Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

Genetics

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Summary

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

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Huang, J., Gali, H., Gichimu, J., Bellani, M. A., Pokharel, D., Paramasivam, M., Seidman, M. M. Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts. J. Vis. Exp. (122), e55541, doi:10.3791/55541 (2017).

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Abstract

La risposta al danno del DNA (DDR) è stato ampiamente caratterizzato in studi di rotture dei filamenti doppi (DSB) indotta dal laser micro irradiazione con fascio di cellule vive. DDR a Helix distorsione modificazioni covalenti DNA, tra interstrand legami crociati DNA (ICL), non è così ben definita. Abbiamo studiato la DDR stimolato da ICL, localizzato dalla fotoattivazione laser di psoraleni immunotagged, nei nuclei delle cellule vive. Per affrontare domande fondamentali sulla distribuzione addotto e incontri replica forcella, abbiamo combinato localizzazione laser con altre due tecnologie. fibre di DNA sono spesso utilizzati per visualizzare l'avanzamento delle forche di replicazione mediante immunofluorescenza di analoghi nucleosidici, incorporati durante impulsi brevi. puntini Immunoquantum sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging singola molecola. Nel nuovo approccio, fibre di DNA da cellule portatrici laser localizzato ICLs sono distribuite su vetrini da microscopio. Le targhette ICL vengono visualizzati con punti immunoquantum e the distanze tra le lesioni determinate. collisioni replica forcella con ICL possono essere visualizzati e diversi modelli incontro identificate e quantificate.

Introduction

DNA è sotto costante aggressione dagli agenti esogeni come radiazione, luce ultravioletta, tossine ambientali, prodotti di combustione, ecc Inoltre, è attaccato anche da specie radicaliche endogene prodotte dal metabolismo ossidativo. Tutti questi hanno il potenziale di distruggere chimicamente o fisicamente l'integrità del DNA 1. Perturbazioni nel genoma possono attivare la risposta al danno del DNA (DDR), un reclutamento e post traslazionale modifica a cascata con centinaia, se non migliaia, di proteine ​​e microRNA coinvolti nella riparazione della lesione, regolazione del ciclo cellulare, apoptosi, senescenza e vie infiammatorie 2.

La maggior parte delle nostre informazioni sulla DDR viene da studi con DSB. Ciò è in gran parte a causa della disponibilità di tecnologie per introdurre le pause, comprese le pause sequenza specifica, nel DNA genomico nelle cellule viventi 3. Inoltre, il propensity di pause per indurre foci di proteine ​​DDR, che possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza, è stato molto utile per identificare la cinetica ei requisiti di proteine ​​rispondere. Una delle tecnologie chiave per lo studio della DDR è stato introdotto da Bonner e colleghi, che ha usato un raggio laser per dirigere una striscia di DSB in una "regione di interesse" (ROI) nei nuclei delle cellule viventi 4. In effetti, hanno creato un lungo fuoco in cui le proteine ​​del DDR potevano essere identificati mediante immunofluorescenza. Ciò è stato illustrato dalla loro dimostrazione della forte banda di fosforilata H2AX istone (γ-H2AX) nelle cellule esposte laser. Da allora, l'approccio laser è stata impiegata in numerosi studi della DDR indotti da DSBs. Anche se potente e popolare, e la fonte di immagini di immunofluorescenza drammatiche, va notato che nella maggior parte degli esperimenti l'intensità del laser viene regolata in modo da produrre risultati osservabili, senza preoccupazione per l'identità della lesione,densità, o spaziatura. In effetti, può essere difficile fare queste stime. Così essi sono in gran parte ignorati, nonostante la molteplicità delle lesioni introdotte nel DNA da laser 5. Ciò contribuisce a molte contraddizioni nella letteratura 6.

In contrasto DSB, la maggior parte delle modificazioni chimiche del DNA non stimolano la formazione di foci discreta di proteine ​​DDR. Questo è importante alla luce della nostra attuale comprensione delle frequenze lesione. È stato stimato che le cellule umane in coltura incorrere ben 50 DSBs per ciclo cellulare, formati principalmente durante la fase S 7, 8, 9. Meno sono formate in cellule non proliferanti. Ciò contrasta con il numero di perdite nucleobase o eventi di modifica, che sono nell'ordine delle decine di migliaia per cellula / giorno 1, 10. Così, sappiamo di più diDDR indotta da eventi che sono relativamente rare, e molto meno di quelli indotti dalla elica distorsione lesioni, che complessivamente sono molto più comuni.

Per affrontare domande circa la risposta cellulare al modificazioni covalenti di DNA genomico, abbiamo voluto lavorare con un'elica distorcere addotto del DNA che ha avuto l'attività DDR induzione intrinseca. Inoltre, per facilitare la progettazione sperimentale e interpretazione che sono interessati una struttura la cui introduzione potrebbe essere controllato rispetto al tempo ed era suscettibile di visualizzazione. Di conseguenza, abbiamo sviluppato una strategia basata su psoraleni. Psoraleni sono ben caratterizzati intercalanti del DNA fotoattivi favorendo 5' TA: AT siti. A differenza di altri agenti reticolanti quali mostarde azotate e mitomicina C (MMC) non sono DNA reattivi meno esposta a onde lunghe luce UV (UVA). Le molecole intercalate reagiscono con basi timina su filamenti opposti per produrre elica distorsione reticolazioni interstrand (ICL) 11. Con la psoralen trimetil utilizzato nei nostri esperimenti maggior parte dei prodotti sono ICL, relativamente pochi monoadducts vengono generati (meno del 10%), 12 e reticola intraelicoidali tra basi adiacenti su un filo non si formano. Perché sono potenti blocchi di replicazione e la trascrizione, psoraleni e altri agenti di reticolazione, come cis-platino e MMC, sono comunemente utilizzati in chemioterapia. Così psoralen abilitato studi che hanno seguito l'attivazione del DDR da una struttura distorsione elica, e anche fornito informazioni sulla risposta cellulare ad un composto con importanza clinica.

Abbiamo sintetizzato un reagente in cui trimetil psoraleni era legato alla digossigenina (DIG), uno steroli vegetali non trovato nelle cellule di mammifero e spesso usato come immunotag. Il requisito di fotoattivazione consente localizzazione dalla luce laser (365 nm) di ICLs psoraleni in ROI definita nei nuclei nelle cellule viventi. Questi possono essere visualizzati immunofluorescence contro il tag Dig. La riparazione del DNA e le proteine DDR apparsi nelle strisce di laser localizzati ICL 13, 14.

DDR attivato dalle intensità laser elevate utilizzate per produrre DSB potrebbe essere causa di danni isolati o cluster 15, 16. Di conseguenza, la pertinenza dei risultati di questi esperimenti presenti in natura, lesioni presenti a concentrazioni molto più basse, è incerto. Per far fronte a domande simili sulla frequenza addotto psoraleni e spaziatura in DNA, abbiamo approfittato della tecnologia in fibra DNA 17 e puntini immunoquantum. punti quantici sono molto maggiori coloranti fluorescenti e non sono sbiancati dall'esposizione alla luce. Così essi sono spesso utilizzati per l'imaging singola molecola 18, un'applicazione per cui coloranti fluorescenti sono sufficientemente brillante. fibre di DNA individuali possono essere allungati su gscivoli lass e possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro analoghi nucleosidici incorporati durante l'incubazione prima alla cella raccolto. Abbiamo trattato cellule con Dig-psoralene e esposti ROI fino micro laser irradiazione. Fibre sono state preparate dalle cellule e singoli addotti Dig-psoralene potrebbe essere visualizzato con i puntini immunoquantum. Esponendo le cellule ad analoghi nucleosidici per tempi relativamente brevi (20-60 min) permette la visualizzazione dei tratti di replica in prossimità del laser localizzato ICL.

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Protocol

1. Preparazione di Dig-TMP

  1. Mescolare 50 mg (0,18 mmoli) di 4'-clorometil-4,5' , 8-trimethylpsoralen e 590 mg (2,7 mmoli) di 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-ammina in 25 mL asciutto rotondo pallone -bottom sotto azoto. Aggiungere 10 ml di toluene e riflusso per 12 ore. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta.
    1. Purificare il residuo da cromatografia flash su colonna su gel di silice. Eluire la colonna con cloroformio, metanolo, e la soluzione di ammoniaca al 28% (9: 1: 0,5). Evaporare il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta, e recuperare il puro 4 '- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5', 8-trimethylpsoralen come giallo paglierino viscoso liquido.
    2. Mescolare 5,5 mg (0,012 mmoli) di 4 '- [N- (13-ammino-4,7,10-trioxatrideca)] amminometil-4,5', 8-trimethylpsoralen con 5 mg (0,008 mmoli) di estere NHS in digossigenina asciutto pallone a fondo tondo sotto azoto. Aggiungere 0,5 ml di dimetil formammide anidra (DMF) und 3.4 ml di trimetilammina e agitare a 50 ° C per 18 h.
    3. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotante sotto pressione ridotta.
    4. Sciogliere il residuo in quantità minima di diclorometano. Applicare la soluzione in 2 punti uL orizzontalmente lungo la parte inferiore di una piastra preparativa su strato sottile di gel di silice come fase stazionaria. Eseguire il TLC preparativa in cloroformio: metanolo: ammoniaca 28% (8: 1: 0,1).
    5. Mascherare la piastra tranne per i bordi verticali e identificare la banda di prodotto con lunghezza d'onda corta UV 254 nm lampada. Raschiare il prodotto dalla piastra con una spatola e isolare il prodotto puro con cloroformio: metanolo: idrossido di ammonio 28% (8: 1: 0,1) miscela.
    6. Rimuovere solventi in evaporatore rotante sotto pressione ridotta. Sciogliere il pellet residuo in 1 ml di 50% EtOH: H 2 O, dispensare in aliquote di 50 microlitri in provette da 1,5 mL (~ 20 Aliquote) e secco in un evaporatore centrifugo finché tutto il solvente è evaporato (~ 3 h).
    7. Riprendere ciascuna aliquota in 200 microlitri di 50% EtOH: H 2 O e asciugare nuovamente in un evaporatore centrifugo. Sciogliere ciascuna aliquota di nuovo in 200 ml di 50% EtOH: H 2 O, secco in un evaporatore e conservare centrifughe pellet a -20 ° C per una conservazione a lungo termine.
  2. Per l'uso, sciogliere il precipitato in 50 ml di 50% EtOH: H 2 O. Preparare una diluizione 1: 100 del disciolto Dig-TMP in H 2 O e misurare OD a 250 nm. Il coefficiente di estinzione di Dig-TMP è 25.000. La soluzione è stabile per circa un mese se conservato a -20 ° C. Verificare la concentrazione misurando OD a 250 nm prima di ogni uso.
    1. Calcola concentrazione stock: Abs x 100 x10 6 / 25.000 = concentrazione (in micron). In genere la soluzione di riserva è di circa 3 mm. È importante essere in questo intervallo per ridurre al minimo il volume di EtOH aggiunto al mezzo.

2. Laser localizzati Dig-TMP ICL

  1. Perform localizzazione laser con un microscopio confocale con un laser ad azoto SRS (337 nm) pompato attraverso una cella colorante che emette una linea di 365 nm e cottura 3 ns impulsi a 10 Hz, con una potenza di 0,7 nW.
  2. Fare un segno verticale sul lato di un vetro 35 millimetri a fondo piatto di coltura cellulare con un pennarello. Graffiare il cross al centro del vetro sulla superficie cultura con una penna diamante tale che la striscia nera sul lato del piatto è nella parte superiore di un braccio della croce. La croce è segnata sulla superficie di crescita del vetro in modo che le cellule e sarà nello stesso piano focale.
  3. Sterilizzare la piastra dopo marcatura con un risciacquo di 70% EtOH. Asciutto prima placcatura le cellule.
  4. cellule piastra (ceppi di laboratorio standard come HeLa o U2OS) nella croce assegnati in piatti di coltura di uno o due giorni prima. Cellulare dovrebbe essere attivamente dividendo e il 50-70% confluenti il ​​giorno dell'esperimento. Incubare 24 h con 1 uM 5-cloro-2-deossiuridina (CldU) per DNA etichetta uniformemente.
  5. InserisciDig-TMP in 50% EtOH: H 2 O per mezzo di coltura cellulare ad una concentrazione finale di 20 pM. Portare il mezzo a 37 ° C. Cambiare il mezzo sulle cellule e posto in incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 30 min per permettere il Dig-TMP equilibrare.
  6. Mentre le cellule sono incubando, stabilire le coordinate x / y del campo visivo in cui il laser è attivo. Seguire la procedura di calibrazione del produttore, in cui il laser è diretto dal software per incidere un vetrino a specchio lungo una linea orizzontale e diagonale. Le due linee definiscono i confini del campo in cui il laser può colpire un bersaglio.
  7. Si pone la placca nella camera ambientale, a 37 ° C con controllata CO 2 ed umidità, sul palco microscopio e mettere a fuoco con l'obiettivo 60X olio sulla intersezione della croce.
  8. Dirigere il fascio laser 365 nm ad una ROI, stabilita dallo sperimentatore con lo strumento forma nel software, per formare una striscia di 3 &# 181; mx 0,6 micron. Il contorno della ROI viene collocata dal cursore in nuclei delle cellule situate nelle immediate vicinanze dell'intersezione della croce. Regolare il piano focale z per indirizzare la metà laser attraverso il nucleo. Utilizzare un laser nel range di 350-370 nm. 405 nm laser non possono indurre reticolazioni 19.
    NOTA: Noi individuare il ROI nelle zone nucleoplasmic fuori della nucleoli, che può essere distinto da nucleoplasm in contrasto interferenziale differenziale (DIC) imaging.
  9. Verificare il focus e l'attività del laser, aumentando l'impostazione di potenza ad un livello sufficiente per cancellare una cella (la cella si scurisce e quindi scompaiono). Questo è un importante diagnostico per un percorso ottico senza ostacoli per il laser attraverso il microscopio e poi attraverso il vetrino e nelle cellule.
    1. Abbassare l'impostazione della potenza di appena sufficiente per attivare il psoraleni e l'ICL indotta DDR (questo deve essere determinato empiricamente per ogni laser / microfonoROSCOPE combinazione). Utilizzare un'intensità del laser impostazione (1,7% qui) che non attiva il DDR in assenza di psoralene (monitorato dalla formazione di γ-H2AX).
      NOTA: Questa è una determinazione importante e le impostazioni possono richiedere una regolazione se la sorgente laser o di un componente nel percorso ottico è cambiato. Seguire l'accumulo di GFP tag proteine ​​di riparazione come XPC o FAN1, entrambi i quali sono rapidamente reclutati (in secondi) alle strisce psoraleni laser, ma non al ROI esposto al solo laser. Alcune proteine ​​del DDR appaiono in pochi secondi, mentre diversi minuti possono essere richiesti per gli altri. E 'necessario effettuare determinazioni corso di tempo per ogni proteina di interesse. Si segnala altresì che in cellule che non sono stati esposti al laser non ci sono strisce di proteine ​​rispondere.
  10. Dopo che tutte le celle in un campo sono stati indirizzati spostare la piastra in un campo, rimanendo vicino alla intersezione della croce.
  11. Negli esperimenti progettati per determine la distribuzione delle distanze tra l'lesione esporre cellule al laser in 20-25 campi (4-5 cellule / campo) intorno all'intersezione. Al fine di analizzare i modelli di replica in prossimità delle ICL localizzate incubare le cellule con 10 micron 5-iodo-2-deossiuridina (IDU) dopo la cottura del laser.
    NOTA: Il tempo di incubazione con Idu è un po 'arbitraria. Abbiamo usato il più corto di 20 minuti e fino a 60 minuti (vedi sotto). impulsi più lunghi (poche ore) spesso sfociano in molteplici tratti di replica coalescenza, perdendo così l'opportunità di immagine il progresso di singole forcelle. In alcuni esperimenti ces sono etichettati con CldU per 24 ore in maniera uniforme DNA etichetta prima dell'esposizione a Dig-TMP seguita da etichettatura impulso di tratti di replica.

3. Raccolta di cellule e di fibre Stretching DNA

  1. Rimuovere la piastra dal palco, rimuovere il terreno, e lavare con tampone fosfato (PBS). Rimuovere la soluzione PBS. Mettere una goccia 10 ml di un tripsina commerciale/ EDTA sulla intersezione della croce al centro della superficie del vetro.
  2. Incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente (RT) e quindi disegnare la soluzione di tripsina con le cellule staccate nella punta della pipetta. Non v'è alcuna necessità di neutralizzare la tripsina.
  3. Posizionare la goccia di tripsina / EDTA con le cellule ad un'estremità di un silanizzata vetrino per microscopio. Lisare le cellule e rilasciare il DNA mediante aggiunta di 10 ml di soluzione 0,5% SDS e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente mescolando delicatamente con la punta della pipetta, consentendo la periferia della piscina ad asciugare.
  4. Inclinare il vetrino 20 ° e consentire al liquido di scorrere fino alla fine. Le fibre di DNA vengono estesi / allungato dalle forze idrodinamiche del liquido che scorre. Lasciare asciugare i vetrini all'aria (~ 10 min) e fissare in 3: 1 metanolo / acido acetico per 10 min. Rimuovere i vetrini dalla soluzione correzione e l'aria secca di nuovo. A questo punto si possono conservare indefinitamente in 70% EtOH a -20 ° C. Rimozione dal EtOH 70% lasciare asciugare all'aria prima della nestep xt.
  5. Lavare i vetrini in PBS, e quindi denaturate in 2.5 M HCl per 1 ha RT. Questo trattamento depurinates messa nucleobasi alogenati incorporate accessibili agli anticorpi DNA.
  6. Neutralizzare i vetrini in 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Lavare due volte in PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) per 5 minuti ciascuna.
  7. Blocco vetrini con 5% di albumina sierica bovina (BSA) e 10% siero di capra in PBS. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la soluzione di saturazione uniformemente sul vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
  8. Pipettare 100 ml di 1: 200 diluizione in soluzione bloccante di ratto anti-bromodeossiuridina (rileva specificamente CldU) anticorpo primario per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm per diffondere la diluizione uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Rimuovere il parafilm e lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuna.
  9. Pipettare 100 ml di diluito (1: 100) di capra anti-topo Alexa Fluor 647 in soluzione bloccante per ogni diapositiva. coprire ilscivola delicatamente con un parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno.
  10. Pipettare 100 ml di diluito (01:40) topo anti-bromodeossiuridina (rileva ldu e CldU Questa doppia specificità richiede il blocco CldU dal ratto contro BrdU in incubazione precedente.) Anticorpo primario e coniglio anti-DIG anticorpi (1: 200 ) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con un parafilm e incubare in una camera umidificata per 1 ha RT. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno.
  11. Dispensare 100 ml di diluito (1: 100) capra anti-topo Alexa Fluor 488 ec (1: 5.000) sonda anti-coniglio di capra (ad esempio, Qdot 655) in soluzione bloccante per ogni diapositiva. Coprire i vetrini delicatamente con parafilm e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte in PBST per 5 minuti ciascuno.
  12. Drenare eccesso PBST su un tovagliolo di carta. Aggiungere 50 ml di antifade mezzo di montaggio su ciascun vetrino e coprire con un coprioggetto. Immagine o negozio pernon più di 48 ore a -20 ° C.

4. Imaging fibra da microscopia a fluorescenza

  1. Eseguire l'acquisizione di immagini attraverso un obiettivo 63X su un microscopio invertito con annessa ruota portafiltri completamente motorizzato con FITC, Cy5 e Q Dot 655 rilevamento. Il filtro di eccitazione è 425 nm, e il filtro di emissione è 655 nm con 20 nm centrata in corrispondenza del picco di emissione 20.

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Representative Results

Localizzate Dig-TMP (Figura 1A) ICLs laser possono essere visualizzati mediante immunofluorescenza contro la Dig-tag collegato al psoraleni. Anche se il laser può essere diretto a colpire in un'area di qualsiasi contorno, le strisce non sono forme "naturali" nelle cellule, e segnali legittimi possono essere facilmente distinguibili da artefatti dovuti al legame non specifico degli anticorpi primari o secondari. Questa funzione è utile quando si utilizzano gli anticorpi di meno che perfetto specificità. Un esempio del marcatore noto della DDR, γ-H2AX, in una striscia di Dig-TMP ICLs è mostrato nella Figura 1B.

L'immunofluorescenza della Dig tag lesioni nelle strisce laser non permette alcuna conclusione circa la frequenza e la spaziatura degli addotti. Al fine di rendere queste cellule sono state incubate con determinazione CldU per 24 h prima dell'introduzione dei ICLs. La colorazione contro esimoe CldU permette la visualizzazione del Dig etichettato lesioni sulle fibre lunghe e produce modelli fibre chiare di macchie diretti come DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) o YOYO {1,1' - (4,4,8 , 8-tetrametil-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-metilbenzo-1,3-ossazol-2-il) metilidene] -l, 4-dihydroquinolinium] tetraioduro}. Dopo l'introduzione del ICLs dalla fotoattivazione laser, fibre sono state distribuite dalle cellule bersaglio. L'analisi dei segnali Dig sulle fibre come quelle mostrate in figura 2 ha rivelato che le distanze tra l'ICL variava da meno di 10 kb a più di 160 kb, come descritto nella nostra recente pubblicazione 21. Non c'era alcuna prova di addotti in cluster. Quindi la striscia del tag Dig, e l'accumulo delle proteine ​​DDR in striscia, riflette la presenza di lesioni ben separati, almeno come misurato lungo il DNA estesa. Considerata in termini di cromatina cellulare se i ICLs formate in matrici nucleosomal, con 6piega compressione della lunghezza DNA estesa, sarebbero comunque essere separati dal equivalente di circa 1,6 kb di DNA.

Gli esperimenti che caratterizzano laser danni al DNA indotti generalmente seguono l'induzione della DDR. Questi esperimenti sono raramente occupano di questioni riguardanti la replicazione del DNA. D'altra parte, i saggi di fibre di DNA sono tipicamente utilizzati per studi di replicazione. Esposizione delle cellule a brevi impulsi di alogenati analoghi nucleosidici risultati nel loro incorporazione nel DNA. immunofluorescenza di fibre di DNA rivela tratti di analoghi incorporati rappresentano la sintesi del DNA recente. E 'stato interessante chiedere se replicazione del DNA si è verificato nel laser localizzato strisce ICL, e in caso affermativo, quale sarebbe il modello di replica in prossimità delle ICL? Le cellule sono state incubate per 24 h con CldU per facilitare la visualizzazione di fibre lunghe. ICL laser localizzato sono stati introdotti nelle cellule seguita da un 1 h impulso di Idu. DNA f IBERS sono stati preparati dalle cellule bersaglio e la Dig contrassegnati ICL e delle vie di replica visualizzati. I risultati hanno indicato che l'attivazione del laser psoralen non si chiude la replica o influenzare la frequenza complessiva di modelli di replica. Replica è verificato su un lato, ed anche su entrambi i lati delle ICLs, con i modelli a doppio lato in un 4: 1 maggioranza abbiamo recentemente dimostrato 21.

Figura 1
Figura 1: Generazione di laser localizzate Dig-TMP ICLs. (A) Struttura di Dig-trimetil psoraleni. (B) L'accumulo di γ-H2AX (verde) del ROI contenente laser localizzato ICL (Dig, rosso). Il nucleo è macchiato con DAPI (blu). La foto mostra una cella campo chiaro parzialmente sul segno tracciato dalla penna di diamante. Si noti la nucleoli, e il posizionamento del ROI di fuori di esse.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Fibre DNA con segnali laser localizzata Dig-TMP. (A) Le cellule sono state incubate per 24 h con CldU per etichettare DNA. Poi laser localizzato ICL sono stati introdotti e (B) le cellule sono state raccolte e diffuse fibre. (C, D) I segnali Dig stati visualizzati con un puntino immunoquantum (rosso) e la CldU immunofluorescenza (verde). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La tecnologia di localizzazione laser richiede l'uso di cellule aderenti con nuclei che sono visibili in microscopia in campo chiaro. Abbiamo cercato di attaccare le cellule non aderenti, quali linfociti primari o cellule coltivate debolmente aderenti come AD293, alla superficie di vetro con preparazioni adesive cella come polilisina o collagene, o miscele più complesse. Anche se questi trattamenti possono legarsi alle cellule di superficie, troviamo che essi rimangono generalmente arrotondata che rende molto difficile mettere a fuoco nei nuclei. Inoltre, le cellule spesso non riescono a sopravvivere il lavaggio iniziale dopo la rimozione del mezzo di crescita. Tuttavia, all'interno del requisito di cellule aderenti, abbiamo utilizzato con successo una vasta gamma di linee di cellule normali e cellule primarie per questi studi. E 'utile per testare le cellule per la contaminazione da micoplasma. Troviamo che le risposte delle cellule sono alterate da queste infezioni.

Il piano focale del laser è importante. L'obiettivo è quello diposizionare le ICL all'interno del nucleo. Troppo elevato e la fotoattivazione sarà sopra il nucleo; troppo basso e sarà sul vetro. Per noi è utile per affinare la messa a fuoco dell'immagine DIC all'incrocio tra citoplasma e nel nucleo.

I saggi di fibre non sono difficili, ma richiedono una certa pratica prima campi interpretabili vengono recuperati. E 'importante implementare questa tecnica in modo corretto. Il numero di cellule recuperate dagli esperimenti laser è bassa e ciascun campione viene utilizzato nella sua interezza su una singola diapositiva. Di conseguenza, è essenziale per massimizzare il rendimento di ogni esperimento, come campioni non possono essere divisi, con aliquote salvate per una successiva analisi. Tuttavia, centinaia di eventi possono essere recuperati da un singolo campione. Due caratteristiche della procedura sono di importanza centrale. Una è la velocità di flusso del lisato cellulare giù la diapositiva. Se troppo veloce, la maggior parte del DNA verrà eseguito dal vetrino. La qualità dei vetrini è anche critico. Occasionalmente receive lotti che sono inefficaci. Di conseguenza, ogni nuovo lotto deve essere testato prima dell'uso.

Come è vero per tutte le manipolazioni di laboratorio l'affidabilità dei reagenti anticorpi commerciali, punti immunoquantum, ecc, è sempre una preoccupazione. Questi non sono sempre stabili e fallimento sperimentale è generalmente ricondotti a problemi con uno o un altro reagente. I punti immunoquantum sono particolarmente problematici e più di un lotto può avere bisogno di essere testati al fine di individuare quello che è accettabile. un sacco inefficaci sono contrassegnati da alti segnali di fondo. Questi non sono associati con fibre e saranno visti sulle regioni della slitta che non hanno DNA.

L'uso del laser per introdurre il danno al DNA locale è diventato molto popolare da quando è stato introdotto dal gruppo Bonner 4. In questi, e la maggior parte esperimenti successivi le impostazioni di alimentazione del laser sono impostate in modo da indurre direttamente la DDR. Abbiamo usato una regolazione sufficientemente bassa potenza such che l'attivazione del DDR dipende sia laser e psoraleni. Come discusso sopra, la separazione tra addotti psoraleni sostiene che stiamo guardando la risposta a singoli eventi. Mentre il numero di ICLs che sono formate da agenti reticolanti endogeni non è noto, notiamo che la localizzazione degli addotti psoraleni non uccide le cellule, in quanto sono in grado di rimuovere gli addotti psoraleni entro 6-8 h (dati non pubblicati) e sono presenti e sano 24 ore più tardi. Così questo approccio è molto meno tossico per le cellule di protocolli che prevedano l'esposizione ad agenti che introducono danno al DNA nel nucleo e mitocondri.

La combinazione laser / psoralen introdurre una struttura ad elica distorsione che attivano il DDR. A questo proposito i risultati ottenuti da questo approccio sono applicabili ad una gamma di lesioni elica distorsione, data la natura cascata della DDR, a seguito dell'attivazione del bancomat / DNAPK / ATR chinasi 22.A questo proposito l'approccio fibra DNA qui descritto potrebbe essere esteso a qualsiasi struttura del DNA che può essere rilevato mediante immunologici o chimici o biochimici che possono essere visualizzate mediante fluorescenza. Questi potrebbero includere UV Photoproducts 23, alkylators ingombranti 24, G quadruplex 25 e lesioni ossidativi 5.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on Aging (Z01 AG000746-08) e il Fondo di ricerca Anemia di Fanconi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digoxigenin NHS ester Sigma-Aldrich 11333054001
Chloro-psoralen Berry and Associates PS 5000
diaminoglycol Sigma-Aldrich 369519 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform Acros Organics 423550040
Methanol Fisher Scientific A4524
Ammonium solution Sigma-Aldrich 5002
TLC plates Analtech, Inc. P02511
Flass glass column 24/40, 100 mL Chemglass Life Sciences CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder Perkin Elmer With Volocity Software
Micropoint Galvo  Andor Technologies with a Nitrogen pulsed laser 
dye cell Andor Technologies MP-2250-2-365
365 dye Andor Technologies MP-27-365-DYE
IdU  Sigma-Aldrich 17125
35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated Matek P35G-1.5-10-C
microscope slides New Comer Supply Part # 5070 New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU) BD Biosciences 347580 1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU) Abcam ab6326 1 in 200 
Rabbit anti Dig antibody ThermoFisher Scientific 710019 1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG ThermoFisher Scientific Q-11421MP 1 in 5,000
AF647- goat anti Rat IgG Jackson Immunoresearch 112-605-167 1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-545-166 1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200 Zeiss  with Axiovision software
Q-dot 655 filter Chroma 39107

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References

  1. Lindahl, T. The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture). Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55, (30), 8528-8534 (2016).
  2. Sirbu, B. M., Cortez, D. DNA damage response: three levels of DNA repair regulation. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).
  3. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nat. Protoc. 3, (5), 915-922 (2008).
  4. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
  5. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).
  6. Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB? Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).
  7. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).
  8. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).
  9. Aguilera, A., Garcia-Muse, T. Causes of genome instability. Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).
  10. Swenberg, J. A., et al. Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment. Toxicol. Sci. 120, (1), S130-S145 (2011).
  11. Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions. J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).
  12. Lai, C., et al. Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation. Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).
  13. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).
  14. Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells. J Biol. Chem. 284, (41), 27908-27917 (2009).
  15. Nowsheen, S., et al. Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues. Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).
  16. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).
  17. Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique. J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).
  18. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Mol. Cell. 37, (5), 702-713 (2010).
  19. Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, (10), 4514-4518 (1992).
  20. Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).
  21. Huang, J., et al. Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks. Front Genet. 7, 84 (2016).
  22. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).
  23. Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts. Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).
  24. Poirier, M. C. Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples. Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).
  25. Henderson, A., et al. Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).

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