الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

Published 4/13/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

خلايا CD4 + T هي منسقين حاسم للاستجابة المناعية التكيفية. السذاجة خلايا CD4 + T قادرة على التطور إلى عدة خلايا التائية المستجيب مختلفة (على سبيل المثال TH1، TH2، Th17، وما إلى ذلك)، ولكل منها مجموعة خاصة بهم من السيتوكينات المميزة وعوامل النسخ، وهذا يتوقف على المكروية المحلية 1. القرارات النسب التي تجعل خلايا T حاسمة لكلا مناعة وقائية والتسامح في تقرير المصير. خلايا Th17 هي مجموعة فرعية واحدة من خلايا T المعروف لمكافحة البكتيريا خارج الخلية والفطريات، ولكن وتورط ردودهم غير لائقة أيضا في التسبب في أمراض المناعة الذاتية والتهابات متعددة مثل التصلب المتعدد والصدفية 2 و 3. خلايا Th17 الإنسان يمكن أن تتولد من خلايا CD4 + T ساذجة في المختبر عن طريق تزويدهم بيئة الاستقطاب المناسبة 4. فاريو لنا مزيج من السيتوكينات IL-1β، IL-23، وقد استخدمت TGFβ، وIL-6 لتطوير خلايا Th17 الإنسان. خلايا Th17 الإنسان تعبر عن CCR6، مستقبلات chemokine التي يشيع استخدامها لتحديد هذه الفئة من السكان الخلية ويتم تحديدها من خلال التعبير عن عامل من النسخ الرئيسي، RORγt (المشفرة بواسطة RORC) 6. خلايا Th17 لديها القدرة على التعبير عن السيتوكينات متعددة، ولكن IL-17A هو المستجيب خلوى-تحديد النسب التي تنتجها هذه الخلايا. درسنا التعبير عن كل علامات المصاحب Th17 الثلاثة (CCR6، RORγt، IL-17A) لتقييم متانة لدينا البشري Th17 في المختبر التمايز الفحص. بالإضافة إلى ذلك، نحن مثقف خلايا CD4 + T البشر في ظل ظروف غير الاستقطاب، حيث تم إضافة أي السيتوكينات أو الأجسام المضادة ومنع وسائل الإعلام ثقافة لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية منذ تعبير عن هذه العلامات Th17 يجب أن تكون منخفضة جدا أو غير موجودة.

ve_content "> طريقة واحدة لدراسة طبيعية تطوير خلية T الإنسان وعلم الأحياء هو التلاعب التعبير الجيني خلال تنميتها. قصيرة التدخل RNA (سيرنا) هي الاصطناعية جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تستهدف من mRNAs تشفير البروتين ويمكن استخدامها للحد من التعبير الجيني المحدد . MicroRNAs (miRNAs) هي الذاتية غير الترميز الرنا الصغيرة المعروفة لتعديل التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally. وقد ثبت miRNAs للعب دورا هاما في كل من الفئران وبيولوجيا الخلايا T الإنسان، بما في ذلك خلايا Th17 و أمر حاسم لدينا وسائل موثوق بها من التلاعب النشاط RNA الصغيرة في خلايا T الإنسان لدراسة آثارها على التعبير الجيني وفي نهاية المطاف على بيولوجيا الخلايا T البشري. هنا، نحن تصف بروتوكول سهل الاستخدام، بما يتفق وموثوق بها التي قمنا بتطويرها لإدخال الرنا صغيرة الاصطناعية والأحماض النووية مقفل (LNAs، تعديل كيميائيا الأحماض النووية مع زيادة الاستقرار)في الخلايا المناعية، وعلى وجه التحديد إلى خلايا Th17 الإنسان.

هناك عدة طرق بديلة لإدخال الرنا صغيرة في خلايا الثدييات، التي تقع عادة في فئات الكيميائية والبيولوجية، أو الفيزيائية (10). الطرق الكيميائية التي يشيع استخدامها، بما في ذلك تعداء القائم على الدهون وتعداء الكالسيوم فوسفات، تعتمد على خلق المجمعات الكيميائية DNA التي تؤخذ بشكل أكثر كفاءة من قبل الخلايا. بشكل عام، الطرق الكيميائية ليست كما فعالة لترنسفكأيشن من خلايا T الابتدائية. طريقة البيولوجي الأكثر شيوعا هو استخدام ناقلات فيروسية (مثل الفيروس الارتجاعي أو الفيروسة البطيئة)، الذي يدرج مباشرة RNA الأجانب إلى مجموعة كجزء من دورة تكرار الطبيعية. تنبيغ الفيروسية عادة ما يستغرق وقتا أطول لاستكمال، وخصوصا عندما العوامل واحد في الوقت المناسب لاستنساخ الجزيئي للالبلازميدات proviral. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للناقلات تنبيغ الفيروسية يحتمل أن تكون ضارة للباحثين البشري. Electroporation للهو م البدنيethod على إحداث غشاء permeabilization بإخضاع الخلايا لنبضات الجهد العالي، مما يسمح الأحماض النووية لدخول عابر في الخلية حيث يمكن أن تعمل على هدفهم. وكانت الأدوات Electroporation للالتقليدية غير فعالة لtransfecting الخلايا الليمفاوية الأولية. ومع ذلك، فقد ثبت الأمثل Electroporation للجيل القادم لتكون قادرة على transfecting خلايا T في كفاءة عالية جدا، وخصوصا عندما المواد التي سيتم transfected هو RNA الصغيرة. يستخدم الجيل القادم مصطلح فضفاض إلى التفريق بين أحدث منصات (على سبيل المثال، النيون، Amaxa) من آلات Electroporation للالتقليدية. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قابلة بسهولة للشاشات الإنتاجية المعتدلة مع ما يصل إلى ما يقرب من 120 الرنا صغيرة في تجربة واحدة، وغالبا ما تستخدم المواد الكيميائية الاصطناعية التحقق من صحتها. الأهم من ذلك، تعداء الناجح لا يمكن أن يتحقق في اقل من 16 ساعة بعد تفعيل الخلايا التائية. وعيب هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أنه لا يؤدي إلى incorporati الجينومية مستقرةعلى، وبالتالي فهو عابر. وبالتالي، فإن الأمر يستحق مزيدا من الجهد لخلق بناء التعبير مستقرة والتي يمكن تعبئتها في ناقلات فيروسية وأعرب بنجاح في خلايا T في الحالات التي تتطلب التعبير على المدى الطويل من الحمض النووي الريبي الصغيرة.

لقد استخدمت ترنسفكأيشن الجيل القادم (على سبيل المثال، النيون) لتسليم متنوعة RNA أو قليل النوكليوتيد LNA أدوات احدة أو المزدوج تقطعت بهم السبل الاصطناعية لأغراض مختلفة 11 و 12 و 13. تدخل RNA كفاءة يمكن أن يتسبب في الماوس الأساسي وخلايا T الإنسان باستخدام RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التدخل القصير (سيرنا). يصف هذا البروتوكول الظروف الأمثل لاستخدام هذه التقنية في خلايا Th17 الإنسان. بالإضافة إلى الرناوات siRNAs، وهي متاحة تجاريا يحاكي ميرنا الاصطناعية ومثبطات يمكن استخدامها لدراسة مكاسب ميرنا وفقدان الوظيفة. يحاكي ميرنا هي المزدوج تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي مشابهة جدا لالرناوات siRNAs، ولكن المصممد مع تسلسل miRNAs ناضجة الذاتية. مثبطات ميرنا وكيميائيا تعديل-RNA و / أو LNA أساس أليغنوكليوتيد واحدة الذين تقطعت بهم السبل التي تربط لmiRNAs الأم واستعداء وظيفتها. لقد وجدنا أن جميع هذه الأدوات يمكن استخدامها بشكل فعال في الخلايا الليمفاوية T الأساسي مثقف، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على خلايا Th17 الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يلتزم هذا البروتوكول إلى المبادئ التوجيهية UCSF لأخلاقيات البحث الإنسان.

1. إعداد T الثقافة الخليوي، عزل خلايا CD4 + T، وTh17 الاستقطاب

  1. في اليوم 0، معطف 6-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع 1.5 مل لكل بئر من مكافحة الإنسان CD3 (2 ميكروغرام / مل) وCD28 مكافحة الإنسان (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 ° C.
    1. بدلا من ذلك، معطف لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التفاف لوحات في بارافيلم.
  2. إعداد الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي في تعليمات الشركة الصانعة.
    تنبيه: العمل بعناية وضمان معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) يتم ارتداؤها عند التعامل مع الدم البشري لتجنب أي خطر من التعرض لمسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم.
  3. مرة واحدة وقد تم عزل الخلايا وحيدة النواة وغسلها، نفذ الإنسان CD4 + T العزلة الخلية سيلي السلبيةction استخدام عدة خلايا CD4 + T الإنسان التجارية.
    ملاحظة: إذا كان هناك أحمر تلوث خلايا الدم بعد عزل الخلايا وحيدة النواة، يمكن إجراء اختياري الأحمر تحلل خلايا الدم قبل الخطوات عزل خلايا CD4 + T. Resuspend الخلايا وحيدة النواة في 1 مل من العازلة العزلة (2٪ FBS في PBS). إضافة 5 مل من 1X حل الناشر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 5 مل من العازلة العزل والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه.
    1. Resuspend الخلايا وحيدة النواة في مناطق ذات كثافة من 50 × 10 6 في 500 ميكرولتر في المخزن المؤقت العزلة في جديد 5 مل أنبوب.
    2. إضافة 100 ميكرولتر من FBS و 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة في أنبوب ثم احتضان كل أنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر المداري لتخلط جيدا.
    3. بعد الحضانة، إضافة 3-4 مل من العازلة العزلة لغسل الخلايا. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه. نضح بعناية سوبrnatant.
    4. أثناء هذا الدوران، قبل غسل حبات مغناطيسية. تحويل المبلغ المطلوب من حبات مغناطيسية في أنبوب جديد (المستخدمة في 1: 1 مع الخلايا) وإضافة حجم مساو من العازلة العزلة لتغسل حبات. تخلط جيدا باستخدام micropipette 1 مل ثم وضع أنبوب في المغناطيس لا يقل عن 1 دقيقة. نضح بعناية طاف. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في نفس حجم نقل في البداية قبل الغسيل.
    5. إعادة تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت العزلة وإضافة 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي قبل غسلها.
    6. احتضان الخلايا مع حبات مغناطيسية لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة (18 ° C إلى 25 ° C) إلى المزيج جيدا.
    7. بعد الحضانة، الماصة بدقة الخلايا باستخدام micropipette 1 مل 10 مرات على الأقل. ثم إضافة 3-4 مل من العازلة العزل ووضع كل أنبوب في المغناطيس لمدة 2 دقيقة.
    8. بعناية نقل الخلايا CD4 + T مختارة سلبا التي هي فيطاف لأنبوب جديد.
  4. بمجرد الانتهاء من CD4 + T العزلة الخلية، عد الخلايا مع عدادة الكريات والحفاظ على الخلايا على الجليد.
  5. تغسل الصحون المغلفة الأجسام المضادة مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم يضاف 1.5 مل من 2X مزيج من Th17-استقطاب وسائل الإعلام إلى كل بئر: IFNγ مكافحة الإنسان (20 ميكروغرام / مل)، ومكافحة البشري IL-4 (20 ميكروغرام / مل)، والإنسان TGFβ (10 نانوغرام / مل) والبشرية IL-1β (40 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-23 (40 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-6 (50 نانوغرام / مل) كل تضعف في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل (تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 1 ملم الصوديوم البيروفات و 100 ميكرومتر 2-المركابتويثانول).
    ملاحظة: ترنسفكأيشن والتدخل RNA يفعل العمل في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل. الغرض من استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل مع هذا البروتوكول هو تحقيق أفضل إنتاج IL-17A.
  6. الطرد المركزي الخلايا CD4 + T الإنسان في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا. نضح بعناية supernatالنمل. ثم resuspend الخلايا في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل ولوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 6 في 1.5 مل لكل بئر بحيث الحجم النهائي هو 3 مل لكل بئر والسيتوكينات استقطاب الآن بتركيز نهائي 1X.
    1. وضع لوحات في 5٪ CO 37 ° C الحاضنة لمدة يومين.

2. خلايا Electroporation للفي المختبر الاستقطاب Th17 الإنسان

  1. في يوم 2، ومعطف 48-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع 250 ميكرولتر لكل بئر من مكافحة الإنسان CD3 (2 ميكروغرام / مل) وCD28 مكافحة الإنسان (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 ° C.
    1. بدلا من ذلك، معطف لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التفاف لوحات في بارافيلم.
  2. إعداد الرنا صغيرة لترنسفكأيشن. لكل ترنسفكأيشن، قسامة 1 ميكرولتر من 5 ميكرومتر حل سهم سيرنا في أنبوب مل microcentrifuge 1.5. تشمل المناسب المطابقة الكيمياء صغير مقاولات RNAرأ. منع جميع أنابيب على الجليد.
  3. تغسل الصحون المغلفة الأجسام المضادة مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 500 ميكرولتر من 1X Th17-استقطاب وسائل الإعلام إلى كل بئر: IFNγ مكافحة الإنسان (10 ميكروغرام / مل)، ومكافحة البشري IL-4 (10 ميكروغرام / مل)، TGFβ البشري (5 نانوغرام / مل)، ايل الإنسان 1β (20 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-23 (20 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-6 (25 نانوغرام / مل) كل تضعف في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل (تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 1 ملم البيروفات الصوديوم و 100 ميكرومتر 2-المركابتويثانول).
  4. بعد إعداد لوحات ثقافة والكواشف ترنسفكأيشن، resuspend الخلايا مع 1 مل micropipette، pipetting بلطف ولكن التأكد من أن جميع الخلايا وفصل من الجزء السفلي من الآبار. تجميع خلايا في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: للحصول على فترات أطول من ثقافة البروتوكول لمدة أربعة أيام المقدمة هنا، ينبغي transfected الخلايا تقريبا كل 3 أيام باستخدام هذا البروتوكول نفسه. الخطوة 20.4 يجب أن يتم تعديل ذلك منذ الخلايا تعامل مع الرنا صغيرة مختلفة لا ينبغي المجمعة. جميع الشروط التي يجري اختبارها يجب جمعها وعدها، وtransfected بشكل منفصل.
  5. نضح بعناية طاف، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في لا يقل عن 1 مل من برنامج تلفزيوني لغسل. عد الخلايا الحية Th17 (على سبيل المثال مع عدادة الكريات باستخدام استبعاد التريبان الأزرق لتقييم جدوى) ثم نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه.
  7. نضح بعناية طاف، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام المخزن المؤقت إعادة تعليق المقدمة من عدة ميكرولتر نظام ترنسفكأيشن 10 في مناطق ذات كثافة من 2،5-4 × 10 7 خلايا لكل مليلتر. حفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: كما توجيهي، في محاولة لإعداد فقط العديد من الخلايا كما يمكن transfected في غضون 30 دقيقة. ويمكن مقارنة دفعات متعددة.
  8. إضافة 9 ميكرولتر من الخلايا إلى 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغيرة في كل microcأنبوب entrifuge. الماصة مرة واحدة لمزج الخلايا والرنا صغيرة لترنسفكأيشن ثم تحميل في المقدمة طرف ماصة الكهربائي.
    ملاحظة: عادة، إضافة 9.5 ميكرولتر من تعليق خلية لضمان وجود ما يكفي من الخليط لمنع خلق فقاعات في الماصة القطب غيض قبل ترنسفكأيشن.
  9. ملء كفيت المقدمة مع 3 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة كهربائيا E. مكان كفيت داخل محطة ماصة ثم ضع ماصة في الموقف داخل كفيت.
  10. على الفور electroporate كل مزيج 10 ميكرولتر من الخلايا والحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام المعلمات التالية: نبض الجهد 1،500-1،550 V، عرض النبض 10 مللي، ومجموع 3 البقول على الجهاز ترنسفكأيشن.
  11. بعد Electroporation للاكتمال، إضافة مباشر على خليط الخلية إلى 500 ميكرولتر من 1X Th17-استقطاب وسائل الإعلام في الآبار المعدة لوحة الثقافة. لوحات مكان في 5٪ CO 37 ° C الحاضنة لمدة يومين آخرين.
    ملاحظة: غسل طرف ماصة الكهربائي من قبل pipettingصعودا وهبوطا في برنامج تلفزيوني بين كل ترنسفكأيشن.

3. خلايا حصاد Th17 الإنسان

  1. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة مع micropipette، pipetting بلطف ولكن التأكد من أن جميع الخلايا وفصل من الجزء السفلي من الآبار. إعداد الخلايا لفحوصات التعبير وظيفية و / أو الجينات.
    ملاحظة: بشكل روتيني، وحقق ما يكفي من الخلايا من بئر واحدة من خلايا Th17 transfected لاستخدامها لتحليل تدفق cytometric من علامة السطحية والخلايا خلوى وعامل النسخ تلطيخ أو لإعداد RNA لتحليل التعبير الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكانت الخطوة الأولى لوضع نظام فعال للelectroporating خلايا Th17 الإنسان بنجاح لتوليد قوة في المختبر متباينة الثقافات خلية Th17 الإنسان. أعربت T الخلايا المستزرعة تحت ظروف Th17-استقطاب مستقبلات chemokine CCR6 وعامل النسخ RORγt (الشكل 1A، يسار). لم التعبير عن هذه العلامات عندما مثقف خلايا T في ظل ظروف غير الاستقطاب (THN) (الشكل 1A، يمين). T الخلايا المستزرعة تحت ظروف Th17-استقطاب تنتج أيضا IL-17A على restimulation (الشكل 1B، يسار) ولكن ليس في ظل ظروف THN (الشكل 1B، يمين). لا يزال يحدث Th17 التمايز بعد ترنسفكأيشن مع الرنا صغيرة ولكن في بعض التجارب، هناك انخفاض الملحوظ في وتيرة إنتاج IL-17A (الشكل 1C). تأثير ترنسفكأيشن RNA صغير على إنتاج السيتوكينات يوضح المجمدةتفاوت وجود سيطرة RNA الصغيرة مطابقة الكيمياء للمقارنة في كل تجربة. الأهم من ذلك، هو الحفاظ على بقاء بعد ترنسفكأيشن مع الرنا الصغيرة وعادة ما يكون أكبر من 70٪ (الشكل 1D).

لتحديد كفاءة هذا البروتوكول، وكنا تدخل الحمض النووي الريبي. يتم ترميز مستضد CD45 من قبل PTPRC (بروتين تيروزين الفوسفاتيز، نوع مستقبلات C) الجينات. وأعرب عن CD45 على جميع الخلايا المكونة للدم والخلايا Th17 بالتالي الإنسان ينبغي أن تعبر بقوة هذه العلامة السطح. خفضت ترنسفكأيشن من خلايا Th17 الإنسان في يوم 2 مع بركة سباحة في سيرنا استهداف PTPRC بقوة التعبير عن CD45 مقارنة الكيمياء مطابقة تحكم سيرنا (الشكل 2A). هذا التحول السكاني أحادي الواسطة في التعبير CD45 يشير قرب 100٪ كفاءة ترنسفكأيشن، نموذجية من هذا البروتوكول لالرنا الصغيرة. وهكذا، وهذا هو أداة هامة التي يمكن استخدامها لتقييم ترنسفكأيشن ممثل المؤسسةiciency خلال تحسينات بروتوكول. RORC يشفر RORγt، عامل النسخ السائد للخلايا Th17 الإنسان، الذي ينظم مباشرة إنتاج IL-17A. Transfecting تطوير خلايا Th17 الإنسان مع حوض سباحة سيرنا ضد RORC خفض بقوة التعبير RORγt كما هو متوقع (الشكل 2B). وكان الحد التعبير RORγt التي كتبها رني تأثير وظيفي، وهذه الخلايا عرضت خفض إنتاج IL-17A (الشكل 2C) مقارنة مع خلايا transfected مع عنصر تحكم سيرنا. يجب عدم الاستقطاب خلايا CD4 + T تعبر عن أي RORγt أو IL-17A وتظهر كعنصر تحكم السلبية في هذا الرقم.

شكل 1
الشكل 1: في المختبر خلايا متباينة Th17 الإنسان اكسبرس CCR6، RORγt، وIL-17A. كان المثقف CD4 + T الإنسان خلايا معزولة من دم الحبل السري undeشروط ص Th17 (IL-1β، IL-23، IL-6، وTGFβ) أو في ظروف غير الاستقطاب (THN) (وسائل الإعلام فقط، لا السيتوكينات استقطاب أو منع الأجسام المضادة المضافة) في المختبر وتحليلها في يوم 4 لTh17 علامة التعبير التدفق الخلوي: (A) CCR6 الممثل المؤامرات كفاف عرض سطح وداخل الخلايا RORγt شارك في تلطيخ الخلايا CD4 + T. أرقام في الأرباع تشير المئة CCR6 و / أو خلايا RORγt إيجابية الحية القميص CD4 +. (B) IL-17A وIFNγ الإنتاج بعد restimulation مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin. أرقام في الأرباع تشير المئة IL-17A و / أو القميص الحية IFNγ إيجابية CD4 + الخلايا. (C) التمثيلية يعرض مؤامرة كفاف سطح CCR6 والخلايا RORγt شارك في تلطيخ الخلايا CD4 + T بعد ترنسفكأيشن مع التحكم RNA الصغيرة. أرقام في الأرباع تشير المئة CCR6 و / أو RORγt إيجابية الحية القميص CD4 + الخلايا (يسار). الممثلين،تعرض TIVE كفاف مؤامرة IL-17A وIFNγ الإنتاج بعد restimulation مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin بعد ترنسفكأيشن مع التحكم RNA الصغيرة. أرقام في الأرباع تشير المئة IL-17A و / أو القميص الحية IFNγ إيجابية CD4 + الخلايا (يمين). (D) التمثيلية كفاف مؤامرة تعرض سلامة CD4 + الخلايا بعد ترنسفكأيشن مع التحكم RNA الصغيرة. عدد يشير في المئة CD4 + خلايا القميص الحية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: RNA التدخل في الخلايا الأولية Th17 الإنسان. و transfected خلايا CD4 + T الإنسان من دم الحبل السري مثقف في ظل ظروف Th17 في يوم 2 مع عنصر تحكم سيرنا nontargeting (siNeg CTL) أو تجمع تستهدف ضد PTPRC (سي PTPRC) أو RORC (سي RORC) تتألف من 4 الرناوات siRNAs الفردية. ثم تم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي في يوم 4: (A) CD45 السطحية التعبير هو مبين في الرسم البياني التمثيلي بعد ترنسفكأيشن مع الاشتراكية PTPRC (لون رمادي) أو siNeg CTL (خط أسود). ويرد (B) بين الخلايا RORγt التعبير في الرسم البياني التمثيلي بعد ترنسفكأيشن مع الاشتراكية RORC (لون رمادي) أو siNeg CTL (خط أسود). (C) المؤامرات كفاف التمثيلية عرض سطح CD4 والخلايا RORγt شارك في تلطيخ الخلايا CD4 + T (أعلى هيئة) أو IL-17A والإنتاج IFNγ بعد restimulation مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin (اللوحة السفلية). أرقام في الأرباع تشير المئة CD4 + RORγt + أو IL-17A و / أو إيجابية IFNγ خلايا القميص يعيش تحت THN أو Th17 الظروف transfected مع siNeg CTL أو سي RORC.fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول وسيلة إيجابية للتسليم الرنا صغيرة إلى خلايا Th17 الإنسان. رغم استخدام خلايا Th17 الإنسان هنا، وهذه الطريقة من Electroporation للمع الرنا صغيرة يمكن استخدامها مع غيرها من مجموعات فرعية المساعد الإنسان الأساسي T، مثل TH1، TH2، وTregs. لم يعمل جيدا لخلايا CD4 + T السذاجة بحيث يجب تنشيط الخلايا في الثقافة قبل ترنسفكأيشن. لهذا البروتوكول، ونحن أول الأمثل في المختبر نظام ثقافة لأفضل إنتاج IL-17A. وكان أكبر عامل وسائل الإعلام القاعدة. لقد وجدنا أن وسائل الإعلام كانت خالية من المصل متفوقة على خلايا Th17 الإنسان التقليدية وسائل الاعلام للتحريض أفضل من IL-17A إنتاج المحتوية على مصل. منذ خلايا Th17 يمكن أن تتولد مع مجموعات فرعية من السيتوكينات TGFβ، IL-1β، IL-23، وIL-6، نحن اختبار يمزج خلوى مختلفة. في هذه الدراسة، حققنا أكثر قوة إنتاج IL-17A عندما أدرجت جميع السيتوكينات أربعة الاستقطاب. بالإضافة إلى ذلك، نحن الأمثل تقصير طولالثقافة لضمان وترنسفكأيشن واحد فقط ضروري خلال الفترة الثقافة. بينما يسمح هذا البروتوكول لمدة أربعة أيام النتائج إلى أن تتولد بشكل أسرع ويتطلب فقط ترنسفكأيشن واحد، يمكن أن تطول مدة الثقافة لزيادة إنتاج IL-17A. قد تكون هناك فترة أطول الثقافة حتى ضروري لتحقيق التمايز الأمثل لأخرى فرعية الخلايا T الأساسي. وبما أن هذه تعداء عابر، قد تكون هناك حاجة تعداء متعددة على مر الزمن لفترات طويلة الثقافة. نقترح تجديد الكواشف RNA صغيرة بعد حوالي 3 أيام من خلال إعادة electroporating-الخلايا مع كاشف لمنع تخفيف الانقسامات خلايا متعددة. قمنا به بشكل روتيني هذا فأرة الحاسوب خلايا CD4 + T. على الرغم من أنه أكثر من الناحية الفنية تحديا منذ الخلايا في كل حالة يجب أن تجمع وتحسب على حدة، ترنسفكأيشن ناجحة وهناك الحد الأدنى من الآثار على بقاء الخلية.

في هذه التجارب، وخلايا Th17 الإنسان نحنإعادة توليدها من خلال ثقافة في المختبر من دم الحبل السري البشري. الأهم من ذلك، أن خيار بديل عن هذا الاختبار التمايز يكون لاستخدام الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى الإنسان (PBMCs). لكل من CBMCs وPBMCs، فمن الضروري عزل خلايا CD4 + T قبل بدء الثقافة. نقدم هنا لدينا وسيلة لتنقية خلايا CD4 + T عن طريق الانتقاء السلبية، والتي أسفرت عن كفاءة ترنسفكأيشن قوية، لكننا نتوقع غيرها من أساليب إعداد خلايا CD4 + T الإنسان الأساسية ستعمل ايضا على قدم المساواة. لقد حاولت عدة مجموعات التي تستخدم اختيار إما إيجابية أو سلبية لعزل الماوس خلايا CD4 + T وكلتا الطريقتين قد أسفرت عن كفاءة ترنسفكأيشن مماثلة. وهناك اعتبار آخر هو أهمية استخدام خلايا T ساذجة من أجل التفريق على النحو الأمثل في خلايا Th17. استخدام دم الحبل السري البشري هو مفيد لهذا السبب لأنه يحتوي بالفعل على نسبة أعلى من السذاجة الخلايا التائية صتستاء، وبالتالي فإنه ليس من الضروري فرز أو قبل إثراء للخلايا T ساذجة قبل بدء الثقافة. ومع ذلك، فإن العيب الواضح لهذا النهج هو محدودية توافر دم الحبل السري. بدلا من ذلك، فرز خلايا T ساذجة من PBMCs 14 لا يمكن أن يؤديها قبل الثقافة منذ هذا المورد هو أكثر توافرا، على الرغم من أن كميات الكبيرة التي يتعين الحصول عليها.

في حين أن هناك أساليب متعددة لtransfecting خلايا الثدييات، وخلايا T الأولية تميل إلى أن تكون نوع من الخلايا أكثر صعوبة ل transfect. الجيل القادم Electroporation للهي طريقة البدني الناجح transfecting عابر خلايا T التي هي سهلة من الناحية الفنية لأداء وغير قابلة للتكرار. مرة واحدة الأمثل، لديها كفاءة عالية جدا من ترنسفكأيشن لالرنا الصغيرة التي تقترب من 100٪. ويمكن ملاحظة ذلك في الشكل 2 حيث السكان أحادي الواسطة كامل CD45 + الخلايا (الشكل 2A) وصpulation جميع الخلايا معربا عن RORγt (الشكل 2B) تحول إلى مستوى أقل التعبير. الأهم من ذلك، ترنسفكأيشن الأمثل مع الرنا صغيرة لا يضر بقاء الخلية. ونلاحظ بشكل روتيني أكبر من 70٪ الجدوى بعد ترنسفكأيشن مع الرنا صغيرة (1D الشكل). وعلى الرغم من بقاء ليست مشكلة مع هذا البروتوكول، بيولوجيا خصائص الخلايا التائية الأخرى، مثل إنتاج السيتوكينات، قد تتأثر بعد ترنسفكأيشن مع الرنا الصغيرة. لهذا السبب، من المهم للغاية لاستخدام عنصر تحكم RNA الصغيرة مطابقة الكيمياء في كل تجربة.

نحن الأمثل معلمتين Electroporation للوالنبض والجهد، لتقليل موت الخلايا وتزيد من كفاءة ترنسفكأيشن. ارتفاع الفولتية زيادة موت الخلايا خلال ترنسفكأيشن. بعض الاعتبارات التقنية الأخرى لمنع موت الخلايا وضمان ترنسفكأيشن ناجحة تشمل تقليل كمية المواد الكيميائية الاصطناعية المستخدمة والحد من الوقت بين هذا وذاك إعداد خلية ن و electroporation ينبغي دائما تركيزات الحد الأدنى اللازمة للمواد ترنسفكأيشن الاصطناعية أن تستخدم لمنع المحتملة سمية الخلايا T والآثار بعيدا عن الهدف. تقليل الوقت اللازم لإعداد الخلية قبل ترنسفكأيشن لتقليل الوقت الخلايا في المخزن ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة أمر بالغ الأهمية، ويمكن أن يتحقق من خلال إعداد الخلايا في دفعات، إذا لزم الأمر.

حاليا، هناك نوعان من الأدوات المتاحة تجاريا Electroporation للجيل القادم. كل من هذه النظم يمكن transfect كفاءة خلايا T الابتدائية. وكان محسن هذا البروتوكول باستخدام نظام ترنسفكأيشن النيون. في حين أن هذا النظام ترنسفكأيشن هو أكثر فعالية من حيث التكلفة، ونظام Amaxa يقدم فريد محول 96-جيدا ل electroporation لتطبيقات الإنتاجية العالية. نأمل أن التطورات التجارية الإضافية سوف تستمر في زيادة الإنتاجية وكفاءة نظم ترنسفكأيشن هذه، مع الحفاظ على التكلفة كحد أدنى.

"> التالي جيل Electroporation للخلايا T الإنسان يمكن إدخال بكفاءة الرنا الصغيرة بما في ذلك الرناوات siRNAs ضد الجينات المستهدفة من الفائدة كما حدث مثلا في هذا البروتوكول، وكذلك يقلد ميرنا أو مثبطات، وكفاءة عالية تجعل من غير الضروري استخدام علامات ترنسفكأيشن منذ ما يقرب من كل خلية transfected مع الرنا صغيرة. هذا هو على النقيض من ترنسفكأيشن من خلايا T الأولية مع البلازميدات DNA حيث يؤدي تعداء البلازميد نموذجية في التعبير٪ فقط 20-30 من الجين علامة مع أكثر من 50٪ سمية التي تزيد مع زيادة كميات البلازميد لدى تقديمه وقد سمح يقلد الاصطناعية باستخدام هذه الطريقة لعشرات من الجينات ليتم عرضه من أجل وظيفة في T بيولوجيا الخلية في نفس الوقت دون الحاجة إلى استنساخ الجزيئي 12 و 13. وقد مكن أيضا اختبار وظيفة كل miRNAs أعرب من قبل خلايا T بالتوازي 11 13. مع هذا البروتوكول، هذه الأنواع من الشاشات الإنتاجية معتدلة قابلة للتطبيق على خلايا T الإنسان. والجدير بالذكر، وقد استخدمت هذه التقنية في الآونة الأخيرة لإدخال RNA الصغيرة (gRNA) المجمعات بروتين نووي ريبوزي -Cas9 إلى خلايا T الإنسان الأساسي لتحرير الجينوم 15. هذه التطبيقات المتنوعة تبرز فائدة والمرونة وقوة بروتوكول المقدمة هنا كأداة هامة للمناعة تسعى لدراسة بيولوجيا الخلايا T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats