लेजर स्थानीयकृत Psoralen adducts की एकल अणु विश्लेषण

Genetics

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Summary

लेजर अक्सर डीएनए की क्षति के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया के अध्ययन में किया जाता है। हालांकि, वे घावों जिसका रिक्ति, आवृत्ति, और टकराव से प्रतिकृति कांटे के साथ शायद ही कभी विशेषता है उत्पन्न करते हैं। यहाँ, हम एक दृष्टिकोण है कि लेजर स्थानीय interstrand crosslinks के साथ इन मानकों के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है का वर्णन।

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Huang, J., Gali, H., Gichimu, J., Bellani, M. A., Pokharel, D., Paramasivam, M., Seidman, M. M. Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts. J. Vis. Exp. (122), e55541, doi:10.3791/55541 (2017).

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Abstract

डीएनए नुकसान की प्रतिक्रिया (डीडीआर) बड़े पैमाने पर डबल भूग्रस्त टूटता (DSBs) जीवित कोशिकाओं में लेजर सूक्ष्म बीम विकिरण से प्रेरित के अध्ययन में बताया गया है। डीडीआर interstrand डीएनए crosslinks (ICLs) सहित सहसंयोजक डीएनए संशोधनों, विकृत हेलिक्स के लिए, साथ ही परिभाषित नहीं है। हम डीडीआर ICLs द्वारा प्रेरित, immunotagged psoralens की लेजर photoactivation के द्वारा स्थानीय अध्ययन किया है, जीवित कोशिकाओं के नाभिक में। आदेश अभिवर्तन वितरण और प्रतिकृति कांटा मुठभेड़ों बारे में बुनियादी सवालों को संबोधित करने के लिए, हम दो अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ लेजर स्थानीयकरण संयुक्त। डीएनए फाइबर अक्सर कम दालों के दौरान शामिल किया न्यूक्लीओसाइड analogues की इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रतिकृति कांटे की प्रगति प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Immunoquantum डॉट्स व्यापक रूप से एक अणु इमेजिंग के लिए नियोजित किया गया है। नए दृष्टिकोण में, लेजर स्थानीय ICLs ले जाने कोशिकाओं से डीएनए फाइबर खुर्दबीन स्लाइड पर फैले हुए हैं। टैग ICLs immunoquantum डॉट्स और वें के साथ प्रदर्शित किए जाते हैंई अंतर-घाव दूरी निर्धारित। ICLs साथ प्रतिकृति कांटा टकराव देखे जा सकते हैं और विभिन्न मुठभेड़ पैटर्न की पहचान की और quantitated।

Introduction

डीएनए विकिरण, पराबैंगनी प्रकाश, पर्यावरण के विषैले तत्वों, दहन उत्पाद, आदि इसके अतिरिक्त, यह भी अंतर्जात कट्टरपंथी ऑक्सीडेटिव चयापचय के द्वारा उत्पन्न प्रजातियों के द्वारा हमला किया जाता है के रूप में exogenous एजेंटों से लगातार हमले के अंतर्गत है। इन सभी संभावित रासायनिक या शारीरिक रूप से डीएनए 1 की अखंडता को बाधित करने के लिए है। जीनोम में अव्यवस्थाएं, डीएनए नुकसान की प्रतिक्रिया (डीडीआर), एक भर्ती और बाद अनुवादकीय संशोधन झरना सैकड़ों के साथ सक्रिय कर सकते हैं प्रोटीन और microRNAs घाव की मरम्मत में शामिल के हजारों यदि नहीं, तो, कोशिका चक्र, apoptosis, बुढ़ापा, और भड़काऊ रास्ते में से विनियमन 2।

डीडीआर बारे में हमारी जानकारी के अधिकांश DSBs के साथ अध्ययन से आता है। यह जीवित कोशिकाओं 3 में टूट जाता है शुरू, अनुक्रम विशिष्ट निकालने सहित, जीनोमिक डीएनए में के लिए प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता की वजह से बड़े हिस्से में है। इसके अलावा, propensitटूट के y डीडीआर प्रोटीन है, जो इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता की फोकी प्रेरित करने के लिए, गतिकी और जवाब प्रोटीन की आवश्यकताओं की पहचान करने के लिए बहुत उपयोगी है। डीडीआर के अध्ययन के लिए कुंजी प्रौद्योगिकियों में से एक बोनर और उनके सहयोगियों ने (आरओआई) जीवित कोशिकाओं 4 के नाभिक में एक लेजर बीम का इस्तेमाल किया एक "रुचि के क्षेत्र" में DSBs की एक पट्टी को निर्देशित करने के द्वारा शुरू की गई थी। वास्तव में, वे एक लंबी फोकस जिसमें डीडीआर के प्रोटीन इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पहचाना जा सकता है बनाया। इस मजबूत फॉस्फोरिलेटेड हिस्टोन H2AX की लेजर उजागर हुई कोशिकाओं में (γ-H2AX) पट्टी के अपने प्रदर्शन के रूप में रेखांकित किया गया था। तब से, लेजर दृष्टिकोण DSBs से प्रेरित डीडीआर के कई अध्ययन में प्रयुक्त किया गया है। हालांकि शक्तिशाली और लोकप्रिय है, और नाटकीय इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों का स्रोत है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सबसे प्रयोगों में लेजर तीव्रता निकाला जाता है तो के रूप में नमूदार परिणाम पाने के लिए, घाव पहचान के लिए चिंता का विषय के बिना,घनत्व, या रिक्ति। वास्तव में, यह इन अनुमानों बनाने के लिए मुश्किल हो सकता है। इस प्रकार वे काफी हद तक नजरअंदाज कर दिया जाता लेज़रों 5 से डीएनए में पेश घावों की बहुलता के बावजूद। यह साहित्य 6 में कई विरोधाभास योगदान देता है।

DSBs के विपरीत, डीएनए के सबसे रासायनिक संशोधनों डीडीआर प्रोटीन की असतत फोकी के गठन को प्रोत्साहित नहीं करते। यह घाव आवृत्तियों की हमारी वर्तमान समझ के प्रकाश में महत्वपूर्ण है। ऐसा अनुमान है कि संस्कृति में मानव कोशिकाओं कोशिका चक्र के अनुसार 50 DSBs, एस चरण 7, 8, 9 के दौरान बड़े पैमाने पर गठन उठाना। कम गैर proliferating कोशिकाओं में बनते हैं। यह nucleobase नुकसान या संशोधन की घटनाओं, जो सेल / दिन 1, 10 प्रति हजारों में हैं की संख्या के विपरीत है। इस प्रकार, हम के बारे में सबसे पताडीडीआर घटनाओं अपेक्षाकृत दुर्लभ है, और हेलिक्स विकृत घावों, जो कुल में कहीं अधिक आम हैं से प्रेरित उन के बारे में बहुत कम कर रहे हैं से प्रेरित।

आदेश सेलुलर प्रतिक्रिया जीनोमिक डीएनए के संशोधनों सहसंयोजक के बारे में प्रश्नों का उत्तर देने के लिए, हम एक हेलिक्स विकृत डीएनए अभिवर्तन कि निहित डीडीआर प्रेरण गतिविधि था के साथ काम करना चाहता था। इसके अलावा, प्रयोगात्मक डिजाइन की सुविधा के लिए और व्याख्या हम एक संरचना जिसका परिचय समय के संबंध में नियंत्रित किया जा सकता और दृश्य के लिए उत्तरदायी था में रुचि रखते थे। तदनुसार, हम psoralen के आधार पर एक रणनीति विकसित की है। स्थलों पर: Psoralens अच्छी तरह से पक्ष 5 'टीए प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित डीएनए intercalators विशेषता है। जैसे नाइट्रोजन सरसों और mitomycin सी (एमएमसी) वे डीएनए प्रतिक्रियाशील जब तक लंबे लहर यूवी (यूवीए) प्रकाश के संपर्क में नहीं हैं के रूप में अन्य crosslinking एजेंट के विपरीत। intercalated अणुओं विपरीत किस्में हेलिक्स विकृत interstrand crosslinks का उत्पादन करने पर थाइमिन अड्डों (ICLs के साथ प्रतिक्रिया) 11। Trimethyl हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया psoralen के साथ अधिकांश उत्पादों ICLs, अपेक्षाकृत कुछ monoadducts उत्पन्न कर रहे हैं (कम से कम 10%) 12, और एक किनारा पर आसन्न बेस के बीच intrastrand crosslinks का गठन नहीं कर रहे हैं। क्योंकि वे प्रतिकृति और प्रतिलेखन, psoralen और अन्य crosslinking एजेंट, सिस-प्लेटिनम और एमएमसी की तरह करने के लिए शक्तिशाली खंड हैं, आमतौर पर कीमोथेरेपी में किया जाता है। इस प्रकार psoralen सक्षम अध्ययन है कि एक हेलिक्स विकृत संरचना द्वारा डीडीआर की सक्रियता पीछा किया, और भी नैदानिक ​​महत्व के साथ एक यौगिक के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

हम एक अभिकर्मक जिसमें trimethyl psoralen Digoxigenin को (खुदाई) से जुड़ा हुआ था संश्लेषित, एक संयंत्र स्टेरोल स्तनधारी कोशिकाओं में नहीं मिला है और अक्सर एक immunotag रूप में इस्तेमाल किया। photoactivation के लिए आवश्यकता जीवित कोशिकाओं में नाभिक में परिभाषित लागत पर लाभ में psoralen ICLs की लेजर प्रकाश (365 एनएम) द्वारा स्थानीयकरण अनुमति देता है। ये IMM द्वारा प्रदर्शित किया जा सकताखुदाई टैग के खिलाफ unofluorescence। डीएनए की मरम्मत और डीडीआर प्रोटीन लेजर की धारियों स्थानीय ICLs 13, 14 में दिखाई दिया।

डीडीआर DSBs का उत्पादन किया जाता उच्च लेजर तीव्रता से सक्रिय पृथक या क्लस्टर क्षति 15, 16 की वजह से हो सकता है। नतीजतन, इन प्रयोगों से परिणाम की प्रासंगिकता स्वाभाविक रूप से घावों, वर्तमान में काफी कम एकाग्रता होने वाली है, अनिश्चित है। Psoralen अभिवर्तन आवृत्ति और डीएनए में अंतर के बारे में इसी तरह के सवाल करने के लिए, हम डीएनए फाइबर प्रौद्योगिकी 17 और immunoquantum डॉट्स का फायदा उठाया। क्वांटम डॉट्स फ्लोरोसेंट रंजक की तुलना में बहुत उज्जवल हैं और प्रकाश के संपर्क से प्रक्षालित नहीं हैं। इस प्रकार वे अक्सर एक अणु इमेजिंग 18 के लिए उपयोग किया जाता है, एक आवेदन जिसके लिए फ्लोरोसेंट रंजक अपर्याप्त चमकदार हैं। व्यक्तिगत डीएनए फाइबर ग्राम पर फैला किया जा सकता हैलड़की स्लाइड और फसल सेल से पहले incubations के दौरान शामिल किया न्यूक्लीओसाइड analogues के खिलाफ immunofluorescence द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता। हम खुदाई-psoralen के साथ कोशिकाओं का इलाज किया और लेजर सूक्ष्म विकिरण करने के लिए लागत पर लाभ से अवगत कराया। फाइबर कोशिकाओं और व्यक्तिगत खुदाई-psoralen adducts से तैयार किए गए immunoquantum डॉट्स के साथ देखे जा सकते थे। कोशिकाओं को उजागर अपेक्षाकृत कम बार (20-60 मिनट) के लिए analogues न्यूक्लीओसाइड लिए लेजर स्थानीय ICLs के आसपास के क्षेत्र में प्रतिकृति इलाकों के प्रदर्शन की अनुमति देता है।

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Protocol

1. खुदाई-TMP की तैयारी

  1. की 4'-chloromethyl-4,5 ', 8-trimethylpsoralen 50 मिलीग्राम (0.18 mmoles) और एक सूखी 25 एमएल दौर में 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-एमाइन की 590 मिलीग्राम (2.7 mmoles) मिक्स नाइट्रोजन के तहत -bottom कुप्पी। 12 घंटे के लिए 10 एमएल टोल्यूनि और भाटा जोड़ें। कम दबाव में एक रोटरी वाष्पक में विलायक निकालें।
    1. सिलिका जेल के ऊपर फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों शुद्ध। (: 1: 0.5 9) क्लोरोफॉर्म, मेथनॉल, और 28% अमोनिया समाधान के साथ स्तंभ Elute। कम दबाव में एक रोटरी वाष्पक में विलायक लुप्त हो, और ठीक हो शुद्ध 4 '- [N- (13 अमीनो 4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5', के रूप में 8 trimethylpsoralen एक हल्के पीले चिपचिपा तरल।
    2. '- [(13 अमीनो 4,7,10-trioxatrideca) N-] aminomethyl-4,5', में digoxigenin एनएचएस एस्टर के 5 मिलीग्राम (0.008 mmoles) के साथ 8-trimethylpsoralen 4 की 5.5 मिलीग्राम (0.012 mmoles) मिक्स नाइट्रोजन के तहत एक सूखी राउंड पेंदी वाले फ्लास्क। 0.5 एमएल निर्जल डाइमिथाइल formamide जोड़े (DMF) एकघ trimethylamine की 3.4 μL और 18 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हलचल।
    3. कम दबाव में एक रोटरी वाष्पक में विलायक निकालें।
    4. क्लोराइड की न्यूनतम राशि में अवशेषों भंग। क्षैतिज एक स्थिर चरण के रूप में सिलिका जेल के साथ एक प्रारंभिक पतली परत प्लेट के निचले भाग पर 2 μL स्थानों में समाधान को लागू करें। मेथनॉल: में क्लोरोफॉर्म प्रारंभिक टीएलसी भागो 28% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (8: 1: 0.1)।
    5. ऊर्ध्वाधर किनारों के अलावा थाली मास्क और छोटी तरंग दैर्ध्य के यूवी 254 एनएम दीपक के साथ उत्पाद की बैंड की पहचान। एक लेपनी साथ थाली से उत्पाद स्क्रैप और का उपयोग कर क्लोरोफॉर्म शुद्ध उत्पाद को अलग: मेथनॉल: 28% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (8: 1: 0.1) मिश्रण।
    6. कम दबाव में एक रोटरी वाष्पक में सॉल्वैंट्स निकालें। 50% EtOH के 1 एमएल में अवशिष्ट छर्रों भंग: एच 2 ओ, एक केन्द्रापसारक वाष्पक में 1.5 एमएल ट्यूब (~ 20 aliquots) और शुष्क में 50 μL aliquots में बांटना जब तक सभी विलायक सुखाया जाता है (~ 3 ज)।
    7. एच 2 हे और सूखी एक केन्द्रापसारक वाष्पक में फिर से: 50% EtOH के 200 μL में प्रत्येक विभाज्य redissolve। 50% EtOH के 200 μL में फिर से प्रत्येक विभाज्य भंग: एच 2 हे, लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एक केन्द्रापसारक वाष्पक और दुकान छर्रों में सूखा।
  2. एच 2 ओ एक 1 तैयार:: एच 2 ओ में भंग खुदाई-TMP के 100 कमजोर पड़ने और 250 एनएम पर आयुध डिपो को मापने के उपयोग के लिए, 50% EtOH के 50 μL में गोली भंग। खुदाई-TMP के विलुप्त होने गुणांक 25,000 है। यदि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत समाधान करीब एक महीने तक स्थिर है। प्रत्येक उपयोग करने से पहले 250 एनएम पर आयुध डिपो को मापने के द्वारा एकाग्रता को सत्यापित करें।
    1. शेयर एकाग्रता की गणना करें: पेट x 100 x10 6 / 25,000 = एकाग्रता (माइक्रोन में)। आमतौर पर शेयर समाधान के बारे में 3 मिमी है। यह आदेश माध्यम से जोड़ा EtOH की मात्रा कम करने के लिए इस श्रेणी में होना जरूरी है।

2. लेजर स्थानीयकृत खुदाई-TMP ICLs

  1. पीईएक एसआरएस नाइट्रोजन लेजर (337 एनएम) के साथ एक कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ rform लेजर स्थानीयकरण 365 एनएम की एक पंक्ति उत्सर्जन और 10 हर्ट्ज पर 3 एनएस दालों फायरिंग 0.7 NW की एक शक्ति के साथ, एक डाई सेल के माध्यम से पंप।
  2. एक 35 मिमी गिलास के किनारे पर एक ऊर्ध्वाधर चिह्न बनाएं एक अंकन कलम से सेल संस्कृति पकवान तह। एक हीरे की कलम से संस्कृति की सतह पर कांच के केंद्र में एक क्रॉस स्क्रैच इस तरह के पकवान के किनारे पर काला पट्टी क्रॉस के एक हाथ के शीर्ष पर है। पार कांच के विकास को सतह पर चिह्नित इतना है कि यह और कोशिकाओं में एक ही फोकल हवाई जहाज़ में हो जाएगा है।
  3. 70% EtOH के एक कुल्ला के साथ अंकन के बाद थाली नसबंदी। चढ़ाना कोशिकाओं से पहले सूखी।
  4. प्लेट कोशिकाओं (जैसे हेला या U2OS के रूप में मानक प्रयोगशाला उपभेदों) पार में एक या दो दिन से पहले संस्कृति व्यंजन चिह्नित। सेल को सक्रिय रूप से विभाजित किया जाना चाहिए और प्रयोग के दिन पर 50-70% संगामी। 1 माइक्रोन समान रूप से लेबल डीएनए के लिए 5-क्लोरो 2-डिऑक्सीयूरिडीन (CldU) के साथ सेते हैं 24 घंटे।
  5. जोड़ना50% EtOH में खुदाई-TMP: 20 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए एच 2 ओ सेल संस्कृति माध्यम से। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मध्यम ले आओ। इनक्यूबेटर में कोशिकाओं और जगह मध्यम बदलें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) 30 मिनट खुदाई-TMP संतुलित करने के लिए अनुमति देने के लिए के लिए।
  6. कोशिकाओं विकासशील कर रहे हैं, दृश्य के क्षेत्र में जो लेजर सक्रिय है की x / y निर्देशांक स्थापित। निर्माता की अंशांकन प्रक्रिया है, जिसमें लेजर सॉफ्टवेयर द्वारा निर्देशित है एक क्षैतिज और विकर्ण रेखा के साथ एक मिरर गिलास स्लाइड खोदना करने के लिए का पालन करें। दो पंक्तियों क्षेत्र है जिसमें लेजर लक्ष्य हमला कर सकता है की सीमाओं को परिभाषित करते हैं।
  7. नियंत्रित सीओ 2 और नमी के साथ पर्यावरण कक्ष में थाली जगह, 37 डिग्री सेल्सियस पर, माइक्रोस्कोप के मंच पर और पार के चौराहे पर 60x तेल उद्देश्य से ध्यान देते हैं।
  8. एक लागत पर लाभ, सॉफ्टवेयर में आकार टूल के अन्वेषक द्वारा स्थापित करने के लिए 365 एनएम लेजर बीम प्रत्यक्ष, 3 और की एक पट्टी के रूप में# 181; एमएक्स 0.6 सुक्ष्ममापी। लागत पर लाभ की रूपरेखा पार के चौराहे के तत्काल आसपास के क्षेत्र में स्थित कोशिकाओं के नाभिक में कर्सर द्वारा रखा गया है। नाभिक के माध्यम से लेजर रास्ते के मध्य में लक्षित करने के लिए जेड फोकल हवाई जहाज़ को समायोजित करें। 350-370 एनएम की सीमा में एक लेजर का उपयोग करें। 405 एनएम लेज़रों crosslinks 19 प्रेरित नहीं कर सकते हैं।
    नोट: हम उपकेन्द्रक, जो अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) इमेजिंग में nucleoplasm से प्रतिष्ठित किया जा सकता बाहर nucleoplasmic क्षेत्रों में लागत पर लाभ का पता लगाने।
  9. एक स्तर एक सेल (सेल काला कर और उसके बाद गायब हो जाएगा) मिटा करने के लिए पर्याप्त करने के लिए पावर सेटिंग में वृद्धि से ध्यान केंद्रित करने और लेजर की गतिविधि को सत्यापित करें। इस माइक्रोस्कोप के माध्यम से और फिर coverslip के माध्यम से और कोशिकाओं में लेजर के लिए एक अबाध प्रकाश पथ के लिए एक महत्वपूर्ण निदान हो सकता है।
    1. पावर सेटिंग सिर्फ psoralen और आईसीएल प्रेरित डीडीआर (यह प्रत्येक लेजर / माइक के लिए अनुभव निर्धारित किया जाना चाहिए सक्रिय करने के लिए पर्याप्त करने के लिए कमroscope संयोजन)। एक लेजर तीव्रता की स्थापना (यहाँ 1.7%) है कि psoralen के अभाव (γ-H2AX के गठन की निगरानी) में डीडीआर को सक्रिय नहीं है का उपयोग करें।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण दृढ़ संकल्प है और सेटिंग्स समायोजन करता है, तो लेजर स्रोत या प्रकाश पथ में एक घटक बदल गया है की आवश्यकता हो सकती। GFP के संचय में चिह्नित ऐसे XPC या FAN1, जो दोनों के तेजी से भर्ती किया जाता है (सेकंड में) के रूप में की मरम्मत प्रोटीन लेजर psoralen धारियों के लिए का पालन करें, लेकिन लेजर अकेले के संपर्क में लागत पर लाभ के लिए नहीं। डीडीआर के कुछ प्रोटीन, सेकंड के भीतर दिखाई देता है जबकि कई मिनट दूसरों के लिए आवश्यक हो सकता है। यह ब्याज की प्रत्येक प्रोटीन के लिए समय बेशक निर्धारण प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है। हम यह भी ध्यान दें कि है कि लेजर के संपर्क में नहीं थे कोशिकाओं में वहाँ जवाब प्रोटीन की कोई धारियों हैं।
  10. के बाद एक क्षेत्र में सभी कक्षों कदम एक नए क्षेत्र के लिए थाली लक्षित किया गया है, पार के चौराहे के पास रहने।
  11. प्रयोगों में determ के लिए बनाया गयाऑफ़लाइन अंतर घाव दूरी के वितरण चौराहे के आसपास 20-25 क्षेत्रों (4-5 कोशिकाओं / क्षेत्र) में लेजर करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब। आदेश स्थानीय ICLs के आसपास के क्षेत्र में प्रतिकृति पैटर्न विश्लेषण करने के लिए लेजर फायरिंग के बाद 10 माइक्रोन 5-iodo-2-डिऑक्सीयूरिडीन (आईडीयू) के साथ कोशिकाओं सेते हैं।
    नोट: को IDU के साथ ऊष्मायन के समय हद तक अनियन्त्रित है। हम 20 मिनट के रूप में कम और जब तक 60 के रूप में मिनट (नीचे देखें) के रूप में इस्तेमाल किया है। लंबे समय तक दालों (कुछ ही घंटों) अक्सर वालों, इस प्रकार छवि के लिए एक कांटे की प्रगति का अवसर खोने कई प्रतिकृति इलाकों में परिणाम। कुछ प्रयोगों में सीईएस प्रतिकृति इलाकों की नब्ज लेबलिंग के बाद खुदाई-TMP के लिए जोखिम से पहले लेबल डीएनए समान रूप से करने के लिए 24 घंटे के लिए CldU के साथ लेबल रहे हैं।

3. कोशिकाओं की फसल और डीएनए रेशों का स्ट्रेचिंग

  1. मंच से थाली निकालें, मध्यम हटाने, और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ धोएं। पीबीएस समाधान निकालें। एक वाणिज्यिक ट्रिप्सिन के एक 10 μL बूंद रखें/ कांच की सतह के बीच में पार के चौराहे पर EDTA समाधान।
  2. कमरे के तापमान (आर टी) में 3-4 मिनट के लिए सेते हैं और फिर pipet टिप में अलग कोशिकाओं के साथ ट्रिप्सिन समाधान आकर्षित। ट्रिप्सिन बेअसर करने के लिए कोई जरूरत नहीं है।
  3. एक silanized गिलास खुर्दबीन स्लाइड के एक छोर पर कोशिकाओं के साथ ट्रिप्सिन / EDTA के ड्रॉप रखें। ल्य्से कोशिकाओं और 0.5% एसडीएस समाधान के 10 μL के अलावा द्वारा डीएनए जारी करने और आरटी पर 3-4 मिनट के लिए सेते हैं pipet टिप के साथ धीरे मिश्रण, पूल सुखाने के लिए की परिधि की इजाजत दी।
  4. स्लाइड झुकाएँ 20º और तरल समाप्त करने के लिए नीचे चलाने के लिए अनुमति देते हैं। डीएनए फाइबर बढ़ाया / बह तरल के हाइड्रोडाइनमिक बलों द्वारा फैला रहे हैं। स्लाइड हवा शुष्क (~ 10 मिनट) करते हैं और 3 में ठीक: 10 मिनट के लिए 1 मेथनॉल / एसिटिक एसिड। ठीक समाधान और हवा शुष्क फिर से स्लाइड निकालें। इस बिंदु पर वे -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% EtOH में अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता। 70% EtOH से हटाने पर ne से पहले हवा शुष्क करने की अनुमतिxt कदम।
  5. पीबीएस में स्लाइड धो लें, और फिर आरटी पर 1 घंटे के लिए 2.5 एम एचसीएल में denature। इस उपचार depurinates डीएनए शामिल halogenated न्यूक्लियोबेस एंटीबॉडी के लिए सुलभ बना रही है।
  6. 0.4 एम Tris-एचसीएल, पीएच 7.4 में स्लाइड बेअसर। 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस में दो बार धोएं / 0.5% बीच 20 (PBST)।
  7. ब्लॉक 5% गोजातीय सीरम albumin (BSA) और पीबीएस में 10% बकरी सीरम के साथ स्लाइड। एक parafilm स्लाइड पर समान रूप अवरुद्ध समाधान फैलाने और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते के साथ धीरे स्लाइड कवर।
  8. 1 की Pipet 100 μL: चूहा विरोधी bromodeoxyuridine के समाधान को रोकने में 200 कमजोर पड़ने प्रत्येक स्लाइड के प्राथमिक एंटीबॉडी (विशेष रूप से CldU का पता लगाता है)। एक parafilm कमजोर पड़ने आरटी पर 1 घंटे के लिए एक humidified कक्ष में स्लाइड पर समान रूप से फैल और सेते के साथ धीरे स्लाइड कवर। parafilm निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए स्लाइड PBST में तीन बार धोएं।
  9. प्रत्येक स्लाइड का हल रोकने में: (100 1) बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा Fluor 647 Pipet 100 पतला की μL। आवरणएक parafilm के साथ धीरे स्लाइड और आरटी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं। स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए PBST में तीन बार धोएं।
  10. पतला (01:40) माउस विरोधी bromodeoxyuridine की Pipet 100 μL (पता लगाता है LDU और CldU यह दोहरी विशिष्टता पूर्व ऊष्मायन में चूहा विरोधी BrdU द्वारा CldU के अवरुद्ध आवश्यकता होती है।) प्राथमिक एंटीबॉडी और खरगोश विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी (1: 200 ) प्रत्येक स्लाइड का हल रोकने में। एक parafilm के साथ धीरे स्लाइड कवर और आरटी पर 1 घंटे के लिए एक humidified कक्ष में सेते हैं। स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए PBST में तीन बार धोएं।
  11. (: 100 1) बकरी विरोधी माउस एलेक्सा Fluor 488 andC (1: 5,000) बकरी विरोधी खरगोश जांच (जैसे, Qdot 655) प्रत्येक स्लाइड का हल अवरुद्ध में पतला के Pipet 100 μL। धीरे parafilm के साथ स्लाइड कवर और आरटी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं। स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए PBST में तीन बार धोएं।
  12. एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त PBST नाली। antifade बढ़ते मध्यम के 50 μL प्रत्येक स्लाइड पर जोड़ें और एक coverslip साथ कवर। छवि या के लिए दुकान-20 डिग्री सेल्सियस पर ज कोई 48 से अधिक है।

4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा फाइबर इमेजिंग

  1. FITC, Cy5 और क्यू डॉट 655 का पता लगाने के साथ एक संलग्न पूरी तरह से मोटर फिल्टर पहिया के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप पर एक 63X उद्देश्य के माध्यम से छवि अधिग्रहण को पूरा करें। उत्तेजना फिल्टर 425 एनएम है, और उत्सर्जन फिल्टर 20 उत्सर्जन चोटी 20 पर केन्द्रित एनएम के साथ 655 एनएम है।

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Representative Results

लेजर स्थानीय खुदाई-TMP (चित्रा 1 ए) ICLs खुदाई टैग psoralen से जुड़ा हुआ खिलाफ immunofluorescence द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता। हालांकि लेजर किसी भी समोच्च के एक इलाके में हड़ताल करने के लिए निर्देशित किया जा सकता है, धारियों कोशिकाओं में "प्राकृतिक" आकार नहीं हैं, और वैध संकेत आसानी से गैर विशिष्ट प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा बंधन की वजह से कलाकृतियों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। जब सही विशिष्टता से भी कम समय के एंटीबॉडी का उपयोग कर यह सुविधा उपयोगी है। डीडीआर, γ-H2AX की अच्छी तरह से ज्ञात मार्कर, खुदाई-TMP ICLs की एक पट्टी में का एक उदाहरण चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।

खुदाई के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेजर धारियों में टैग घावों आवृत्ति और adducts की दूरी के बारे में कोई निष्कर्ष अनुमति नहीं है। यह सुनिश्चित करने के इस संकल्प कोशिकाओं ICLs की शुरूआत करने से पहले 24 घंटे के लिए CldU के साथ इनक्यूबेट रहे थे। वें के खिलाफ धुंधलाई CldU खुदाई के दृश्य लंबे तंतुओं पर टैग घावों परमिट और इस तरह के DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) या YOYO {1,1' के रूप में प्रत्यक्ष दाग से स्पष्ट फाइबर पैटर्न पैदावार - (4,4,8 , 8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) भारतीय मानक ब्यूरो [4 - [(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene] -l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide}। लेजर photoactivation के द्वारा ICLs की शुरूआत के बाद, फाइबर लक्षित कोशिकाओं से फैल रहे थे। इस तरह के चित्र 2 में दिखाया उन लोगों के रूप फाइबर पर खुदाई संकेतों के विश्लेषण से पता चला है कि इंटर आईसीएल दूरी हमारे हाल के प्रकाशन 21 में वर्णित है, एक से अधिक 160 केबी के लिए कम से कम 10 केबी से लेकर। क्लस्टर adducts के लिए कोई सबूत नहीं था। इस प्रकार खुदाई टैग, और पट्टी में डीडीआर प्रोटीन का संचय की धारी, अच्छी तरह से अलग घावों की उपस्थिति परिलक्षित होता है, कम से कम के रूप में विस्तारित डीएनए के साथ मापा जाता है। सेलुलर क्रोमेटिन अगर ICLs nucleosomal सरणियों में गठन के संदर्भ में माना जाता है, एक 6 के साथविस्तारित डीएनए लंबाई के संपीड़न गुना, वे अभी भी डीएनए के लगभग 1.6 केबी के बराबर के द्वारा अलग किया जाएगा।

लेजर प्रेरित डीएनए की क्षति की विशेषता प्रयोगों आम तौर पर डीडीआर के शामिल होने का पालन करें। इन प्रयोगों को शायद ही कभी डीएनए प्रतिकृति के बारे में सवाल को लेकर चिंतित हैं। दूसरी ओर, डीएनए फाइबर assays आमतौर पर प्रतिकृति के अध्ययन के लिए किया जाता है। डीएनए में उनके शामिल करने में halogenated न्यूक्लीओसाइड analogues परिणाम से कम दालों के लिए कोशिकाओं के संपर्क में। डीएनए फाइबर की इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण हाल डीएनए संश्लेषण का प्रतिनिधित्व शामिल analogues के इलाकों का पता चलता है। यह पूछने के लिए ब्याज की थी अगर डीएनए प्रतिकृति लेजर स्थानीय आईसीएल धारियों में हुई, और यदि हां, तो क्या ICLs के आसपास के क्षेत्र में प्रतिकृति के पैटर्न हो सकता है? प्रकोष्ठों लंबे तंतुओं के प्रदर्शन की सुविधा के लिए CldU के साथ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट रहे थे। लेजर स्थानीय ICLs को IDU के 1 घंटे नाड़ी के बाद कोशिकाओं में शुरू किए गए थे। डीएनए च ibers लक्षित कोशिकाओं से तैयार किए गए और खुदाई में चिह्नित ICLs और प्रतिकृति इलाकों का प्रदर्शन किया। परिणाम संकेत दिया कि psoralen की लेजर सक्रियण प्रतिकृति बंद नहीं करता है या प्रतिकृति पैटर्न के समग्र आवृत्ति प्रभावित करते हैं। हम हाल ही में पता चला है के रूप में 21 1 बहुमत: प्रतिकृति एक 4 में दो तरफा पैटर्न के साथ एक तरफ हुआ, और यह भी ICLs के दोनों किनारों पर,।

आकृति 1
चित्रा 1: लेजर स्थानीयकृत खुदाई-TMP ICLs की पीढ़ी। (ए) खुदाई-trimethyl psoralen की संरचना। (बी) के लागत पर लाभ में γ-H2AX (हरा) का संचय लेजर स्थानीय ICLs (खुदाई, लाल) से युक्त। नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग है। brightfield तस्वीर हीरा कलम द्वारा किए गए निशान पर आंशिक रूप से एक सेल को दर्शाता है। उपकेन्द्रक, और उन्हें बाहर लागत पर लाभ के स्थान पर ध्यान दें।csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: लेजर स्थानीयकृत खुदाई-TMP सिग्नल के साथ डीएनए फाइबर। (ए) कोशिकाओं CldU के साथ 24 घंटे के डीएनए लेबल करने के लिए इनक्यूबेट रहे थे। फिर लेजर स्थानीय ICLs शुरू किए गए थे और (बी) कोशिकाओं काटा गया और फाइबर में फैल गया। (सी, डी) खुदाई संकेतों एक immunoquantum डॉट (लाल) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (हरा) द्वारा CldU के साथ प्रदर्शित किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

लेजर स्थानीयकरण प्रौद्योगिकी नाभिक कि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में दिखाई दे रहे हैं के साथ पक्षपाती कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता है। हम इस तरह polylysine या कोलेजन, या अधिक जटिल मिश्रण के रूप में सेल चिपकने वाला तैयारी के साथ कांच की सतह के लिए, इस तरह के प्राथमिक लिम्फोसाइटों, या ऐसे AD293 के रूप में शिथिल पक्षपाती संवर्धित कोशिकाओं के रूप में nonadherent कोशिकाओं, संलग्न करने के लिए कोशिश की है। हालांकि इन उपचार की सतह के लिए कोशिकाओं के लिए बाध्य कर सकते हैं, तो हम पाते हैं कि वे आम तौर पर यह बहुत मुश्किल नाभिक में ध्यान केंद्रित करने के बनाने गोल रहते हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं अक्सर विकास का माध्यम को हटाने के बाद प्रारंभिक धोने जीवित रहने के लिए असफल। हालांकि, पक्षपाती कोशिकाओं के लिए आवश्यकता के भीतर, हम सफलतापूर्वक मानक सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ-साथ इन अध्ययनों के लिए प्राथमिक कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है। यह माइकोप्लाज़्मा संदूषण के लिए कोशिकाओं का परीक्षण करने के लिए उपयोगी है। हम पाते हैं कि कोशिका प्रतिक्रियाओं इन संक्रमणों द्वारा बदल दिया गया है।

लेजर का केन्द्र विमान महत्वपूर्ण है। लक्ष्य के लिए हैनाभिक के भीतर ICLs जगह। बहुत अधिक और photoactivation के नाभिक से ऊपर हो जाएगा; बहुत कम है और यह कांच पर होगा। हम इसे उपयोगी कोशिका द्रव्य और नाभिक के चौराहे पर डीआईसी छवि का ध्यान केंद्रित पैनापन करने के लिए लगता है।

फाइबर assays मुश्किल नहीं हैं, लेकिन कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती पहले व्याख्या क्षेत्रों बरामद कर रहे हैं। यह इस तकनीक को ठीक से लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। लेजर प्रयोगों से बरामद कोशिकाओं की संख्या कम है और प्रत्येक नमूने एक स्लाइड से अपनी संपूर्णता में प्रयोग किया जाता है। नतीजतन यह प्रत्येक प्रयोग से उत्पादन अधिकतम करने के लिए आवश्यक है, के रूप में नमूने बाद में विश्लेषण के लिए बचाया aliquots के साथ, विभाजित नहीं किया जा सकता। हालांकि, घटनाओं के सैकड़ों एक भी नमूना से बरामद किया जा सकता है। प्रक्रिया के दो विशेषताएं केंद्रीय महत्व है। एक स्लाइड नीचे सेल lysate के प्रवाह की दर है। तो बहुत तेजी से, डीएनए के बहुत से स्लाइड चलेंगे। कांच स्लाइड की गुणवत्ता भी महत्वपूर्ण है। हम कभी-कभी receबहुत सारे है कि अप्रभावी कर रहे हैं ive। नतीजतन हर नई बहुत उपयोग करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए।

के रूप में वाणिज्यिक अभिकर्मकों-एंटीबॉडी, immunoquantum डॉट्स, आदि की विश्वसनीयता सभी प्रयोगशाला जोड़तोड़ के लिए सच है, हमेशा एक चिंता का विषय है। ये हमेशा स्थिर नहीं कर रहे हैं और प्रयोगात्मक विफलता आमतौर पर एक या एक और अभिकर्मक के साथ समस्याओं का पता लगाया है। immunoquantum डॉट्स विशेष रूप से समस्याग्रस्त हैं और एक से अधिक बहुत कुछ आदेश एक है कि स्वीकार्य है की पहचान करने में परीक्षण किया जाना पड़ सकता है। अप्रभावी बहुत सारे उच्च पृष्ठभूमि संकेतों द्वारा चिह्नित हैं। इन तंतुओं से संबद्ध नहीं हैं और स्लाइड कोई डीएनए है के क्षेत्रों पर देखा जाएगा।

लेज़र के उपयोग स्थानीय डीएनए की क्षति को पेश करने के लिए काफी लोकप्रिय हो गया है के बाद से यह बोनर समूह 4 द्वारा शुरू की गई थी। उन है, और सबसे बाद के प्रयोगों में लेजर शक्ति सेटिंग्स सेट कर रहे हैं ताकि डीडीआर सीधे प्रेरित करती थीं। हम एक शक्ति पर्याप्त रूप से कम सफलता की स्थापना का इस्तेमाल किया हैज कि डीडीआर की सक्रियता दोनों लेजर और psoralen पर निर्भर है। जैसा कि ऊपर चर्चा, psoralen adducts के बीच अलगाव का तर्क है कि हम अलग-अलग घटनाओं की प्रतिक्रिया देख रहे हैं। ICLs की संख्या कि अंतर्जात तिर्यक एजेंटों द्वारा बनते हैं ज्ञात नहीं है, हम ध्यान दें कि psoralen adducts का स्थानीयकरण कोशिकाओं के रूप में वे 6-8 घंटे (अप्रकाशित डेटा) के भीतर psoralen adducts को दूर करने में सक्षम हैं को मारने नहीं है, और वर्तमान और स्वस्थ 24 घंटे के बाद कर रहे हैं। इस प्रकार इस दृष्टिकोण बहुत कम प्रोटोकॉल है कि एजेंटों कि नाभिक और mitochondria भर डीएनए की क्षति को लागू करने के लिए जोखिम की आवश्यकता की तुलना में कोशिकाओं को विषाक्त है।

लेजर / psoralen संयोजन एक हेलिक्स विकृत संरचना कि डीडीआर को सक्रिय परिचय। इस संबंध में इस दृष्टिकोण से प्राप्त परिणामों हेलिक्स विकृत घावों की एक श्रृंखला के लिए लागू कर रहे हैं, डीडीआर की व्यापक प्रकृति को देखते हुए, एटीएम / DNAPK / एटीआर के सक्रियण के बाद 22 kinases।इस संबंध में डीएनए फाइबर दृष्टिकोण यहाँ वर्णित किसी भी डीएनए संरचना कि immunologic या रासायनिक या जैव रासायनिक का मतलब है कि प्रतिदीप्ति द्वारा प्रदर्शित किया जा सकता द्वारा पता लगाया जा सकता करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। ये यूवी शामिल हो सकते हैं 23, भारी alkylators 24, जी quadruplexes 25, और ऑक्सीडेटिव घावों 5 photoproducts।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgements

इस शोध एजिंग (Z01 AG000746-08) और Fanconi एनीमिया रिसर्च फंड पर एनआईएच, राष्ट्रीय संस्थान के अंदर रिसर्च प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digoxigenin NHS ester Sigma-Aldrich 11333054001
Chloro-psoralen Berry and Associates PS 5000
diaminoglycol Sigma-Aldrich 369519 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform Acros Organics 423550040
Methanol Fisher Scientific A4524
Ammonium solution Sigma-Aldrich 5002
TLC plates Analtech, Inc. P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL Chemglass Life Sciences CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder Perkin Elmer With Volocity Software
Micropoint Galvo  Andor Technologies with a Nitrogen pulsed laser 
dye cell Andor Technologies MP-2250-2-365
365 dye Andor Technologies MP-27-365-DYE
IdU  Sigma-Aldrich 17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated Matek P35G-1.5-10-C
microscope slides New Comer Supply Part # 5070 New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU) BD Biosciences 347580 1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU) Abcam ab6326 1 in 200 
Rabbit anti Dig antibody ThermoFisher Scientific 710019 1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG ThermoFisher Scientific Q-11421MP 1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG Jackson Immunoresearch 112-605-167 1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-545-166 1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200 Zeiss  with Axiovision software
Q-dot 655 filter Chroma 39107

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References

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