Análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse após o desafio bacteriano de células de mamífero

Immunology and Infection

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Summary

Descrevemos um método para a análise qualitativa e quantitativa da formação de grânulos de estresse em células de mamíferos após as células serem desafiadas com bactérias e vários estresses diferentes. Este protocolo pode ser aplicado para investigar a resposta do grânulo do estresse celular em uma ampla gama de interações hospedeiro-bacteriana.

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Vonaesch, P., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (125), e55536, doi:10.3791/55536 (2017).

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Abstract

A imagem fluorescente de componentes celulares é uma ferramenta eficaz para investigar interações hospedeiro-patógeno. Os agentes patogênicos podem afetar muitas características diferentes das células infectadas, incluindo a ultraestrutura orgânica, a organização da rede do citoesqueleto, bem como processos celulares, como a formação de grânulos de estresse (SG). A caracterização de como os patógenos subvertem os processos do hospedeiro é uma parte importante e integral do campo da patogênese. Embora os fenótipos variáveis ​​possam ser facilmente visíveis, a análise precisa das diferenças qualitativas e quantitativas nas estruturas celulares induzidas pelo desafio dos patógenos é essencial para definir diferenças estatisticamente significativas entre amostras experimentais e de controle. A formação de SG é uma resposta de estresse conservada de forma evolutiva que leva a respostas antivirais e tem sido investigada por meio de infecções virais 1 . A formação de SG também afeta as cascatas de sinalização e pode ter outras conseqüências ainda desconhecidas2 . A caracterização desta resposta de estresse a agentes patogênicos que não sejam vírus, como patógenos bacterianos, é atualmente uma área de pesquisa emergente 3 . Por enquanto, a análise quantitativa e qualitativa da formação de SG ainda não é rotineiramente utilizada, mesmo nos sistemas virais. Aqui, descrevemos um método simples para induzir e caracterizar a formação de SG em células não infectadas e em células infectadas com um patógeno bacteriano citosólico, o que afeta a formação de SGs em resposta a vários estresses exógenos. A análise da formação e composição do SG é conseguida utilizando vários marcadores de SG diferentes e o plug-in do detector de pontos da ICY, uma ferramenta de análise de imagens de código aberto.

Introduction

A visualização das interações hospedeiro-patógeno em um nível celular é um método poderoso para obter informações sobre estratégias patogênicas e para identificar caminhos celulares chave. Na verdade, os agentes patogênicos podem ser usados ​​como ferramentas para identificar alvos ou estruturas celulares importantes, pois os agentes patogênicos evoluíram para subverter processos celulares centrais como uma estratégia para sua própria sobrevivência ou propagação. A visualização de componentes celulares pode ser conseguida por proteínas de hospedeiro marcadas fluorescentemente com expressão de forma recombinante. Embora isso permita uma análise em tempo real, a geração de linhas celulares com proteínas hospedeiras especificamente marcadas é altamente laboriosa e pode resultar em efeitos colaterais indesejáveis. Mais conveniente é a detecção de fatores celulares usando anticorpos específicos, porque vários fatores do hospedeiro podem ser analisados ​​simultaneamente e um não está limitado a um tipo de célula particular. Uma desvantagem é que apenas uma visão estática pode ser capturada à medida que a análise de imunofluorescência requer a fixação de célula hospedeiraíon. No entanto, uma vantagem importante da imagem de imunofluorescência é que se presta facilmente a análise tanto qualitativa como quantitativa. Isso, por sua vez, pode ser usado para obter diferenças estatisticamente significativas para fornecer novos conhecimentos sobre interações hospedeiro-patógeno.

Os programas de análise de imagens fluorescentes são poderosas ferramentas analíticas para realizar análises 3D e 4D. No entanto, o alto custo do software e sua manutenção tornam mais atraentes os métodos baseados em software livre de código aberto. A análise cuidadosa da imagem usando o software de bioanálise é valiosa porque sustenta a análise visual e, ao atribuir significados estatísticos, aumenta a confiança na correção de um determinado fenótipo. Anteriormente, os SGs foram analisados ​​usando o software ImageJ gratuito, o que requer a identificação manual de SGs individuais 4 . Aqui fornecemos um protocolo para a indução e análise da formação de SG celular no contexto de bacInfecções teriais usando o software livre de análise de bio-imagem de código aberto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). O software de análise de bio-imagem possui um programa integrado de detectores de pontos que é altamente adequado para análise de SG. Permite o ajuste fino do processo de detecção automatizada em Regiões de Interesse (ROIs) especificadas. Isso supera a necessidade de análise manual de SGs individuais e remove o viés de amostragem.

Muitos estresses ambientais induzem a formação de SGs, que são estruturas citossólicas, não membranosas densas em fase, de 0,2 a 5 μm de diâmetro 5 , 6 . Esta resposta celular é conservada evolutivamente em leveduras, plantas e mamíferos e ocorre quando a tradução global de proteínas é inibida. Envolve a agregação de complexos de iniciação de tradução estancados em SGs, que são considerados lugares de espera para mRNAs ativamente translacionais, o que permite a tradução seletiva de um subconjunto de mRNAs celulares.Após a remoção do estresse, os SGs se dissolvem e as taxas globais de resumo da síntese protéica. Os SGs são compostos de fatores de iniciação da alongamento da tradução, proteínas envolvidas no metabolismo do RNA, proteínas de ligação ao RNA, além de proteínas de andaimes e fatores envolvidos na sinalização celular do hospedeiro 2 , embora a composição exata possa variar dependendo do estresse aplicado. Os fatores ambientais que induzem a formação do SG incluem a inanição de aminoácidos, irradiação UV, choque térmico, choque osmótico, estresse do retículo endoplasmático, hipoxia e infecção viral 2 , 7 , 8 . Muitos progressos foram feitos para entender como os vírus induzem e também subverter a formação do SG, enquanto pouco se sabe sobre como outros agentes patogênicos, como patógenos bacterianos, fúngicos ou protozoários, afetam essa resposta de estresse celular 1 , 7 .

ShigeLla flexneri é um patógeno citossico facultativo gram-negativo dos seres humanos e o agente causador de diarréia grave ou shigelose. A shigelose é um grande fardo para a saúde pública e leva a 28 mil mortes por ano em crianças com menos de 5 anos de idade 9 , 10 . S. flexneri infecta o epitélio colônico e se espalha de célula para célula ao seqüestrar os componentes do citoesqueleto do hospedeiro 11 , 12 . A infecção do epitélio apóia a replicação de S. flexneri no citosol, mas os macrófagos infectados morrem através de um processo inflamatório de morte celular chamado pirotecto. A infecção leva a um recrutamento maciço de neutrófilos e inflamação grave que é acompanhada por calor, estresse oxidativo e destruição tecidual. Assim, enquanto as células infectadas estão sujeitas a estresses internos induzidos por infecção, como a ruptura de Golgi, estresse genotóxico e rearranjo do citoesqueletoS, as células infectadas também são submetidas a estresses ambientais devido ao processo inflamatório.

A caracterização do efeito da infecção por S. flexneri sobre a capacidade das células para responder a estresses ambientais usando uma série de marcadores de SG demonstrou que a infecção leva a diferenças qualitativas e quantitativas na composição SG 3 . No entanto, pouco se sabe sobre outros agentes patogênicos bacterianos. Aqui descrevemos uma metodologia para a infecção de células hospedeiras com o patógeno citossolo S. flexneri , o estressamento de células com diferentes estresses ambientais, a rotulagem de componentes de SG e a análise qualitativa e quantitativa da formação e composição de SG no contexto de infecção E células não infectadas. Este método é amplamente aplicável a outros agentes patogênicos bacterianos. Além disso, a análise de imagem da formação de SG pode ser usada para infecções por vírus ou outros agentes patogênicos. Pode ser usado para analisar SGFormação após a infecção ou o efeito da infecção na formação de SG em resposta a estresses exógenos.

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Protocol

1. Preparação de bactérias e células hospedeiras

  1. Transferir a tampa de vidro de 12 ou 14 mm em placas de 24 ou 12 poços, respectivamente, com uma pinça estéril, contando um poço por condição experimental. Esterilize-os por tratamento UV em um capuz de cultura de tecidos por 15 min.
    NOTA: Incluir poços de controle para desafio bacteriano e para indução de SG por estresses exógenos.
  2. Para uma placa de 24 poços com lamelas de 12 mm, semente 1 x 10 5 células de mamífero ( por exemplo, células HeLa) em lamínulas; Pressione as lamelas para baixo com uma ponta de pipeta estéril. As células de células aderem durante a noite a 37 ° C numa incubadora de cultura de tecidos a 5% CO 2 em meio de cultura apropriado para cada tipo de célula.
    NOTA: células de placa de modo que a confluência de células esteja entre 40 e 60% no dia seguinte.
    1. Para células HeLa, incubar no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com Aminoácidos Não-Essenciais (NEAA) e 10% de Soro Fetal de Caldo Desmaturado (FCS).Decomplementar FCS por aquecimento durante 30 min em um banho de água a 56 ° C, rodando o soro uma vez após 15 min.
  3. Para esticar as bactérias, use uma ponta de pipeta estéril para remover uma pequena quantidade de um estoque de glicerol bacteriano (20% de glicerol) armazenado em um congelador de -80 ° C e colocá-lo em uma placa rotulada. Use um loop estéril para espalhar as bactérias em cerca de 10% da placa. Use um novo loop estéril e arraste-o através do esfregaço para fazer 3 linhas paralelas, metade de uma placa longa. Percorra essas linhas cobrindo o resto da placa. Incubar a placa O / N a 37 ° C.
    1. Selecione uma única colônia bacteriana ( por exemplo, S. flexneri ) da placa recém-esticada. Evite trabalhar com colônias bacterianas com mais de 1 semana.
    2. Para a estirpe M90T de S. flexneri , inocule uma colónia vermelha a partir de um Agar Tryptic Soy Agri-0,1% de placa de ágar vermelho congênita em 8 ml de caldo Tryptic de soja em um tubo de 15 mL; Aperte a tampa e incube agitando a 222 rpm O / N às 306; C.
      CUIDADO: Não use grandes colônias brancas, pois perderam o plasmídeo de virulência e não são infecciosas.

2. Desafio bacteriano de células hospedeiras

  1. Prepare bactérias para maximizar o potencial de infecção.
    1. Para S. flexneri , bactérias de subcultura, adicionando 150 μL de cultura de O / N a 8 mL de Tryptic Soy Agar e incubar agitando 222 rpm a 37 ° C até a fase exponencial tardia (~ 2 h) para induzir a expressão do gene da virulência e aumentar a infecção.
      1. Quando a cultura está em uma densidade óptica entre 0,6 e 0,9 (medida a 600 nm), transfira 1 mL de cultura para um tubo de 1,5 mL. Bactérias de pelotização durante 2 min a 8 000 xg e ressuspender em meio de infecção (DMEM com NEAA, sem FCS) em OD 600 = 1. Assim, se a OD 600 for 0,85, ressuspenda em 850 μL.
        NOTA: Para S. flexneri, em OD 600 = 1, haverá 8 x 10 8 bactérias por mL quandoCultivado em 8 mL de meio. Uma Multiplicidade de Infecção (MOI) de 20 é apropriada. Para outros agentes patogênicos, o número de bactérias por mL em uma OD 600 e o MOI apropriado precisam ser determinados empiricamente.
    2. Para melhorar as interações bacteriano-hospedeiro, coletar bactérias com Poly-L-Lysine (PLL).
      NOTA: O tratamento PLL de S. flexneri não teve efeito sobre a dinâmica do SG. Outros agentes patogênicos precisam ser avaliados quanto à sua capacidade de tratamento com PLL.
      1. Para revestir as bactérias com PLL, centrifugar 1 mL de cultura bacteriana durante 2 minutos a 8 000 xg e depois ressuspender o sedimento em 10 μg / mL de PLL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma DO 600 = 1.
      2. Adicione a solução bacteriana a um prato pequeno, como um poço dentro de uma placa de 12 poços, e incuba à temperatura ambiente (~ 20 ° C) durante 10 minutos com agitação suave sobre um agitador de placas.
      3. Bactérias de pelotização durante 2 min a 8000 xg, remover o excesso de PLL. Ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS eRepita este passo de lavagem duas vezes. Após a lavagem final, ressuspenda em meio de infecção em OD 600 = 1.
        NOTA: Aqui, o meio de infecção para S. flexneri é meio celular hospedeiro com HEPES 20 mM com FCS.
  2. Prepare células para o desafio bacteriano.
    1. Remova o meio das células HeLa de mamífero usando uma bomba de sucção. Adicione 500 μL de meio de células RT HeLa para lavar as células, redirecione, remova o meio usando uma bomba de sucção e substitua com 500 μL de meio de infecção apropriado de RT ( por exemplo , meio celular hospedeiro com HEPES 20 mM com FCS).
    2. NOTA: Para todas as etapas de lavagem, trabalhe rapidamente e processe apenas até 4 lamínulas de cada vez para evitar a secagem das células.
  3. Desafiar as células HeLa preparadas com bactérias para infectar 20 a 50% das células.
    NOTA: O tempo apropriado e MOI precisam ser determinados para cada espécie bacteriana. Geralmente, um bom começo é de 30 min aos 37° C com um MOI de 10.
    1. Para S. flexneri, desafie as células das células HeLa usando um dos dois métodos (passo 2.3.1.1 ou 2.3.1.2).
      1. Bactérias tratadas sem PLL (20 μL de OD 600 = 1 / poço de placa de 24 poços em 500 μL de meio) em células durante 10 min a 13000 x g.
      2. Adicionar bactérias revestidas com PLL (15 μL de OD 600 = 1 / poço de placa de 24 poços em 500 μL de meio) durante 15 minutos à TA para permitir que as bactérias se depositem nas células.
    2. Permitir que a infecção ocorra colocando células com bactérias estabelecidas em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante 30 min.
      NOTA: Para pontos curtos de tempo, sincronize a infecção por S. flexneri colocando placas em um banho de água a 37 ° C durante 15 minutos em vez de na incubadora de cultura de tecidos.
  4. Pare a infecção lavando as células.
    1. Para lavar as células e remover o excesso de bactérias, retire o meio usando uma bomba de sucção, adicione 1 mLMeio de cultura HeLa pré-aquecido (37 ° C) (DMEM, 10% FCS, NEAA). Remova o meio, remova e substitua com um meio fresco. Repita duas vezes e deixe o meio fresco nas células.
      1. Para S. flexneri , ou outras bactérias intracelulares, após a infecção de células HeLa e as lavagens, substitua o meio com meio de cultura de tecido padrão contendo 50 μg / mL de gentamicina para matar bactérias extracelulares e evitar novas invasões celulares.
        NOTA: Não adicione antibióticos no meio para bactérias extracelulares.
  5. Incubar bactérias com células durante a quantidade desejada de tempo em uma incubadora de cultura de tecidos.
    NOTA: Para S. flexneri , a infecção pode durar até 6 h, dependendo do tipo de célula. Para células HeLa, deixe a infecção prosseguir durante 1,5 a 2 h antes de adicionar estresses exógenos para induzir a formação de SG. Para infecções de Caco-2, em que Shigella se espalha de célula para célula, infecte por 30 min a 6 h antes de adicionar estresse exógeno. CePodem ser consertados neste ponto sem adicionar estresses exógenos para avaliar a formação de SG como resultado da infecção bacteriana (nesse caso, proceder à seção 4).

3. Induzindo a formação de grânulos de estresse pela adição de estressores exógenos

  1. Remova o meio das células HeLa infectadas e não infectadas usando uma bomba de sucção, substitua o meio com 500 μL de meio apropriado com ou sem o estressor e incube.
    NOTA: As condições de indução de estresse incluem o seguinte (veja abaixo). Para tratamentos adicionais, veja Kedersha et al . 13 .
    1. Para tratamento de choque térmico, use um meio regular contendo HEPES 20 mM e coloque a placa em banho-maria a 44 ° C durante 30 min.
    2. Para o tratamento com clotrimazol (induz o estímulo mitocondrial), use meio regular sem FCS com clotrimazol 20 μM e incuba em uma incubadora de cultura de tecidos durante 1 h.
      NOTA: Armazene alíquotas de uso único de 20 mM de estoque de clotrimazol em dimetilsulfóxido (DMSO) a -20 ° C por até 4 meses. Use o veículo DMSO para células de controle.
    3. Para o tratamento com arsenito (induzmento de estresse oxidativo), use um meio regular com arsenito 0,5 μM e incuba na incubadora de cultura de tecidos durante 1 h.
      NOTA: Armazene alíquotas de uso único de estoque de arsenito 0,5 mM a -20 ° C por até 6 meses.
      CUIDADO: Clotrimazol e arsenito são prejudiciais e perigosos para o meio ambiente e devem ser descartados adequadamente.
    4. Para o tratamento com Des-Methyl Des-Amino (DMDA) -pateamina (inibe a iniciação da tradução eucariótica), use um meio regular com 50 a 200 nM de DMDA-pateamina e incuba na incubadora de cultura de tecidos durante 1 h.
      NOTA: Armazene DMDA-pateamina a -80 ° C. Armazene os reagentes como pequenas alíquotas para evitar a congelação da descongelação.

4. Fixação e análise de imunofluorescência da formação de grânulos de estresse

NOTA: processe o controle eLamelas experimentais ao mesmo tempo para evitar manchas de diferenças que possam impactar a análise da imagem nas etapas subseqüentes. As amostras de controle incluem nenhuma infecção com e sem tratamento SG induzido e amostras infectadas com e sem SG induzindo tratamento.

  1. Remova o meio completamente usando uma bomba de sucção e coloque amostras adicionando 0,5 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS. Incubar durante 30 min à TA.
    CUIDADO: O PFA é prejudicial ao manipulador e ao meio ambiente. Tome a medida adequada para proteger o manipulador e descarte com resíduos químicos.
    NOTA: Em alternativa, repare durante 15 min e, em seguida, substitua com metanol pré-grelhado a -20 ° C durante 10 minutos para reter mais localização citoplasmática de marcadores SG 13 .
  2. Remova o PFA com uma pipeta e descarte o líquido em um recipiente de lixo apropriado. Lavar a lamínula com 1 ml de solução salina tamponada com Tris (TBS: Tris 25 mM, pH 7,3, NaCl 15 mM). Incube o lamínula durante 2 minutos com agitação suaveEm um agitador de placas durante a lavagem.
  3. Remova o TBS completamente usando uma bomba de sucção e adicione 500 μL de Triton-X100 a 0,3% em TBS por 10 minutos para permeabilizar as células.
  4. Remova a solução de permeabilização com uma bomba de sucção. Substitua por 1 mL de TBS, remova suavemente a placa, remova TBS por sucção e adicione 1 mL de solução de bloqueio (5% de FCS em TBS) durante 1 h à TA.
  5. Prepare a solução de anticorpo primário (diluição 1: 300) em FCS a 5% em TBS. Calcule 50 μL por lamela de 12 mm e faça o suficiente para todos os lamínulas em um lote.
    NOTA: Os anticorpos primários comuns que são usados ​​alvo G3BP1, eIF3b e TIA1.
  6. Posicione 50 μL da mistura primária de anticorpos sobre uma película de parafina de plástico (parafilm) firmemente gravada no banco ou na câmara.
    NOTA: Uma lista de marcadores SG canônicos é fornecida na Tabela de Materiais , mas a composição de SGs pode depender do estresse aplicado. Outros marcadores SG estão listados em Kedersha et al. 13 S. flexneri estão listados na Tabela 1 .
  7. Pegue a lamínula com pinças, dab a borda da lamínula no tecido, soltando brevemente a pinça para remover o excesso de líquido, e coloque suavemente a face para baixo na gota. Incubar lamínulas durante 1,5 h à RT ou durante a noite a 4 ° C numa câmara úmida.
    NOTA: Para preparar uma câmara húmida, coloque os tecidos pré-molhados ao longo das bordas de uma câmara firmemente fechada revestida com parafilme de plástico.
  8. Transfira cada lamínula com pinças em um poço de uma nova placa de 24 poços preenchida com 1 mL de TBS; Incubar com agitação suave em um agitador de placas durante 5 min. Sucção de TBS em cada poço usando uma bomba de sucção, substitua por 1 mL de TBS e coloque de volta no agitador de placas durante 5 min. Repita a lavagem mais uma vez.
    NOTA: Reutilize o parafilme removendo o excesso de líquido com um tecido e lavando a superfície com água. Certifique-se de que o filme de parafina esteja completamente seco antes de usinG para o passo de coloração subseqüente.
  9. Prepare a solução de anticorpo secundário em TBS (diluição 1: 500 - 1: 2 000). Para manchar o núcleo e as bactérias, adicione 2 μg / mL de DAPI à mistura. Para manchar a actina, adicione a faloidina fluorescente. Pipetar 50 μL de mistura de anticorpos secundários na película de parafina de plástico.
    NOTA: O uso de anticorpos secundários de burro absorvidos altamente purificados são recomendados para estudos de co-localização de diferentes marcadores de SG quando o G3BP1 (anticorpo de cabra) é usado. Escolha anticorpos secundários marcados de forma fluorescente com espectros não sobrepostos. EIF3b mancha claramente o citoplasma das células e, portanto, é um bom marcador para delinear as células. A mancha de actina ajuda ainda a delinear células em locais de contato célula a célula e áreas de entrada bacteriana.
  10. Pegue a lamínula com pinças, dab a borda do lamíngulo no tecido, liberando brevemente a pinça, para remover o excesso de líquido. Coloque delicadamente o lamínula de frente para baixo na gota e incuba os lamínulasNo escuro durante 1 h na RT.
  11. Use pinças para colocar a lamínula de volta nas placas de 24 poços preenchidas com 1 mL de PBS fresco. Certifique-se de que o lamínula esteja totalmente coberto pelo PBS. Lave as células 3x com agitação suave durante 5 minutos cada.
    NOTA: Mantenha a placa durante as lavagens sob uma tampa para proteger da luz, pois os fluoróforos do anticorpo secundário são sensíveis à luz.
  12. Diminua brevemente a lamínula em água desionizada para remover o sal, retire-se da borda em um tecido e monte a lamínula em 5 μL de meio de montagem de fluorescência em uma lâmina de vidro. Selar o lamínula antes da imagem usando o esmalte de unhas. Mantenha os slides a 4 ° C para curto prazo (semana) ou a -20 ° C para armazenamento a longo prazo (mês).
    NOTA: Evite as bolhas de ar ao selar, pois isso prejudicará a qualidade da imagem.

5. Imagem de fluorescência

NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para otimizar a configuração.

  1. Adquira imagens usando um microscópio confocal usando uma lente de imersão a óleo 40 ou 63X. Selecione os canais fluorescentes desejados para aquisição de imagem. Ao usar vários canais fluorescentes, selecione o modo de aquisição seqüencial.
    NOTA: Comece com as amostras experimentais onde os SGs foram induzidos os mais fortes para evitar a superexposição em amostras subseqüentes. Certifique-se de não ter SGs sobre-expostos em toda a profundidade da célula.
    1. Defina o tamanho do bit 12 ou superior dentro das configurações do microscópio para garantir a precisão da análise da imagem.
    2. Defina as pilhas da imagem para cobrir toda a profundidade da célula. Verifique os diferentes canais e para diferentes marcadores SG para garantir que todo o intervalo esteja incluído. Defina o início da pilha na base das células e a parte superior das pilhas na altura na parte superior das células onde não são observados mais marcadores SG.
    3. Adquira a pilha. Mantenha o tamanho da pilha igual para todas as imagens.
      NOTA: NãoAltere as configurações de aquisição entre o controle e as amostras experimentais que serão usadas para comparação subseqüente.

6. Análise de imagem

NOTA: Aqui, descreve-se a análise do SG em pilhas colapsadas usando freeware ICY. A análise de imagens de reconstruções 3D também pode ser feita usando outro software especializado. A detecção de SG pode ser realizada através de um fluxo de trabalho totalmente automatizado estabelecido para este protocolo (disponível em http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Para usar este protocolo, os núcleos precisam ser corados com uma mancha de DNA para o software para encontrar o centro de cada célula, e as bordas das células precisam ser marcadas por um marcador citoplasmático (como eIF3b) ou mancha de actina para o software Para identificar os limites das células. O fluxo de trabalho automático pode ser usado para validar resultados derivados manualmente ou diretamente para análise quando os limites celulares são detectados com alta confiança, o que seráStly depende da densidade das células e do marcador utilizado para detectar os limites das células.

  1. Usando ImageJ ou Fiji, colapse as pilhas de imagem (Imagem> Pilhas> projeção Z) e salve como .tiff arquivos.
    NOTA: Crie uma nova pasta para cada imagem, pois o software de análise de imagem irá vincular seus resultados ao site da imagem original.
  2. Carregue um controle e uma imagem experimental .tiff para a plataforma de análise de imagem (Arquivo> Abrir). Vá para a janela Seqüência. Desloque-se para baixo na "Tabela de Pesquisa" para os parâmetros do canal.
  3. Desative todos os canais clicando na caixa de seleção de todas as abas do canal. Clique no canal 0 e selecione a cor preferida clicando na barra de cores acima. Aumente a intensidade do canal conforme necessário para ver todas as estruturas clicando e movendo a linha no campo de intensidade. Repita isso para todos os canais.
    NOTA: Desative os canais que não são necessários para uma determinada tarefa para minimizar a polarização na análise de amostra.
  4. RolagemPara cima e dentro da guia Tela, amplie para aproximadamente 10 células por campo, ajustando a aba de zoom.
  5. Use as ferramentas de função de polígono (na barra superior) para delinear os limites celulares das células na imagem. Use a mancha de actina ou um marcador citosólico para delineação de limites celulares ( por exemplo, eIF3b).
    1. Clique na função polígono dentro das ferramentas "Arquivo e ROI". Comece a delineação clicando na célula e, em seguida, estenda a linha, criando âncoras através de um clique repetido em torno do limite da célula. Para terminar um ROI, clique novamente na função de polígono dentro das ferramentas "Arquivo e ROI".
      NOTA: Identifique as subpopulações das células delineadas que estão infectadas. A amostra consiste em uma mistura de células infectadas e não infectadas. Para identificar bactérias, use a mancha DAPI ou bactérias fluorescentes (como bactérias que expressam GFP). Aumente a intensidade para garantir que todas as bactérias sejam vistas.
    2. Para nomear um ROI, vá para a janela ROI à direita e cliCk na célula de interesse na imagem. Isso irá destacar o ROI correspondente na guia ROI. Clique duas vezes no nome do ROI e modifique o nome ( por exemplo, célula infectada # 1).
      NOTA: se uma imagem for usada para analisar células infectadas e não infectadas, é mais fácil salvar a imagem em duas pastas separadas e delinear separadamente as células infectadas e não infectadas, gerando duas planilhas diferentes, o que facilitará a análise mais tarde.
  6. Abra o aplicativo detector local na guia "Detecção e rastreamento" (barra superior). Dentro da guia Entrada, a imagem atual será selecionada. Não mude nada. Na guia Pré-processamento, selecione o canal a ser analisado.
    NOTA: Somente um canal pode ser analisado a qualquer momento. Uma análise de lote pode ser selecionada aqui se alguém usar a sequência de análise totalmente automatizada cujos parâmetros foram verificados para dar resultados satisfatórios.
    1. Na guia Detector, escolha "DeTect pontos brilhantes em fundo escuro ". Em seguida, selecione a escala apropriada e a sensibilidade. Faça isso testando diferentes configurações e verificação cruzada da detecção de pontos no controle e nas amostras experimentais.
      NOTA: Para uma imagem com uma resolução de 2.048 x 2.048 e um tamanho de pixel de 0,12 μm 2 , um limite de nível 2 com uma sensibilidade de 25 a 100 é geralmente apropriado, mas cada marcador SG deve ser testado empiricamente. Configure a detecção de pontos de modo que, na amostra de controle não tratada, manchas não sejam detectadas, enquanto na amostra experimental com SGs, todos os SGs pequenos e grandes são contados.
    2. Dentro da guia ROI, selecione o ROI sugerido a partir da seqüência. Na guia Filtragem, selecione Sem filtragem. Na guia Saída, escolha a saída apropriada.
      NOTA: escolher o arquivo Ativar específico é útil para salvar diferentes condições de detecção ou canais diferentes. Selecionar para exportar a imagem binária e a imagem original com ROIs e a detecção éPara análise de controle de qualidade.
    3. Selecione "Remover pontos anteriores renderizados como ROIs". Escolha a pasta para salvar o arquivo clicando no botão "sem arquivo selecionado". Dentro da guia Exibir, selecione as opções desejadas. Clique em "Iniciar detecção".
      NOTA: Será criada uma pasta com o nome e a localização escolhida que contém as opções de imagens exportadas. Essas imagens serão substituídas por cada nova condição testada. Para manter as imagens, renomeie a pasta para que uma nova pasta seja criada ou transfira as imagens da pasta salvar para uma nova pasta. Para o controle de qualidade das imagens, é útil selecionar a marca de detecção de exibição, o número de detecção de ROI e o número de ROI e o nome.
  7. Consolide e guarde os dados para os diferentes parâmetros usando a planilha gerada para cada imagem ou condição testada.
    NOTA: Os parâmetros a analisar incluem o número de SGs por ROI, as áreas de superfície do SG e o SG maxIntensidades médias e mínimas.
  8. Transfira os dados e analise usando um programa de análise capaz de analisar, representar e determinar a significância estatística.

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Representative Results

Para explicar e demonstrar o protocolo descrito neste manuscrito, caracterizamos a imagem de SGs induzidos por clotrimazol em células HeLa infectadas ou não com o patógeno citosólico S. flexneri . Um esboço do procedimento é apresentado na Figura 1 e inclui S. flexneri virulento e avirulento listado em placas de Red Congo, preparação de bactérias, infecção, adição de estresse ambiental, fixação e coloração de amostras, imagem de amostra e quantificação, bem como análise de imagem . Uma série de tensões diferentes podem ser usadas para induzir formação de SG e uma variedade de marcadores de SG estão disponíveis para interrogatório. EIF3b é um marcador SG canônico que também mancha claramente o compartimento citoplasmático da célula e pode ser usado para identificar as bordas das células. G3BP1 é um marcador de SG amplamente utilizado que se agrega em SGs sem coloração de fundo ( Figura 2 A, B D ). As células são melhoras com um microscópio confocal e as pilhas cobrindo a profundidade total da célula são carregadas no freeware de análise de imagem ICY ( Figura 2 A - C ). Para identificar melhor as células infectadas e colocar células no grupo infectado ou não infectado para posterior análise, é útil aumentar a intensidade da mancha de ácido nucleico ( Figura 2 D ). No software de análise de imagem, o detector de pontos é então usado para identificar SGs dentro de cada um dos ROIs designados ( Figura 2 E ) e uma imagem binária é gerada que exibe todos os SGs identificados ( Figura 2 F ).

A análise SG precisa ser adaptada a cada marcador de SG analisado e a configuração apropriada para análise deve ser cuidadosamente escolhida. Concentrando-se na SG MaO rker G3BP1, alterando o requisito de tamanho do ponto detectado ou alterando a sensibilidade dos parâmetros de detecção levará a resultados variáveis, conforme demonstrado na Figura 3 A-C . A seleção da escala (1 - 3, embora as escalas possam ser adicionadas) é baseada no tamanho do pixel e, portanto, em escalas mais altas, SGs menores não serão contados e os números de SGs diminuirão ( Figura 3 C ). A sensibilidade é medida de 1 a 100, sendo 100 o mais sensível. Ao aumentar a sensibilidade, o número de SGs detectados aumenta ( Figura 3 C ). Assim, as configurações corretas devem ser encontradas para minimizar falsos positivos e falsos negativos. Isso é melhor feito analisando cuidadosamente os recursos visuais obtidos para cada configuração. Para G3BP1, uma escala de 2 com uma sensibilidade de 100 (2 - 100, destacada em vermelho) deu o melhor resultado. Uma escala de 2 com menor sensibilidade (50 ou 25) deixada pequenaSG sem conta (veja as setas laranja). Da mesma forma, uma escala de 3 deixou pequena SG não registrada enquanto uma escala de 1 superamplejou. Importante, podem ser adicionadas escalas adicionais para se concentrar apenas em grandes SGs, se isso for garantido. Para eIF3b, uma escala de 2 com uma sensibilidade de 55 (2 - 55) deu o melhor resultado para eIF3b (realçado em vermelho), embora as setas vermelhas destaque sob ou oversampling em uma escala de 2 a 50 e 2 - 55, respectivamente.

Uma vez que os parâmetros para análises SG estão adequadamente definidos, os dados podem ser analisados ​​de várias maneiras ( Figura 4 ). O detector de pontos fornece o número de SGs detectados dentro de cada ROI, de modo que as células não infectadas e infectadas podem ser comparadas ( Figura 4 A ). Da mesma forma, o tamanho, neste caso, é dado número de pixels, a partir do qual a área de superfície pode ser calculada ( Figura 4 B ). Distribuição de frequência pOts também são úteis para destacar mudanças no tamanho de SGs encontrados em diferentes populações de células. Aqui, uma ausência completa de grandes SGs em células infectadas com S. flexneri , bem como uma mudança definitiva na distribuição torna-se mais clara ( Figura 4 C ). Além disso, a intensidade (mostrada aqui é a intensidade mínima e máxima) fornece informações sobre a qualidade dos SGs analisados. Para células infectadas com S. flexneri , os SGs são significativamente menos intensos. Essas análises fornecem informações estatisticamente relevantes sobre a natureza qualitativa e quantitativa das SGs formadas em resposta ao estresse exógeno quando as células são infectadas com ou sem S. flexneri .

figura 1
Figura 1 : Esboço do Procedimento Experimental para Infectar Células com S. Flexneri ePara analisar o efeito da infecção SG Formação. Uma colônia Congo-Vermelha e uma colônia não-safena Congo-negativa-vermelha, são colhidas e cultivadas O / N em caldo de soja tríptico. A cultura durante a noite é subcultivada até a fase exponencial tardia antes que as bactérias estejam revestidas com PLL para promover a aderência. As células hospedeiras cultivadas em lamelas de vidro em placas de 12 poços são infectadas com bactérias por 30 min. As células de controle não estão infectadas. As células são lavadas e tratadas com indutores de estresse para induzir a formação de SG, quer por substituição do meio com meio contendo estresse ou sujeição das células às condições de estresse, como o calor. As células são então fixadas, permeabilizadas, coradas com marcadores específicos de SG imunofluorescentes e imagens usando microscopia confocal. As projeções Z são feitas usando ImageJ e analisadas usando o detector local do software de análise de imagem. Os dados são então analisados. Clique aqui para ver um grandeE a versão desta figura.

Figura 2
Figura 2 : Análise do Detector de Pontos das Células HeLa Infectadas com S. Flexneri por 1,5 h antes da Adição de Clotrimazol por 1 h. A. Imagem imunofluorescente de uma projeção z mostrando células coradas com os marcadores SG eIF3b e G3BP1, DAPI e actina. B. A mesma imagem que em (A), mas sem a mancha de actina para destacar o uso de eIF3b para delinear limites celulares. C. Tira de tela do software de análise de imagem com o módulo detector de pontos. D. Gating das células infectadas e não infectadas como visto usando diferentes canais. Para ver todas as bactérias, aumenta a intensidade. As células com mais de 1 bactéria presentes na célula são rotuladas com uma estrela vermelha. E. Saída do spot detecAnálise de ROIs individuais, indicando o nome do ROI, o número de pontos e sua localização. F. Imagem dos pontos detectados nos ROIs. Barra de escala = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3
Figura 3 : Comparações de diferentes configurações de escala e sensibilidade do Detector de pontos para a detecção de SGs através de diferentes marcadores de SG. A. Zoom para células HeLa infectadas ou não com S. flexneri e coradas com DAPI e o marcador SG G3BP1 e analisadas em diferentes escalas (tamanho de pixel cortado, 1 - 3) e sensibilidade (1 - 100). Representação gráfica de números SG em células não infectadas e infectadas analisadas em diferentes escalas ( > B) e sensibilidades ( C ). Visuals ( D ) e representação gráfica ( E ) da detecção de número SG do marcador SG eIF3b para a mesma imagem ao alterar o limite de sensibilidade sem alterar o corte do tamanho do ponto. A escrita vermelha e os símbolos vermelhos indicam os melhores parâmetros. As setas vermelhas apontam para falsas positivas e flechas de laranja para a falta de detecção de SG. Os valores incluem média com desvio padrão. Os melhores resultados são destacados em vermelho. Análise estatística selecionada incluída para clareza usando o p-valores de teste de soma de classificação de Wilcoxon à esquerda e o teste F de variância à direita. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = não significativo. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Figura 4 : Análise de dados de SG gerados pelo detector de pontos obtidos a partir de células HeLa tratadas com Clotrimazol Infectadas com S. Flexneri . A. Número de SGs G3BP1 por célula em células HeLa infectadas e não infectadas. B. Área de superfície de G3BP1-SGs em células infectadas e não infectadas, e sua porcentagem de freqüência de distribuição ( C ). D. Valores de intensidade mínima e máxima (arbitrária) de G3BP1-SGs. Os valores incluem significados com erro padrão. Análise estatística selecionada incluída para clareza usando o p-valores de teste de soma de classificação de Wilcoxon à esquerda e o teste F de variância à direita. * = <0,05, ** = <0,01, *** = <0,001, ns = não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Discussion

O protocolo aqui descrito descreve a indução, localização e análise de SGs em células não infectadas e células infectadas com o patógeno citosólico S. flexneri na presença ou ausência de estresse exógeno. Com o uso de software de imagem livre, os protocolos permitem a análise qualitativa e quantitativa precisa da formação de SG para identificar e abordar de forma estatística as diferenças em determinados fenótipos.

Existem vários passos críticos dentro do protocolo para a infecção, peças de indução de SG e de imagem. Para a infecção, é importante que a interação bacteriana com células hospedeiras, como a invasão como o protocolo esboçado aqui, seja sincronizada tanto quanto possível. Isto é particularmente importante quando se investiga os efeitos do desafio bacteriano no início do processo de infecção. Nós anteriormente mostramos que alguns fenótipos, como a localização da eIF3b após a infecção por S. flexneri , são perturbados cedo durante o tipo selvagemDesafio de S. flexneri enquanto outros fenótipos, como a agregação de SGs contendo G3BP1, são mais afetados em pontos posteriores 3 . Assim, para descrever com precisão o efeito temporal do desafio bacteriano, a sincronização da infecção é aconselhável. Notavelmente, para analisar a formação de SG, as células devem estar em fase exponencial de crescimento e, portanto, a densidade celular no momento da adição de estresse também é um parâmetro importante. Também limita a análise do SG aos modelos de infecção celular não confluentes. Outro aspecto crítico é o co-processamento de amostras de controle e experimentais durante o processamento das amostras para a imagem e durante a aquisição da imagem. Para o processamento imunofluorescente, todas as amostras devem ser coradas com as mesmas diluições de trabalho de anticorpos durante a mesma quantidade de tempo e nas mesmas condições ( ou seja, RT Vs. 4 ° C), enquanto também cuida tratar cada lamínula de forma semelhante durante as etapas de lavagem e Montagem oF os lamínulas. Isso garantirá manchas imunofluorescentes comparáveis ​​que podem ser analisadas de forma qualitativa e quantitativa. As diferenças no meio de montagem podem ter efeitos significativos no branqueamento das amostras durante a aquisição da imagem e, portanto, devem ser mantidas constantes. Da mesma forma, a aquisição de imagens para todas as amostras a serem comparadas na análise deve ser realizada em uma única sessão e com as mesmas configurações para minimizar as diferenças decorrentes da força do laser ou da montagem da amostra.

Ao usar estresses exógenos, é importante armazenar adequadamente o reagente e freqüentemente fazer novos estoques de trabalho. Os períodos prolongados (> 4 meses para o clotrimazol, por exemplo) levam à diminuição da potência do medicamento e afetarão a formação do SG. Os reagentes devem ser adicionados ao meio de cultura imediatamente antes da adição às células; Se uma redução na formação de SG nas células de controle for observada ou a agregação de SGs parece aberrante, os reagentes devem ser testados quanto à sua CAAtividade e novas ações devem ser feitas.

Uma limitação é que a identificação de SG usando o detector de pontos torna-se menos confiável quando há muita fluorescência de fundo presente. Embora este não seja um problema para muitos marcadores de SG, alguns, como eIF3b, que é um marcador citosólico claro sob condições de indução de SG e não indutoras, são mais difíceis de analisar, como demonstrado na Figura 3 . Além disso, as escalas e sensibilidades precisam ser determinadas empiricamente para cada marcador SG. Outra limitação é que a análise através do software de análise de imagem é melhor com imagens 2D e, portanto, funciona bem em fatias ópticas ou pilhas colapsadas, o que, no entanto, resulta em perda de informação em 3D. A análise das projeções z, portanto, tende a exagerar o tamanho dos SGs e subestimar o número de SGs. A análise 3D de SGs pode ser realizada com Imaris para dar uma caracterização espacial ainda mais precisa, se for considerado necessário para um fenótipo particular. A caracterização de SG pode ser realizada de forma rápida e padronizada utilizando o detector de pontos automatizado do software de análise de imagem. Em contraste, métodos manuais para identificar e delinear SGs como executado anteriormente 4 , deixa a análise aberta para mais viés e é consideravelmente mais demorado. A análise SG usando o detector local também pode ser adaptada para incluir ou excluir pequenos agregados SG, selecionando diferentes limites de sensibilidade e tamanho, permitindo assim a flexibilidade na avaliação de diferentes aspectos da formação de SG. A análise SG também pode ser realizada de forma completamente automática usando um fluxo de trabalho automatizado estabelecido 3 . Dentro deste fluxo de trabalho, o centro da célula é identificado através de uma mancha DAPI e o programa deixa uma esfera maleável crescer para fora para delinear os limites das células com base em uma mancha citoplasmática (como eIF3b) ou actina. Ao mesmo tempo, usando uma análise semi-automatizada porDelineando manualmente células individuais para análise, pode ser vantajoso quando as células crescem em clusters e os limites das células são difíceis de delinear claramente o programa automatizado. Nessas circunstâncias, a definição de limites celulares manualmente pode eliminar falsos valores positivos ou negativos.

O protocolo pode ser adaptado a outras condições de indução de SG e a outros agentes patogênicos, incluindo vírus, bactérias, fermento e protozoários. De particular interesse podem ser outros agentes patogênicos citostáticos, como Rickettsia spp., Francisella tularensis , Burkholdieria pseudomallei e Listeria spp. 14 Para cada agente infeccioso, e possivelmente também linhas celulares diferentes, o protocolo de infecção terá que ser adaptado e os tempos de amostra dos estresses exógenos determinados empiricamente. Além disso, a caracterização de SG usando software de análise de imagem também pode ser estendida para imagens de células vivas no futuro. A análise de SG em tempo real seria necessáriaSeparar a expressão de um ou mais marcadores de SG com marcação fluorescente nas células hospedeiras, permitindo assim que as questões relativas à dinâmica temporal e especial da formação de SG sejam abordadas em diferentes condições experimentais. Seria necessária uma bactéria marcada de forma fluorescente para complementar a análise do SG em tempo real em células infectadas e não infectadas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

O PS é um destinatário da subvenção do Grand Challenge de Bill e Melinda Gates OPP1141322. O PV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da mobilidade pós-doutora da Fundação Nacional da Ciência Nacional da Suíça e uma bolsa de pós-doutorado Roux-Cantarini. O PJS é suportado por uma concessão HHMI e ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat  Santa Cruz sc-16377 Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat  Santa Cruz sc-16378 Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) Cell Signaling 3411 Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat  Santa Cruz sc-14211 Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit Abcam ab186856 Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit Cell Signaling 3592 Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit Santa Cruz sc-11373 Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) BD Biosciences 611126 Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat  Santa Cruz sc-1751 Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey Thermo Fisher A-11055 Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey Thermo Fisher A-11057 Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A-21202 Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A10037 Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey Thermo Fisher A31571 Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A-21206 Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey Thermo Fisher A10042 Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth BD Biosciences 211825 Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar BD Biosciences 236950 Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red SERVA Electrophoresis GmbH 27215.01 Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL) Sigma-Aldrich P1274 Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES Life Technologies 15630-056 PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 31885 Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS) Biowest S1810-100 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Life Technologies 11140 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D2650 Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite Sigma-Aldrich S7400 Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole Sigma-Aldrich C6019 Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA Electron Microscopy Scences 15714 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin Thermo Fisher A22287 Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI Sigma-Aldrich D9542 Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm Sigma-Aldrich BR701501 Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold Thermo Fisher 36930 Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate Sigma-Aldrich CLS3527 Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips NeuVitro 1001/12 Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps Sigma-Aldrich 81381 Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism GraphPad Software Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5 Leica Microsystems Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris Bitplane Professional image analysis program, application - data analysis
Excel Microsoft Data analysis and graphing program, application - data analysis

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References

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