Piccolo RNA trasfezione in cellule primarie Th17 Human Next Generation elettroporazione

Published 4/13/2017
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Immunology and Infection

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Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

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Abstract

Introduction

Cellule T CD4 + sono orchestrators cruciali della risposta immunitaria adattativa. Naive cellule T CD4 + sono capaci di svilupparsi in diversi cellule T effettrici (es Th1, Th2, Th17, ecc), ciascuno con la propria serie di citochine e fattori di trascrizione caratteristici, a seconda del microambiente locale 1. Le decisioni lignaggio che le cellule T fanno sono fondamentali sia per l'immunità protettiva e la tolleranza per sé. Cellule Th17 sono un sottogruppo di cellule T conosciuti per combattere batteri extracellulari e funghi, ma le loro risposte improprie sono anche implicati nella patogenesi di più malattie autoimmuni e infiammatorie come la sclerosi multipla e psoriasi 2, 3. Cellule Th17 umane possono essere generati da cellule T CD4 + naive in vitro fornendo loro un appropriato ambiente polarizzazione 4. Vario ci combinazioni delle citochine IL-1β, IL-23, TGF, e IL-6 sono stati utilizzati per lo sviluppo delle cellule Th17 umane. Cellule Th17 umane esprimono CCR6, un recettore delle chemochine che viene comunemente utilizzato per identificare questa popolazione cellulare e sono definite dall'espressione del loro fattore di trascrizione principale, RORγt (codificata dal RORC) 5, 6. cellule Th17 hanno la capacità di esprimere molteplici citochine, ma IL-17A è la citochina effettore lignaggio definizione prodotta da queste cellule. Abbiamo esaminato l'espressione di tutti i tre marcatori Th17-associato (CCR6, RORγt, IL-17A) per valutare la robustezza della nostra analisi umana Th17 in vitro differenziazione. Inoltre, abbiamo coltivato le cellule T CD4 + umane in condizioni non polarizzante, in cui sono stati aggiunti citochine o anticorpi bloccanti al mezzo di coltura da usare come controllo negativo in quanto espressione di questi marcatori Th17 dovrebbe essere molto bassa o assente.

ve_content "> Un modo per studiare il normale sviluppo delle cellule T umane e la biologia è quello di manipolare l'espressione genica durante il loro sviluppo. A breve RNA interferenti (siRNA) sono sintetici piccole molecole di RNA che hanno come target mRNA codificanti proteine ​​e possono essere utilizzati per ridurre l'espressione genica specifica . I microRNA (miRNA) sono endogeni non codificanti piccoli RNA noti per modulare l'espressione genica post-trascrizionale. miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante sia murine e biologia delle cellule T umane, anche in cellule Th17 7, 8, 9. e ' è fondamentale avere metodi affidabili di manipolare piccola attività di RNA nelle cellule T umane per studiare i loro effetti sulla espressione genica e, infine, sulla biologia delle cellule T umano. Qui, descriviamo un protocollo facile da usare, affidabile e coerente che abbiamo sviluppato per l'introduzione piccoli RNA sintetici e acidi nucleici bloccati (LNA, chimicamente modificati acidi nucleici con maggiore stabilità)nelle cellule del sistema immunitario, e in particolare nelle cellule Th17 umane.

Ci sono diversi metodi alternativi di introdurre piccoli RNA in cellule di mammifero, che generalmente rientrano in chimici, biologici o fisici categorie 10. metodi chimici comunemente usati, tra trasfezioni base di lipidi e trasfezioni calcio-fosfato, si basano sulla creazione di complessi chimico-DNA che vengono più efficacemente assorbiti dalle cellule. In generale, i metodi chimici non sono efficienti per la trasfezione di cellule T primarie. Il metodo biologico più comune è quella di utilizzare un vettore virale (ad esempio retrovirus o lentivirus), che inserisce direttamente RNA estraneo in un host come parte del suo ciclo di replica naturale. trasduzione virale richiede in genere più tempo per completare, soprattutto quando si tiene conto in tempo per la clonazione molecolare di plasmidi provirale. Inoltre, i vettori di trasduzione virali possono essere potenzialmente dannosi per i ricercatori umani. L'elettroporazione è una m fisicoetodo di indurre permeabilizzazione della membrana sottoponendo cellule di impulsi di alta tensione, permettendo agli acidi nucleici di entrare transientemente nella cella dove possono agire per suo bersaglio. strumenti elettroporazione tradizionali non sono stati efficaci per trasfezione linfociti primari. Tuttavia, ottimizzato generazione elettroporazione accanto ha dimostrato di essere in grado di trasfettare cellule T ad altissima efficienza, specialmente quando il materiale da transfettate è piccolo RNA. La prossima generazione termine è genericamente usato per differenziare le due piattaforme più recenti (ad esempio, neon, Amaxa) dalle macchine tradizionali elettroporazione. Inoltre, questo metodo è facilmente scalabile per schermi di throughput moderati con fino a circa 120 piccoli RNA in un singolo esperimento, spesso utilizzando reagenti convalidati sintetici. Soprattutto, trasfezioni successo può essere raggiunto in appena 16 h dopo l'attivazione delle cellule T. Lo svantaggio di questo metodo, tuttavia, è che non comporti stabile incorporati genomicasu, ed è quindi transitoria. Quindi, vale la pena lo sforzo supplementare per creare un costrutto di espressione stabile che può essere confezionato in un vettore virale ed espresso con successo in cellule T nei casi in cui è richiesta l'espressione a lungo termine di un piccolo RNA.

Abbiamo utilizzato un trasfezione prossima generazione (ad esempio, neon) per fornire diversi strumenti semplice o doppio filamento di RNA o LNA oligonucleotidici per scopi diversi 11, 12, 13. RNA interferenza efficiente può essere indotta nel topo primaria e cellule T umane usando RNA corto interferenti doppio filamento (siRNA). Questo protocollo descrive condizioni ottimizzate per l'utilizzo di questa tecnica in cellule Th17 umane. Oltre a siRNA, disponibili in commercio imita miRNA sintetiche e inibitori possono essere utilizzati per studiare guadagno miRNA e perdita di funzione. imita miRNA sono molecole di RNA a doppio filamento molto simili a siRNA, ma designed con la sequenza dei miRNA maturi endogeni. inibitori miRNA sono chimicamente modificati RNA e / o LNA basato oligonucleotidi cavo rigido che si legano a miRNA nativi e antagonizzano la loro funzione. Abbiamo scoperto che tutti questi strumenti possono essere utilizzati efficacemente in coltura i linfociti T primari, compreso ma non limitato alle cellule Th17 umane.

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Protocol

Questo protocollo aderisce alle linee guida del UCSF per l'etica della ricerca umana.

1. Preparazione di T coltura cellulare, Isolamento di cellule T CD4 + e Th17 polarizzazione

  1. Al giorno 0, cappotto 6 pozzetti di coltura tissutale con 1,5 ml per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C.
    1. In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm.
  2. Preparare le cellule mononucleate del sangue del cordone (CBMCs) di densità centrifugazione in gradiente le istruzioni del produttore.
    ATTENZIONE: Lavorare con cura e garantire la corretta dispositivi di protezione individuale (DPI) è indossare durante la manipolazione del sangue umano per evitare ogni rischio di esposizione ad agenti patogeni.
  3. Una volta che le cellule mononucleate sono state isolate e lavati, eseguire isolamento delle cellule T CD4 + umano sele negativoction utilizzando un kit commerciale di cellule T CD4 + umana.
    NOTA: Se c'è contaminazione globuli rossi dopo l'isolamento di cellule mononucleate, una lisi dei globuli rossi opzionale può essere eseguita prima delle fasi di isolamento delle cellule T CD4 +. Risospendere le cellule mononucleari in 1 ml di tampone di isolamento (2% FBS in PBS). Aggiungere 5 ml di soluzione di lisi 1x. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quindi 5 ml di tampone di isolamento e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule.
    1. Risospendere le cellule mononucleari ad una densità di 50 x 10 6 per 500 microlitri nel buffer isolamento in una nuova provetta 5 ml.
    2. Aggiungere 100 ml di FBS e 100 microlitri della miscela di anticorpi per provetta poi incubare ciascun tubo a 4 ° C per 20 minuti in un agitatore orbitale per mescolare bene.
    3. Dopo l'incubazione, aggiungere 3-4 mL di tampone isolamento per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 300 xg per 8 minuti a 4 ° C per sedimentare le cellule. aspirare accuratamente la supernatant
    4. Durante questo spin, pre-lavare le sfere magnetiche. Trasferire la quantità desiderata di perline magnetiche in un nuovo tubo (usato a 1: 1 con le cellule) e aggiungere un uguale volume di tampone di isolamento per lavare le perline. Mescolare bene con una micropipetta mL 1 e quindi inserire il tubo nel magnete per almeno 1 min. Con attenzione aspirare il surnatante. Risospendere le sfere magnetiche nello stesso volume inizialmente ceduto prima del lavaggio.
    5. Risospendere le cellule in ciascuna provetta con 500 ml di tampone di isolamento e aggiungere 500 ml di perline magnetiche pre-lavati.
    6. Incubare le cellule con le perline magnetiche per 15 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) miscelare bene.
    7. Dopo l'incubazione, pipettare accuratamente le cellule utilizzando una micropipetta 1 mL almeno 10 volte. Quindi aggiungere 3-4 ml di tampone isolamento e posizionare ciascun tubo nel magnete per 2 min.
    8. Trasferire accuratamente le cellule T CD4 + negativamente selezionati che sonoil surnatante in una nuova provetta.
  4. Una volta che l'isolamento delle cellule T CD4 + è stata completata, contare le cellule con un emocitometro e mantenere le cellule in ghiaccio.
  5. Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 1,5 mL di 2x mix di media Th17-polarizzazione in ciascun pozzetto: IFNy anti-umana (20 mg / ml), anti-IL-4 (20 mg / ml), TGF umana (10 ng / mL), umano IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 umana (50 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo).
    NOTA: Transfection e RNA interference fa il lavoro in supporto contenente siero. Lo scopo di utilizzare supporti privo di siero con questo protocollo è quello di ottenere una migliore produzione di IL-17A.
  6. Centrifugare le cellule umane T CD4 + a 500 xg per 5 min a 4 ° C a pellet cellule. Aspirare accuratamente la supernatformica. Poi risospendere le cellule in base privo di siero e piastra le cellule ad una densità di 3 x 10 6 in 1,5 ml per pozzetto in modo che il volume finale è di 3 ml per pozzetto e citochine polarizzanti sono ora ad una concentrazione finale 1x.
    1. Posizionare le piastre in 5% CO 2, 37 ° C incubatore per due giorni.

2. Le cellule elettroporazione di In Vitro polarizzato Th17 umana

  1. Il giorno 2, cappotto 48-pozzetti di coltura tissutale con 250 microlitri per pozzetto di anti-umana CD3 (2 ug / mL) e CD28 anti-umano (4 ug / ml) in PBS con calcio e magnesio per almeno 2 ore a 37 ° C.
    1. In alternativa, ricoprire le piastre per una notte a 4 ° C. Avvolgere le piastre in parafilm.
  2. Preparare piccoli RNA per la trasfezione. Per ogni trasfezione, aliquota 1 ml di 5 mM soluzione stock di siRNA in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Includi appropriata chimica-abbinato piccolo contr RNAolo. Tenere tutti i tubi in ghiaccio.
  3. Lavare le piastre rivestite con anticorpo due volte con PBS. Quindi aggiungere 500 ml di 1X Th17-polarizzazione media per ogni pozzetto: IFNy anti-umana (10 mg / ml), anti-IL-4 (10 mg / ml), TGF umano (5 ng / mL), IL-umano 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 umana (25 ng / mL) tutti diluita in un mezzo di base privo di siero (integrato con 2 mM di L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 10 mM HEPES, 1 mM sodio piruvato e 100 pM 2-mercaptoetanolo).
  4. Dopo che le piastre di coltura e reagenti di trasfezione sono preparati, risospendere le cellule con 1 ml micropipetta, pipettando gentilmente ma assicurando che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Raggruppare le cellule in una provetta conica e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    NOTA: Per periodi più lunghi di cultura del protocollo di quattro giorni qui presentate, le cellule devono essere trasfettate circa ogni 3 giorni usando lo stesso protocollo. Passo 2.4 dovrebbe essere modificato tuttavia, poiché le cellule trattate con differenti piccoli RNA non dovrebbero essere convogliati. Tutte le condizioni in fase di test devono essere raccolti, contati e trasfettate separatamente.
  5. aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule in almeno 1 ml di PBS per lavare. Contare le cellule Th17 vive (ad esempio con un emocitometro utilizzando Trypan Blue esclusione per valutare la vitalità) e poi trasferire le cellule in una provetta.
  6. Centrifugare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule.
  7. Aspirare accuratamente il surnatante e quindi risospendere le cellule usando il tampone di risospensione fornito dal sistema di transfezione 10 microlitri kit ad una densità di 2,5-4 x 10 7 cellule per ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
    NOTA: Come linea guida, provare a preparare solo il maggior numero di cellule, come si può transfettate entro 30 min. lotti multipli possono essere confrontati.
  8. Aggiungere 9 ml di cellule per 1 ml di piccoli RNA in ogni MicroCtubo entrifuge. Dispensare una volta per mescolare le cellule e piccoli RNA per trasfezione quindi caricare nella punta dell'elettrodo pipetta.
    NOTA: Tipicamente, aggiungere 9,5 ml di sospensione cellulare per garantire il della miscela per evitare la creazione di bolle nella punta dell'elettrodo pipetta prima trasfezione.
  9. Riempire la vaschetta fornito con 3 ml di temperatura ambiente elettrolitico Buffer E. Posizionare la cuvetta all'interno della stazione pipetta e quindi inserire la pipetta in posizione all'interno della provetta.
  10. elettroporazione immediatamente ogni 10 ml mix di cellule e piccoli RNA utilizzando i seguenti parametri: tensione ad impulsi 1,500-1,550 V, larghezza di impulso di 10 ms, e 3 impulsi totale sul dispositivo trasfezione.
  11. Dopo l'elettroporazione è completa, aggiungere direttamente la miscela di cellule per 500 ml di 1X Th17-polarizzante media in pozzetti preparati dei piastra di coltura. Piastre posto in un 5% di CO 2, 37 ° C incubatore per altri due giorni.
    NOTA: Lavare l'elettrodo pipetta pipettandosu e giù in PBS tra ogni trasfezione.

3. Cellule raccolta Th17 umane

  1. Risospendere le cellule in coltura con una micropipetta, pipettando gentilmente ma garantire che tutte le cellule sono staccate dal fondo dei pozzetti. Preparare le cellule per analisi di espressione funzionale e / o geni.
    NOTA: Di routine, abbastanza cellule vengono ceduti da un singolo pozzo di cellule Th17 trasfettate da utilizzare per l'analisi di citometria di flusso del marcatore di superficie e intracellulare di citochine e fattori di trascrizione colorazione o per la preparazione di RNA per l'analisi di espressione genica.

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Representative Results

Il primo passo per lo sviluppo di un sistema affidabile di electroporating successo cellule Th17 umane era di generare robusta in vitro differenziato colture di cellule Th17 umane. Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili espresso il recettore delle chemochine CCR6 e il fattore di trascrizione RORγt (Figura 1A, sinistra). Questi marcatori non sono stati espressi quando le cellule T sono state coltivate in condizioni non polarizzante (THN) (Figura 1A, destra). Le cellule T coltivate in condizioni Th17 polarizzabili prodotte anche IL-17A upon restimolazione (Figura 1B, sinistra) ma non in condizioni THN (Figura 1B, destra). Differenziazione Th17 persiste dopo trasfezione con piccoli RNA ma in alcuni esperimenti, v'è una riduzione osservata nella frequenza di produzione di IL-17A (Figura 1C). L'effetto di piccolo RNA trasfezione sulla produzione di citochine dimostra l'importanza di avere un piccolo controllo RNA chimica-abbinato per confronto all'interno di ogni esperimento. È importante sottolineare che la vitalità viene mantenuta dopo trasfezione con piccoli RNA ed è tipicamente maggiore di 70% (Figura 1D).

Per determinare l'efficienza di questo protocollo, abbiamo utilizzato RNA interference. L'antigene CD45 è codificata dal PTPRC (proteina tirosina fosfatasi, recettore di tipo C) gene. CD45 è espresso su tutte le cellule ematopoietiche e le cellule Th17, pertanto umani dovrebbe robustamente esprimere questo marcatore di superficie. Trasfezione di cellule Th17 umane il giorno 2 con una piscina siRNA PTPRC riduce fortemente l'espressione di CD45 rispetto ad una chimica abbinato controllo siRNA (Figura 2A). Questo spostamento popolazione unimodale espressione CD45 indica vicino efficienza di trasfezione 100%, tipico di questo protocollo per piccoli RNA. Quindi, questo è un importante strumento che può essere utilizzato per valutare la trasfezione effcienza durante ottimizzazioni del protocollo. RORC codifica RORγt, il fattore di trascrizione predominante di cellule Th17 umane, che regola direttamente la produzione di IL-17A. Trasfezione sviluppo cellule Th17 umane con una piscina siRNA contro RORC fortemente ridotta espressione RORγt come previsto (Figura 2B). Riducendo RORγt espressione da RNAi ha avuto un effetto funzionale, poiché queste cellule esposte ridotta produzione di IL-17A (Figura 2C) rispetto alle cellule trasfettate con un controllo siRNA. Non polarizzati cellule T CD4 + non devono esprimere qualsiasi RORγt o IL-17A e vengono visualizzati come controllo negativo in questa figura.

Figura 1
Figura 1: In vitro cellule differenziate Th17 umano espresso CCR6, RORγt, e IL-17A. Cellule T CD4 + umane isolate dal sangue del cordone ombelicale sono stati coltivati undeCondizioni r Th17 (IL-1β, IL-23, IL-6, e TGF) o in condizioni non-polarizzante (THN) (media only, nessun citochine polarizzanti o anticorpi bloccanti aggiunti) in vitro e analizzate il giorno 4 per marcatore Th17 espressione mediante citometria di flusso: (A) CCR6 rappresentativa grafici di contorno della superficie di visualizzazione e intracellulare RORγt co-colorazione di cellule T CD4 +. I numeri in quadranti indicano per cento CCR6 e / o cellule RORγt positive dal vivo singoletto CD4 +. (B) IL-17A e IFNgamma produzione dopo restimolazione con PMA / ionomicina. I numeri in quadranti indicano per cento IL-17A e / o singoletto vivo IFNgamma-positivi cellule CD4 +. (C) trama Rappresentante display contorno superficiale CCR6 e intracellulare RORγt co-colorazione di cellule T CD4 + post-trasfezione con piccolo controllo RNA. I numeri in quadranti indicano per cento CCR6 e / o cellule RORγt positive dal vivo singoletto CD4 + (a sinistra). representatrama di contorno tive mostra IL-17A e IFNy produzione dopo restimolazione con PMA / ionomicina post-trasfezione con piccolo controllo RNA. I numeri in quadranti indicano per cento IL-17A e / o celle (a destra) di singoletto vivo IFNgamma-positivi CD4 +. (D) trama di contorno rappresentativa mostra vitalità delle cellule CD4 + post-trasfezione con piccolo controllo RNA. Numero indica cento cellule vive di singoletto CD4 +. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: RNA interferenza nelle cellule primarie Th17 umana. Cellule T CD4 + umani dal sangue del cordone ombelicale coltivate in condizioni Th17 sono state trasfettate il giorno 2 con un controllo siRNA nontargeting (siNeg Ctl) o in piscina targeting contro PTPRC (si PTPRC) o RORC (si RORC) comprendente 4 siRNA individuali. Le cellule sono state poi analizzate al citofluorimetro il giorno 4: Espressione (A) di superficie CD45 mostrato in un istogramma rappresentante dopo trasfezione con si PTPRC (tinta grigio) o siNeg Ctl (linea nera). Espressione (B) intracellulare RORγt è mostrato in un istogramma rappresentante dopo trasfezione con si RORC (tinta grigio) o siNeg Ctl (linea nera). (C) mostrano grafici di contorno rappresentative superficie CD4 e intracellulare RORγt co-colorazione di cellule T CD4 + (pannello superiore) o IL-17A e produzione IFNy dopo restimolazione con PMA / ionomicina (pannello inferiore). Numeri in quadranti indicano percentuale CD4 + RORγt + o IL-17A e / o IFNy-positivi cellule singoletto vivo in condizioni THN o Th17 transfettate con siNeg Ctl o si RORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per la consegna di piccoli RNA in cellule Th17 umane. Sebbene le cellule Th17 umane sono stati usati qui, questo metodo di elettroporazione con piccoli RNA può essere utilizzato con altri sottoinsiemi helper umana primaria T, come Th1, Th2 e Tregs. Esso non funziona bene per le cellule T CD4 + naive quindi le cellule devono essere attivati in coltura prima della trasfezione. Per questo protocollo, abbiamo prima ottimizzato il sistema di coltura in vitro in una migliore produzione di IL-17A. Il più grande fattore era base per supporti multimediali. Abbiamo trovato che mezzo privo di siero era superiore alle celle tradizionali siero contenenti supporti per una migliore induzione di IL-17A produzione umani Th17. Poiché le cellule Th17 possono essere generati con sottoinsiemi delle citochine TGFp, IL-1b, IL-23 e IL-6, abbiamo testato diverse miscele di citochine. In questo studio, abbiamo ottenuto più robusta produzione di IL-17A quando tutte e quattro le citochine polarizzanti sono stati inclusi. Inoltre, abbiamo ottimizzato accorciando la lunghezza dila cultura di garantire un solo trasfezione era necessario durante il periodo di coltura. Anche se questo protocollo di quattro giorni consente risultati da generare più veloce e richiede solo una trasfezione, lunghezza di cultura potrebbe essere allungato per aumentare ulteriormente la produzione di IL-17A. Un periodo di coltura più lungo può anche essere necessaria per raggiungere la differenziazione ottimale di altre sottopopolazioni di cellule T primarie. Poiché questi trasfezioni sono transitori, più trasfezioni possono essere necessari nel tempo per periodi lunghi di coltura. Vi proponiamo di rifornire piccoli RNA reagenti dopo circa 3 giorni da re-electroporating le cellule con il reagente per evitare la diluizione su più divisioni cellulari. Abbiamo regolarmente fatto per le cellule di topo T CD4 +. Anche se è più tecnicamente difficile poiché le cellule in ciascuna condizione devono essere raccolti e contati separatamente, la trasfezione è successo e ci sono effetti minimi sulla vitalità cellulare.

In questi esperimenti, le cellule Th17 umane noiri generata attraverso coltura in vitro di sangue del cordone ombelicale umano. Soprattutto, un'opzione alternativa a questo saggio differenziazione sarebbe usare cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC). Per entrambi CBMCs e PBMC, è necessario isolare le cellule T CD4 + prima dell'inizio della coltura. Presentiamo qui il nostro metodo per purificare le cellule T CD4 + da selezione negativa, che ha prodotto robusto efficienza di trasfezione, ma ci aspettiamo che altri metodi di preparazione di cellule T CD4 + umani primari funziona altrettanto bene. Abbiamo provato diversi kit che utilizzano la selezione positiva o negativa per l'isolamento delle cellule T CD4 + mouse e entrambi i metodi hanno prodotto simile efficienza di trasfezione. Un'ulteriore considerazione è l'importanza di usare cellule T naive per differenziare in modo ottimale in cellule Th17. Utilizzando cordone ombelicale umano è vantaggioso per questo motivo perché ha già una proporzione maggiore di naive T cellule prisentono e quindi non è necessario ordinare o pre-arricchimento per le cellule T naive prima dell'inizio della coltura. Tuttavia, un chiaro svantaggio di questo approccio è la limitata disponibilità di sangue del cordone ombelicale. In alternativa, l'ordinamento di cellule T naive da PBMC 14 può essere eseguita prima di coltura poiché questa risorsa è più facilmente disponibile, anche se grandi quantità dovrebbero essere ottenuti.

Mentre ci sono diversi metodi per trasfettare cellule di mammifero, cellule T primarie tendono ad essere un tipo cellulare più difficile trasfezione. generazione elettroporazione successivo è un metodo fisico efficace di cellule T transitoriamente trasfezione che è tecnicamente semplice da eseguire e riproducibile. Una volta ottimizzato, ha una elevata efficienza di trasfezione per piccoli RNA che si avvicina al 100%. Questo può essere visto in Figura 2 dove l'intera popolazione unimodale delle cellule CD45 + (Figura 2A) e il population di tutte le cellule che esprimono RORγt (Figura 2B) passaggio ad un livello minore espressione. Soprattutto, trasfezione ottimizzato con piccoli RNA non compromette la vitalità cellulare. Noi abitualmente osserviamo superiore al 70% redditività post-trasfezione con piccoli RNA (Figura 1D). Sebbene la vitalità non è un problema con questo protocollo, la biologia di altre caratteristiche delle cellule T, come la produzione di citochine, possono essere colpiti dopo trasfezione con piccoli RNA. Per questo motivo, è estremamente importante utilizzare un controllo piccolo RNA chimica-abbinato in ogni esperimento.

Abbiamo ottimizzato la due parametri di elettroporazione, impulsi e tensione, per minimizzare la morte cellulare e massimizzando l'efficienza di trasfezione. Tensioni superiori aumentano la morte delle cellule durante la trasfezione. Alcune altre considerazioni tecniche per prevenire la morte cellulare e garantiscono trasfezione successo includono minimizzando la quantità di reagenti sintetici utilizzati e limitando al tempo betwee preparato cellulare n ed elettroporazione. concentrazioni minime necessarie per i reagenti di trasfezione sintetiche dovrebbe essere sempre utilizzati per prevenire potenziale tossicità delle cellule T e effetti off-bersaglio. Riducendo i tempi di preparazione di cellule prima della trasfezione per minimizzare il tempo di cellule in tampone trasfezione a temperatura ambiente è cruciale e può essere ottenuto preparando cellule in lotti, se necessario.

Attualmente, sono disponibili in commercio due strumenti elettroporazione prossima generazione. Entrambi i sistemi possono trasfettare efficientemente cellule T primarie. Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando il sistema trasfezione neon. Mentre questo sistema trasfezione è più conveniente, il sistema Amaxa offre in modo univoco un adattatore a 96 pozzetti per l'elettroporazione per le applicazioni di throughput più elevati. Ci auguriamo che i progressi commerciali supplementari continueranno ad aumentare il throughput e l'efficienza di questi sistemi di trasfezione, pur mantenendo costi al minimo.

"> Generazione successiva elettroporazione di cellule T umane può efficacemente introdurre piccoli RNA compresi siRNAs contro geni bersaglio di interesse come esemplificato in questo protocollo, nonché imita miRNA o inibitori. L'alta efficienza rende superflua l'utilizzazione di marcatori di trasfezione poiché quasi ogni cellula è trasfettate con piccoli RNA. Questo è in contrasto con la trasfezione di cellule T primarie con plasmidi di DNA dove tipici trasfezioni plasmidi determinano solo il 20-30% espressione del gene marcatore con una tossicità superiore al 50% che aumenta con quantità crescenti di plasmide. Introdurre imita sintetiche che utilizzano questo metodo ha permesso di decine di geni di essere sottoposti a screening per la funzione in biologia delle cellule T in parallelo senza necessità di clonazione molecolare 12, 13. Esso ha inoltre consentito di test per la funzione di tutti miRNA espressi dalle cellule T in parallelo 11 , 13. Con questo protocollo, Questi tipi di schermi di throughput moderati sono applicabili a cellule T umane. In particolare, questa tecnica è stata recentemente utilizzata per introdurre piccoli RNA (gRNA) -Cas9 complessi ribonucleoproteici in cellule T umane primarie per la modifica del genoma 15. Queste diverse applicazioni evidenziano l'utilità, la flessibilità e la potenza del protocollo presentato qui come un importante strumento per immunologi che cercano di studiare la biologia delle cellule T.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

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References

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