Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

Published 4/13/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CD4 + Т - клетки являются важными оркестраторами адаптивного иммунного ответа. Наивные CD4 + Т - клетки способны превращаться в нескольких различных эффекторных Т - клеток (например , Th1, Th2, Th17 и т.д.), каждый со своим собственным набором характерных цитокинов и факторов транскрипции, в зависимости от местного микроокружения 1. Решения линии преемственности, что Т-клетки составляют критичны как для защитного иммунитета и толерантности к себе. Th17 клетки представляют собой одно подмножество Т - клеток , известных для борьбы с внеклеточных бактерий и грибков, но их неправильные ответы также участвуют в патогенезе множества аутоиммунных и воспалительных заболеваний , таких как рассеянный склероз и псориаз 2, 3. Человеческие клетки Th17 могут быть получены из нативных CD4 + Т - клеток в пробирке путем предоставления им соответствующей поляризационной среды 4. Vario нас комбинации цитокинов IL-1β, IL-23, TGF-beta, и IL-6 были использованы для развития клеток Th17 человека. Человек Th17 клетки экспрессируют CCR6, рецептор хемокинов , который обычно используется , чтобы идентифицировать эту популяцию клеток и определяется выражением их основного фактора транскрипции, RORγt (кодируемого) RORC 5, 6. Th17 клетки обладают способностью выражать несколько цитокинов, но IL-17A является родословная определяющего эффектор цитокин, продуцируемый этими клетками. Мы исследовали экспрессию всех трех Th17-ассоциированных маркеров (CCR6, RORγt, IL-17A) для оценки надежности нашего человеческого Th17 в пробирке дифференциации анализа. Кроме того, мы культивировали человеческие CD4 + Т - клеток в неполяризующих условиях, в которых не добавл ли никакого цитокины или блокирующие антитела к культуральной среде , чтобы использовать в качестве отрицательного контроля , так как экспрессия этих маркеров Th17 должно быть очень низким или отсутствует.

ve_content "> Один из способов изучить нормальное развитие клеток человека T и биологии, чтобы манипулировать экспрессии генов в процессе их развития. Краткосрочные вмешательства РНК (миРНК) представляют собой синтетические небольшие молекулы РНК, которые нацелены на белок-кодирующих мРНК, и могут быть использованы для уменьшения специфической экспрессии гена . MicroRNAs (миРНК) является эндогенным некодирующим малым РНКОМ , известным для модуляции экспрессии гена посттранскрипционно. микроРНК , как было показан , играет важную роль как в мышином и биологии Т - клетки человека, в том числе в Th17 клетках 7, 8, 9. Это очень важно иметь надежные методы манипулирования небольшой РНК-активности в Т-клетках человека, чтобы изучить их влияние на экспрессию генов и в конечном счете на человеческой клеточной биологии T. Здесь мы опишем простой в использовании, последовательный и надежный протокол, который мы разработали для введения небольшой синтетический РНК и запертые нуклеиновые кислоты (МШИТ, химически модифицированные нуклеиновые кислоты с повышенной стабильностью)в клетки иммунной системы, а именно в Th17-клеток человека.

Есть несколько альтернативных способов введения малого РНКА в клетки млекопитающих, которые обычно попадают в химические, биологические или физические категории 10. Обычно используемые химические методы, в том числе на основе липидов и трансфекций кальция-фосфатной трансфекции, полагаются на создание комплексов химико-ДНК, которые более эффективно поглощаются клетками. В общем, химические методы не являются столь эффективными для трансфекции первичных Т-клеток. Наиболее распространенный биологический метод является использование вирусного вектора (например , ретровирус или лентивирус), который непосредственно вставляет внешний РНК в хозяин в качестве части своего естественного цикла репликации. Вирусные трансдукции, как правило, занимает больше времени, чтобы закончить, особенно когда факторы во время для молекулярного клонирования провирусных плазмид. Кроме того, вирусные векторы трансдукции могут быть потенциально опасными для человека исследователей. Электропорация является физическим менит индуцировать мембраны пермеабилизации, подвергая клетки воздействия высоких импульсов напряжения, позволяя нуклеиновые кислоты, чтобы транзиторно войти в камеру, где они могут действовать на своей цели. Традиционные электропорации инструменты не являются эффективными для трансфекции первичных лимфоцитов. Тем не менее, оптимизированная для следующего поколения электропорации, оказалось способной трансфекция Т-клеток при очень высокой эффективности, особенно когда материал для трансфекции мал РНК. Термин следующего поколения свободно используется , чтобы различать две новые платформы (например, неоновые, Amaxa) от традиционных электропорации машин. Кроме того, этот метод легко масштабируется для умеренных экранов пропускной способности с до приблизительно 120 малых РНК в одном эксперименте, часто с использованием проверенных синтетических реагентов. Важно отметить, что успешная трансфекция может быть достигнута в качестве всего лишь 16 ч после активации Т-клеток. Недостаток этого способа, однако, является то, что она не приводит к стабильной геномной incorporatiна, и поэтому преходяще. Следовательно, стоит дополнительных усилия, чтобы создать стабильную экспрессирующую конструкцию, которая может быть упакована в вирусный вектор и успешно высказанную в Т-клетках в тех случаях, когда требуется долгосрочное выражение малой РНК.

Мы использовали следующее поколение трансфекции (например, неон) для доставки различных синтетических одно- или двухцепочечных РНК или МШАТ олигонуклеотидных инструментов для различных целей 11, 12, 13. Эффективное РНК-интерференции может быть вызван в первичной мыши и Т-клеток человека с помощью двухцепочечной короткого вмешательства РНК (миРНК). Этот протокол описывает оптимизированные условия для использования этого метода в клетках Th17 человека. В дополнении к киРНКу, коммерчески доступный синтетический микроРНК подражает и ингибиторы могут быть использованы для изучения усиления микроРНКа и потери функции. микроРНК имитирует являются двухцепочечной молекулы РНК, очень похожие на киРНК, но Дизайнд с последовательностью эндогенного зрелого микроРНКа. ингибиторы микроРНК химически модифицированной РНК и / или LNA на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, которые связываются с носителями микроРНК и противодействуют их функции. Мы обнаружили, что все эти инструменты могут быть эффективно использованы в культивируемых первичных Т-лимфоцитов, в том числе, но не ограничиваясь клеток Th17 человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол придерживается принципов UCSF для исследовательской этики человека.

1. Получение Т - клеточная культура, выделение CD4 + Т - клетки, и Th17 поляризации

  1. На день 0, пальто 6-луночных культуры тканей пластины с 1,5 мл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и анти-CD28 человека (4 мкг / мл) в PBS с кальцием и магнием в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
    1. В качестве альтернативы, слой пластины в течение ночи при 4 ° С. Оберните пластины в парафине.
  2. Подготовьте одноядерные клетки пуповинной крови (CBMCs) путем центрифугирования в градиенте плотности в соответствии с инструкциями изготовителя.
    ВНИМАНИЕ: Работа тщательно и обеспечить надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) носится при обращении с человеческой крови, чтобы избежать любого риска контакта с кровью патогенами.
  3. После того , как мононуклеарные клетки были выделены и промывают, выполняют изоляцию CD4 + Т - клеток человека с помощью отрицательного Селефикция с использованием набора для коммерческого человеческого CD4 + Т - клеток.
    Примечание: Если есть красное загрязнение клеток крови после выделения мононуклеарных клеток, необязательные эритроциты лизис может быть выполнен до тех стадий выделения клеток CD4 + T. Ресуспендируют мононуклеарных клеток в 1 мл буфера изоляции (2% FBS в PBS). Добавьте 5 мл лизирующего раствора 1x. Инкубирую в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл буфера изоляции и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
    1. Ресуспендируют мононуклеарных клеток при плотности 50 × 10 6 в 500 мкл в буфере изоляции в новой 5 мл трубки.
    2. Добавьте 100 мкл ФБС и 100 мкл антител смеси в пробирке, затем инкубировать каждую пробирку при 4 ° С в течение 20 мин на орбитальном шейкере, чтобы хорошо перемешать.
    3. После инкубации, добавьте 3-4 мл буфера изоляции, чтобы промыть клетки. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 8 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Тщательно аспирата Супаrnatant.
    4. Во время этого вращения, предварительно моют магнитные шарики. Передача желаемого количества магнитных шариков в новую пробирку (используется при 1: 1 с клетками) и добавляют равный объем буфера изоляции мыть шарики. Хорошо перемешать с помощью 1 мл микропипетки, а затем поместить трубку в магнит, по меньшей мере, 1 мин. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют магнитные шарики в том же объеме, первоначально переданного до стирки.
    5. Ресуспендируют клеток в каждую пробирку с 500 мкл буфера выделения и добавить 500 мкл предварительно промытых магнитных шариков.
    6. Инкубируйте клетки с магнитными шариками в течение 15 мин на орбитальном шейкере при комнатной температуре (18 ° C до 25 ° C), чтобы хорошо перемешать.
    7. После инкубации тщательно пипетка клеток с использованием 1 мл микропипеткой, по меньшей мере в 10 раз. Затем добавляют 3-4 мл буфера выделения и поместить каждую трубку в магните в течение 2 мин.
    8. Тщательно передачи отрицательно отобранных CD4 + Т - клетки , которые находятся всупернатант в новую пробирку.
  4. После того, как выделение CD4 + Т - клеток завершается, подсчет клеток с помощью гемоцитометра и сохранить клетки на льду.
  5. Промыть пластины покрытых антителами два раза PBS. Затем добавляют 1,5 мл 2 раза смесь Th17-поляризационной средств массовой информации в каждую лунку: анти-человеческий IFN & gamma; (20 мкг / мл), анти-человеческий ИЛ-4 (20 мкг / мл), TGF-beta человека (10 нг / мл), человек ИЛ-1β (40 нг / мл), человеческий IL-23 (40 нг / мл), человеческий IL-6 (50 нг / мл), все разводили в бессывороточной базовой средах (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
    Примечание: Трансфекция и РНК-интерференции делает работу в содержащей сыворотку средах. Цель использования бессывороточной среды с этим протоколом для достижения лучшего производства IL-17A.
  6. Центрифуга человека CD4 + Т - клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Тщательно аспирата supernatмуравей. Затем клетки вновь суспендируют в бессывороточной базовых сред и пластины клеток при плотности 3 × 10 6 в 1,5 мл на лунку так, чтобы конечный объем 3 мл на лунку и поляризационные цитокины теперь на 1x конечной концентрации.
    1. Поместите планшеты в 5% СО 2, 37 ° C инкубатора в течение двух дней.

2. электропорации в пробирке Поляризованные Человеческие клетки Th17

  1. На 2день, пальто 48-луночных культуры тканей пластины с 250 мкл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и анти-CD28 человека (4 мкг / мл) в PBS с кальцием и магнием в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
    1. В качестве альтернативы, слой пластины в течение ночи при 4 ° С. Оберните пластины в парафине.
  2. Приготовьте небольшой РНК для трансфекции. Для каждой трансфекции, аликвота 1 мкл 5 мкМ исходного раствора киРНКа в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Включите соответствующую химию соответствием небольшой РНК CONTRол. Храните все трубы на льду.
  3. Промыть пластины покрытых антителами два раза PBS. Затем добавляют 500 мкл 1X Th17-поляризационная средств массовой информации в каждую лунку: анти-IFN & gamma; человека (10 мкг / мл), анти-человеческий ИЛ-4 (10 мкг / мл), человеческого TGF-beta (5 нг / мл), человеческого IL- 1β (20 нг / мл), человеческий IL-23 (20 нг / мл), человеческий IL-6 (25 нг / мл), все разводили в бессывороточной базовой средах (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
  4. После того, как культуральные планшеты и трансфекция реагенты получают, ресуспендирование клеток с 1 мл микропипетки, пипеткой осторожно, но обеспечивающие, что все клетки отделяют от дна лунки. Бассейн клеток в коническую пробирку и центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    Примечание: Для периодов культуры дольше, чем протокол четырех дней, представленных здесь, клетки должны быть трансфицированы приблизительно каждые 3 дня, используя этот же протокол. Шаг 2.4 должны быть изменены, однако поскольку клетки, обработанные различными малыми РНК не должны быть объединены. Все условия испытывалось должны быть собраны, подсчитывают и трансфицируют отдельно.
  5. Тщательно аспирата супернатант, а затем ресуспендирования клеток, по крайней мере, 1 мл PBS для мытья. Количество живых клеток Th17 (например , с помощью гемоцитометра с использованием трипанового синего для оценки жизнеспособности) , а затем перенести клетки в микроцентрифужной трубку.
  6. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре для осаждения клеток.
  7. Тщательно аспирата супернатанта, а затем ресуспендирование клеток с помощью прилагаемого ресуспендирования буфера из мкла набора для трансфекции системы 10 с плотностью 2,5-4 × 10 7 клеток на мл. Держите клетки при комнатной температуре.
    Примечание: В качестве ориентира, старайтесь готовить только столько ячеек, сколько может быть трансфицированы в течение 30 мин. Несколько партий можно сравнить.
  8. Добавить 9 мкл клеток в 1 мкл малых РНК в каждом MicroCentrifuge трубки. Пипетка один раз, чтобы смешать клетки и малый РНК для трансфекции затем загрузить в предусмотренном для наконечника пипетки электрода.
    Примечание: Как правило, добавляют 9,5 мкл клеточной суспензии, чтобы обеспечить в достаточном количестве смеси для предотвращения образования пузырьков в наконечник пипетки электрода до трансфекции.
  9. Заполните представленную кювету 3 мл при комнатной температуре Электролитических буферов E. Место кюветы внутри пипетки станции, а затем поместить пипетку в положение внутри кюветы.
  10. Немедленно электропорации 10 мкл каждой смеси клеток и малых РНК с использованием следующих параметров: импульсного напряжения 1,500-1,550 В, длительность импульса 10 мс и 3 импульсов в общей сложности на устройстве трансфекции.
  11. После того, как электропорация завершена, непосредственно добавьте смесь клеток в 500 мкл 1X Th17-поляризационные среды в подготовленных скважинах культуральной пластины. Место пластины в 5% СО 2, 37 ° C инкубаторе в течение еще двух дней.
    Примечание: Промыть кончик пипетки электрода с помощью пипеткивверх и вниз в PBS между каждой трансфекции.

3. Заготовка Человеческие клетки Th17

  1. Ресуспендируют клетки в культуральной среде с помощью микропипетки, пипетка осторожно, но обеспечение того, чтобы все клетки отделяют от дна лунки. Подготовка клеток для функциональных и / или экспрессии генов анализов.
    Примечание: Регулярно, достаточное количество клеток получали из одной скважины трансфицированных клеток Th17, которые будут использоваться для проточной цитометрии анализа поверхностных маркеров и внутриклеточных цитокинов и фактора транскрипции окрашивания или для получения РНК для анализа экспрессии генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Первый шаг к разработке надежной системы успешно электропорации клеток Th17 человека было создание надежной в пробирке дифференцированы культур человека Th17 клеток. Т - клетки , культивированные в Th17-поляризационных условиях выразили хемокинов рецептор CCR6 и фактор транскрипции RORγt (Фигура 1А, слева). Эти маркеры не были выражены , когда Т - клетки культивировали в неполяризующих (THN) условиях (Фигура 1А, справа). Т - клетки , культивированные в Th17-поляризационных условиях также производится IL-17A на рестимуляции (Фигура 1В, слева) , но не в условиях Thn (Фигура 1В, справа). Th17 дифференцировка по- прежнему происходит после трансфекции с малым РНКОМ , но в некоторых экспериментах, есть наблюдаемое снижение частоты производства IL-17A (рис 1C). Эффект небольшой РНК-трансфекции на продукцию цитокинов демонстрирует Imporстояние, имеющие химическое соответствием небольшого контроля РНКА для сравнения в пределах каждого эксперимента. Важно отметить, что жизнеспособность сохраняется после трансфекции с малым РНКОМ и , как правило , больше , чем 70% (рис 1D).

Для определения эффективности этого протокола, мы использовали РНК-интерференцию. Антиген CD45 кодируется PTPRC (протеин - тирозин - фосфатазы, рецептор типа С) гена. CD45 экспрессируется на все гемопоэтические клетки и клетки Th17 поэтому человек должны решительно выразить этот поверхностный маркер. Трансфекция клеток человека Th17 на 2 -й день с бассейном миРНК ориентации PTPRC сильно снижается экспрессия CD45 по сравнению с соответствующей контрольной химии миРНК (фигура 2А). Это унимодальны сдвиг населения в экспрессии CD45 указывает на около 100% эффективности трансфекции, типичных для этого протокола для малых РНК. Таким образом, это является важным инструментом, который может быть использован для оценки трансфекции эффiciency при оптимизации протокола. RORC кодирует RORγt, преобладающий фактор транскрипции клеток Th17 человека, который непосредственно регулирует выработку IL-17A. Трансфекцию клетки Th17 развивающиеся человека с миРНК пула против RORC сильно пониженную экспрессию RORγt , как и ожидалось (фигура 2В). Снижение экспрессии RORγt с помощью RNAi имели функциональный эффект, так как эти клетки экспонируются снижается IL-17A производства (рис 2C) по сравнению с клетками , трансфицированными с контролем миРНК. Неполяризованная CD4 + Т - клетка не должна выражать любые RORγt или IL-17A и показаны в качестве отрицательного контроля в этой фигуре.

Рисунок 1
Рисунок 1: В пробирке Дифференцированный Человеческие клетки Th17 Экспресс CCR6, RORγt и IL-17A. Человеческого CD4 + Т - клетки , выделенные из пуповинной крови культивировали недеформированнойУсловия г Th17 (IL-1β, IL-23, IL-6 и TGF - beta) или в неполяризующих (THN) условиях (только медиа, нет поляризационные цитокины или блокирующие антитела добавлены) в пробирке и анализировали на 4 -й день для Th17 маркера выражение с помощью проточной цитометрии: (а) представителя контурных график поверхности дисплея CCR6 и внутриклеточная RORγt со-окрашивание CD4 + Т - клеток. Цифры в квадрантах указывают процентное CCR6 и / или RORγt-позитивных живой синглет CD4 + клеток. (B) , IL-17A и IFN- , производство после повторной стимуляции РМА / иономицином. Цифры в квадрантах указывают процента IL-17A и / или IFN & gamma-позитивных живой синглет CD4 + клетки. (С) Представительные контурный график отображает поверхностные CCR6 и внутриклеточная RORγt совместно окрашивания CD4 + Т - клеток после трансфекции с небольшим контролем РНК. Цифры в квадрантах указывают процентное CCR6 и / или RORγt-положительных живой синглет CD4 + клетки (слева). RepresentaTIVE контурный график отображает IL-17A и IFN-, производство после повторной стимуляции РМА / иономицином после трансфекции с небольшим контролем РНК. Цифры в квадрантах указывают процентное IL-17A и / или IFN & gamma-положительных живой синглетных CD4 + клеток (справа). (D) , представитель контурный график показывает жизнеспособность клеток CD4 + после трансфекции с небольшим контролем РНК. Число указывает на процентное CD4 + синглетный живые клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: РНК - интерференции в первичных человеческих Th17 клеток. Человеческие CD4 + Т - клетки из пуповинной крови культивируют в условиях Th17 трансфицировали на 2 -й день с nontargeting контролем миРНК (siNeg CTL) или ориентации пула против PTPRC (си PTPRC) или RORC (си RORC) , содержащие 4 индивидуального киРНКа. Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на 4 -й день: выражение (A) поверхности CD45 , показанной на представительной гистограммы после трансфекции с си PTPRC (серый оттенок) или siNeg Ctl (черная линия). Выражение (В) Внутриклеточном RORγt показано в представительной гистограмме после трансфекции с си RORC (серый оттенок) или siNeg Ctl (черная линия). (C) Представительные контурные графики отображения поверхности CD4 и внутриклеточный RORγt совместное окрашивание CD4 + Т - клеток (верхняя панель) или IL-17A и производства IFN- , после повторной стимуляции РМА / иономицином (нижняя панель). Цифры в квадрантах указуют процент CD4 + RORγt + или IL-17A и / или IFN & gamma-положительные клетки в прямом эфире синглетных в условиях Thn или Th17 , трансфицированного siNeg Ctl или си RORC.fig2large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол обеспечивает улучшенный способ доставки малых РНК в клетки Th17 человека. Хотя клетки Th17 человека здесь были использованы, этот метод электропорации с малым РНКОМ может быть использован с другими хелперами подмножествами первичного человеческим Т, такими как Th1, Th2, и Tregs. Он не работал хорошо для наивных CD4 + Т - клеток , так что клетки должны быть активированы в культуре до трансфекции. Для этого протокола, мы сначала оптимизировали систему экстракорпоральной культуры в для лучшего производства IL-17A. Самый большой фактор базы СМИ. Мы обнаружили, что бессывороточные СМИ превосходят традиционные сыворотки, содержащий носитель для лучшей индукции IL-17A продуцирующих клеток Th17 человека. Так как клетки Th17 могут быть сформированы с помощью подмножеств цитокинов TGF-beta, IL-1, IL-23 и IL-6, мы тестировали различные цитокин смеси. В данном исследовании мы достигли более надежного производства IL-17A, когда были включены все четыре поляризационные цитокины. Кроме того, мы оптимизировали укорачивая длинукультура обеспечить только один трансфекция была необходима в течение периода культивирования. Хотя это четыре дня протокол позволяет результаты, которые будут генерироваться быстрее и требуют только один трансфекции, длина культуры может быть увеличена для дальнейшего увеличения производства IL-17A. Более длительный период культивирования может даже быть необходим для достижения оптимальной дифференциации других подмножеств первичного Т-клеток. Так как эта трансфекция преходяща, несколько трансфекцию могут потребоваться в течение долгого времени в течение длительных периодов культуры. Мы предлагаем пополнение небольших РНКОВ реагентов после приблизительно 3 дней путем повторном электропорации клеток с реагентом для предотвращения разбавления по множеству клеточных делений. Мы обычно делали это для мыши CD4 + Т - клеток. Несмотря на то, что технически более сложным, так как клетки в каждом состоянии должны быть собраны и подсчитаны отдельно, трансфекция успешна и есть минимальные эффекты на жизнеспособность клеток.

В этих экспериментах, клетки Th17 человека мыповторно генерируется через культуру в пробирке пуповинной крови человека. Важно отметить, что альтернативный вариант для этой дифференциации анализа было бы использовать мононуклеарные клетки периферической человека (РВМС). Для обоих CBMCs и МНПК, необходимо , чтобы изолировать CD4 + Т - клеток перед началом культуры. Мы представляем здесь наш метод очистки CD4 + Т - клеток путем негативной селекции, которая давала надежную эффективность трансфекции, но мы ожидаем , что другие способы получения первичных человеческих CD4 + Т - клетки будут работать одинаково хорошо. Мы попытались несколько комплектов , которые используют либо положительный или отрицательный выбор для выделения мышиных CD4 + Т - клеток и оба методов привели к аналогичной эффективности трансфекции. Дополнительным фактором является важность использования наивных Т-клеток, для того, чтобы оптимально дифференцироваться в клетки Th17. Использование пуповинной крови человека является предпочтительным по этой причине, поскольку он уже имеет более высокую долю наивных Т-клетки рвозмущает и, следовательно, нет необходимости для сортировки или предварительно обогащают для наивных Т-клеток до начала культуры. Тем не менее, очевидно, недостаток этого подхода является ограниченной доступностью пуповинной крови. В качестве альтернативы, сортировка наивных Т - клеток из РВМСА 14 может быть выполнено до культуры , поскольку этот ресурс является более легко доступны, хотя в большом количества должны быть получены.

В то время как существует несколько способов трансфекции клеток млекопитающих, первичные Т-клетка имеет тенденцию быть более трудным типом клеток для трансфекции. Следующее поколение электропорация является успешным физическим методом транзиторна трансфицирующим Т-клеток, которые технически легко выполнить и воспроизводимо. После того, как оптимизируется, он имеет очень высокую эффективность трансфекции для малых РНК, приближается к 100%. Это можно видеть на фигуре 2 , где вся унимодальны популяция CD45 + клеток (фигура 2А) и ромахинация всех клеток , экспрессирующих RORγt (фигура 2В) переход к более низкому уровню экспрессии. Важно отметить, что оптимизированный трансфекция с малыми РНК не ставит под угрозу жизнеспособность клеток. Мы регулярно наблюдаем более 70% жизнеспособность после трансфекции с малым РНКОМ (рис 1D). Несмотря на то, жизнеспособность не является проблемой с этим протоколом, биологии других характеристик Т-клеток, таких как производство цитокинов, могут быть затронуты после трансфекции с малых РНК. По этой причине, крайне важно, чтобы использовать химический контроль соответствием мал РНК в каждом эксперименте.

Мы оптимизировали два параметра электропорации, пульс и напряжение, для сведения к минимуму гибели клеток и максимизации эффективности трансфекции. Более высокое напряжение увеличивает гибель клеток при трансфекции. Некоторые другие технические соображения, чтобы предотвратить гибель клеток и обеспечить успешные трансфекции включают сведение к минимуму количества синтетических реагентов, используемых и ограничению времени betwee клеточный препарат п и электропорации. Минимальные концентрации, необходимые для синтеза реагентов трансфекции всегда должны быть использованы для предотвращения потенциальной токсичности Т-клеток и офф-мишени эффектов. Сокращение времени подготовки клеток до трансфекции, чтобы минимизировать время клеток в трансфекции буфере при комнатной температура имеет решающее значение, и может быть достигнута путем получения клеток в пакетном режиме, если это необходимо.

В настоящее время существует два коммерчески доступных электропорации приборов нового поколения. Обе эти системы могут эффективно трансфекции первичные Т-клетки. Этот протокол был оптимизирован с помощью системы трансфекции Неон. Хотя эта система трансфекции более рентабельна, система Amaxa однозначно предлагает адаптер 96-луночный для электропорации для применения при более высоком пропускной способности. Мы надеемся, что дополнительные коммерческие достижения будут продолжать увеличивать пропускную способность и эффективность этих систем трансфекции, сохраняя при этом затраты на минимальном уровне.

«> Следующее поколение электропорации Т-клеток человека можно эффективно вводить малые РНК, включая киРНК против генов-мишеней, представляющих интерес в качестве примера в данном протоколе, а также микроРНК имитирует или ингибиторов. Высокая эффективность делает ненужным использование маркеров трансфекции, так как почти каждая клетка трансфицировали малых РНК. Это в отличие от трансфекции первичных Т-клеток с ДНК плазмид, где типичные плазмиды трансфекции приводят лишь на 20-30% экспрессии гена-маркера с более чем 50% токсичности, что увеличивается с увеличением количества плазмиды. Вводя синтетические подражает , используя этот метод позволил десятки генов , которые будут экранированы для функции в биологии Т - клеток параллельно без необходимости молекулярного клонирования 12, 13. Он также включен тестирование для функции всех микроРНК , выраженной Т - клетками параллельно 11 , 13. С помощью этого протоколаЭти типы средних экранов пропускной способности применимы к Т-клеткам человека. Следует отметить, что этот метод был недавно использован для введения малых РНК (gRNA) -Cas9 рибонуклеопротеидных комплексов в Т - клетках человека , первичные для редактирования генома 15. Эти разнообразные приложения подчеркивают полезность, гибкость и силу протокола, представленный здесь в качестве важного инструмента для иммунологов, стремящихся изучить Т-клеточную биологию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats