Små RNA transfektion i primära humana Th17 celler genom Next Generation elektroporering

Published 4/13/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Montoya, M. M., Ansel, K. M. Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation. J. Vis. Exp. (122), e55546, doi:10.3791/55546 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

CD4 + T-celler är viktiga orchestra av det adaptiva immunsvaret. Naiva CD4 + T-celler är kapabla att utvecklas till flera olika effektor-T-celler (t.ex. Th1, Th2, Th17, etc.), var och en med sin egen uppsättning av karakteristiska cytokiner och transkriptionsfaktorer, beroende på den lokala mikromiljön 1. Besluten härstamning att T-celler gör är avgörande för både skyddande immunitet och tolerans mot själv. Th17 celler är en undergrupp av T-celler som är kända för att bekämpa extracellulära bakterier och svampar, men deras felaktiga responser är också inblandade i patogenesen av flera autoimmuna och inflammatoriska sjukdomar, såsom multipel skleros och psoriasis 2, 3. Humana Th17 celler kan genereras från naiva CD4 + T-celler in vitro genom att förse dem med en lämplig polariserande miljö 4. Vario Amerikanska kombinationer av cytokinerna IL-1β, IL-23, TGF-p och IL-6 har använts för utvecklingen av mänskliga Th17 celler. Humana Th17 celler uttrycker CCR6, en kemokinreceptor som ofta används för att identifiera denna cellpopulation och definieras genom uttrycket av deras huvudsakliga transkriptionsfaktor, RORγt (kodad av RORC) 5, 6. Th17 celler har förmågan att uttrycka multipla cytokiner, men IL-17A är härstamningen avgränsande effektor cytokin som produceras av dessa celler. Undersökte vi uttrycket av alla tre Th17-associerade markörer (CCR6, RORγt, IL-17A) för att bedöma robustheten i vår Th17 differentiering in vitro assay människa. Dessutom, odlade vi humana CD4 + -T-celler under icke-polariserande betingelser, där inga cytokiner eller blockerande antikroppar tillsattes till odlingsmediet för att använda som en negativ kontroll, eftersom uttrycket av dessa Th17 markörer bör vara mycket låg eller obefintlig.

ve_content "> Ett sätt att studera normal human cellutveckling och biologi T är att manipulera genuttrycket under deras utveckling. Short-interfererande RNA (siRNA) är syntetiska små RNA-molekyler som målsöker proteinkodande mRNA och kan utnyttjas för att minska den specifika genuttryck . MicroRNAs (miRNA) är endogena icke-kodande små RNA är kända för att modulera genexpression post-transkriptionellt. miRNA har visats spela en viktig roll i både murina och humana T-cell-biologi, inklusive i Th17 celler 7, 8, 9. Det är viktigt att ha tillförlitliga metoder för att manipulera små RNA-aktivitet i humana T-celler för att studera deras effekter på genuttryck och i slutändan på human T cellbiologi. Här beskriver vi ett lättanvänt, konsekvent och pålitlig protokoll som vi utvecklat för att införa små syntetiska RNA och låsta nukleinsyror (LNA: er, kemiskt modifierat nukleinsyror med ökad stabilitet)in immunceller, och specifikt till humana Th17 celler.

Det finns flera alternativa metoder för att införa små RNA in i däggdjursceller, som i allmänhet faller inom kemiska, biologiska eller fysiska kategorierna 10. Vanligen använda kemiska metoder, inklusive lipidbaserade transfektioner och kalcium-fosfat transfektioner, förlitar sig på att skapa kemisk-DNA-komplex som är mer effektivt tas upp av celler. I allmänhet, kemiska metoder är inte så effektiva för transfektion av primära T-celler. Den vanligaste biologiskt förfarande är att använda en viral vektor (t ex retrovirus eller lentivirus), som direkt sätter främmande RNA in i en värd som en del av sin naturliga replikationscykel. Viral transduktion tar normalt längre tid att slutföra, särskilt när man faktorer i tid för molekylär kloning av provirala plasmider. Dessutom kan viral transduktion vektorer vara potentiellt skadliga för mänskliga forskare. Elektroporering är en fysisk metod att inducera membran permeabilisering genom att utsätta cellerna för höga spänningspulser, så att nukleinsyror att övergående träda in i cellen där de kan agera på deras mål. Traditionella elektroporation instrument var inte effektiva för transfektion primära lymfocyter. Emellertid, har optimerat nästa generation elektroporering visat sig vara i stånd att transfektera T-celler vid mycket hög effektivitet, särskilt när det material som skall transfekteras är litet RNA. Termen nästa generation är löst används för att differentiera de två nyare plattformar (t.ex., neon, Amaxa) från traditionella elektroporer maskiner. Dessutom är detta förfarande lätt skalbara för måttliga genomströmning skärmar med upp till cirka 120 små RNA i ett enda experiment, ofta med hjälp av validerade syntetiska reagens. Viktigare, kan framgångsrika transfektioner uppnås i så lite som 16 h efter T-cellaktivering. Nackdelen med denna metod är emellertid att det inte resulterar i en stabil genomisk incorporatipå, och är därför övergående. Därför är det värt det extra besväret att skapa en stabil uttryckskonstruktion som kan förpackas i en virusvektor och framgångsrikt uttryckt i T-celler i de fall där det krävs långsiktiga uttryck för ett litet RNA.

Vi har använt en nästa generations transfektion (t.ex. neon) för att leverera olika syntetiska enkel- eller dubbelsträngade RNA- eller LNA oligonukleotid verktyg för olika ändamål 11, 12, 13. Effektiv RNA-interferens kan induceras i primär mus och humana T-celler med användning av dubbelsträngade korta interfererande RNA (siRNA). Detta protokoll beskriver optimerade betingelser för att använda denna teknik i humana Th17 celler. Förutom siRNA, kan kommersiellt tillgängliga syntetiska miRNA härmar och inhibitorer användas för att studera miRNA vinst och förlust av funktion. miRNA härmar är dubbelsträngade RNA-molekyler som är mycket lika siRNA, men designed med sekvensen av endogena mogna miRNA. miRNA hämmare kemiskt modifierade RNA- och / eller LNA-baserad enkelsträngade oligonukleotider som binder till nativa miRNA och antagoniserar deras funktion. Vi har funnit att alla dessa verktyg kan användas på ett effektivt sätt i odlade primära T-lymfocyter, inklusive men inte begränsat till humana Th17 celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer UCSF: s riktlinjer för mänskliga forskningsetik.

1. Framställning av T Cell Culture, Isolering av CD4 + T-celler, och Th17 Polarization

  1. På dag 0, coat 6-brunnars vävnadsodlingsplattor med 1,5 ml per brunn av anti-human-CD3 (2 | ig / ml) och anti-human CD28 (4 | ig / ml) i PBS med kalcium och magnesium under åtminstone 2 h vid 37 ° C.
    1. Alternativt belägga plattorna över natten vid 4 ° C. Wrap plattor parafilm.
  2. Framställa de navelsträngsblod mononukleära celler (CBMCs) genom densitetsgradientcentrifugering enligt tillverkarens instruktioner.
    VARNING: Arbeta noggrant och säkerställa korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) bärs vid hantering av blod för att undvika risken att utsättas för blodburna patogener.
  3. När de mononukleära cellerna har isolerats och tvättats, utföra humana CD4 + T-cellisolering genom negativ seleInsatser användning av en kommersiell Human CD4 + T-cellsats.
    OBS: Om det finns röda blodkontamination cellen efter mononukleär cellisolering, kan en valfri röda blod cellys utföras före cellisoleringsstegen CD4 + T. Resuspendera de mononukleära cellerna i 1 ml isoleringsbuffert (2% FBS i PBS). Tillsätt 5 ml 1x lyseringslösning. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur. Lägg sedan till 5 ml av isoleringsbuffert och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C för att pellettera cellerna.
    1. Resuspendera de mononukleära cellerna vid en densitet av 50 x 10 6 per 500 mikroliter i isoleringsbuffert i ett nytt 5 ml rör.
    2. Lägga 100 mikroliter av FBS och 100 mikroliter av antikropps Mix per rör sedan inkubera varje rör vid 4 ° C under 20 minuter på en orbital skakanordning för att blanda väl.
    3. Efter inkubationen, till 3-4 ml isoleringsbuffert för att tvätta cellerna. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 8 minuter vid 4 ° C för att pellettera cellerna. Försiktigt aspirera Supernatant.
    4. Under denna spinn, för-tvätta de magnetiska pärlorna. Överföra den önskade mängden av magnetiska pärlor i ett nytt rör (används vid en: en med cellerna) och tillsätt en lika stor volym av isoleringsbuffert för att tvätta pärlorna. Blanda väl med användning av en 1 ml mikropipett och därefter placera röret i magnet under minst 1 min. Försiktigt aspirera supernatanten. Resuspendera de magnetiska pärlorna i samma volym som ursprungligen överförs före tvätten.
    5. Resuspendera cellerna i varje rör med 500 mikroliter av isoleringsbuffert och tillsätt 500 pl av förtvättade magnetiska pärlor.
    6. Inkubera cellerna med de magnetiska pärlorna för 15 min på en orbital skakanordning vid rumstemperatur (18 ° C till 25 ° C) för att blanda väl.
    7. Efter inkubationen, grundligt Pipettera cellerna med användning av en 1 ml mikropipett minst 10 gånger. Tillsätt sedan 3-4 ml isoleringsbuffert och placera varje rör i magnet för 2 min.
    8. Överföra noggrant de negativt utvalda CD4 + -T-celler som är isupernatanten till ett nytt rör.
  4. Gång CD4 + T-cellisolering är klar, räkna cellerna med en hemocytometer och hålla cellerna på is.
  5. Tvätta de antikroppsbelagda plattorna två gånger med PBS. Tillsätt sedan 1,5 ml 2x blandning av Th17-polariserande media till varje brunn: anti-human IFNy (20 | ig / ml), anti-human IL-4 (20 | ig / ml), human TGFp (10 ng / ml), humant IL-1β (40 ng / ml), humant IL-23 (40 ng / ml), humant IL-6 (50 ng / ml) alla utspädda i ett serumfritt bas medium (kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat och 100 | iM 2-merkaptoetanol).
    OBS: Transfektion och RNA-interferens fungerar i serum innehållande media. Syftet med att använda serumfritt medium med detta protokoll är att uppnå bättre IL-17A produktion.
  6. Centrifug de humana CD4 + T-celler vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C för att pelletera cellerna. Försiktigt aspirera supernatmyra. Resuspendera sedan cellerna i serumfria basmedium och utstrykning av celler vid en densitet av 3 x 10 6 i 1,5 ml per brunn, så att den slutliga volymen är 3 ml per brunn och polariserande cytokiner är nu på en 1x slutlig koncentration.
    1. Placera plattorna i 5% CO 2, 37 ° C inkubator under två dagar.

2. Elektroporation av In Vitro Polarized Human Th17 Celler

  1. På dag 2, belägga 48-brunnars vävnadsodlingsplattor med 250 mikroliter per brunn av anti-human-CD3 (2 | ig / ml) och anti-human CD28 (4 | ig / ml) i PBS med kalcium och magnesium under åtminstone 2 h vid 37 ° C.
    1. Alternativt belägga plattorna över natten vid 4 ° C. Wrap plattor parafilm.
  2. Förbered små RNA för transfektion. För varje transfektion, alikvot 1 mikroliter av en 5 uM stamlösning av siRNA in i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkludera lämplig kemi matchade små RNA control. Håll alla rör på is.
  3. Tvätta de antikroppsbelagda plattorna två gånger med PBS. Lägg sedan till 500 mikroliter av 1X Th17-polariserande media till varje brunn: anti-human IFNy (10 | ig / ml), anti-human IL-4 (10 | ig / ml), human TGFp (5 ng / ml), humant IL- 1β (20 ng / ml), humant IL-23 (20 ng / ml), humant IL-6 (25 ng / ml) alla utspädda i ett serumfritt bas medium (kompletterat med 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat och 100 | iM 2-merkaptoetanol).
  4. Efter det att odlingsplattor och transfektionsreagens är beredda, återsuspendera cellerna med en 1 ml mikropipett, pipettering försiktigt men säkerställer att alla cellerna lossas från botten av brunnarna. Pool cellerna in i ett koniskt rör och centrifugera vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C.
    OBS: För kultur perioder längre än fyra dagar Protokollet presenteras här cellerna bör transfekteras ungefär var 3 dagar med hjälp av samma protokoll. Steg 20,4 bör modifieras emellertid eftersom cellerna behandlade med olika små RNA inte bör slås samman. Alla de villkor som testas måste samlas, räknades och transfekteras separat.
  5. Försiktigt aspirera supernatanten och sedan återsuspendera cellerna i åtminstone 1 ml av PBS för att tvätta. Räkna de levande Th17-celler (t ex med en hemocytometer med användning av trypanblått-uteslutning för att bedöma livsduglighet) och sedan överföra cellerna till ett mikrocentrifugrör.
  6. Centrifugera vid 500 xg under 5 min vid rumstemperatur för att pelletera cellerna.
  7. Försiktigt aspirera supernatanten och sedan återsuspendera cellerna med den medföljande resuspensionsbuffert från transfektionssystem 10 pl-kit vid en densitet av 2,5-4 x 10 7 celler per ml. Hålla cellerna vid rumstemperatur.
    OBS: Som en riktlinje, försöker att förbereda sig endast så många celler som kan transfekteras inom 30 minuter. Flera partier kan jämföras.
  8. Lägga 9 mikroliter av celler till en mikroliter av små RNA i varje MicroCentrifuge rör. Pipett en gång för att blanda celler och små RNA för transfektion sedan ladda in den medföljande pipetten elektrodspetsen.
    OBS: Typiskt till 9,5 mikroliter av cellsuspension för att se till att det finns tillräckligt av blandningen för att förhindra att skapa bubblor i pipett elektrodspetsen före transfektion.
  9. Fylla tillgänglig kuvett med 3 ml av rumstemperatur Elektrolytisk Buffert E. Placera kyvett inuti pipetten stationen och sedan placera pipetten i läge inne i kuvetten.
  10. Omedelbart electroporate varje 10 mikroliter blandning av celler och små RNA med användning av följande parametrar: pulsspänning 1,500-1,550 V, bredd puls 10 ms, och 3 pulser totalt på transfektion anordningen.
  11. Efter elektroporation är fullständig, direkt lägga cellblandningen till 500 mikroliter av 1X Th17-polariserande media i preparerade brunnar i en odlingsplatta. Place plattor i en 5% CO 2, 37 ° C inkubator under ytterligare två dagar.
    OBS: Tvätta pipetten elektrodspetsen genom att pipetteraupp och ner i PBS mellan varje transfektion.

3. Skörd Human Th17 celler

  1. Resuspendera cellerna i odlingsmedier med en mikropipett, pipettering försiktigt men se till att alla cellerna lossas från botten av brunnarna. Förbereda cellerna för funktionella och / eller genuttryck analyser.
    OBS: Rutinmässigt är tillräckligt med celler gav från en enda brunn av transfekterade Th17 celler som skall användas för flödescytometrisk analys av ytmarkör och intracellulär cytokin och transkriptionsfaktor-färgning eller för beredning av RNA för genuttrycksanalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det första steget att utveckla ett pålitligt system för framgångsrikt electroporating humana Th17-celler var att generera robust in vitro differentierade humana Th17 cellkulturer. T-celler som odlats under Th17-polariserande betingelser uttryckte kemokinreceptorn CCR6 och transkriptionsfaktom RORγt (figur 1 A, vänster). Dessa markörer uttrycktes inte när T-celler odlades under icke-polariserande (THN) förhållanden (figur 1 A, höger). T-celler som odlats under Th17-polariserande betingelser producerade också IL-17A vid återstimulering (Figur 1B, vänster) men inte under THN betingelser (Figur 1B, höger). Th17 differentiering inträffar fortfarande efter transfektion med små RNA men i vissa experiment, det finns en observerad reduktion i frekvensen av IL-17A-produktion (Figur 1C). Effekten av små RNA-transfektion på cytokinproduktionen visar imptance av att ha en kemi-matchad lilla RNA kontroll för jämförelse inom varje experiment. Viktigare, är viabiliteten bibehålls efter transfektion med små RNA och är typiskt större än 70% (figur 1D).

För att bestämma effektiviteten av detta protokoll använde vi RNA-interferens. CD45-antigenet kodas av PTPRC (proteintyrosinfosfatas, receptortyp C) genen. CD45 uttrycks på alla hematopoetiska celler och därför humana Th17 celler bör kraftfullt uttrycka denna yta markör. Transfektion av humana Th17 celler på dag 2 med en siRNA pool targeting PTPRC reduceras starkt uttryck av CD45 jämfört med en kemi matchad kontrollgrupp siRNA (Figur 2A). Denna unimodal population förskjutning i CD45 uttryck indikerar nära 100% transfektionseffektivitet, typisk för detta protokoll för små RNA-molekyler. Således är detta ett viktigt verktyg som kan användas för att bedöma transfektion efficiency under protokoll optimeringar. RORC kodar RORγt, det dominerande transkriptionsfaktorn av humana Th17 celler, som direkt reglerar IL-17A produktion. Transfektera utvecklings humana Th17-celler med en siRNA pool mot RORC reduceras starkt RORγt uttryck som förväntat (figur 2B). Reducerande RORγt expression genom RNAi hade en funktionell effekt, eftersom dessa celler uppvisade reducerade IL-17A-produktion (figur 2C) jämfört med celler transfekterade med en kontroll siRNA. Icke-polariserade CD4 + T-celler bör inte uttrycka någon RORγt eller IL-17A och visas som en negativ kontroll i denna figur.

Figur 1
Figur 1: In vitro Differentierade Human Th17 celler uttrycker CCR6, RORγt, och IL-17A. Humana CD4 + T-celler isolerade från navelsträngsblod odlades under Th17 betingelser (IL-1β, IL-23, IL-6, och TGFp) eller i icke-polariserande (THN) förhållanden (endast media, inga polariserande cytokiner eller blockerande antikroppar tillsatta) in vitro och analyserades på dag 4 för Th17 markör expression med flödescytometri: (A) Representativa konturdiagram bildskärmsytan CCR6 och intracellulär RORγt co-färgning av CD4 + T-celler. Siffror i kvadranter indikerar procent CCR6 och / eller RORγt-positiva levande sing CD4 + celler. (B) IL-17A och IFNy-produktion efter re-stimulering med PMA / jonomycin. Siffror i kvadranter indikerar procent IL-17A och / eller IFNy-positiva levande sing CD4 + celler. (C) Representativa kontur plot displayer surface CCR6 och intracellulär RORγt co-färgning av CD4 + T-celler efter transfektion med små RNA-kontroll. Siffror i kvadranter indikerar procent CCR6 och / eller RORγt-positiva levande sing CD4 + celler (vänster). Representative konturkurva visar IL-17A och IFNy-produktion efter re-stimulering med PMA / jonomycin efter transfektion med små RNA-kontroll. Siffror i kvadranter indikerar procent IL-17A och / eller IFNy-positiva levande sing CD4 + celler (höger). (D) Representativa konturkurva visar viabiliteten hos CD4 + celler efter transfektion med små RNA-kontroll. Siffran anger procent CD4 + levande singlet celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: RNA-interferens i primära humana Th17 Cells. Humana CD4 + T-celler från navelsträngsblod odlade under Th17 betingelser transfekterades på dag 2 med en siRNA nontargeting kontroll (siNeg Ctl) eller inriktnings poolen mot PTPRC (si PTPRC) eller RORC (si RORC) innefattande 4 individuella siRNA. Celler analyserades sedan genom flödescytometri på dag 4: (A) Yta CD45 uttryck visas i en representativ histogram efter transfektion med si PTPRC (grå nyans) eller siNeg Ctl (svart linje). (B) Intracellulär RORγt expression visas i ett representativt histogram efter transfektion med si RORC (grå nyans) eller siNeg Ctl (svart linje). (C) Representativa konturdiagram visar yt-CD4 och intracellulär RORγt co-färgning av CD4 + T-celler (övre panelen) eller IL-17A och IFNy-produktion efter re-stimulering med PMA / jonomycin (nedre panelen). Siffror i kvadranter indikerar procent av CD4 + RORγt + eller IL-17A och / eller IFNy-positiva levande singlet celler under THN eller Th17 betingelser transfekterade med siNeg Ctl eller si RORC.fig2large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll tillhandahåller en förbättrad metod för leverans av små RNA-molekyler i humana Th17 celler. Även om humana Th17 celler användes här, kan denna metod för elektroporation med små RNA användas med andra primära humana T-hjälparceundergrupper, såsom Th1, Th2, och tregs. Det har inte fungerat bra för naiva CD4 + T-celler så att cellerna måste aktiveras i kultur före transfektion. För detta protokoll först optimerat vi in vitro-kultur system för bättre IL-17A produktion. Den största faktorn var bas media. Vi fann att serumfritt medium var överlägsen traditionella seruminnehållande media för bättre induktion av IL-17A producera humana Th17 celler. Eftersom Th17 celler kan genereras med underuppsättningar av cytokinerna TGFp, IL-1, IL-23, och IL-6, testade vi olika cytokin-mixar. I denna studie har vi uppnått mer robust IL-17A produktion när alla fyra polariserande cytokiner ingick. Dessutom, optimerad vi förkortakulturen att säkerställa att endast en transfektion var nödvändigt under odlingsperioden. Även om detta fyradagars-protokollet gör det möjligt resultat genereras snabbare och kräver endast en transfektion, kunde kultur längd förlängas för att ytterligare öka IL-17A produktion. En längre odlingsperiod kan även vara nödvändigt för att uppnå optimal differentiering av andra primära T-cell-underuppsättningar. Eftersom dessa transfektioner är övergående, kan flera transfektioner krävas över tiden för långa kultur perioder. Vi föreslår att fylla små RNA reagens efter ungefär tre dagar genom att åter electroporating cellerna med reagenset för att förhindra utspädning över flera celldelningar. Vi har rutinmässigt gjort detta för mus CD4 + T-celler. Även om det är mer tekniskt utmanande eftersom cellerna i varje tillstånd måste samlas in och räknas separat, är transfektion framgångsrika och det finns minimala effekter på cellernas livskraft.

I dessa experiment humana Th17 celler vire genereras genom in vitro-odling av humant navelsträngsblod. Viktigare, skulle en alternativ möjlighet för denna differentiering analys vara att använda humana perifera mononukleära blodceller (PBMC). För både CBMCs och PBMC, är det nödvändigt att isolera CD4 + T-celler före starten av kulturen. Vi presenterar här vår metod för att rena CD4 + T-celler genom negativ selektion, vilket gav robust transfektion effektivitet, men vi förväntar oss att andra metoder för att framställa primära humana CD4 + T-celler skulle fungera lika bra. Vi har försökt flera kit som använder antingen positiv eller negativ selektion för isolering av mus-CD4 + T-celler och båda metoderna har resulterat i liknande transfektionseffektivitet. En ytterligare faktor är vikten av att använda naiva T-celler för att optimalt differentiera till Th17 celler. Med användning av humant navelsträngsblod är fördelaktig av den anledningen, eftersom den redan har en högre andel av naiva T-celler pogillar och därför är det inte nödvändigt att sortera eller pre-anrika för naiva T-celler före starten av odlingen. Men det är en klar nackdel med detta tillvägagångssätt den begränsade tillgången på navelsträngsblod. Alternativt sortering av naiva T-celler från PBMCs 14 kan utföras före odling eftersom denna resurs är mer lättillgängligt, även om större mängder skulle behöva erhållas.

Medan det finns flera metoder för att transfektera däggdjursceller, primära T-celler tenderar att vara en svårare celltyp att transfektera. Nästa generation elektroporering är en framgångsrik fysisk metod för transient transfektering T-celler som är tekniskt enkelt att utföra och är reproducerbar. Gång optimerad, den har en mycket hög effektivitet för transfektion för små RNA-molekyler som närmar 100%. Detta kan ses i figur 2, där hela unimodal population av CD45 + -celler (Figur 2A) och population av alla cellerna som uttrycker RORγt (Figur 2B) övergång till en lägre uttrycksnivå. Viktigt är optimerad transfektion med små RNA inte äventyra cellviabilitet. Observerar vi rutinmässigt större än 70% livsduglighet efter transfektion med små RNA (figur 1D). Även om livsduglighet är inte ett problem med detta protokoll, biologin hos andra cellegenskaper T, såsom cytokinproduktion, kan påverkas efter transfektion med små RNA. Av denna anledning är det mycket viktigt att använda en kemi matchad små RNA kontroll i varje experiment.

Vi optimerat två elektroporerparametrar, puls och spänning, för att minimera celldöd och maximera transfektionseffektivitet. Högre spänningar ökar celldöd under transfektion. Några andra tekniska överväganden för att förhindra celldöd och säkerställa framgångsrik transfektion inkluderar minimering av mängden av syntetiska reagens som används och begränsning av tiden betwee n cellberedningen och elektroporering. Minimala koncentrationer nödvändiga för syntetiska transfektionsreagens bör alltid användas för att förhindra potentiell toxicitet T-cell och ej åsyftade effekter. Reducera cell förberedelsetid före transfektion för att minimera tiden för celler i transfektionsbuffert vid rumstemperatur är av avgörande betydelse och kan uppnås genom framställning av celler i partier, om så är nödvändigt.

För närvarande finns det två kommersiellt tillgängliga nästa generations elektroporation instrument. Båda dessa system kan effektivt transfektera primära T-celler. Detta protokoll har optimerats med användning av Neon transfektionssystem. Även om detta transfektion systemet är mer kostnadseffektivt, erbjuder Amaxa systemet unikt en 96-håls adapter för elektroporering för högre genomströmning applikationer. Vi hoppas att ytterligare kommersiella framsteg kommer att fortsätta att öka genomströmningen och effektiviteten i dessa transfektion system, samtidigt som kostnaderna till ett minimum.

"> Nästa generations elektroporation av humana T-celler kan effektivt införa små RNA inklusive siRNA mot målgener av intresse såsom exemplifieras i detta protokoll samt miRNA härmar eller inhibitorer. Den höga verkningsgraden gör det onödigt att använda markörer för transfektion eftersom nästan varje cell är transfekterades med små RNA. Detta är i motsats till transfektion av primära T-celler med DNA-plasmider där typiska plasmid transfektioner resulterar i endast 20-30% expression av markörgenen med större än 50% toxicitet som ökar med ökande mängder av plasmid. Presentation syntetiska härmar användning av denna metod har gjort det möjligt för dussintals gener som skall screenas för funktion i T-cellbiologin parallellt utan något behov av molekylär kloning 12, 13. det har också gjort det möjligt att testa för funktionen av alla miRNA uttrycks av T-celler parallellt 11 , 13. Med detta protokollDessa typer av måttliga genomströmning skärmar är tillämpliga på humana T-celler. Noterbart var denna teknik nyligen användes för att införa små RNA (gRNA) -Cas9 ribonukleoproteinpartiklar komplex i primära humana T-celler för genomet redigering 15. Dessa olika tillämpningar markera verktyget, flexibilitet och kraft av protokollet presenteras här som ett viktigt verktyg för immunologer som vill studera T cellbiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human IL-17A PE ebioscience 12-7179-42  Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC ebioscience 11-7319-82 Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605 ebioscience 83-0047-42 Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421 BD biosciences 562515 Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647 BD biosciences 563620 Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450 ebioscience 48-9459-42 Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set ebioscience 00-5523-00 For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified ebioscience 14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium Stemcell Technologies 10981 "Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human Miltenyi Biotec 130-093-375 Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified UCSF monoclonal antibody core N/A Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4 Biolegend 500815 Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified ebioscience 16-7318-85 Clone: NIB42
Recombinant human IL-23 Peprotech  200-23
Recombinant human IL-1β Peprotech  200-01B
Recombinant human TGF-β1 Peprotech  100-21C
Recombinant human IL-6 Peprotech  200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2 Dharmacon D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC Dharmacon M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC Dharmacon M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit ThermoFisher Scientific 11346D Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System ThermoFisher Scientific MPK5000 Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Resuspension Buffer T ThermoFisher Scientific Provided in kit (MPK1096) "Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep Stemcell Technologies #07801 Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates Corning 3516 flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates Corning 3548 flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x BD biosciences 555899 Must make 1x solution with distilled water prior to use

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28, (1), 445-489 (2010).
  2. Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27, (1), 485-517 (2009).
  3. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14, (9), 585-600 (2014).
  4. Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47, (1), 3-7 (2009).
  5. Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8, (6), 639-646 (2007).
  6. Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204, (8), 1849-1861 (2007).
  7. Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10, (12), 1252-1259 (2009).
  8. Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40, (6), 865-879 (2014).
  9. Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15, (4), 393-401 (2014).
  10. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397, (8), 3173-3178 (2010).
  11. Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35, (2), 169-181 (2011).
  12. Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15, (12), 1162-1170 (2014).
  13. Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44, (4), 821-832 (2016).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
  15. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112, (33), 10437-10442 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats