אגר סויה טריפטית-0.1% קונגו צלחת אגר אדום לתוך 8 מ"ל של מרק סויה טריפטית בצינור 15 מ"ל; להדק את המכסה דגירה רועד ב 222 סל"ד O / N ב 306; ג.
      זהירות: אין להשתמש מושבות גדולות לבן כפי שהם איבדו את ארסיות פלסמיד והם שאינם זיהומיות.

2. אתגר בקטריאלי של תאים המארח

  1. הכן חיידקים למקסם פוטנציאל ההדבקה.
    1. עבור S. flexneri , חיידקים תת-תרבויות על ידי הוספת 150 μL O / N התרבות כדי 8 מ"ל סויה אגר טריפטית דגירה רועד 222 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס לשלב מאוחר מעריכי (~ 2 שעות) כדי לגרום ביטוי גנים ארסיות ולשפר את הזיהום.
      1. כאשר התרבות היא בצפיפות אופטי בין 0.6 ו 0.9 (נמדד ב 600 ננומטר), להעביר 1 מ"ל של התרבות לתוך צינור 1.5 מ"ל. חיידקים גלולה עבור 2 דקות ב 8,000 xg ו resuspend בזיהום בינוני (DMEM עם NEAA, חסר FCS) ב OD 600 = 1. לכן, אם 600 OD הוא 0.85, resuspend μL 850.
        הערה: עבור S. flexneri, ב OD 600 = 1, יהיו 8 x 10 8 חיידקים לכל מ"ל כאשרמתורבת בינוני 8 מ"ל. ריבוי זיהום (משרד הפנים) של 20 הוא מתאים. עבור פתוגנים אחרים, מספר החיידקים לכל מ"ל ב OD 600 ואת משרד הפנים המתאים צריך להיקבע באופן אמפירי.
    2. כדי לשפר את האינטראקציה בין חיידקים ומארחים, חיידקים עם פולי-ליזין (PLL).
      הערה: טיפול PLL של S. flexneri לא השפיע על הדינמיקה SG. פתוגנים אחרים צריכים להיות מוערכים עבור amenability שלהם לטיפול PLL.
      1. כדי חיידקים המעיל עם PLL, צנטריפוגות 1 מ"ל של תרבות חיידקים במשך 2 דקות ב XG 8000 ולאחר מכן resuspend גלולה ב 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PLL ב-מלחץ שנאגרו פוספט (PBS) ב OD 600 = 1.
      2. מוסיפים את הפתרון החיידקי למאכל קטן, כמו גם בתוך צלחת 12 גם, ו דגירה ב RT (~ 20 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה על צלחת שייקר.
      3. חיידקים גלולה עבור 2 דקות ב XG 8000, להסיר את PLL עודף. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל PBS אד לחזור על שלב כביסה פעמיים. לאחר לשטוף הסופי, resuspend בזיהום בינוני ב OD 600 = 1.
        הערה: כאן, בינוני זיהום עבור S. flexneri הוא בינוני תא המארח עם 20 מ"מ HEPES w / o FCS.
  2. הכן תאים לאתגר חיידקי.
    1. הסר בינוני מ תאים יונקים יונקים באמצעות משאבת שאיבה. הוספת 500 μL RT המדיום תא hela לשטוף את התאים, מערבולת, להסיר בינוני באמצעות משאבת יניקה, ולהחליף עם בינוני μL RT בינוני זיהום ( למשל , בינוני תא המארח עם 20 מ"מ HEPES w / o FCS).
    2. הערה: עבור כל השלבים כביסה, לעבוד במהירות ולעבד רק עד 4 coverslips בכל פעם, כדי למנוע ייבוש של התאים.
  3. האתגר הכין תאים HeLa עם חיידקים להדביק 20 - 50% של התאים.
    הערה: הזמן המתאים משרד הפנים צריך להיקבע עבור כל מיני חיידקי. בדרך כלל, התחלה טובה היא 30 דקות ב 37° C עם משרד הפנים של 10.
    1. עבור S. flexneri, האתגר תאים תאים HeLa באמצעות אחת משתי השיטות (שלב 2.3.1.1 או 2.3.1.2).
      1. ספין שאינם PLL שטופלו חיידקים (20 μL של OD 600 = 1 / טוב של צלחת 24 גם במדיום 500 μL) על תאים 10 דקות ב 13000 x גרם.
      2. הוסף חיידקים מצופים PLL (15 μL של OD 600 = 1 / טוב של צלחת 24 גם במדיום 500 μL) במשך 15 דקות ב RT כדי לאפשר חיידקים להתיישב על תאים.
    2. אפשר זיהום להתרחש על ידי הצבת תאים עם חיידקים התיישבו לתוך 37 ° C רקמות תרבות חממה במשך 30 דקות.
      הערה: עבור נקודות זמן קצרות, לסנכרן זיהום S. flexneri ידי הצבת צלחות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 15 דקות במקום בחממה תרבות רקמות.
  4. עצור זיהום על ידי שטיפת תאים.
    1. כדי לשטוף תאים ולהסיר חיידקים עודפים, להסיר את המדיום באמצעות משאבת שאיבה, להוסיף 1 מ"לPrewarmed טריים (37 מעלות צלזיוס) בינוני תרבות הלה (DMEM, FCS 10%, NEAA). מערבולת בינוני, להסיר ולהחליף בינוני טרי. לחזור פעמיים ולהשאיר בינוני טרי על התאים.
      1. עבור S. flexneri , או חיידקים תאיים אחרים, לאחר ההדבקה של תאים Hella ו שוטף, להחליף בינוני עם בינוני רגיל רקמת התרבות המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין להרוג חיידקים תאיים ולמנוע הפלישה תא נוסף.
        הערה: אין להוסיף אנטיביוטיקה במדיום עבור חיידקים תאיים.
  5. דגירה חיידקים עם תאים עבור הכמות הרצויה של זמן בחממה תרבות רקמות.
    הערה: עבור S. flexneri , זיהום עשוי להיות כל עוד 6 שעות בהתאם לסוג התא. עבור תאים Hella, בואו זיהום להמשיך 1.5 - 2 שעות לפני הוספת מדגיש אקסוגניים כדי לגרום היווצרות SG. עבור זיהומים Caco-2, בהם Shigella מתפשט תא לתא, להדביק במשך 30 דקות עד 6 שעות לפני הוספת מתח אקסוגני. לִספִירַת הַנוֹצרִיםLl יכול להיות קבוע בשלב זה מבלי להוסיף מדגיש אקסוגני כדי להעריך את היווצרות של SGs כתוצאה של זיהום חיידקי (במקרה זה, המשך סעיף 4).

3. השראה גרגר מתח על ידי תוספת של אקסוגניים Stressors

  1. הסר את המדיום מ נגועים ולא נגועים תאים hella באמצעות משאבת שאיבה, להחליף בינוני עם 500 μL של המדיום המתאים עם או בלי הלחץ ו דגירה.
    הערה: התנאים המניבים מתח כוללים את הפעולות הבאות (ראה להלן). לטיפולים נוספים ראה Kedersha et al . 13 .
    1. לקבלת טיפול בהלם חום, להשתמש בינוני רגיל המכיל 20 מ"מ HEPES ומניחים את הצלחת לתוך אמבט מים 44 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. עבור clotrimazole (גורם ללחץ המיטוכונדריאלי), להשתמש בינוני רגיל ללא FCS עם clotrimazole 20 מיקרומטר ו דגירה של חממה תרבות רקמות עבור 1 ח.
      הערה: אחסן aliquots לשימוש יחיד של 20 מטרM clotrimazole המניות ב sulfoxide דימתיל (DMSO) ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 4 חודשים. השתמש ברכב DMSO לתאי בקרה.
    3. עבור ארסניט (גורם ללחץ חמצוני) טיפול, להשתמש בינוני רגיל עם ארסניט 0.5 מיקרומטר ו דגירה בתרבות רקמה חממה עבור 1 ח.
      הערה: חנות aliquots לשימוש יחיד של 0.5 מ"מ מלאי arsenite ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      זהירות: Clotrimazole ו ארסניט מזיקים ומסוכן לסביבה ויש להיפטר כראוי.
    4. עבור Des-Methyl Des-Amino (DMDA) טיפול פטמין (מעכבת ייזום תרגום אוקריוטים), להשתמש בינוני רגיל עם 50-200 ננומטר DMDA-pateamine ו דגירה בתרבות רקמה חממה עבור 1 שעות.
      הערה: חנות DMDA-pateamine ב -80 ° C. חנות ריאגנטים כמו aliquots קטן כדי למנוע הקפאה הפשרה.

4. קיבוע ו Immunofluorescence ניתוח של גרגר גיבוש

הערה: לעבד את הבקרה וCoverslips ניסיוני באותו זמן, כדי למנוע הבדלים מכתים שעלולות להשפיע על ניתוח התמונה בשלבים הבאים. דגימות הבקרה אינן כוללות זיהום עם וללא מתן טיפול ב- SG, ודגימות נגועות ללא וללא טיפול ב- SG.

  1. הסר בינוני לחלוטין באמצעות משאבת שאיבה לתקן דגימות על ידי הוספת 0.5 מ"ל RT 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS. דגירה של 30 דקות ב RT.
    זהירות: PFA מזיק למפעיל ולסביבה. קח מידה נאותה כדי להגן על המטפל ולהשליך עם פסולת כימית.
    הערה: לחלופין, לתקן במשך 15 דקות ולאחר מכן להחליף עם -20 מעלות צלזיוס מתנול prechilled למשך 10 דקות כדי לשמור על לוקליזציה cytoplasmic יותר של סמנים SG 13 .
  2. הסר את PFA עם פיפטה והשליך את הנוזל במיכל פסולת המתאים. לשטוף את coverslip עם 1 מ"ל טריס, שנאגרו מלוחים (כפות: 25 מ"מ טריס, pH 7.3, 15 mM NaCl). דגירה coverslip במשך 2 דקות עם רעד עדיןעל צלחת שייקר במהלך כביסה.
  3. הסר כפות לחלוטין באמצעות משאבת יניקה ולהוסיף 500 μL 0.3% Triton-X100 ב כפות במשך 10 דקות permeabilize התאים.
  4. הסר פתרון permeabilizing עם משאבת שאיבה. החלף עם 1 מ"ל TBS, מערבולת צלחת בעדינות, להסיר כפות ידי יניקה, ולהוסיף פתרון 1 מ"ל חסימת (5 FCS ב TBS) במשך שעה 1 ב RT.
  5. הכן את הפתרון נוגדן העיקרי (דילול 1: 300) ב FCS 5% ב TBS. חישוב 50 μL לכל 12 coverslip מ"מ ולעשות מספיק עבור כל coverslips אצווה אחת.
    הערה: הנוגדנים העיקריים הנפוצים המשמשים את היעד G3BP1, eIF3b ו- TIA1.
  6. ספוט 50 μL של תערובת הנוגדן העיקרי על סרט פרפין פלסטיק (parafilm) מוקלט היטב על הספסל או החדר.
    הערה: רשימה של סמנים SG קנוני מסופקים בטבלה של חומרים , אבל הרכב SGs עשוי להיות תלוי בלחץ מוחל. סמנים אחרים של SG מפורטים Kedersha et al. 13 S. flexneri המפורטים בטבלה 1 .
  7. להרים את coverslip עם פינצטה, dab קצה coverslip על הרקמה, לשחרר בקצרה את פינצטה כדי להסיר נוזלים עודפים, בעדינות במקום הפנים כלפי מטה על הירידה. דגירה coverslips עבור 1.5 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר לח.
    הערה: כדי להכין תא לח, במקום רקמות prewetted לאורך הקצוות של החדר סגור היטב עם שורות parafilm פלסטיק.
  8. העברת coverslip כל עם פינצטה לתוך באר של צלחת חדשה 24 גם מלא 1 מ"ל TBS; דגירה עם רעד עדין על צלחת שייקר במשך 5 דקות. יניקה את הכפות בכל היטב באמצעות משאבת שאיבה, להחליף עם 1 מ"ל TBS ומניחים בחזרה על צלחת שייקר במשך 5 דקות. חזור לשטוף פעם נוספת.
    הערה: שימוש חוזר parafilm ידי הסרת הנוזל עודף עם רקמה לשטוף את פני המים עם מים. ודא את הסרט פרפין יבש לחלוטין לפני usinG עבור שלב מכתים הבאים.
  9. הכן את הפתרון נוגדנים משני ב כפות (דילול 1: 500 - 1: 2,000). כדי הכתם את הגרעין ואת החיידקים, להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI לתערובת. כדי הכתם actin, להוסיף phalloidin פלואורסצנטי. פיפטה 50 μL משניים נוגדנים משני על הסרט פרפין פלסטיק.
    הערה: שימוש נוגדנים משני חוצה מטוהרים מאוד חמור סופג מומלץ ללימודי שיתוף לוקליזציה של סמנים שונים SG כאשר G3BP1 (נוגדנים עז) משמש. בחר נוגדנים משני שכותרתו fluorescently עם ספקטרה שאינם חופפים. EIF3b בבירור מכתים את הציטופלסמה של תאים ולכן הוא סמן טוב לתאים תאים. הכתם אקטין נוספת מסייעת לתא תאים באתרי תא אל תא ואזורים של כניסת חיידקים.
  10. להרים את coverslip עם פינצטה, dab קצה coverslip על הרקמה, משחרר בקצרה את פינצטה, כדי להסיר עודף נוזלים. בעדינות במקום coverslip פניו כלפי מטה על ירידה ו דגירה coverslipsבחושך במשך שעה אחת ב RT.
  11. השתמש פינצטה למקום coverslip בחזרה לתוך צלחות 24 גם מלא טרי 1 מ"ל PBS. ודא coverslip מכוסה במלואו על ידי PBS. שטפו את התאים 3x עם רעד עדין במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: שמור את הצלחת במהלך הכביסה מתחת לכסות כדי להגן מפני האור כמו fluorophores של הנוגדנים משני הם רגישים לאור.
  12. בקצרה לטבול את coverslip לתוך מים deionized להסיר את המלח, dab יבש מהקצה על רקמה ואת הר coverslip על 5 μL של המדיום הרכבה פלואורסצנטי על שקופית זכוכית. חותם את coverslip לפני הדמיה באמצעות לק. שמור שקפים על 4 מעלות צלזיוס לטווח קצר (שבוע) או ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך (חודש).
    הערה: הימנע מבעיות אוויר בעת איטום, מכיוון שהדבר יפגע באיכות התמונה.

5. פלואורסצנטי הדמיה

הערה: עיין במדריך למשתמש של המיקרוסקופ לאופטימיזציה של המערכת.

  1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal באמצעות או 40 או 63X שמן טבילה העדשה. בחר את ערוצי הניאון הרצוי לרכישת תמונות. בעת שימוש במספר ערוצי ניאון, בחר במצב רכישה עוקבת.
    הערה: התחל עם דגימות ניסיוני שבו SGs כבר המושרה החזק ביותר כדי למנוע overexposure על דגימות הבאות. הקפד לא להיות overexposed SGs לאורך כל עומק התא.
    1. הגדר גודל סיביות של 12 או גבוה יותר בתוך הגדרות מיקרוסקופ כדי להבטיח דיוק של ניתוח התמונה.
    2. הגדר את ערימות התמונה כדי לכסות את כל עומק התא. בדוק את הערוצים השונים עבור סמנים שונים SG כדי להבטיח את כל טווח כלול. הגדר את תחילת הערימה בבסיס התאים ואת החלק העליון של ערימות בגובה בחלק העליון של התאים שבו לא עוד סמנים SG נצפים.
    3. לרכוש את הערימה. שמור את גובה המחסנית זהה לכל התמונות.
      הערה: אל תעשה זאתלשנות את הגדרות הרכישה בין שליטה דגימות ניסיוני שישמש להשוואה הבאה.

6. ניתוח תמונה

הערה: כאן, ניתוח SG על התמוטטות ערימות באמצעות ICY תוכנה חופשית מתואר. ניתוח תמונה של שחזור 3D עשוי להיעשות גם באמצעות תוכנות מיוחדות אחרות. זיהוי SG יכול להתבצע באמצעות זרימת עבודה אוטומטית לחלוטין שהוקמה עבור פרוטוקול זה (זמין ב http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). כדי להשתמש בפרוטוקול זה, הגרעינים צריכים להיות מוכתמים בכתם דנ"א עבור התוכנה כדי למצוא את המרכז של כל תא, ואת הקצוות התא צריך להיות מסומנת על ידי סמן cytoplasmic (כגון eIF3b) או כתם actin עבור התוכנה כדי לזהות את גבולות התאים. זרימת העבודה האוטומטית יכולה לשמש לאימות תוצאות נגזרות באופן ידני או ישירות לניתוח כאשר גבולות התאים מזוהים בביטחון גבוה,Stly תלוי בצפיפות של תאים ואת סמן המשמש כדי לזהות את גבולות התאים.

  1. באמצעות ImageJ או פיג 'י, לכווץ את ערימות התמונה (תמונה> ערימות> תחזית Z) ולשמור כקובצי .tiff.
    הערה: צור תיקייה חדשה עבור כל תמונה כמו תוכנת ניתוח התמונה יהיה קישור התוצאות שלה לאתר של התמונה המקורית.
  2. טען תמונה ניסויית ותמונה ניסיונית לפלטפורמת ניתוח התמונה (File> Open). עבור אל החלון רצף. גלול מטה את "Lookup Table" לפרמטרים של הערוץ.
  3. בטל את כל הערוצים על ידי לחיצה על תיבת הסימון של כל כרטיסיות הערוץ. לחץ על ערוץ 0 ולאחר מכן בחר את הצבע המועדף על ידי לחיצה על פס הצבע לעיל. הגדל את עוצמת הערוץ לפי הצורך כדי לראות את כל המבנים על ידי לחיצה והעברה של הקו בשדה האינטנסיביות. חזור על זה לכל הערוצים.
    הערה: בטל ערוצים שאינם נדרשים למשימה מסוימת כדי למזער את ההטיה בניתוח המדגם.
  4. גְלִילָהלמעלה ובתוך הכרטיסייה בד, התקרב ל -10 תאים לכל שדה על-ידי התאמת לשונית הזום.
  5. השתמש בכלים של מצולע (בסרגל העליון) כדי להגדיר גבולות תאים של תאים בתמונה. השתמש בכתם אקטין או סמן cytosolic עבור התיחום גבול התא ( למשל eIF3b).
    1. לחץ על הפונקציה פוליגון בתוך "קובץ & החזר ההשקעה" כלים. התחל סימון על ידי לחיצה על התא ולאחר מכן להאריך את הקו על ידי יצירת עוגנים באמצעות לחיצה חוזרת סביב הגבול התא. כדי לסיים את החזר ה- ROI, לחץ שוב על פונקציית המצולע בתוך כלי "קובץ והחזר ROI".
      הערה: זיהוי תת אוכלוסיות של תאים מסומן כי הם נגועים. המדגם מורכב מתערובת של תאים נגועים ולא נגועים. כדי לזהות חיידקים, או להשתמש כתם DAPI או חיידקים ניאון (כגון חיידקים להביע GFP). להגביר את האינטנסיביות כדי להבטיח כי כל החיידקים נראים.
    2. כדי לתת החזר ROI, עבור לחלון ההחזר על ההשקעה מימין ומשמאלCk על התא עניין של התמונה. פעולה זו תדגיש את החזר ה- ROI המתאים בכרטיסייה החזר ROI. לחץ פעמיים על שם החזר ROI ולשנות את השם ( למשל תא נגוע # 1).
      הערה: אם יש להשתמש בתמונה אחת כדי לנתח תאים נגועים ולא נגועים, קל יותר לשמור את התמונה בשתי תיקיות נפרדות ולסמן את התאים הנגועים והבלתי נגועים בנפרד, תוך יצירת שני גיליונות אלקטרוניים שונים, דבר שיאפשר ניתוח יותר מאוחר.
  6. פתח את יישום גלאי נקודה בתוך "איתור & מעקב" הכרטיסייה (פס עליון). בכרטיסייה קלט, התמונה הנוכחית תיבחר. אל תשנו דבר. בכרטיסייה עיבוד מראש, בחר את הערוץ שיש לנתח.
    הערה: ניתן לנתח רק ערוץ אחד בכל זמן נתון. ניתוח אצווה ניתן לבחור כאן אם אחד משתמש רצף ניתוח אוטומטי לחלוטין אשר הפרמטרים נבדקו כדי לתת תוצאות מספקות.
    1. בתוך הכרטיסייה גלאי, בחר "Deכתמים בהירים על רקע כהה ", ולאחר מכן בחרו את הסולם והרגישות המתאימים, ועשו זאת על ידי בדיקה של הגדרות שונות ובדיקה חוזרת של זיהוי נקודה הן בבקרה והן בדגימות הניסוי.
      הערה: לקבלת תמונה עם רזולוציה של 2,048 x 2,048 וגודל פיקסלים של 0.12 מיקרומטר 2 , סף ברמה 2 עם רגישות של 25 עד 100 מתאים בדרך כלל, אך כל סמן SG צריך להיבדק באופן אמפירי. הגדרת זיהוי נקודה כך במדגם בקרת הלא מטופלים, כתמים לא מזוהים, ואילו במדגם ניסיוני עם SGS, כל SGs קטנים וגדולים נספרים.
    2. בכרטיסייה החזר ROI, בחר את ההחזר על ההשקעה המוצע מתוך רצף. בכרטיסייה סינון, בחר ללא סינון. בכרטיסייה פלט, בחר את הפלט המתאים.
      הערה: בחירה באפשרות אפשר קובץ ספציפי מסייעת לשמירת תנאי זיהוי שונים או ערוצים שונים. בחירה כדי לייצא את התמונה הבינארית ואת התמונה המקורית עם החזרים ROI וזיהוי הוא helPful עבור ניתוח בקרת איכות.
    3. בחר "הסר כתמים קודמים שניתנו כחזרי ROI". בחר את התיקייה לשמירת הקובץ על ידי לחיצה על הלחצן "ללא קובץ נבחר". בתוך הכרטיסייה תצוגה, בחר את האפשרויות הרצויות.לחץ על "התחל גילוי".
      הערה: תיקייה עם השם והמיקום שנבחר תיווצר המכילה את אפשרויות ההדמיה המיוצאות. תמונות אלה יחליפו עבור כל מצב חדש שנבדק. כדי לשמור את התמונות, או לשנות את שם התיקייה כך תיקייה חדשה תיווצר או להעביר את התמונות מתיקייה שמירה לתיקייה חדשה. לקבלת בקרת איכות של התמונות, כדאי לבחור סימן זיהוי תצוגה, מספר זיהוי החזר ROI ומספר החזר ROI ושם.
  7. לאחד ולשמור את הנתונים עבור הפרמטרים השונים באמצעות גיליון אלקטרוני שנוצר עבור כל תמונה או מצב נבדק.
    הערה: הפרמטרים לניתוח כוללים את מספר ה- SGs לכל החזר ROI, את פני השטח של SG, ואת המקסימום של SG, ממוצע ועוצמות מינימום.
  8. להעביר את הנתונים ולנתח באמצעות תוכנית ניתוח מסוגל לנתח, גרפים וקביעת המשמעות סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להסביר ולהמחיש את הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה, אנו מאופיין את התמונה של clotrimazole- המושרה SGS ב תאים hella נגוע או לא עם הפתוגן cytosolic S. flexneri . מתווה של הנוהל מוצג בתרשים 1 , וכולל נגיפי ואכזרית ס. Flexneri מפוספס על קונגו צלחות אדומות, הכנת חיידקים, זיהום, תוספת של מתח סביבתי, קיבוע מדגם מכתים, הדמיה מדגם quantitation, כמו גם ניתוח תמונה . מספר לחצים שונים עשויים לשמש כדי ליצור גיבוש SG ומגוון של סמנים SG זמינים לחקירה. EIF3b הוא סמן SG קנוני שגם בבירור כתמים תא cytoplasmic של התא והוא יכול לשמש כדי לזהות את הקצוות התא. G3BP1 הוא סמן SG בשימוש נרחב כי אגרגטים לתוך SGS ללא כל מכתים רקע ( איור 2 א ', ב' D ). תאים הם צילמו הטובה ביותר עם מיקרוסקופ confocal, ואת ערימות המכסים את עומק התא כולו נטענים על ניתוח הדמיה ICY חופשית ( איור 2 א - ג ). כדי לזהות טוב יותר תאים נגועים לשים תאים לתוך או נגוע או קבוצה לא נגועים לניתוח מאוחר יותר, זה שימושי כדי להגביר את עוצמת הכתם חומצה גרעין ( איור 2 ד ). בתוך תוכנת ניתוח הדמיה, גלאי ספוט משמש לאחר מכן כדי לזהות SGs בתוך כל ROIs המיועד ( איור 2 E ) ותמונה בינארי שנוצר המציג את כל SGS מזוהה ( איור 2 F ).

ניתוח SG צריך להיות מותאם לכל סמן SG ניתח את ההגדרה המתאימה לניתוח חייב להיות נבחר בקפידה. התמקדות MA MAR3 G3BP1, שינוי גודל הדרישה של הנקודה זוהה או שינוי הרגישות של הפרמטרים זיהוי יוביל לתוצאות משתנות, כפי שמוצג באיור 3 A - C. בחירת סולם (1 - 3, אם כי קשקשים ניתן להוסיף) מבוססת על גודל פיקסל ולכן בקשקשים גבוהים יותר, SGs קטן לא יספרו את המספרים של SG יקטן ( איור 3 ג ). רגישות נמדדת מ -100, כאשר 100 הם הרגישים ביותר. על ידי הגדלת הרגישות, מספר SGs זוהה מגביר ( איור 3 ג ). לפיכך, ההגדרות הנכונות יש למצוא כדי למזער חיוביות שגויות ותשלילים שווא. זה נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח זהיר של חזותיים שהושגו עבור כל הגדרה. עבור G3BP1, סולם של 2 עם רגישות של 100 (2 - 100, מודגש באדום) נתן את התוצאה הטובה ביותר. סולם של 2 עם רגישות נמוכה יותר (50 או 25) נותר קטןSGs uncounted (ראה חצים כתומים). באופן דומה, בקנה מידה של 3 שמאל SG קטן unaccounted תוך סולם של 1 oversampled. חשוב לציין, קשקשים נוספים ניתן להוסיף להתמקד רק על SG גדול, אם זה מוצדק. עבור eIF3b, סולם של 2 עם רגישות של 55 (2 - 55) נתן את התוצאה הטובה ביותר עבור eIF3b (מודגש באדום) למרות החצים האדומים להדגיש או תחת או oversampling בסולם 2 - 50 & 2 - 55, בהתאמה.

לאחר הפרמטרים לניתוח SG מוגדרים כראוי, הנתונים ניתן לנתח במובנים רבים ( איור 4 ). גלאי נקודה נותן את מספר SGs זוהה בתוך כל ROI כך תאים נגוע נגוע ניתן להשוות ( איור 4 א ). באופן דומה, הגודל, במקרה זה מספר פיקסלים, ניתנת שממנו השטח ניתן לחשב ( איור 4 ב ). התפלגות התדריםOts הם גם שימושיים כדי להדגיש משמרות בגודל של SGs למצוא אוכלוסיות תאים שונים. כאן, היעדר מוחלט של SG גדול בתאים נגועים S. flexneri , כמו גם שינוי מובהק בהתפלגות הופך ברור יותר ( איור 4 ג ). בנוסף, אינטנסיביות (המוצגת כאן היא עוצמת מינימום ומקסימום) מספק מידע על איכות SGs ניתח. עבור תאים סובלים flexneri נגוע, SGs הם פחות אינטנסיבי באופן משמעותי. ניתוחים אלה מספקים מידע רלוונטי מבחינה סטטיסטית הן על אופי איכותי וכמותי של SG שנוצרו בתגובה ללחץ אקסוגני כאשר תאים נגועים עם או ללא S. flexneri .

איור 1
איור 1 : מתאר של נוהל ניסיוני כדי להדביק תאים עם ס 'Flexneri וכדי לנתח את ההשפעה של זיהום SG גיבוש. מושבה של קונגו-אדום, ומושבה של קונגו-אדום-שלילה לא-מוצלחת, נבחרים ומגדלים את הסוכר במרק סויה טריפטי. התרבות לילה הוא subcultured לשלב מעריכי מאוחר לפני חיידקים מצופים PLL כדי לקדם את הדבקות. תאים המארח גדל coverslips זכוכית בצלחות 12 גם הם נגועים חיידקים למשך 30 דקות. תאי בקרה אינם נגועים. תאים נשטפים ומטופלים עם inducers מתח לגרום להיווצרות SG או על ידי החלפת המדיום עם בינוני המכיל מתח או הנושא את התאים כדי להדגיש תנאים, כגון חום. תאים קבועים מכן, permeabilized, מוכתמים עם סמנים ספציפיים SG immunofluorescent, ו צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal. Z- תחזיות מתבצעים באמצעות ImageJ ונותח באמצעות גלאי נקודה של תוכנת ניתוח התמונה. לאחר מכן לנתח את הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולהגירסת er של נתון זה.

איור 2
איור 2 : ניתוח גלאי ספוט של תאים Hella נגוע ס 'Flexneri עבור 1.5 שעות לפני תוספת של Clotrimazole עבור 1 שעות. א . תמונה Immunofluorescent של הקרנת z מראה תאים מוכתם סמנים SG eIF3b ו G3BP1, DAPI ו אקטין. ב . אותה תמונה כמו ב (א) אבל בלי הכתם אקטין כדי להדגיש את השימוש של eIF3b כדי להגדיר גבולות התא. ג . צילום מסך של תוכנת ניתוח התמונה עם מודול גלאי נקודה. ד . Gating של תאים נגועים ולא נגועים כמו לראות באמצעות ערוצים שונים. כדי לראות את כל החיידקים, האינטנסיביות גדלה. תאים עם יותר מ 1 חיידק נוכח בתא מסומנים עם כוכב אדום. ה . פלט של נקודה detecלניתוח של החזר השקעה אינדיבידואלי, המציין את שם החזר ההשקעה, מספר המקומות ומיקומם. F. תמונה של כתמים שזוהו ROIs. סולם בר = 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 : השוואות של סולם שונים הגדרות רגישות של גלאי ספוט עבור גילוי של SGS באמצעות סמנים שונים SG. א . התקרבות לתאי חילה נגועים או לא עם S. flexneri ומוכתמת DAPI ואת הסמן G3BP1 סמן, ונותחו בקשקשים שונים (גודל פיקסל לחתוך, 1 - 3) ורגישות (1 - 100). ייצוג גרפי של מספרי SG בתאי נגוע ונגוע ניתח בקשקשים שונים ( > B) ורגישות ( C ). חזותיים ( D ) וייצוג גרפי ( E ) של זיהוי מספר SG של הסמן SG eIF3b עבור אותה תמונה בעת שינוי מגבלת הרגישות מבלי לשנות את גודל נקודה לחתוך. כתיבה אדומה וסמלים אדומים מציינים את הפרמטרים הטובים ביותר. החצים האדומים מצביעים על תוצאות חיוביות שגויות וחצים כתומים לחוסר איתור SG. ערכים כוללים ממוצע עם סטיית תקן. התוצאות הטובות ביותר מודגשות באדום. ניתוח סטטיסטי נבחר שנכלל בהירות תוך שימוש ב - Wilcoxon בדרג ה - p של ערכי ה - p בצד שמאל וב - F-var variance בצד ימין. * = <0.05, ** = = 0.01, *** = <0.001, ns = לא משמעותי. סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Es / ftp_upload / 55536 / 55536fig4.jpg "/>
איור 4 : ניתוח של גלאי ספוט נתוני SG שנוצר כתוצאה מ Clotrimazole שטופלו תאים Hella נגוע ס 'Flexneri . א . מספר ה- G3BP1 SG לכל תא בתאי הלהמה הנגועים והבלתי נגועים. ב . שטח שטח של G3BP1-SGs של תאים נגועים ובלתי נגוע, ואת התפלגות אחוז התפלגות שלהם ( ג ). ד . ערכי עוצמת מינימום ומקסימום (שרירותי) של G3BP1-SGs. ערכים כוללים ממוצע עם שגיאה סטנדרטית. ניתוח סטטיסטי נבחר שנכלל בהירות תוך שימוש ב - Wilcoxon בדרג ה - p של ערכי ה - p בצד שמאל וב - F-var variance בצד ימין. * = <0.05, ** = = 0.01, *** = <0.001, ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את אינדוקציה, לוקליזציה וניתוח של SGS בתאים שאינם נגועים ותאים נגועים הפתוגן cytosolic S. flexneri בנוכחות או היעדר הלחץ אקסוגני. באמצעות תוכנת הדמיה חופשית, פרוטוקולים מאפשר ניתוח איכותי וכמותי מדויק של היווצרות SG לזהות וכתובת סטטיסטית ההבדלים פנוטיפים נתון.

ישנם מספר צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקול עבור הזיהום, SG- השראה חלקים הדמיה. עבור זיהום, חשוב אינטראקציה חיידקית עם תאים המארח, כגון פלישה כמו פרוטוקול המתואר כאן, מסונכרן ככל האפשר. זה חשוב במיוחד כאשר חוקרים את ההשפעות של אתגר חיידקי מוקדם במהלך תהליך הזיהום. בעבר הראינו כי פנוטיפים מסוימים, כגון לוקליזציה eIF3b לאחר זיהום S. flexneri , מוטרדים מוקדם במהלך wild-typeS. אתגר flexneri בעוד פנוטיפים אחרים, כגון צבירה של G3BP1 המכילים SGs, מושפעים יותר בנקודות זמן מאוחרות יותר 3 . לכן, כדי לתאר בדיוק את ההשפעה הזמנית של אתגר חיידקי, סינכרון של זיהום מומלץ. ראוי לציין, כדי לנתח גיבוש SG, תאים צריכים להיות בשלב מעריכי של צמיחה, ולכן צפיפות התא בזמן תוספת הלחץ הוא גם פרמטר חשוב. זה גם מגביל ניתוח SG שאינם מודבקים תאים זיהום מודלים. היבט קריטי נוסף הוא שיתוף עיבוד של דגימות בקרה ניסוי במהלך עיבוד הן של דגימות עבור הדמיה במהלך רכישת התמונה. עבור עיבוד immunofluorescent, כל הדגימות צריך להיות מוכתם עם דילולים אותו נוגדנים עובד עבור אותה כמות של זמן תחת אותם תנאים ( כלומר RT Vs 4 ° C), תוך הקפדה לטפל בכל coverslip דומה במהלך שלבי כביסה ו O הרכבהF את coverslips. זה יבטיח כתמים immunofluorescent דומים שניתן לנתח הן איכותית כמותית. ההבדלים המדיום גובר יכול להיות השפעות משמעותיות על הלבנה של דגימות במהלך רכישת התמונה ולכן צריך להישמר קבוע. באופן דומה, רכישת התמונה עבור כל דגימות להשוואה בניתוח צריך להתבצע בתוך ישיבה אחת עם הגדרות זהות כדי למזער הבדלים הנובעים חוזק לייזר או הגדרת מדגם.

בעת שימוש במתח אקסוגני, חשוב לאחסן כראוי את מגיב ולעיתים קרובות לעשות מניות עבודה חדשים. תקופות ממושכות (4 חודשים עבור clotrimazole, למשל) מובילות לירידה בעוצמה של התרופה וישפיעו על היווצרות SG. ריאגנטים יש להוסיף בינוני המדיום מיד לפני תוספת לתאים; אם ירידה בהיווצרות SG בתאי שליטה הוא ציין או את הצבירה של SGs נראה חריג, ריאגנטים צריך להיבדק עבור AC שלהםTivity ומניות חדשות צריך להיעשות.

מגבלה אחת היא כי זיהוי SG באמצעות גלאי נקודה הופך פחות אמין כאשר יותר מדי רקע הקרינה קיים. אמנם זה לא בעיה עבור סמנים רבים SG, כמה, כגון eIF3b, המהווה סמן cytosolic ברור תחת שני- SG ו- inducing גורם תנאים, קשה יותר לנתח כפי שמוצג באיור 3 . בנוסף, קשקשים ורגישות צריך להיות מוגדר אמפירית עבור כל סמן SG. מגבלה נוספת היא כי ניתוח באמצעות תוכנת ניתוח התמונה הוא הטוב ביותר עם תמונות דו מימדיות, ולכן עובד היטב על פרוסות או ערימות אופטיים התמוטטות, אשר תוצאות עם זאת אובדן של מידע 3D. ניתוח על z- תחזיות ולכן נוטה להגזים בגודל של SGs להמעיט את מספר SGs. ניתוח 3D של SGS יכול להתבצע עם Imaris לתת אפיון מרחבי אפילו יותר מדויק, אם ייחשב הכרחי פנוטיפ מסוים. אפיון SG ניתן לבצע במהירות באופן סטנדרטי באמצעות גלאי נקודה אוטומטית של תוכנת ניתוח התמונה. לעומת זאת, שיטות ידניות לזהות ולסמן SGS כפי שבוצעו בעבר 4 , להשאיר את הניתוח פתוח להטיה יותר הוא זמן רב יותר זמן רב. ניתוח SG באמצעות גלאי ספוט יכול להיות מותאם גם לכלול או לא לכלול אגרגטים SG קטן על ידי בחירת רגישות שונים וספים גודל, ובכך מאפשר גמישות בהערכת היבטים שונים של היווצרות SG. ניתוח SG יכול גם להתבצע באופן אוטומטי לחלוטין באמצעות עבודה אוטומטית הוקמה 3 . בתוך זרימת עבודה זו, מרכז התא מזוהה באמצעות כתם DAPI והתוכנה מאפשרת לאחר מכן לגבש כדור חוצה החוצה כדי להגדיר את גבולות התא על סמך כתם cytoplasmic (כגון eIF3b) או אקטין. במקביל, באמצעות ניתוח אוטומטי למחצה על ידיבאופן ידני המתאר תאים בודדים לניתוח, יכול להיות יתרון כאשר תאים לגדול באשכולות גבולות תאים קשה עבור תוכנית אוטומטית כדי להגדיר בבירור. בנסיבות אלה, הגדרת גבולות התאים באופן ידני יכולה למנוע ערכים חיוביים או שליליים כוזבים.

ניתן להתאים את הפרוטוקול לתנאים אחרים המביאים את ה- SG ולפתוגנים אחרים, כולל וירוסים, חיידקים, שמרים ופרוטוזואנים. עניין מיוחד עשוי להיות פתוגנים cytosolic אחרים כגון Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei ו Listeria spp. 14 עבור כל סוכן זיהומיות, ואולי גם שורות תאים שונים, הפרוטוקול זיהום יהיה צורך להתאים את הדגימה פעמים של מדגיש אקסוגני נקבע אמפירית. בנוסף, אפיון SG באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עשוי גם להיות מורחבת הדמיה לחיות תא בעתיד. ניתוח בזמן אמת SG יהיה צורךזה להביע את הביטוי של אחד או יותר fluorescently- מתויג סמנים SG בתא המארח אבל היה בכך לאפשר שאלות לגבי הדינמיקה הזמנית והמיוחדת של היווצרות SG להיות לטפל בתנאים ניסיוניים שונים. פלואורסצנטי שכותרתו חיידקים אז יהיה צורך להשלים את ניתוח SG בזמן אמת בתאים נגועים ובלתי מזוהמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgements

נ.ב. היא נמענת של ביל ומלינדה גייטס גרנט האתגר הגדול OPP1141322. PV נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מוקדמות פוסטדוק ניידות מילגות רוסט-קנטאריני פוסט דוקטורט. PJS נתמך על ידי מענק HHMI ו- ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat  Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat  Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat  Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat  Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS) Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Life Technologies 11140 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application - data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application - data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436, (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38, (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18, (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315, (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33, (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12, (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298, (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8, (9), 72788 (2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14, (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23, (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7, (5), 333-340 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics