Liten RNA Transfeksjon i Primær Menneskelig Th17 celler av Next Generation Electroporation

Published 4/13/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CD4 + T-celler er avgjørende orchestrators av den adaptive immunrespons. Naive CD4 + T-celler er i stand til å utvikle seg til flere forskjellige effektor-T-celler (f.eks TM1, TM2, Th17, etc.), hver med sitt eget sett av karakteristiske cytokiner og transkripsjonsfaktorer, avhengig av den lokale mikromiljøet 1. Avstamning beslutninger som T-celler lager er avgjørende både for beskyttende immunitet og toleranse til selv. Th17-celler er en undergruppe av T-celler som er kjent for å bekjempe ekstracellulære bakterier og sopp, men deres urettmessige responser blir også implisert i patogenesen av mange autoimmune og inflammatoriske sykdommer så som multippel sklerose og psoriasis 2, 3. Humane Th17 celler kan genereres fra naive CD4 + T-celler in vitro ved å gi dem en passende polariserende miljø 4. Vario us kombinasjoner av cytokinene IL-1β, IL-23, TGFp og IL-6 har blitt benyttet for utvikling av humane Th17-celler. Humant Th17-celler uttrykker CCR6, en kjemokinreseptor som vanligvis brukes til å identifisere denne cellepopulasjon, og er definert ved uttrykket av sine viktigste transkripsjonsfaktor, RORγt (kodet for av RORC) 5, 6. Th17 celler har evnen til å uttrykke flere cytokiner, men IL-17A er slektslinje-definerende effektor cytokin produsert av disse cellene. Vi undersøkte ekspresjonen av alle tre Th17-assosierte markører (CCR6, RORγt, IL-17A) for å vurdere robustheten vår menneskelige Th17 in vitro differensiering analyse. I tillegg har vi dyrket human CD4 + T-celler under ikke-polariserende betingelser, hvor ingen cytokiner eller blokkerende antistoffer ble tilsatt til kulturmedier som kan brukes som en negativ kontroll, siden ekspresjon av disse Th17 markører bør være meget lav eller fraværende.

ve_content "> En måte å studere normal human T-celleutvikling og biologi er å manipulere genekspresjon i løpet av deres utvikling. Short-interfererende RNA (siRNA) er syntetiske små RNA molekyler som er rettet mot protein-kodende mRNA-er og kan benyttes for å redusere spesifikk genekspresjon . microRNAs (mirnas) er endogene ikke-kodende små RNA er kjent for å modulere genekspresjon post-transkripsjonelt. mirnas har vist seg å spille en viktig rolle i både murine og humane T-cellebiologi, som blant annet i Th17-celler 7, 8, 9. Det er viktig å ha pålitelige metoder for manipulering av små RNA-aktivitet i humane T-celler for å studere deres virkninger på genekspresjon og i siste instans for human T-cellebiologi. Her beskriver vi en lett-å-bruke, konsekvent og pålitelig protokoll som vi utviklet for å innføre små syntetiske RNA'er og låste nukleinsyrer (LNAs, kjemisk modifiserte nukleinsyrer med økt stabilitet)inn i immunceller, og spesielt inn i humane celler Th17.

Det er flere alternative metoder for å innføre små RNA inn i pattedyrceller, som er inndelt i kjemiske, biologiske eller fysikalske kategorier 10. Vanlige brukte kjemiske metoder, omfattende lipid-baserte transfeksjoner og kalsium-fosfat-transfeksjoner er avhengige av å skape kjemisk-DNA komplekser som er mer effektivt tatt opp av cellene. Generelt, kjemiske metoder er ikke så effektive for transfeksjon av primære T-celler. Den mest vanlige biologiske metode er å anvende en viral vektor (for eksempel retrovirus eller lentivirus), som direkte setter fremmed RNA inn i en vert som en del av sin naturlige replikasjonssyklus. Viral transduksjon vanligvis tar lengre tid å fullføre, særlig når man faktorer i tid for molekylær kloning av provirale plasmider. I tillegg kan virale vektorer transduksjon være potensielt skadelige for mennesker forskere. Elektroporering er en fysisk method for å indusere membran permeabilisering ved å utsette cellene for høye spenningspulser, slik at nukleinsyrer til forbigående å komme inn i cellen, hvor de kan virke på deres mål. Tradisjonelle elektroporeringsbetingelser instrumenter var ikke effektive for trans primære lymfocytter. Imidlertid har optimalisert neste generasjon elektroporering vist seg å være i stand til å transfektering av T-celler med meget høy virkningsgrad, særlig når materialet som skal transfekteres er liten RNA. Begrepet neste generasjon er løst brukes til å skille de to nyere plattformer (f.eks, Neon, Amaxa) fra tradisjonelle elektroporasjonseksperimentene maskiner. Dessuten er denne metode lett skalerbar for moderat gjennomstrømning skjermer med opp til omtrent 120 små RNA i et enkelt eksperiment, ofte ved anvendelse av validerte syntetiske reagenser. Viktigere, kan vellykkede transfeksjoner oppnås på så lite som 16 timer etter T-celleaktivering. Ulempen med denne metoden er imidlertid at det ikke resulterer i stabile genomisk incorporatipå, og er derfor forbigående. Derfor er det verdt den ekstra innsats for å skape en stabil ekspresjonskonstruksjon som kan pakkes inn i en viral vektor, og med hell uttrykt i T-celler i de tilfeller hvor det kreves langvarig ekspresjon av en liten RNA.

Vi har benyttet en neste generasjon transfeksjon (f.eks Neon) for å levere forskjellige syntetiske enkelt- eller dobbelt-trådet RNA eller LNA oligonukleotid verktøy for forskjellige formål 11, 12, 13. Effektiv RNA interferens kan bli indusert i primær mus og humane T-celler ved hjelp av dobbelt-trådet kort interfererende RNA (siRNA). Denne protokollen beskriver optimaliserte betingelser for bruk av denne teknikken i humane Th17-celler. I tillegg til sirnas, kan kommersielt tilgjengelige syntetiske miRNA etterligner og inhibitorer brukes til å studere miRNA vinning og tap av funksjon. miRNA etterligner er dobbelt-trådet RNA-molekyler som er svært lik sirnas, men designed med sekvensen av endogene modne miRNAs. miRNA inhibitorer er kjemisk modifisert RNA og / eller LNA basert enkelttrådede oligonukleotider som bindes til innfødte mirnas og antagoniserer deres funksjon. Vi har funnet at alle disse verktøyene kan brukes effektivt i dyrkede primære T-lymfocytter, inkludert men ikke begrenset til menneskelige Th17 celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger UCSF retningslinjer for menneske forskningsetikk.

1. Fremstilling av T Cell Culture, Isolering av CD4 + T-celler, og Th17 Polarisering

  1. På dag 0, frakk 6-brønners vevskulturplater med 1,5 ml pr brønn av anti-human CD3 (2 ug / ml) og anti-human CD28 (4 ug / ml) i PBS med kalsium og magnesium i minst 2 timer ved 37 ° C.
    1. Alternativt kan belegge platene over natten ved 4 ° C. Pakk plater i parafilm.
  2. Klargjør ledningen blod mononukleære celler (CBMCs) ved densitetsgradientsentrifugering henhold til produsentens anvisninger.
    ADVARSEL: Arbeid nøye og sikre riktig personlig verneutstyr (PVU) er slitt ved håndtering av menneskeblod for å unngå risiko for eksponering for blodbårne patogener.
  3. Når mononukleære celler er blitt isolert og vasket, utføre human CD4 + T-celleisolering ved negativ seleDette skjer ved hjelp av et kommersielt human CD4 + T-cellesett.
    MERK: Hvis det er røde blodlegemer forurensning etter mononukleær celleisolasjon, kan en valgfri røde blodcellelysering utføres før de CD4 + T-celleisoleringstrinn. Resuspender de mononukleære celler i 1 ml isoleringsbuffer (2% FBS i PBS). Tilsett 5 ml av 1 x lysende løsning. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Deretter tilsett 5 ml isoleringsbuffer og sentrifuger ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C for å pelletere cellene.
    1. Resuspender mononukleære celler ved en tetthet på 50 x 10 6 per 500 ul i isoleringsbuffer i en ny 5 ml rør.
    2. Tilsett 100 ul av FBS og 100 ul av den antistoffblanding som per rør deretter inkubere hvert rør ved 4 ° C i 20 min på en orbital-rystemaskin for å blande godt.
    3. Etter inkuberingen, tilsett 3-4 ml isoleringsbuffer for å vaske cellene. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 8 minutter ved 4 ° C for å pelletere cellene. aspirere nøye supernatant
    4. I løpet av dette spinn, pre-vaske de magnetiske kuler. Overfør den ønskede mengde av magnetiske kuler inn i et nytt rør (anvendt ved 1: 1 med cellene) og tilsett et likt volum av isolasjonsbuffer for å vaske perlene. Bland godt ved anvendelse av en 1 ml mikropipette og deretter plassere røret i magneten i minst 1 min. aspirer nøye supernatanten. Resuspender de magnetiske perler i det samme volum i utgangspunktet overføres forut for vaskingen.
    5. Resuspender cellene i hvert rør med 500 mL av isoleringsbuffer og tilsett 500 ul av forvasket magnetiske kuler.
    6. Cellene inkuberes med magnetiske kuler i 15 minutter på en orbitalrister ved romtemperatur (18 ° C til 25 ° C) for å blande godt.
    7. Etter inkuberingen grundig pipettér cellene ved anvendelse av en 1 ml mikropipette minst 10 ganger. Deretter legger 3-4 ml isoleringsbuffer og plassere hvert rør i magneten i 2 min.
    8. Overføre nøye de negativt utvalgte CD4 + T-celler som er isupernatanten til et nytt rør.
  4. Når CD4 + T-celleisolering er fullført, telle cellene med et hemocytometer og holde cellene på is.
  5. Vask de antistoff-belagte plater to ganger med PBS. Deretter legger 1,5 ml 2x blanding av Th17-polariserende media til hver brønn: anti-humant IFN-y (20 ug / ml), anti-humant IL-4 (20 ug / ml), human TGFp (10 ng / mL), human IL-1β (40 ng / ml), humant IL-23 (40 ng / ml), human IL-6 (50 ng / mL) alle fortynnet i en serum-fri base medium (supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat og 100 uM 2-merkaptoetanol).
    MERK: Transfeksjon og RNA-interferens virker i serumholdig medium. Hensikten med å bruke serum-fritt medium med denne protokollen er å oppnå bedre IL-17A produksjon.
  6. Sentrifuger de humane CD4 + -T-celler ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å pelletere cellene. Aspirere nøye supernatmaur. Deretter resuspender cellene i serum-frie basismedium og plate cellene ved en tetthet på 3 x 10 til 6 i 1,5 ml per brønn, slik at sluttvolumet er 3 ml per brønn, og polariserings cytokiner er nå på en 1 x sluttkonsentrasjon.
    1. Plasser platene i 5% CO2, 37 ° C inkubator i to dager.

2. Elektroporering av in vitro-Menneske Polariserte celler Th17

  1. På dag 2, belegge 48-brønners vevkulturplater med 250 ul per brønn av anti-human CD3 (2 ug / ml) og anti-human CD28 (4 ug / ml) i PBS med kalsium og magnesium i minst 2 timer ved 37 ° C.
    1. Alternativt kan belegge platene over natten ved 4 ° C. Pakk plater i parafilm.
  2. Forberede små RNA for transfeksjon. For hver transfeksjon, aliquot 1 pl av en 5 mM stamløsning av siRNA inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Inkluder passende kjemi-matchet små RNA kontrol. Hold alle rør på is.
  3. Vask de antistoff-belagte plater to ganger med PBS. Deretter tilsett 500 ul 1X Th17-polariserende media til hver brønn: anti-humant IFN-y (10 ug / ml), anti-humant IL-4 (10 ug / ml), human TGFp (5 ng / ml), humant IL- 1β (20 ng / ml), humant IL-23 (20 ng / ml), human IL-6 (25 ng / mL) alle fortynnet i en serum-fri base medium (supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat og 100 uM 2-merkaptoetanol).
  4. Etter at kulturplatene og transfeksjonsreagenser fremstilles, resuspender cellene med en 1 ml mikropipette, pipetteringen forsiktig, men som sikrer at alle cellene er adskilt fra bunnen av brønnene. Pool cellene inn i et konisk rør og sentrifuger ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
    MERK: For kultur perioder lengre enn de fire-dagers protokoll som presenteres her, cellene bør transfektert ca hver 3. dag ved hjelp av den samme protokollen. Steg 20,4 bør modifiseres imidlertid fordi cellene ble behandlet med forskjellige små RNA ikke bør være slått sammen. Alle betingelsene blir testet må samles inn, telles, og transfektert separat.
  5. aspirere nøye supernatanten, og deretter resuspender cellene i minst 1 ml PBS for å vaske. Telle de levende Th17-celler (for eksempel med et hemocytometer ved hjelp av Trypan Blue utelukkelses for å vurdere levedyktigheten), og overføre cellene til et mikrosentrifugerør.
  6. Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene.
  7. Aspirere nøye supernatanten, og deretter resuspender cellene ved hjelp av den medfølgende resuspensjonsbuffer fra transfeksjonssystem 10 ul kit ved en tetthet på 2,5-4 x 10 7 celler per ml. Hold celler ved romtemperatur.
    MERK: Som en retningslinje, prøver å fremstille bare så mange celler som kan transfekteres i løpet av 30 min. Flere grupper kan sammenlignes.
  8. Legg 9 ul celler til 1 pl av små RNA i hver MicroCentrifuge rør. Pipetter en gang for å blande cellene og små RNA for transfeksjon deretter lastes inn i den medfølgende pipetten elektrodespissen.
    MERK: Typisk, tilsett 9,5 mL av cellesuspensjonen for å sikre at det er nok av blandingen for å forhindre skape bobler i pipetten elektrodespissen før transfeksjon.
  9. Fyll gitt kyvetten med 3 ml romtemperatur Elektrolytisk buffer E. Plasser kuverten inne i pipetten stasjonen og deretter plassere pipetten inn i posisjon inne i kyvetten.
  10. Umiddelbart electroporate hver 10 ul blanding av celler og små RNA ved hjelp av de følgende parametere: pulsspenning 1,500-1,550 V, bredde puls 10 ms, og 3 pulser totalt i transfeksjon enheten.
  11. Etter elektroporering er fullført, direkte legge celleblandingen til 500 ul med 1X Th17-polariserende media i fremstilte brønner i en kulturplate. Plasser plater i en 5% CO2, 37 ° C inkubator i to dager.
    MERK: Vask pipette elektrodespissen ved å pipettereopp og ned i PBS i mellom hver transfeksjon.

3. Høsting Humant Th17 Celler

  1. Resuspender cellene i kulturmedium med en mikropipette, pipetteres forsiktig, men å sikre at alle cellene er adskilt fra bunnen av brønnene. Fremstille celler for funksjonelle og / eller genekspresjon analyser.
    MERK: Rutinemessig, nok celler gitt fra en enkelt brønn av transfekterte Th17-celler som skal brukes for flowcytometrisk analyse av overflatemarkør og intracellulære cytokiner og transkripsjonsfaktor farging eller for fremstilling av RNA for genekspresjon analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det første trinnet for å utvikle et pålitelig system med hell electroporating humane celler Th17 var å generere robuste in vitro differensierte humane Th17 cellekulturer. T-celler dyrket under Th17-polariserende betingelser uttrykt kjemokinreseptoren CCR6 og transkripsjonsfaktoren RORγt (figur 1 A, til venstre). Disse markørene ble ikke uttrykt ved T-celler ble dyrket under ikke-polariserende (THN) betingelser (figur 1A, til høyre). T-celler dyrket under Th17-polariserende betingelser også fremstilt IL-17A på restimulering (figur 1 B, venstre), men ikke i henhold til THN betingelser (figur 1 B, høyre). Th17 differensiering oppstår fremdeles etter transfeksjon med små RNAer, men i noen eksperimenter, er det en observert reduksjon i hyppigheten av IL-17A produksjon (figur 1C). Virkningen av små RNA-transfeksjon på cytokinproduksjon demonstrerer viktigheten av å ha en kjemi-matchet liten RNA-kontroll for sammenligning innenfor hvert forsøk. Viktigere er levedyktighet opprettholdes etter transfeksjon med små RNA og er typisk større enn 70% (figur 1D).

For å bestemme effektiviteten av denne protokollen, brukte vi RNA-interferens. CD45-antigenet kodes for av PTPRC (protein tyrosin fosfatase, reseptor type C) -genet. CD45 blir uttrykt på alle hematopoietiske celler og derfor humane Th17-celler bør robust uttrykke dette overflatemarkør. Transfeksjon av humane Th17 celler på dag 2 med et siRNA-basseng rettet mot PTPRC sterkt reduserte ekspresjon av CD45 sammenlignet med en kontrollgruppe kjemi siRNA (figur 2A). Dette unimodal befolkning skift i CD45-ekspresjon tyder på nær 100% transfeksjonseffektiviteten, typisk for denne protokollen for små RNA. Dette er således et viktig verktøy som kan brukes til å vurdere transfeksjon efficiency under protokolloptimaliseringer. RORC koder RORγt, den dominerende transkripsjonsfaktor for humane Th17-celler, som direkte regulerer IL-17A produksjon. Transfektering av humane u-Th17-celler med et siRNA-bassenget mot RORC sterkt redusert RORγt uttrykk som forventet (figur 2B). Reduksjon RORγt ekspresjon av RNAi hadde en funksjonell effekt, ettersom disse cellene utviste redusert IL-17A produksjon (figur 2C) sammenlignet med celler transfektert med en kontroll siRNA. Ikke-polariserte CD4 + T-celler bør ikke uttrykker noen RORγt eller IL-17A og er vist som en negativ kontroll i denne figuren.

Figur 1
Figur 1: In vitro-Menneske Differensiert Th17-celler uttrykker CCR6, RORγt, og IL-17A. Human CD4 + T-celler isolert fra navlestrengsblod ble dyrket under Th17 forhold (IL-1β, IL-23, IL-6 og TGFp) eller i ikke-polariserende (THN) betingelser (media bare, ikke polariserende cytokiner eller blokkerende antistoffene som er tilsatt) in vitro og analysert på dag 4 for Th17 markør ekspresjon ved strømningscytometri: (A) Representative konturopptegninger fremvisningsflate CCR6 og intracellulær RORγt co-farging av CD4 + T-celler. Tallene i kvadrantene indikerer prosent CCR6 og / eller RORγt-positive levende sing CD4 + celler. (B) IL-17A og IFNy-produksjon etter restimulering med PMA / ionomycin. Tallene i kvadrantene indikerer prosent IL-17A og / eller IFNy-positive levende sing CD4 + celler. (C) Representative konturdiagram som viser overflaten CCR6 og intracellulær RORγt co-farging av CD4 + T-celler etter transfeksjon med små RNA-kontroll. Tallene i kvadrantene indikerer prosent CCR6 og / eller RORγt-positive levende sing CD4 + celler (venstre). Representative konturdiagram som viser IL-17A og IFNy-produksjon etter restimulering med PMA / ionomycin etter transfeksjon med små RNA-kontroll. Tallene i kvadrantene indikerer prosent IL-17A og / eller IFNy-positive levende singlet CD4 + celler (høyre). (D) Representative konturopptegning viser levedyktigheten av CD4 + celler etter transfeksjon med små RNA-kontroll. Tallet angir prosent CD4 + levende singlet celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: RNA-interferens i primære, humane Th17 celler. Humane CD4 + T-celler fra navlestrengblod dyrket under betingelser Th17 ble transfektert på dag 2 med et siRNA-nontargeting kontroll (siNeg CTL) eller målretting mot basseng PTPRC (si PTPRC) eller RORC (si RORC) omfattende 4 individuelle sirnas. Cellene ble så analysert ved hjelp av strømningscytometri på dag 4: (A) Overflate CD45-ekspresjon er vist i et representativt histogram etter transfeksjon med Si PTPRC (grå nyanse) eller siNeg Ctl (sort linje). (B) Intracellulær RORγt uttrykket er vist i et representativt histogram etter transfeksjon med Si RORC (grå nyanse) eller siNeg Ctl (sort linje). (C) Representative konturopptegninger viser flate-CD4 og intracellulær RORγt co-farging av CD4 + T-celler (øvre panel) eller IL-17A og IFNy-produksjon etter restimulering med PMA / ionomycin (nedre panel). Tallene i kvadrantene indikere antall CD4 + RORγt + eller IL-17A og / eller IFNy-positive levende singlet-celler under THN eller Th17 betingelser transfektert med siNeg Ctl eller Si RORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen gir en forbedret fremgangsmåte for levering av små RNA inn i humane celler Th17. Selv om humane Th17-celler ble benyttet her, kan denne metoden for elektroporering med små RNA brukes sammen med andre primære humane T-hjelper undergrupper, for eksempel TM1, TM2, og Tregs. Det har ikke fungert godt for naive CD4 + T-celler, slik at cellene må aktiveres i kultur før transfeksjon. For denne protokollen, vi første optimaliserte in vitro dyrkningssystem for bedre IL-17A produksjon. Den største faktoren var grunn medier. Vi har funnet at serumfritt medium var overlegen i forhold til tradisjonelle serumholdig medium for bedre induksjon av IL-17A fremstilling av humane Th17-celler. Siden Th17 celler kan genereres med delsett av cytokiner TGFfi, IL-1 p, IL-23 og IL-6, ble det undersøkt forskjellige cytokin-mikser. I denne studien, har vi oppnådd mer robust IL-17A produksjon når alle fire polariserings cytokiner ble inkludert. I tillegg har vi optimalisert forkorte lengdenkulturen for å sikre at bare ett transfeksjon var nødvendig i løpet av dyrkningsperioden. Selv om denne fire dagers protokollen tillater resultater som skal genereres raskere og nødvendiggjør bare en transfeksjon, ble kultur lengde forlenges for å ytterligere øke IL-17A produksjon. En lengre dyrkningsperioden kan også være nødvendig for å oppnå optimal differensiering fra andre primære T-celleundergrupper. Siden disse transfections er forbigående, kan flere transfections være nødvendig over tid for lange kultur perioder. Vi foreslår at etterfylling små RNA reagenser etter ca. 3 dager ved gjen electroporating cellene med reagenset for å forhindre fortynning over flere celledelinger. Vi har rutinemessig gjort dette for muse CD4 + T-celler. Selv om det er mer teknisk utfordrende siden cellene i hver tilstand må samles og telles hver for seg, er transfeksjon vellykket og det er minimal virkning på celle levedyktighet.

I disse eksperimentene, menneske Th17 celler vire genereres gjennom in vitro dyrking av humant navlestrengsblod. Viktigere, vil et alternativ til denne differensiering analysen være å benytte humane perifere mononukleære blodceller (PBMC). For både CBMCs og PBMC, er det nødvendig å isolere CD4 + T-celler før starten av kulturen. Vi presenterer her vår fremgangsmåte for rensing av CD4 + T-celler ved negativ seleksjon, noe som ga robuste transfeksjonseffektiviteten, men vi forventer at andre metoder for fremstilling av primære, humane CD4 + -T-celler ville fungere like bra. Vi har forsøkt flere kits som benytter enten positiv eller negativ seleksjon for isolering av muse-CD4 + T-celler og begge fremgangsmåter har ført til lignende transfeksjonseffektivitet. En ytterligere betraktning er viktigheten av å bruke naive T-celler for optimalt å differensiere til Th17-celler. Ved hjelp av humant navlestrengsblod er fordelaktig av den grunn, fordi det allerede har en høyere andel av naive T-celler pmislike, og derfor er det ikke nødvendig å sortere eller pre-berike for naive T-celler før start av kulturen. Det er imidlertid en klar ulempe med denne tilnærmingen den begrensede tilgjengeligheten av navlestrengsblod. Alternativt sortering av naive T-celler fra PBMC 14 kan utføres før kultur siden denne ressursen er lettere tilgjengelig, selv om større mengder ville måtte bli oppnådd.

Selv om det finnes flere fremgangsmåter for å transfektere pattedyrceller, primære T-celler har en tendens til å være vanskeligere celletype for å transfektere. Neste generasjon elektroporering er en vellykket fysisk metode for å transfektere forbigående T-celler som er teknisk enkel å utføre og er reproduserbar. Når optimalisert, er det en meget høy virkningsgrad av transfeksjonseffektivitet for små RNA som nærmer seg 100%. Dette kan sees i figur 2, hvor hele unimodal populasjon av CD45 + celler (figur 2A) og den population av alle celler som uttrykker RORγt (figur 2B) for å skifte en lavere ekspresjonsnivå. Viktigere, ikke optimalisert transfeksjon med små RNA ikke kompromiss celleviabilitet. Vi observerer rutinemessig større enn 70% levedyktighet etter transfeksjon med små RNA (Figur 1D). Selv om levedyktighet er ikke et problem med denne protokollen, biologi av andre T-celle-karakteristika, så som cytokin-produksjon, kan påvirkes etter transfeksjon med små RNA. Av denne grunn er det kritisk viktig å bruke en kjemi-matchet små RNA kontroll i hvert eksperiment.

Vi optimalisert to elektroporasjonseksperimentene parametere, puls og spenning, for å minimere celledød og maksimere transfeksjonseffektivitet. Høyere spenninger øke celledød under transfeksjon. Noen andre tekniske hensyn til å forhindre celledød og sikre vellykket transfeksjon omfatter å minimalisere mengden av syntetiske anvendte reagenser og begrense den tid betwee n cellepreparat og elektroporering. Minimale konsentrasjoner som er nødvendige for syntetiske transfeksjonsreagenser bør alltid benyttes for å hindre potensiell T-celletoksisitet og off-target effekter. Reduksjon av cellepreparat tid før transfeksjon for å minimere tiden av celler i transfeksjonsbuffer ved romtemperatur, er avgjørende, og kan oppnås ved å fremstille celler i grupper, om nødvendig.

For tiden er det to kommersielt tilgjengelige neste generasjons elektroporasjonseksperimentene instrumenter. Begge disse systemene kan effektivt transfektere primære T-celler. Denne protokollen ble optimalisert ved bruk av neon transfeksjonssystem. Selv om dette systemet transfeksjon er mer kostnadseffektivt, det Amaxa systemet tilbyr en unik måte en 96-brønn adapter for elektroporering for høyere gjennomstrømning. Vi håper at flere kommersielle fremskritt vil fortsette å øke gjennomstrømningen og effektiviteten av disse transfeksjonssystemer, samtidig som kostnadene på et minimum.

"> Neste generasjon elektroporering av humane T-celler kan effektivt innføre små RNA inkludert sirnas mot mål-gener av interesse som eksemplifisert i denne protokollen, så vel som miRNA etterligner eller inhibitorer. Den høye virkningsgrad som gjør det unødvendig å bruke markører for transfeksjon siden nesten alle cellene er transfektert med små RNA. Dette er i motsetning til transfeksjon av primære T-celler med DNA-plasmider hvor typiske plasmid transfeks resulterer i at bare 20 til 30% ekspresjon av markørgenet med større enn 50% toksisitet, som øker med økende mengder av plasmid. Innføring syntetiske ligner ved hjelp av denne metode har gjort det mulig for mange gener som skal undersøkes for funksjon i T-cellebiologi i parallell uten noe behov for molekylær kloning 12, 13. det har også aktivert testing for funksjonen av alle mirnas uttrykt av T-celler i parallell 11 , 13. Med denne protokollenDisse typer av moderat gjennomstrømning skjermer er anvendelig til humane T-celler. Spesielt, denne teknikken ble nylig anvendt for å innføre små RNA (gRNA) -Cas9 ribonukleoprotein-komplekser til primære humane T-celler for genom redigering 15. Disse forskjellige anvendelser markere verktøyet, fleksibilitet og kraften av den protokoll som presenteres her som et viktig verktøy for immunologer søker å undersøke T-cellebiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats