मछली के तेल की आपूर्ति करता है के लिपिड प्रोफाइल का तेजी से मूल्यांकन के लिए एक मज़बूत उपकरण के रूप में एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी

Chemistry

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Summary

इधर, उच्च संकल्प 1 एच और 13 सी परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी समझाया मछली के तेल की खुराक की मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

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Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

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Abstract

पश्चिमी आहार एन -3 फैटी एसिड में खराब होने पर मछली के तेल की खुराक की खपत इन आवश्यक पोषक तत्वों की सेवन बढ़ाने के लिए सिफारिश की है। इस काम का उद्देश्य उच्च संकल्प 1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी दो अलग एनएमआर उपकरणों के उपयोग का उपयोग कर समझाया मछली के तेल की खुराक के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए है, एक 500 मेगाहर्ट्ज और 850 मेगाहर्ट्ज साधन। दोनों प्रोटॉन (1 एच) और कार्बन (13 सी) एनएमआर स्पेक्ट्रा मछली के तेल की खुराक के प्रमुख घटक के मात्रात्मक निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। मछली के तेल की खुराक में लिपिड के मात्रा प्रासंगिक -1 डी स्पेक्ट्रा में उचित एनएमआर संकेतों के एकीकरण के माध्यम से हासिल की है। 1 एच और 13 सी एनएमआर द्वारा प्राप्त परिणाम संकल्प और दो नाभिक और दो उपकरणों के बीच संवेदनशीलता में अंतर के बावजूद, एक दूसरे के साथ अच्छा समझौता कर रहे हैं। 1 एच एनएमआर प्रस्तावसा और अधिक तेजी से विश्लेषण, 13 सी एनएमआर की तुलना में स्पेक्ट्रम कम से कम 1 मिनट में दर्ज किया जा सकता 13 सी एनएमआर विश्लेषण, जो एक घंटे के लिए 10 मिनट से रहता है के विपरीत,। 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम, तथापि, और अधिक जानकारीपूर्ण है। यह व्यक्तिगत फैटी एसिड की एक बड़ी संख्या के लिए मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं और ग्लिसरॉल रीढ़ की हड्डी पर फैटी एसिड की स्थितीय वितरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। दोनों नाभिक शुद्धि या जुदाई कदम की आवश्यकता के बिना सिर्फ एक प्रयोग में मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैं। चुंबकीय क्षेत्र की ताकत ज्यादातर 13 सी एनएमआर के संबंध में इसकी कम संकल्प की वजह से 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा को प्रभावित करता है, फिर भी, यहां तक कि कम लागत एनएमआर उपकरणों कुशलतापूर्वक खाद्य उद्योग और गुणवत्ता नियंत्रण प्रयोगशालाओं द्वारा एक मानक पद्धति के रूप में लागू किया जा सकता।

Introduction

आहार में एन -3 फैटी एसिड की खपत जैसे हृदय विकारों 1, 2, 3, 4 भड़काऊ रोगों और मधुमेह 5 के रूप में कई स्थितियों के खिलाफ फायदेमंद साबित हो गया है। पश्चिमी आहार एन -3 फैटी एसिड में गरीब माना जाता है और इस तरह मछली के तेल की खुराक की खपत n सुधार करने के लिए सिफारिश की है -6 / एन -3 उपभोक्ता के पोषण 1 में संतुलन। मछली के तेल के पूरक की खपत में हाल ही में वृद्धि के बावजूद, सवाल सुरक्षा, प्रामाणिकता, और इनमें से कुछ उत्पादों की गुणवत्ता के बारे में रहते हैं। मछली के तेल की खुराक का तेजी से और सही compositional विश्लेषण ठीक से इन वाणिज्यिक उत्पादों की गुणवत्ता का मूल्यांकन और उपभोक्ता सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।

मछली के तेल के पूरक के आकलन के लिए सबसे आम तरीकेरों गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) और अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईआर) कर रहे हैं। इन बेहद संवेदनशील तरीके हैं, वहीं वे कई कमियां 6 से ग्रस्त हैं। जीसी विश्लेषण समय लगता है (4-8 ज) क्योंकि जुदाई और अलग-अलग यौगिकों के derivatization आवश्यक है 7 और लिपिड ऑक्सीकरण विश्लेषण 8, 9 के दौरान हो सकता है। आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी मात्रात्मक हो सकता है, एक भविष्यवाणी मॉडल आंशिक कम से कम वर्गों प्रतिगमन (Plsr) का प्रयोग कर बनाया जाना आवश्यक है, हालांकि वहाँ अपवाद है, जिसमें आईआर बैंड एक भी यौगिक 10 के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। Plsr नमूने की एक बड़ी संख्या है, जो विश्लेषण 11 के समय बढ़ जाती है के विश्लेषण की आवश्यकता है। इस कारण से, वहाँ नई विश्लेषणात्मक तरीकों कि मछली के तेल के नमूने की एक बड़ी संख्या का सही और तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देने के विकास में एक बढ़ती हुई ब्याज है। इस तरह के अधिकारी के रूप में संगठनपूरक आहार (ODS) स्वास्थ्य (एनआईएच) और खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) के राष्ट्रीय संस्थानों पर की ce सरकारी विश्लेषणात्मक दवा की दुकानों की एसोसिएशन (AOAC) के साथ सहयोग किया है इन नए तरीकों 12, 13 विकसित करना।

स्क्रीनिंग और इस तरह के पूरक आहार के रूप बहु घटक मेट्रिसेस, के मूल्यांकन के लिए सबसे होनहार विश्लेषणात्मक तरीकों में से एक, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी 14, 15 है। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के कई फायदे हैं: यह एक गैर विनाशकारी और मात्रात्मक तकनीक, यह कोई नमूना तैयार करने के लिए कम से कम की आवश्यकता है, और यह उत्कृष्ट सटीकता और reproducibility की विशेषता है। क्योंकि यह सॉल्वैंट्स के केवल थोड़ी मात्रा का इस्तेमाल करता है इसके अलावा, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक पर्यावरण अनुकूल पद्धति है। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का मुख्य दोष यह अन्य analyti की तुलना में इसकी अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता हैकैलोरी तरीकों, हालांकि, इस तरह के मजबूत चुंबकीय क्षेत्र, विभिन्न व्यास के क्रायोजेनिक जांच, उन्नत डाटा प्रोसेसिंग, और बहुमुखी पल्स दृश्यों और तकनीक के रूप में उपकरण में हाल ही में तकनीकी विकास संवेदनशीलता एनएम रेंज अप करने के लिए बढ़ा दी है। जबकि एनएमआर उपकरण उच्च लागत है, और एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के लंबे जीवन एनएमआर के कई अनुप्रयोगों लंबे समय में विश्लेषण की लागत को कम। यह विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल में मदद करने के क्षेत्र में नई चिकित्सकों 1 एच और 13 मछली के तेल की खुराक की सी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के साथ जुड़े नुकसान से बचने के लिए है।

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Protocol

1. एनएमआर नमूना तैयार करना

नोट: सावधान, उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (MSDS) से परामर्श लें। Deuterated क्लोरोफॉर्म (CDCl 3) नमूना तैयार करने में इस्तेमाल विषैला होता है। जब नमूना तैयारी प्रदर्शन कर एक धूआं डाकू और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के उपयोग सहित सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग करें (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूरी लंबाई पैंट, बंद पैर की अंगुली जूते)।

  1. 1 एच और 13 सी के नमूने की तैयारी
    1. एक आहार कैप्सूल एक सिरिंज का उपयोग करने से मछली के तेल के 120 μL (~ 110 मिलीग्राम) निकालें और एक 4 मल ग्‍लास की शीशी में रखें। मछली के तेल के वजन रिकॉर्ड।
    2. नमूना विघटन
      1. CDCl 3 tetramethylsilane (टीएमएस) जो 1 एच और 13 सी रासायनिक बदलाव के लिए एक संदर्भ के रूप में प्रयोग किया जाता का 0.01% युक्त के 500 μL में मछली के तेल के लगभग 120 μL भंग।
        ध्यान दें: टीएमएस इस्तेमाल होता हैकेवल रासायनिक पारी अंशांकन के लिए (देखें कदम संख्या 2.2.1.2.7 और 2.2.2.2.7) डी, नहीं मात्रा के लिए प्रयोजनों (कदम संख्या 2.2.1.3 और 2.2.2.3 देखें)।
      2. एक 2,6-di- tert -butyl-4-methylphenol तैयार (BHT) स्टॉक समाधान, अगर मात्रा मिलीग्राम में व्यक्त / जी वांछित है ((BHT की लगभग 220 मिलीग्राम और क्रोमियम (iii) acetylacetonate 15 मिलीग्राम भंग सीआर द्वारा, acac) 3) CDCl 3 की 20 एमएल टीएमएस का 0.01% युक्त। मछली के तेल के 100 मिलीग्राम (± 10 मिलीग्राम) भंग करने के लिए स्टॉक समाधान के 500 μL का प्रयोग करें।
    3. तेल (इसमें कुछ सेकंड लेता है) को भंग करने के बाद, सीधे एक उच्च गुणवत्ता 5 मिमी एनएमआर ट्यूब में समाधान के सभी हस्तांतरण और एक टोपी देते हैं। नमूनों की तैयारी के बाद 24 घंटे के भीतर नमूने का विश्लेषण करें।

2. एनएमआर साधन तैयारी

नोट: सावधान, सावधान रहना है कि एनएमआर उपकरणों द्वारा उत्पादित शक्तिशाली चुंबकीय क्षेत्र की उपस्थिति चिकित्सा उपकरणों और impl प्रभावित कर सकते हैंपेसमेकर और शल्य चिकित्सा कृत्रिम अंग है, साथ ही इस तरह के क्रेडिट कार्ड, घड़ियां, आदि जब विश्लेषण गैर परिरक्षण चुंबक का उपयोग किया जाता है अतिरिक्त सावधानी की आवश्यकता है के रूप में इलेक्ट्रॉनिक आइटम के रूप में चींटियों। दो एनएमआर उपकरणों 1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण के लिए किया जाता था; एक स्पेक्ट्रोमीटर 850.23 मेगाहर्ट्ज और 1 एच और 13 सी नाभिक, क्रमशः के लिए 213.81 मेगाहर्ट्ज पर काम कर, एक ट्रिपल गूंज हीलियम कूल्ड उलटा (TCI) 5 मिमी जांच और एक स्पेक्ट्रोमीटर 500.20 मेगाहर्ट्ज और 1 एच और 13 सी के लिए 125.77 मेगाहर्ट्ज पर काम कर के साथ सुसज्जित नाभिक में क्रमश: (BBO) नाइट्रोजन ठंडा 5 मिमी जांच एक ब्रॉड बैंड मनाया के साथ सुसज्जित। सभी प्रयोगों 25 ± 0.1 º सेल्सियस पर प्रदर्शन किया गया और स्पेक्ट्रा एक मानक एनएमआर डेटा विश्लेषण अधिग्रहण और प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पैकेज से प्रोसेस किया गया है (देखें सामग्री सूची)।

  1. एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए तैयारी
    ध्यान दें: 1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रासाधन से नमूना निकाले बिना फलस्वरूप प्राप्त किया जा सकता।
    1. एक स्पिनर टरबाइन में एनएमआर ट्यूब डालें (देखें सामग्री सूची)।
    2. स्पिनर और एक वर्गीकृत गहराई नापने का यंत्र के शीर्ष पर ट्यूब रखें और धीरे ट्यूब के शीर्ष धक्का जब तक अपनी निचले हिस्से गेज के नीचे छू लेती है।
    3. SampleCase का एक खुला स्थान में एनएमआर नमूना रखें। स्लॉट संख्या नमूना में रखा गया है ध्यान दें।
    4. एनएमआर में नमूना लोड करने के लिए नियंत्रण कंप्यूटर और प्रकार 'sx #', जहां # SampleCase में स्लॉट अपने नमूना पकड़े पर वापस जाएँ।
    5. CDCl 3 की ड्यूटेरियम संकेत के लिए प्रतीक्षा करें ताला विंडो स्क्रीन पर प्रकट करने के लिए। यह स्वचालित रूप से दिखाई नहीं देता है, प्रकार "lockdisp"। जैसे ही ड्यूटेरियम संकेत दिख रहा है के रूप में, प्रकार कमांड लाइन पर "ताला" और व्यवस्था CDCl 3 ड्यूटेरियम प्रतिध्वनि का उपयोग कर नमूना लॉक करने के लिए विलायक की सूची से "CDCl 3" का चयन करें।
      नोट: Deuterium रोंignal पिछले उपयोगकर्ता एक अलग विलायक इस्तेमाल किया है, तो दिखाई न दें। उपयोगकर्ता सूचक नमूना नीचे है कि के लिए इंतजार करना चाहिए, तो लॉक कर दें।
    6. प्रकार "bsmsdisp" कमांड लाइन कताई सुनिश्चित करने के लिए सक्रिय नहीं है। "स्पिन" बटन हरी है, कताई निष्क्रिय करने के लिए इसे क्लिक करें।
    7. एक नया डेटा सेट बनाने के लिए 'नई' कमांड टाइप करें। डेटा "नाम" टैब और "EXPNO" टैब में प्रयोग संख्या में सेट के लिए एक नाम दर्ज करें। "PROCNO" टैब में संख्या "1" का प्रयोग करें। "प्रयोग" टैब में, हिट "का चयन करें" और "प्रोटॉन" पैरामीटर फाइल चुनें। "शीर्षक" टैब में प्रयोग के शीर्षक लिखें। ओके पर क्लिक करें।"
    8. आदेश पंक्ति में "getprosol" टाइप करें वर्तमान एनएमआर जांच और विलायक के लिए मानक मापदंडों प्राप्त करने के लिए।
    9. 13 सी के लिए दोहराएँ कदम 2.1.7, 1 डी 13 सी उलटा जी "प्रयोग" टैब में "C13IG" पल्स अनुक्रम का चयनपैदा प्रयोग decoupled।
    10. आदेश पंक्ति में "getprosol" टाइप करें वर्तमान एनएमआर जांच और विलायक के लिए मानक मापदंडों प्राप्त करने के लिए।
    11. आदेश "आत्मा" टाइप दोनों कार्बन और प्रोटॉन नाभिक के लिए स्वत: ट्यूनिंग और जांच का मिलान करने के लिए।
    12. एनएमआर संकेतों के लिए एक आयामी ढाल एक उच्च समरूपी चुंबकीय क्षेत्र को प्राप्त करने के shimming, और इस प्रकार इष्टतम लाइन आकार निष्पादित करें।
      1. , 1 डी shimming के लिए मानक स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग केवल क्रमिक रूप से क्रियान्वित करते हुए कमांड "qu topshim 1dfast एस एस", "qu topshim tuneb एस एस," और कमांड लाइन पर "qu topshim रिपोर्ट"।
  2. पैरामीटर अनुकूलन
    1. 90 ° नाड़ी अंशांकन
      1. 1 एच (चरणों 2.1.7 और 2.1.8 देखें) के लिए एक नया डेटा समूह बनाएं।
      2. कमांड लाइन पर आदेश "paropt" टाइप करें 90 ° पुल कैलिब्रेट के लिए स्वचालन कार्यक्रम शुरू करने के लिएसे। पल्स अवधि का चयन करें, p1, पैरामीटर के रूप में संशोधित किया जा करने के लिए।
      3. p1 का प्रारंभिक मूल्य के रूप में "2" μs के साथ शुरू करो, दर्ज "2" वेतन वृद्धि μs और "16" प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं।
      4. एक नया डेटा 13 सी के लिए निर्धारित बनाएं (कदम 2.1.9 देखें) और 13 सी नाभिक (चरणों 2.2.1.2 और 2.2.1.3 देखें) के लिए प्रक्रिया को दोहराने।
    2. टी 1 माप 1 एच के लिए अशक्त विधि 16 द्वारा मापा
      नोट: अशक्त विधि उलट वसूली पल्स अनुक्रम का उपयोग करता है, एक देरी (ताऊ) द्वारा एक 180 डिग्री नाड़ी पालन से मिलकर, जेड अक्ष और एक अंतिम 90 ° नाड़ी जो नमूदार अनुप्रस्थ चुंबकन बनाता है साथ तनाव कम करने के लिए अनुमति देने के।
      1. 1 एच (चरणों 2.1.7 और 2.1.8 देखें) के लिए एक नया डेटा समूह बनाएं।
      2. टाइप करें "pulprog t1ir1d" उलट-रिकवरी प्रयोग करने के लिए पल्स अनुक्रम बदलने के लिए।
      3. कमांडरों पर निम्न कमांड टाइप करेंघ लाइन पीपीएम में वर्णक्रमीय चौड़ाई, आरएफ ट्रांसमीटर का केंद्र है, स्कैन डमी स्कैन की संख्या और डेटा बिंदुओं "sw 8" की संख्या, "o1p 3.8", "एनएस 2", "डी एस की संख्या स्थापित करने के लिए 2 "और" टीडी 64K "।
      4. प्रकार "p1 (मान)" और के रूप में नाड़ी अंशांकन द्वारा निर्धारित 90 डिग्री नाड़ी के लिए अवधि मान दर्ज (कदम 2.2.1 देखें) और (प्रकार "p2 (मान)" 180 डिग्री नाड़ी के लिए 180 डिग्री के लिए अवधि मान पल्स 90 ° पल्स दो से गुणा अवधि) है।
      5. "D1 10" टाइप करके एक बहुत बड़े मूल्य के लिए रीसायकल देरी सेट करें, जैसे 10 एस।
      6. एक छोटी मूल्य के ताऊ सेट, इस तरह के रूप में 10 एमएस, कमांड लाइन में "d7 10ms" टाइप करके।
      7. आरजी का स्वत: गणना के लिए आदेश "RGA" का उपयोग एक उचित मूल्य के लिए रिसीवर लाभ (आरजी) सेट करें।
      8. आदेश "zg" टाइप करके एक स्पेक्ट्रम चलाएँ।
      9. "EFP" टाइप करके फूरियर-परिवर्तन निष्पादितकमांड लाइन में।
      10. कमांड लाइन में आदेश "APK" टाइप करके स्वत: चरण सुधार निष्पादित करें। अतिरिक्त चरण समायोजन आगे, स्पेक्ट्रम को सुधारने के लिए क्लिक करें की आवश्यकता होती है, तो "प्रक्रिया टैब," फिर "चरण को समायोजित करें" आइकन पर क्लिक चरण सुधार मोड में प्रवेश करने की।
        1. जब तक सभी संकेतों नकारात्मक अवशोषण मोड में हैं माउस खींचकर शून्य आदेश (0) और प्रथम क्रम (1) चरण सुधार माउस का प्रयोग करें। लागू करें और चरण सुधार मोड बाहर निकलने के लिए "द रिटर्न और सहेजें" बटन पर क्लिक करके चरण सुधार मूल्यों को बचाने के।
      11. ताऊ बढ़ाएँ जब तक सभी चोटियों चरण दोहराते हुए या तो सकारात्मक या nulled हैं 2.2.2.6-2.2.2.9। टी 1 मूल्य निर्धारित करने के लिए बस ताऊ मूल्य जहां शिखर LN2 साथ nulled है विभाजित करते हैं।
    3. टी 1 माप 13 सी के लिए अशक्त विधि 16 द्वारा मापा
      1. एक नया डेटा 13 सी के लिए निर्धारित बनाएं (कदम 2.1.9 देखें)
      2. प्रकार "pulprog t1irpg" कार्बन नाभिक के लिए उलट-रिकवरी प्रयोग करने के लिए पल्स अनुक्रम बदलने के लिए।
      3. "Sw 200", "o1p 98": पीपीएम में वर्णक्रमीय चौड़ाई, आरएफ ट्रांसमीटर का केंद्र है, स्कैन की संख्या, डमी स्कैन की संख्या और डेटा बिंदुओं की संख्या स्थापित करने के लिए कमांड लाइन पर निम्न कमांड टाइप करें , "एनएस 8", "डी एस 2" और "टीडी 64K"।
      4. प्रकार "p1 (मान)" और के रूप में नाड़ी अंशांकन द्वारा निर्धारित 90 डिग्री नाड़ी के लिए अवधि मान दर्ज करें और 180 डिग्री नाड़ी के लिए प्रकार "p2 (मान)" (अवधि मान 90 डिग्री है (कदम 2.2.1 देखें) पल्स अवधि दो से गुणा)।
      5. "D1 100" टाइप करके एक बहुत बड़े मूल्य के लिए रीसायकल देरी सेट करें, इस तरह के रूप में 100 रों।
      6. एक छोटी मूल्य के ताऊ सेट, आदेश पंक्ति में "d7 100ms" टाइप करके इस तरह के रूप में 100 एमएस।
      7. receiv सेटएर लाभ (आरजी) एक उचित मूल्य के लिए आरजी का स्वत: गणना के लिए आदेश "RGA" का उपयोग।
      8. आदेश "zg" टाइप करके एक स्पेक्ट्रम चलाएँ।
      9. आदेश पंक्ति में "EFP" टाइप करके फूरियर-परिवर्तन निष्पादित।
      10. कमांड लाइन में आदेश "APK" टाइप करके स्वत: चरण सुधार निष्पादित करें। अतिरिक्त चरण समायोजन आगे स्पेक्ट्रम में सुधार के लिए आवश्यक हैं, तो "चरण को समायोजित करें" आइकन और शून्य आदेश (0) और प्रथम क्रम चरण (1) सुधार के लिए चरण सुधार आइकन पर क्लिक करें।
        1. जब तक सभी संकेतों नकारात्मक अवशोषण मोड में हैं शून्य आदेश और प्रथम क्रम चरण सुधार आइकन पर क्लिक करते हैं, माउस खींचें। लागू करें और चरण सुधार मोड बाहर निकलने के लिए "द रिटर्न और सहेजें" बटन पर क्लिक करके चरण सुधार मूल्यों को बचाने के।
      11. ताऊ बढ़ाएँ जब तक सभी चोटियों चरण दोहराते हुए या तो सकारात्मक या nulled हैं 2.2.3.6-2.2.3.9। इरादा करनाटी 1 मूल्य, बस ताऊ मूल्य जहां शिखर LN2 साथ nulled है विभाजित करते हैं।
  3. एक-आयामी (1 डी) एनएमआर स्पेक्ट्रा
    1. 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा
      1. एनएमआर डेटा का अधिग्रहण
        1. 1 एच डेटा कदम 2.1.7 में बनाया सेट पर जाएँ और टाइप "pulprog zg" कमांड लाइन में से मानक "पल्स प्राप्त नहीं" पल्स अनुक्रम, "zg", का उपयोग करें।
        2. कमांड लाइन पर निम्न कमांड टाइप करें एक 90 डिग्री नाड़ी कोण के लिए पीपीएम में वर्णक्रमीय चौड़ाई, आरएफ ट्रांसमीटर का केंद्र है, स्कैन की संख्या, डमी स्कैन की संख्या, डेटा बिंदुओं की संख्या और पल्स अवधि स्थापित करने के लिए : "sw 8", "o1p 3.8", "एनएस 2", "डी एस 2", "टीडी 64K" और "p1 (के रूप में नाड़ी अंशांकन द्वारा निर्धारित)" (कदम 2.2.1 देखें)।
          नोट: 32K डेटा बिंदुओं 500 मेगाहर्ट्ज साधन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
        3. , "D1 7s" या "d1 9 नंबर के पत्तों" टाइप क्रमशः, कमांड लाइन में से 500 मेगाहर्ट्ज साधन के लिए 7 या 850 MHz उपकरण के लिए 9 के एक विश्राम देरी सेट करें।
        4. आरजी का स्वत: गणना के लिए आदेश "RGA" का उपयोग एक उचित मूल्य के लिए रिसीवर लाभ (आरजी) सेट करें।
        5. टाइप करें "digmod baseopt" बेहतर आधारभूत के साथ एक स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए।
        6. कमांड लाइन में नाड़ी: प्राप्त आदेश "zg" टाइप करके अधिग्रहण शुरू करो।
      2. एनएमआर डेटा के प्रसंस्करण
        1. कमांड लाइन में टाइप करें "सी 64K" शून्य भरने लागू करते हैं और 64K के लिए असली स्पेक्ट्रम के आकार को निर्धारित करने के लिए।
        2. "पौंड 0.3" टाइप कमांड लाइन में एक पंक्ति 0.3 हर्ट्ज के कारक को व्यापक बनाने फूरियर से पहले बदलने के साथ एक भार समारोह (घातीय क्षय) लागू करने के द्वारा लाइन 0.3 हर्ट्ज के लिए पैरामीटर का विस्तार सेट करें।
        3. आदेश में "EFP" टाइप करके फूरियर-परिवर्तन निष्पादितलाइन।
        4. कमांड लाइन में आदेश "APK" टाइप करके स्वत: चरण सुधार निष्पादित करें। अतिरिक्त चरण समायोजन आगे, स्पेक्ट्रम को सुधारने के लिए क्लिक करें की आवश्यकता होती है, तो "प्रक्रिया टैब," फिर "चरण को समायोजित करें" आइकन और शून्य आदेश (0) और प्रथम क्रम (1) चरण सुधार के लिए चरण सुधार आइकन पर क्लिक करें ।
          1. शून्य आदेश और प्रथम क्रम चरण सुधार आइकन पर क्लिक करते हैं, माउस को खींच जब तक संकेतों के सभी सकारात्मक अवशोषण मोड में हैं। लागू करें और चरण सुधार मोड बाहर निकलने के लिए "द रिटर्न और सहेजें" बटन पर क्लिक करके चरण सुधार मूल्यों को बचाने के।
        5. एकीकरण पर कमांड "पेट n" टाइप करके बेस लाइन सुधार के लिए एक बहुपद चौथी आदेश समारोह को लागू करें।
          नोट: यह एक न्यूनतम तीव्रता के साथ एक फ्लैट वर्णक्रमीय आधारभूत सुनिश्चित करता है।
        6. टीएमएस से पीपीएम में रिपोर्ट रासायनिक बदलाव = 0)। अंशांकन पर क्लिक करें ( "Calib। कुल्हाड़ी") आइकन, और टीएमएस एनएमआर संकेत (0 शिखर निकटतम) के शीर्ष पर लाल रेखा के साथ कर्सर रखें। वाम क्लिक करें और में टाइप" है 0 "।
      3. एनएमआर डेटा विश्लेषण
        1. वर्णक्रमीय क्षेत्र एकीकृत 1.1 δ से δ 4.98 पर चोटियों के रूप में 0.6 δ करने के साथ ही, 5.05 और 5.81 δ "एकीकृत" आइकन ( "प्रक्रिया" टैब के अंतर्गत) और आकर्षण का उपयोग कर δ ( "नया क्षेत्र को परिभाषित करें") आइकन। अभिन्न के माध्यम से वाम क्लिक करें और खींचें।
          नोट: यदि वहाँ निष्क्रिय और बाएँ क्लिक करें और क्षेत्र पर ज़ूम करने के लिए माउस खींचें करने के लिए मुख्य आकर्षण आइकन पर क्लिक करें एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है,। सीमा तीव्रता को समायोजित करने के लिए, मध्य माउस बटन का उपयोग करें यदि आवश्यक हो तो। फिर से उजागर आइकन पर क्लिक करें एकीकरण समारोह सक्रिय बनाने के लिए, तो अगले शिखर पर ले जाते हैं।
          1. अभिन्न मूल्य दिखाई देने पर राइट क्लिक करके 100 के ऊपर अभिन्न की राशि को सामान्यसंकेत के तहत और "अभिन्न का योग सामान्यीकृत करें"। इनपुट मान "100" बॉक्स में और एकीकरण मोड से बाहर निकलने के लिए "लौटें और सहेजें" क्लिक करें।
        2. एक आंतरिक मानक के रूप में BHT उपयोग करते समय, δ 6.98 पर पीक एकीकृत और प्रति शेयर समाधान के 0.5 एमएल BHT की millimoles का अभिन्न अंग बराबर निर्धारित किया है।
        3. ब्याज की चोटियों एकीकृत (कदम 2.3.1.3.1 देखें) शिखर के प्रत्येक पक्ष से 10 हर्ट्ज का विस्तार, जब संभव।
        4. एक समान तरीके से 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें।
    2. 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा
      1. एनएमआर डेटा का अधिग्रहण
        1. 13 सी डेटा सेट पर जाएँ और टाइप "pulprog zgig" कमांड लाइन में से उलटा गेटेड decoupled पल्स अनुक्रम, "zgig" का उपयोग करें।
          ध्यान दें: मानक ब्रॉडबैंड decou के साथ एक कार्बन प्रयोग चलाने के लिएPLED पल्स अनुक्रम, प्रकार "pulprog zgpg" कमांड लाइन में।
        2. कमांड लाइन पर निम्न कमांड टाइप करें एक 90 डिग्री नाड़ी कोण के लिए पीपीएम में वर्णक्रमीय चौड़ाई, आरएफ ट्रांसमीटर का केंद्र है, स्कैन की संख्या, डमी स्कैन की संख्या, डेटा बिंदुओं की संख्या और पल्स अवधि स्थापित करने के लिए : "sw 200", "o1p 95", "एनएस 16" "डी एस 2", "टीडी 64K" और "p1 (के रूप में नाड़ी अंशांकन द्वारा निर्धारित)" (कदम 2.2.1.4 देखें)।
        3. , "D1 35s" या "d1 45s" टाइप क्रमशः, कमांड लाइन में से 850 MHz उपकरण के लिए 500 मेगाहर्ट्ज साधन के लिए 35 या 45 के एक विश्राम देरी सेट करें। BHT का उपयोग करते समय, विश्राम देरी 500 मेगाहर्ट्ज साधन में 50 और 850 MHz साधन में 60 रों होना चाहिए।
        4. आरजी का स्वत: गणना के लिए आदेश "RGA" का उपयोग एक उचित मूल्य के लिए रिसीवर लाभ (आरजी) सेट करें।
        5. आदेश पंक्ति में "digmod baseopt" टाइप करें एक स्पेक्ट्रम डब्ल्यू प्राप्त करने के लिएith बेहतर आधारभूत।
        6. कमांड लाइन में नाड़ी: प्राप्त आदेश "zg" टाइप करके अधिग्रहण शुरू करो।
      2. एनएमआर डेटा के प्रसंस्करण
        1. कमांड लाइन में टाइप करें "सी 64K" शून्य भरने लागू करते हैं और 64K के लिए असली स्पेक्ट्रम के आकार को निर्धारित करने के लिए।
        2. "पौंड 1.0" टाइप कमांड लाइन में एक पंक्ति 1.0 हर्ट्ज के कारक को व्यापक बनाने फूरियर से पहले बदलने के साथ एक भार समारोह (घातीय क्षय) लागू करने के द्वारा लाइन 1.0 हर्ट्ज के लिए पैरामीटर का विस्तार सेट करें।
        3. आदेश पंक्ति में "EFP" टाइप करके फूरियर-परिवर्तन निष्पादित।
        4. कमांड लाइन में आदेश "APK" टाइप करके स्वत: चरण सुधार निष्पादित करें। अतिरिक्त चरण समायोजन आगे, स्पेक्ट्रम को सुधारने के लिए क्लिक करें की आवश्यकता होती है, तो "प्रक्रिया टैब," फिर "चरण को समायोजित करें" आइकन और शून्य आदेश (0) और प्रथम क्रम चरण (1) सुधार के लिए चरण सुधार आइकन पर क्लिक करें ।
            नोट: कार्बन स्पेक्ट्रा 214 मेगाहर्ट्ज (850 MHz साधन) आवृत्ति निर्भर त्रुटियों (प्रथम क्रम) के सुधार के Larmor आवृत्ति पर दर्ज के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है और समय की वजह से बड़ी ऑफ गूंज प्रभाव के कम अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए उपभोक्ता 90 ° नाड़ी।
        5. एकीकरण पर कमांड लाइन में आदेश "पेट n" टाइप करके बेस लाइन सुधार के लिए एक बहुपद चौथी आदेश समारोह को लागू करें।
        6. टीएमएस से पीपीएम में रिपोर्ट रासायनिक बदलाव = 0)। अंशांकन ( "Calib। एक्सिस") आइकन पर क्लिक करें, और एनएमआर संकेत के शीर्ष पर लाल रेखा संदर्भित किया जा करने के लिए के साथ कर्सर रखें। वाम क्लिक करें और "0" में टाइप करें।
      3. एनएमआर डेटा विश्लेषण
        1. वर्णक्रमीय क्षेत्र एकीकृत 175 δ से "एकीकृत" आइकन ( "प्रक्रिया" टैब के अंतर्गत) और आकर्षण का उपयोग कर 171 δ करने के लिए ( "नए क्षेत्र को परिभाषित करें") आइकन। अभिन्न के माध्यम से वाम क्लिक करें और खींचें।
          नोट: यदि वहाँ निष्क्रिय और बाएँ क्लिक करें और क्षेत्र पर ज़ूम करने के लिए माउस खींचें करने के लिए मुख्य आकर्षण आइकन पर क्लिक करें एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है,। फिर से उजागर आइकन पर क्लिक करें एकीकरण समारोह सक्रिय बनाने के लिए, तो अगले शिखर पर ले जाते हैं।
          1. अभिन्न मूल्य कि संकेत के नीचे दिखाई देता पर राइट क्लिक करके 100 का अभिन्न अंग निर्धारित करें और "वर्तमान इंटीग्रल कैलिब्रेट" का चयन करें। इनपुट मान "100" बॉक्स में और "द रिटर्न और बचाने" पर क्लिक करें एकीकरण मोड से बाहर निकलने के लिए।
        2. एक आंतरिक मानक के रूप में BHT उपयोग करते समय, δ 151.45 पर पीक एकीकृत और का अभिन्न अंग बराबर सेटशेयर समाधान के 0.5 एमएल प्रति BHT की millimoles।
        3. शिखर के प्रत्येक पक्ष से 5 हर्ट्ज का विस्तार ब्याज की चोटियों एकीकृत (कदम 2.3.2.3.1 देखें)।

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Representative Results

1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मछली के तेल दो एनएमआर उपकरणों का उपयोग कर की खुराक के लिए एकत्र किए गए थे; एक 850 MHz और एक 500 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर। इन स्पेक्ट्रा ऐसे docosahexaenoic एसिड (DHA) और eicosapentaenoic एसिड (ईपीए), इस तरह के एन के रूप में ऐसी एन -1 एसाइल चेन और पोषण महत्वपूर्ण सूचकांक के साथ ही अन्य यौगिकों के रूप में मछली के तेल के घटकों, की मात्रात्मक निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता -6 / एन -3 अनुपात। मात्रा भी एक आंतरिक मानक के उपयोग के बिना किया जा सकता है, तथापि, मात्रात्मक परिणाम रिश्तेदार दाढ़ प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाना चाहिए। डेटा शुद्ध मान (मिलीग्राम / छ) में व्यक्त किया जा करने के लिए की जरूरत है, एक आंतरिक मानक की आवश्यकता है। एनएमआर द्वारा प्राप्त परिणामों, रिश्तेदार मानक विचलन (आरएसडी) 0.3% से 13 सी एनएमआर विश्लेषण के लिए 2% और 0.5% से 1 एच एनएमआर विश्लेषण के लिए 2.5% से लेकर के साथ अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत कर रहे हैं टी के आधार पर वह लिपिड। 1 एच एनएमआर के लिए थोड़ा अधिक आरएसडी अक्सर विशेष रूप से अनुनादों शोर अनुपात (एस / एन) के लिए एक कम सिग्नल मिल रहा है के लिए मनाया, क्योंकि प्रोटॉन स्पेक्ट्रा भीड़ होने के लिए है, जो विश्लेषण की सटीकता को प्रभावित करता है करते है। एक बहुत अच्छा समझौता 850 MHz और 1% से 4% से लेकर RSDS के साथ 500 मेगाहर्ट्ज साधन के बीच मिला था। अपेक्षाकृत उच्च RSDS (8% तक) जब 1 एच और 13 सी के द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना, विशेष रूप से है कि इस तरह एन -1 एसाइल चेन के रूप में कम सांद्रता में प्रदर्शित यौगिकों के लिए देखे गए हैं। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी पहले से लिपिड विश्लेषण के लिए एक उपकरण है, कुछ मछली के तेल घटकों के निर्धारण सहित के रूप में मान्य किया गया है। नतीजे बताते हैं कि यह इस तरह जी सी 17, 18 के रूप में पारंपरिक तरीकों के साथ अच्छे समझौते में है।

1 एच एनएमआर विश्लेषण

"xfig"> चित्रा 1 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा (ए) एक 850 MHz और (बी) एक 500 MHz साधन पर हासिल कर ली है। 850 MHz स्पेक्ट्रम उच्च संकल्प की विशेषता है, DHA, EPA, और एन -6 / एन सहित मछली के तेल की हालांकि प्रमुख घटक -3 अनुपात भी 500 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रम से निर्धारित किया जा सकता है। मछली के तेल फैटी एसिड की 1 एच एनएमआर संकेत है कि quantitation उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तालिका 1 में दिखाया जाता है मछली का तेल का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम की पूरी एनएमआर काम कहीं और 19 पाया जा सकता है, जबकि।

1 एच एनएमआर एन -3 की कुल राशि की मात्रा के लिए विश्वसनीय आंकड़े दे दी है, एन -6, डीएचए, ट्रांस वसा अम्ल, एन -1 एसाइल चेन, और संतृप्त वसा अम्ल (SFA)। 1 एच एनएमआर विश्लेषण के लिए, उचित रिश्तों का उपयोग क्योंकि रों के सबसे आवश्यक हैignals प्रोटॉन कि विभिन्न फैटी एसिड और लिपिड के लिए आम हैं के समूहों के हैं। यही वजह है कि ज्यादातर मामलों में मछली के तेल में फैटी एसिड की एकाग्रता ही विभिन्न 1 एच एनएमआर संकेतों के संयोजन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, उचित संबंधों में शामिल किया। इसके अलावा, इन समीकरणों गणित गुणांक कि प्रत्येक समूह के साथ जुड़े प्रोटॉन की अलग संख्या को सामान्य होते हैं। जब एक आंतरिक मानक प्रयोग किया जाता है निम्न समीकरण विचार किया जाना चाहिए: सी = मैं / मैं है × एन / एन × × एक मेगावाट / मी (1) है, जहां सी मछली के तेल की मिलीग्राम / छ में analyte की एकाग्रता है, मैं एक गूंज है जो विशिष्ट ब्याज की लिपिड को जिम्मेदार ठहराया है की अभिन्न अंग है, मैं है एक प्रोटॉन संकेत आंतरिक मानक के विशिष्ट अंतर्गत आता है कि क्षेत्र है, एन कार्यात्मक समूह है कि विश्लेषण किया जाता है की प्रोटॉनों की संख्या है,एन आंतरिक मानक है कि विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है प्रोटॉनों की संख्या है, एक आंतरिक मानक के millimoles है, मेगावाट फैटी एसिड की आणविक भार (मिथाइल एस्टर में व्यक्त) है, और मीटर मछली के तेल की मात्रा है ग्राम में व्यक्त किया।

उदाहरण 1, डीएचए: डीएचए के अनुपात में समीकरण सी डीएचए = ¾ मैं डीएचए / एस, जहां मैं डीएचए 2.39 δ पर संकेत के अभिन्न जो एच α और एच डीएचए की β प्रोटॉन के अंतर्गत आता है है, और एस से निर्धारित होता है SFA की मिथाइल प्रोटॉन की अभिन्न का योग, एन -6, एन -9, एन -3, ट्रांस वसा अम्ल प्लस δ 4.98 पर एन -1 एसाइल श्रृंखला के चोटियों के अभिन्न, 5.05 और 5.81 δ δ है। अभिन्न मैं डीएचए नोर्मा है3/4 से गुणा क्योंकि यह चार प्रोटॉन से मेल खाती है, जबकि अभिन्न एस तीन प्रोटॉन से मेल खाती है द्वारा lized। 1 एच एनएमआर ग्लिसरॉल रीढ़ की हड्डी पर फैटी एसिड की स्थितीय वितरण के बारे में जानकारी देने के लिए सक्षम नहीं है और इस प्रकार केवल फैटी एसिड की कुल राशि का मात्रा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक समझाया मछली के तेल के पूरक का 1 एच एनएमआर विश्लेषण से पता चला है कि यह डीएचए की 10.5% के होते हैं। एक ही नमूना BHT का उपयोग करने में डीएचए की एकाग्रता 105.23 मिलीग्राम / छ हो पाया था। ये मान बहुत 13 सी एनएमआर (13 सी के विश्लेषण के लिए उदाहरण 2 देखें) के साथ प्राप्त मूल्यों के करीब हैं।

उदाहरण 2, एन -1 एसाइल जंजीरों: n -1 एसाइल चेन की एकाग्रता संबंध सी n-1 द्वारा दिया जाता है = 3 मैं n-1 / एस, जहां मैं n-1 5.818 δ पर संकेत के अभिन्न अंग है। इससंकेत एक प्रोटॉन से मेल खाती है और इस तरह तीन से गुणा द्वारा सामान्यीकृत किया जाना चाहिए। BHT का उपयोग कर, एन -1 जब एसाइल चेन समीकरण सी n-1 = 2 मैं n-1 / मैं BHT द्वारा निर्धारित किया जाता है। परिणाम मिलीग्राम / छ में व्यक्त नहीं किया जा सकता क्योंकि एन -1 एसाइल श्रृंखला के मेगावाट अज्ञात है।

उदाहरण 3, एन -6 / एन -3 अनुपात: यह महत्वपूर्ण सूचकांक 2.77 δ पर गूंज की सामान्यीकृत तीव्रता के अनुपात से गणना की जा सकती है, जो एन -6 एसाइल चेन (दो प्रोटॉन) की बिस-allylic प्रोटॉन से मेल खाती है 0.97 δ पर त्रिक से अधिक है कि एन -3 फैटी एसिड के अंतर्गत आता है और तीन प्रोटॉन से मेल खाती है। रिश्ता है सी एन-6 / सी एन -3 = 3/2 मैं / मैं बी, जहां मैं एक और मैं बी संकेतों के अभिन्न हैं2.77 और δ 0.97 क्रमश: δ पर। n -6 फैटी एसिड संबंध सी एन-6 = 3 / 2I एन-6 / एस, जहां मैं एन-6 2.77 δ पर बिस-allylic प्रोटॉन की अभिन्न अंग है से निर्धारित होते हैं।

उदाहरण 4, ट्रांस वसा अम्ल: ट्रांस फैटी एसिड समीकरण सी ट्रांस = मैं ट्रांस / एस, जहां मैं ट्रांस 0.91 δ पर संकेत के अभिन्न अंग है से गणना की जा सकती। वर्तमान नमूना, ट्रांस फैटी एसिड की 3.07% निहित के रूप में 850 MHz साधन का उपयोग कर 1 एच एनएमआर द्वारा निर्धारित किया। एक ही नमूना एक 500 MHz साधन में विश्लेषण ट्रांस फैटी एसिड की 3.03% शामिल करने के लिए मिला था।

उदाहरण 5, संतृप्त वसा अम्ल (SFA): SFA की एकाग्रता calcul हो सकता हैसमीकरण सी SFA = एस से पैदा - सी एन -3 - सी एन-6 - सी एन-9 - सी n-1 - सी ट्रांस। n -9 फैटी एसिड (मुख्य रूप से ओलिक एसिड) समीकरण सी के अनुसार मात्रा निर्धारित किया जा सकता है एन-9 = (3/4 क्यू - 3/2 मैं एन-6) / एस, जहां क्यू n के allylic प्रोटॉन की अभिन्न अंग है -6 और एन -9 2.01 δ पर। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मछली के तेल के नमूने में SFA की राशि 36.1% हो पाया था। एक ही नमूना 13 सी एनएमआर के साथ विश्लेषण 33.8% SFA शामिल करने के लिए मिला था। SFA विभिन्न एफए (जैसे स्टीयरिक और पामिटिक) विभिन्न मेगावाट के साथ का एक समूह है और इस तरह उनकी एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है, तो मछली के तेल मिलीग्राम / छ में व्यक्त नहीं किया जा सकता है।

उदाहरण 6, कुल स्टेरोल्स: कुल स्टेरोल्स की राशि (स्वतंत्र और एस्टरीकृत) sig द्वारा निर्धारित किया जा सकताजो 0.68 δ में दिखाई देता है कार्बन 18 पर मिथाइल प्रोटॉन, समीकरण सी का उपयोग करने का एनएएल = मैं / एस खड़ा। एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मछली के तेल के नमूने में कुल स्टेरोल्स की दाढ़ अनुपात 0.32% हो पाया था। BHT भी स्टेरोल्स की पूर्ण एकाग्रता के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। मछली के तेल में मुख्य स्टेरोल्स कोलेस्ट्रॉल और विटामिन डी (या अपने पूर्वगामी 7-dehydrocholesterol) होते हैं और अक्सर खुराक में जुड़ जाते हैं। इन यौगिकों एक बहुत ही इसी तरह की मेगावाट की है। इसलिए, परिणाम मिलीग्राम / छ में व्यक्त किया जा सकता है और गणना कर रहे हैं समीकरण के अनुसार सी = 2/3 मैं STE / मैं एक × मेगावाट STE / मी, जहां मेगावाट STE कोलेस्ट्रॉल के आणविक द्रव्यमान (386) है, जो गठन किया है मछली के तेल 20 में sterolic अंश के बहुमत। एक ही नमूना BHT का उपयोग करने में स्टेरोल्स की राशि 3.8 मिलीग्राम / मछली के तेल की ग्राम था। कोलेस्ट्रॉल के व्यक्ति दृढ़ संकल्प (δ 0.678) संकल्प को बढ़ाने के लिए एक खिड़की समारोह के आवेदन के बाद एक 850 MHz साधन पर संभव है।

13 सी एनएमआर विश्लेषण

चित्र 2 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा पर (ए) एक 850 MHz और (बी) कार्बोनिल कार्बन क्षेत्र में एक 500 MHz साधन का अधिग्रहण को दिखाता है। दो स्पेक्ट्रा बहुत समान हैं और सूचना के एक ही राशि प्रदान कर सकते हैं। 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम सफलतापूर्वक stearidonic (SDA) और eicosatetraenoic (ईटीए) एसिड के रूप में अतिरिक्त फैटी एसिड के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि अधिक स्कैन नमूने, जिसमें इन अम्लों कम सांद्रता में हैं के लिए आवश्यक हैं। 13 सी स्पेक्ट्रा बड़ी वर्णक्रमीय चौड़ाई और ब्रॉडबैंड decoupling के आवेदन, की वजह से उच्च संकल्प की विशेषता है जोअदिश युग्मन के प्रभाव को समाप्त और singlets पैदा करता है। इस कारण से, वहाँ भी अतिव्यापी जब एक 500 MHz साधन का उपयोग कर ही सीमित है।

13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम और अधिक जानकारीपूर्ण है 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम की तुलना में और क्योंकि कम संकेत अतिव्यापी मनाया जाता है और अधिक व्यापक मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं (आंकड़े 1 और 2)। 13 सी स्पेक्ट्रम के सबसे अधिक उपयोगी वर्णक्रमीय क्षेत्र कार्बोनिल कार्बन क्षेत्र है क्योंकि यह फैटी एसिड की एक बड़ी संख्या के लिए और साथ ही ग्लिसरॉल कंकाल 19, 21, 22 पर अपने स्थितीय वितरण के लिए मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है। 14.5 δ से मिथाइल समूह क्षेत्र 13.5 δ एन -3 की कुल राशि के त्वरित निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, एन -6, एन -9 और संतृप्त फैटीएसिड (SFA), और साथ ही ट्रांस वसा अम्ल। हालांकि, 500 मेगाहर्ट्ज एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर में, वहाँ एन के एक आंशिक अतिव्यापी -6 और एन -9 संतृप्त वसा अम्ल (SFA) है। संकल्प को बढ़ाने के लिए एक खिड़की समारोह के आवेदन हालांकि 850 MHz साधन अभी भी एक और अधिक विश्वसनीय विकल्प माना जाता है इस समस्या का समाधान हो सकता है। कार्बन स्पेक्ट्रम के olefinic क्षेत्र n की कुल राशि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता -3 और एन -1 एसाइल चेन के साथ-साथ इस तरह के डीएचए, ईपीए, arachidonic एसिड (एए), लिनोलेनिक (Ln) के रूप में अलग-अलग फैटी एसिड के निर्धारण के लिए के रूप में n -3, और ओलिक एसिड (राजभाषा) (तालिका 2 देखें)। 13 सी एनएमआर भी इस तरह के एथिल एस्टर (ईई) δ 14.31 (मिथाइल) में कार्बन संकेतों का उपयोग में अमीर की खुराक के रूप में अन्य स्रोतों से मछली के तेल के लक्षण वर्णन और δ 60.20 (methylene) के लिए आवेदन किया जा सकता है।

कार्बन विश्लेषण के लिए, फैटी एसिड determ हो सकता हैसामान्य संबंध सी के अनुसार, उचित एलिफैटिक, olefinic, और कार्बोनिल सभी एसाइल चेन की कुल अभिन्न साथ संकेतों के अभिन्न भाग देकर ined = मैं / एस (2) है, जहां सी तिल में analyte की एकाग्रता (% है ), मैं एक गूंज है जो विशिष्ट ब्याज की लिपिड को जिम्मेदार ठहराया है की अभिन्न अंग है, और एस संकेत (रों) कि नमूने की कुल लिपिड सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है की कुल अभिन्न अंग है। एसाइल चेन की कुल अभिन्न एस 175 δ से क्षेत्र को एकीकृत 171 δ के लिए निर्धारित किया जा सकता है और 100 पर सेट है।

मछली के तेल की मिलीग्राम / छ में फैटी एसिड की मात्रा निम्नलिखित संबंध के आधार पर एक आंतरिक मानक का उपयोग किया जाता है: सी = मैं / मैं है × × एक मेगावाट / मी (3), जहां सी में analyte की एकाग्रता है मिलीग्राम / छमछली के तेल की, मैं एक गूंज है जो विशिष्ट ब्याज की लिपिड को जिम्मेदार ठहराया है की अभिन्न अंग है, मैं एक कार्बन संकेत आंतरिक मानक के विशिष्ट अंतर्गत आता है कि के क्षेत्र, एक आंतरिक मानक के millimoles है, मेगावाट आणविक है ब्याज की परिसर के वजन, और मीटर (मिथाइल एस्टर में व्यक्त फैटी एसिड के लिए) ग्राम में मछली के तेल की राशि है। मछली के तेल फैटी एसिड के 13 सी एनएमआर संकेत है कि quantitation उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तालिका 2 में दिखाया जाता है 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम की पूरी एनएमआर काम कहीं और 19 पाया जा सकता है, जबकि।

उदाहरण 1, EPA एस.एन. -2 की स्थिति में: एस.एन. -2 स्थिति पर ईपीए की राशि (%) एस द्वारा 172.56 δ पर संकेत के अभिन्न विभाजित किया जाता है। एक सह में एस.एन. -2 की स्थिति में ईपीए की राशिmmercially उपलब्ध नमूना में 850 MHz साधन का उपयोग कर 3.4% हो पाया था। एक ही स्पेक्ट्रोमीटर और BHT एक आंतरिक मानक के रूप में उपयोग करते हुए, एस.एन. -2 की स्थिति में ईपीए की राशि मिलीग्राम में व्यक्त / मछली के तेल की ग्राम 29.73 मिलीग्राम / छ है। एक ही नमूना एक 500 MHz साधन में विश्लेषण एस.एन. -2 की स्थिति में 3.6% या 31.39 मिलीग्राम / EPA के ग्राम शामिल करने के लिए मिला था। जब एस.एन. में ईपीए के रिश्तेदार आणविक अनुपात की गणना -2 एक पूरी तरह से decoupled स्पेक्ट्रम का उपयोग कर इसी तरह के परिणाम प्राप्त किया जा सकता। इसका कारण यह है EPA के कार्बोनिल कार्बन अन्य कार्बोनिल कार्बन, जो संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाता है के रूप में ही नगण्य डिग्री करने के लिए प्रोटॉन decoupling को प्रभावित करती है। हालांकि, बड़े विचलन जब BHT का उपयोग कर, क्योंकि 151.45 δ पर BHT की कार्बन, जो मात्रा के लिए प्रयोग किया जाता है, फैटी एसिड की कार्बोनिल कार्बन की तुलना में एक अलग NOE वृद्धि प्राप्त मनाया जाता है। यही वजह है कि पूरी तरह से decoupled स्पेक्ट्रम जब आंतरिक मानकों का उपयोग कर या एकीकृत ग से बचा जाना चाहिएविभिन्न multiplicities साथ arbons।

उदाहरण 2, डीएचए की कुल राशि: डीएचए की कुल राशि (%) बस के रूप में 172.48 और δ 172.08 क्रमश: δ पर एनएमआर संकेतों द्वारा निर्धारित एस.एन. -1,3 और एस.एन. -2 स्थिति में डीएचए की मात्रा जोड़कर की जाती है। एक ही नमूना 1 एच एनएमआर के साथ विश्लेषण (1 एच विश्लेषण के उदाहरण 1 देखें) 13 सी एनएमआर विश्लेषण के अनुसार डीएचए 10.3% शामिल करने के लिए मिला था। डीएचए की राशि भी एक आंतरिक मानक और समीकरण 3. डीएचए की कुल राशि 103.25 मिलीग्राम / छ था का उपयोग करके मिलीग्राम / छ में व्यक्त किया जा सकता है।

उदाहरण 3, SDA की कुल राशि: SDA की कुल राशि (%) 172.99 δ पर संकेतों के अभिन्न जोड़ने और δ 172.60 जो -1,3 और एस.एन. स्थिति पर SDA के कार्बोनिल कार्बन के हैं से निर्धारित होता हैएस.एन. -2, क्रमशः, तो एस द्वारा राशि विभाजित। विश्लेषण किया नमूना 3.93% SDA या 34.54 मिलीग्राम / छ शामिल करने के लिए मिला था।

उदाहरण 4, एन -3 Ln: n -3 Ln (%) अभिन्न एस के साथ δ 131.85 पर संकेत के अभिन्न विभाजित करके निर्धारित किया जा सकता है। विश्लेषण किया मछली के तेल के नमूने में एन -3 Ln की दाढ़ अनुपात 0.7% थी। BHT का उपयोग कर पूर्ण एकाग्रता 5.5 मिलीग्राम / छ के रूप में गणना की गई थी।

उदाहरण 5, ट्रांस वसा अम्ल: ट्रांस फैटी एसिड की दाढ़ अनुपात एस के साथ 13.80 δ पर संकेत के अभिन्न विभाजित करके निर्धारित किया जाता है। एक ही नमूने के विश्लेषण है कि 1 एच एनएमआर के साथ विश्लेषण किया गया था और ट्रांस एफए का 3.07% हो पाया था, भी 13 सी एनएमआर के साथ विश्लेषण किया गया था और उसके ट्रांस फैटी एसिड सामग्री 3.42% हो पाया था। टीवह 13 सी एनएमआर एक 500 MHz साधन पर ही नमूना के विश्लेषण ट्रांस वसा अम्ल के एक 3.64% सामग्री से पता चला है। मछली के तेल की mmol / छ में ट्रांस एफए की राशि एक आंतरिक मानक और समीकरण सी के रूप में BHT का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता = मैं / मैं × / मीटर है, लेकिन परिणाम 13.80 δ पर पीक क्योंकि मिलीग्राम / छ में व्यक्त नहीं किया जा सकता विभिन्न ट्रांस वसा अम्ल, मुख्य रूप से ट्रांस डीएचए और ट्रांस ईपीए, अलग मेगावाट के साथ मेल खाती है।

उदाहरण 6, ईई: एक मछली के तेल के नमूने में ईई की एकाग्रता 60.50 δ से वर्णक्रमीय क्षेत्र का अभिन्न भाग देकर 60.00 δ के लिए है, जो विभिन्न फैटी एसिड के ईई की methylene कार्बन से मेल खाती है एस के साथ की जाती है। एक ई फ़िश तेल के नमूने के विश्लेषण से पता चला है कि यह 100% ईई शामिल थे। यह ध्यान देने योग्य है कि ई नमूनों में, EPA सीएएन, 173.60 δ पर या 60.20 δ पर methylene ईई कार्बन द्वारा कार्बोनिल शिखर द्वारा या तो गणना की जा जबकि डीएचए 60.31 और / या 173.09 δ पर संकेत δ पर संकेत का उपयोग करके किया जा सकता है।

नैदानिक संकेत है कि 13 सी और 1 एच एनएमआर विश्लेषण के साथ मात्रा उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक पूरी सूची क्रमशः टेबल्स 1 और 2, में पाया जा सकता है, जबकि समीकरण है कि इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का विस्तृत विवरण पाया जा सकता है कहीं 19।

एनएमआर अतिरिक्त मछली के तेल की खुराक के ऑक्सीकरण स्थिति के आकलन के लिए लागू किया जा सकता। 3 चित्र दो ऑक्सीकरण परिस्थितियों में एक मछली के तेल का नमूना 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा तुलना; पराबैंगनी करने के लिए हीटिंग और जोखिम के लिए जोखिम (यूवी)रोशनी। लिपिड ऑक्सीकरण एक जटिल प्रक्रिया है, और ऑक्सीकरण उत्पादों की संरचना ऑक्सीकरण की शर्तों पर निर्भर करता है। मुख्य ऑक्सीकरण उत्पादों hydroperoxides (8.0-8.8 δ), संयुग्मित dienes hydroperoxides 5.4-6.7), और एल्डीहाइड 9.0- 10) कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1। 1 एच एनएमआर विश्लेषण। 850.23 (ए) और 500.20 मेगाहर्ट्ज (बी) 1 CDCl 3 समाधान में एक मछली के तेल के पूरक के एच-एनएमआर स्पेक्ट्रम। कि उनके निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता EPA और DHA के एनएमआर संकेत दिखाए जाते हैं। Δ 0.97 पर पीक एन -3 फैटी एसिड की कुल राशि के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। Δ 1.39-1.20 पर एन्वलप काटी है, के रूप में यह सब फैटी श्रृंखला के methylene प्रोटॉन के अंतर्गत आता हैऔर कोई पहचान या मात्रा उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम एक संकरा वर्णक्रमीय चौड़ाई (दप) 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम के लिए और इस प्रकार कम वर्णक्रमीय संकल्प से तुलना की विशेषता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2। 13 सी एनएमआर विश्लेषण। 213.81 (ए) और 125.77 मेगाहर्ट्ज (बी) 13 कार्बोनिल कार्बन क्षेत्र में CDCl 3 समाधान में एक मछली के तेल के पूरक के सी-एनएमआर स्पेक्ट्रम। एस.एन. -1,3 और एस.एन. -2 स्थिति पर EPA और DHA के एनएमआर संकेत दिखाए जाते हैं। इन संकेतों EPA और DHA के मात्रात्मक निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। हालांकि speCtra 213.81 मेगाहर्ट्ज पर दर्ज की गई एक उच्च संकल्प और संवेदनशीलता की विशेषता है, 125.77 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रा भी प्रमुख यौगिकों के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। 13 सी एनएमआर प्रयोग में decoupling के आवेदन कार्बन और हाइड्रोजन के नाभिक है और इस तरह का संकेत singlets 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम की तुलना में विश्लेषण को आसान बनाने के रूप में दिखाई देते हैं के बीच अदिश युग्मन के प्रभाव को समाप्त। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3 चित्र। मछली के तेल ऑक्सीकरण। ऑक्सीकरण मछली के तेल का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम ऑक्सीकरण की स्थिति पर निर्भर करता है। अनुनादों hydroperoxides 8.0-8.8), ग के लिए जिम्मेदार ठहरायाonjugated dienes hydroperoxides 5.4-6.7), और एल्डीहाइड दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

δ पीपीएम प्रोटॉन यौगिक
0.677 सीएच 3 (18) कोलेस्ट्रॉल
0.678 सीएच 3 (18) 7-dehydrocholesterol
0.88 सीएच 2 सीएच 3 (टी), जम्मू ω1, ω2 = 7.27 हर्ट्ज n -9, SFA एसाइल चेन
0.883 सीएच 2 सीएच 3 (टी), जम्मू ω1, ω2 = 7.08 हर्ट्ज n -6 एसाइल चेन
0.911 सीएच 2 सीएच 3 (टी), जम्मू ω; 1, ω2 = 7.65 हर्ट्ज ट्रांस एसाइल चेन
0.973 सीएच 2 सीएच 3 (टी), जम्मू ω1, ω2 = 7.63 हर्ट्ज n -3 एसाइल चेन
1.25 सीएच 2 सीएच 3 (टी), जे = 7.20 हर्ट्ज इथाइल एस्टर
1.697 OCOCH2CH 2 (टी), जे एच α, Η β = हर्ट्ज ईपीए एसाइल श्रृंखला
2.391 OCOCH 2 सीएच 2 (टी) डीएचए एसाइल श्रृंखला
2.772 सीएच = CHCH 2 सीएच = सीएच n -6 एसाइल चेन
2.81 सीएच = CHCH 2 सीएच = सीएच n -3 एसाइल चेन
3.593 3'a-CH 2 OCO 1-MAG की ग्लिसरॉल
3.722 3'a, 3217, बी-CH 2 OCO (br) 1,2-DAG की ग्लिसरॉल
4.073 2'-Choh (br) 1,3-DAG की ग्लिसरॉल
4.121 सीएच 2 सीएच 3 multiplet इथाइल एस्टर
4.173 1'b, 3'b-CH 2 OCO (दिन) 1,3-DAG की ग्लिसरॉल
4.238 1'a-CH 2 OCO (दिन) 1,2-DAG की ग्लिसरॉल
4.329 1'b-CH 2 OCO (दिन) 1,2-DAG की ग्लिसरॉल
4.989 -ch = सीएच 2 सिस (दिन) n -1 एसाइल चेन
5.052 -ch = 2 सीएच ट्रांस (दिन) n -1 एसाइल चेन
5.082 2'-CHOCO 1,2-DAG की ग्लिसरॉल
5.268 2 '; -CHOCO टैग की ग्लिसरॉल
5.436 सीएच = CHCH 2 सीएच = सीएच 2 n -1 एसाइल चेन
5.818 -ch = सीएच 2 n -1 एसाइल चेन

तालिका 1: 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम का काम। 1 मछली के तेल फैटी एसिड संकेतों के एच एनएमआर रासायनिक बदलाव कि CDCl 3 समाधान में मात्रा उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रस्तुत कर रहे हैं। रासायनिक बदलाव पीपीएम में मापा जाता है और नाभिक के रासायनिक वातावरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं।

δ पीपीएम कार्बन
173.24 सी 1 SFA (-1,3 एस.एन.)
172.21 सी 1 राजभाषा, एलओ (एस.एन. -1,3)
सी 1 ईटीए (एस.एन. -1,3)
173.13 सी 1 डीपीए (-1,3 एस.एन.)
173.03 सी 1 SDA (-1,3 एस.एन.)
172.97 सी 1 ईपीए (-1,3 एस.एन.)
172.73 सी 1 ईटीए (एस.एन. -2)
172.69 सी 1 डीपीए (एस.एन. -2)
172.61 सी 1 SDA (एस.एन. -2)
172.56 सी 1 ईपीए (एस.एन. -2)
172.48 सी 1 डीएचए (-1,3 एस.एन.)
172.08 सी 1 डीएचए (एस.एन. -2)
136.8 Cω1, एन -1
131.85 Cω3 एल.एन.
130.37 C15 ए.ए.
130.11 C9 एल.एन.
130.06 C13 एलओ
129.54 सी 5 डीएचए एस.एन. -2
129.47 सी 5 डीएचए एस.एन. -1,3
128.94 सी 5 ईपीए
128.76 सी 6 ईपीए
128.45 C17 एन -3
127.71 n -3
127.53 सी 4 डीएचए एस.एन. -2
127.5 सी 4 डीएचए एस.एन. -1,3
126.86 Cω4, सभी n -3
114.71 Cω2, एन -1
60.08 डीएचए, इथाइल एस्टर
59.96 ईपीए, इथाइल एस्टर
59.95-59.85 अन्य एफए, इथाइल एस्टर
33.48 सी 2 ईपीए एस.एन. -2
33.32 सी 2 ईपीए एस.एन. -1,3
31.44 सी 3 एन -1
27.05 Allylic एन -6
26.49 सी 4 ईपीए एस.एन. -1,3
26.47 सी 4 ईपीए एस.एन. -2
24.6 सी 3 ईपीए
24.48 सी 3 SDA एस.एन. -1,3
24.44 सी 3 SDA एस.एन. -2
14.27 Cω1, सभी n -3
14.13 Cω1, SFA
14.11 Cω1, राजभाषा
14.07 Cω1, एलओ
13.8 Cω1, ट्रांस एफए

तालिका 2: 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम का काम। मछली के तेल फैटी एसिड संकेतों के 13 सी एनएमआर रासायनिक बदलाव कि quantitation purp के लिए इस्तेमाल किया जा सकताCDCl 3 समाधान में OSes प्रस्तुत कर रहे हैं।

पूरक चित्रा एस 1: 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा के बीच तुलना मानक ब्रॉडबैंड decoupling (ए) और उलटा decoupling (बी) पल्स दृश्यों गेटेड का उपयोग कर प्राप्त कर लिया। स्पेक्ट्रा स्कैन की एक ही नंबर के साथ एक ही नमूना, एक ही प्रसंस्करण मानकों के साथ कार्रवाई के लिए दर्ज किया गया है और एक ही पैमाने कारक के साथ दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

संशोधन और समस्या निवारण के लिए रणनीतियाँ

स्पेक्ट्रल गुणवत्ता। एनएमआर संकेत है और इस तरह एनएमआर स्पेक्ट्रम के संकल्प के linewidth shimming, जो चुंबकीय क्षेत्र की एकरूपता के अनुकूलन के लिए एक प्रक्रिया है पर बहुत निर्भर है। नियमित विश्लेषण के लिए, 1 डी shimming पर्याप्त है और एक 3 डी shimming की आवश्यकता नहीं है, यह देखते हुए कि यह एक नियमित आधार पर एनएमआर कर्मियों द्वारा किया जाता है। डी 2 ओ (90:10): यदि यह मामला नहीं है, एक 3 डी shimming एक नमूना एच 2 ओ की 0.6 एमएल युक्त का उपयोग कर विश्लेषण करने से पहले किया जाना चाहिए। एक बेहतर और तेज shimming को प्राप्त करने, नमूना, रेडियो आवृत्ति (आरएफ) का तार की उत्तेजना / पता लगाने क्षेत्र में केंद्रित किया जाना है, वर्गीकृत गहराई नापने का यंत्र उपयोग करने से पहले यह चुंबक बोर में रखा गया है की जरूरत है। एक और पहलू shimming प्रभावित करता है 10-20 हर्ट्ज के एक स्पिन दर पर नमूना कताई है। हालांकि इस स्पिन दर पर नमूना कताई रेडियल शिम्स को बेहतर बनाता है (एक्स, वाई, एक्सवाई, XZ, YZ, एक्स 2 -Y 2, आदि), यह आम तौर पर आदेश पहले या उच्च आदेश की कताई पक्ष बैंड की उपस्थिति से बचने के लिए अनुशंसित नहीं है। हालांकि, जब उपकरणों कि Larmor में काम पर काम कर रहे 400 से कम मेगाहर्ट्ज आवृत्तियों, कताई -1 डी एनएमआर प्रयोगों के लिए सिफारिश की है।

संकल्प है, साथ ही संवेदनशीलता, रिसीवर लाभ (आरजी) मूल्य से प्रभावित हैं। रिसीवर लाभ के कम मूल्यों, संवेदनशीलता को कम मूल्यों जबकि अनुरूप डिजिटल कनवर्टर (एडीसी) के उचित कारण अतिप्रवाह से अधिक है। nonsymmetrical लाइन आकार में एडीसी अतिप्रवाह परिणाम और संकेत मात्रात्मक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता क्योंकि मुक्त प्रेरण क्षय (खूंटी) के पहले अंक खो सकते हैं। ज्यादातर मामलों में, आदेश "RGA" एक उचित rg मूल्य की गणना करता है। हालांकि, कुछ मामलों में, सॉफ्टवेयर द्वारा गणना rg मूल्य आदर्श मूल्य से अधिक है और वहाँ एनएमआर संकेत के Lorentzian आकार में एक विरूपण है। मेंइस तरह के एक मामले में, उपयोगकर्ता चाहिए आदेश पंक्ति में "rg (मान)" टाइप करके मैन्युअल रूप से इनपुट एक छोटे rg मूल्य। कि इस प्रोटोकॉल के साथ विश्लेषण के नमूने के लिए एक विशिष्ट आरजी मूल्य 8 है।

अक्सर, जब cryogenically का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता कारक (क्यू कारक), एक बड़ी देरी (मृत समय)> 200us पिछले नाड़ी और पता लगाने की अवधि के बीच के साथ ठंडा एनएमआर जांच में इस तरह के ट्रांसमीटर की आवृत्ति के चारों ओर एक कूबड़ के रूप में कलाकृतियों से बचने के लिए आवश्यक है और एक स्पेक्ट्रम के आधार रेखा में रोलिंग। हालांकि, इस तरह के एक लंबे समय से देरी एक बड़ी नकारात्मक प्रथम क्रम चरण त्रुटि है, जो भी मजबूत संकेतों के आधार के आसपास एक आधार रेखा रोलिंग और बड़े डुबकी लागू कर सकते हैं का कारण बनता है। इन मामलों में, एक z- बहाल स्पिन गूंज पल्स अनुक्रम हालांकि एक छोटा सा संवेदनशीलता कमी 23 हो सकती है, काफी सुधार की पूर्ति के साथ एनएमआर स्पेक्ट्रा उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

फॉस्फोलिपिड। मछली के तेल के विश्लेषण के अलावाट्राइग्लिसराइड्स और एथिल एस्टर में समृद्ध नमूने, एनएमआर फॉस्फोलिपिड (कृपया) में अमीर मछली के तेल के नमूनों का विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, विशेष देखभाल की इस तरह के नमूने के लिए आवश्यक है क्योंकि PLs रूप समुच्चय है, जो वर्णक्रमीय संकल्प और संवेदनशीलता में उल्लेखनीय कमी पैदा कर सकता है। मेथनॉल: इन नमूनों का विश्लेषण करने, deuterated क्लोरोफॉर्म के एक विलायक मिश्रण के लिए: 70:30 के अनुपात में (CDCl 3 सीडी 3 ओवर ड्राफ्ट) उच्च गुणवत्ता के स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

आंतरिक मानक। क्योंकि यह सरल 1 एच और 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रा के साथ एक उच्च सममित अणु है और अपनी चोटियों में से कोई भी मछली के तेल घटकों में से उन लोगों के साथ ओवरलैप BHT इस अध्ययन में एक आंतरिक मानक के रूप में चुना गया था। और कम से एक संकेत - BHT 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम में एक संकेत है, जो 6.97 δ पर एक सिंग्लेट के रूप में प्रकट होता है और दो बराबर खुशबूदार प्रोटॉन (OH समूह के संबंध में स्थिति पैरा) के अंतर्गत आता है हैδ 13 सी एनएमआर स्पेक्ट्रम जो खुशबूदार चतुर्धातुक कार्बन -OH समूह असर के अंतर्गत आता है में 151.45। इन संकेतों के दोनों मछली के तेल में घटकों में से किसी के साथ कोई ओवरलैप है, और इस प्रकार मात्रा उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह 1,2,4,5-tetrachloro-3-nitrobenzene (TCNB) या इथाइलीन क्लोराइड के रूप में अन्य यौगिकों भी, वैकल्पिक आंतरिक मानकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता लेकिन, वे लंबे समय तक टी 1 मूल्यों की विशेषता है।

तकनीक की सीमाएं

विभिन्न फैटी एसिड और मछली के तेल की खुराक में लिपिड के मात्रा निर्धारण -1 डी स्पेक्ट्रा में उचित निदान एनएमआर संकेतों के एकीकरण के माध्यम से हासिल की है। इस तरह के संकेत केवल एक विशिष्ट नमूना घटक से संबंधित होना चाहिए और अन्य यौगिकों से संकेत के साथ कोई हस्तक्षेप होना आवश्यक है। यह 1 एच एनएमआर विश्लेषण के लिए एक मुद्दा के बाद से 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम कम संकल्प की विशेषता है चे की कम दूरी के कारण हो सकताmical पाली। इसके अलावा, अदिश युग्मन की उपस्थिति (जे) multiplets पैदा करता है और विश्लेषण और अधिक जटिल बना देता है। उदाहरण के लिए, एथिल एस्टर (ईई) 1.25 δ पर मिथाइल समूह की विशेषता त्रिक (जे = 7.20 हर्ट्ज) द्वारा 1 एच एनएमआर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और 4.12 δ पर multiplet, जो एस्टर समूह के methylene प्रोटॉन के अंतर्गत आता है। हालांकि, जब Larmor में सक्रिय एनएमआर उपकरणों का उपयोग कर की तुलना में कम 850 MHz आवृत्तियों, 1 एच एनएमआर का उपयोग कर ई के विश्लेषण के शिखर का आंशिक अतिव्यापी की वजह से 4.12 δ चोटी के साथ TGS की 4.14 δ पर बचा जाना चाहिए, और के अतिव्यापी 1.23-1.35 δ पर एलिफैटिक methylene प्रोटॉन की व्यापक संकेत के साथ δ 1.25 पर संकेत। बड़े विचलन भी 1 एच और 13 सी कुछ नमूने में ईपीए के विश्लेषण के बीच देखा गया, 13 सी एनएमआर टी द्वारा प्रदान की लेबल रचना के करीब थावह निर्माता। यह शायद δ 1.69 पर संकेत के अतिव्यापी, जो ईपीए के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, अन्य यौगिकों कि मछली के तेल की आपूर्ति करता है के कुछ प्रकार में प्रदर्शित की संकेतों के साथ की वजह से है। quantifications में अतिरिक्त त्रुटियों आंतरिक मानक के अनिश्चित पवित्रता की वजह से और वजन में त्रुटियों से जब एक आंतरिक मानक का उपयोग कर पैदा कर सकते।

compositional विश्लेषण एक आंतरिक मानक के उपयोग के बिना रिश्तेदार दाढ़ सांद्रता में व्यक्त किया जा सकता है। परिणाम तेल (मिलीग्राम / छ) के प्रति ग्राम फैटी एसिड की मिलीग्राम के रूप में उदाहरण के लिए, पूर्ण सांद्रता में व्यक्त किया जा करने के लिए की जरूरत है, एक आंतरिक मानक के उपयोग की आवश्यकता है। हालांकि, ऐसे मामलों में जहां ब्याज की एनएमआर संकेत विभिन्न आणविक वजन के साथ कई यौगिकों के अंतर्गत आता है में, परिणाम के रूप में मिलीग्राम / छ भी जब एक आंतरिक मानक का उपयोग कर व्यक्त नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, आंतरिक मानक का इस्तेमाल आम तौर पर विश्लेषण की लंबाई बढ़ जाती है क्योंकि सबसे आम आंतरिक रों इस तरह के BHT रूप tandards,, उच्च आणविक समरूपता है, जो लंबे विश्राम के दिनों में परिणाम के साथ छोटे अणु होते हैं। पुनरावृत्ति समय के बाद से (दालों + अधिग्रहण समय के बीच देरी) नमूने में सबसे लंबे समय तक तनाव कम करने के समय टी 1 के अनुसार सेट कर दिया जाता, एक आंतरिक मानक के उपयोग के प्रयोगों की अवधि में वृद्धि के रूप में दालों के बीच लंबा अंतराल आवश्यक हैं जाएगा। यह कार्बन नाभिक के असाधारण लंबे टी 1 छूट समय की वजह से 13 सी एनएमआर विश्लेषण के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कारक है। इस तरह के सीआर (acac) के रूप में एक पैरामैग्नेटिक परिसर के अलावा 3 कुशलतापूर्वक टी 1 विश्राम के समय को कम कर सकते हैं। सीआर (acac) 3 की सिफारिश की एकाग्रता 0.75 मिलीग्राम समाधान के एमएल है /। सीआर (acac) 3 की उच्च सांद्रता टी 1 के आगे कम करने के लिए विचार किया जा सकता है, तथापि, सावधानी आदेश S / N में कम हो जाती है से बचने के लिए लाइन विस्तार की वजह से आवश्यक है।

ntent "> हालांकि 13 सी एनएमआर 1 एच की तुलना में एक बहुत अधिक वर्णक्रमीय संकल्प की विशेषता है, 13 सी एनएमआर प्रयोग की संवेदनशीलता कम प्राकृतिक बहुतायत (1.1%) और कम gyromagnetic अनुपात की वजह से काफी कम है (67.26 10 6 रेड रों -1 टी -1) 13 सी नाभिक के। इसके अलावा, 13 सी के लंबे टी 1 विश्राम बार, विश्लेषण की लंबाई बढ़ा सकते हैं। यह एक मुद्दा हो सकता है जब विश्लेषण के लिए उपलब्ध तेल सीमित है क्योंकि एक बढ़ा स्कैन की संख्या शोर अनुपात करने के लिए एक उचित संकेत प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

संवेदनशीलता और एनएमआर स्पेक्ट्रा के संकल्प में सीमाओं मछली के तेल में कई छोटे यौगिकों कि इस तरह के जी सी के रूप में अन्य तकनीकों के साथ विश्लेषण किया जा सकता का विश्लेषण को रोकने के। उदाहरण के लिए, 1 Η एनएमआर व्यक्ति स्टेरोल्स या फैटी एसिड होता है (उदाहरण के लिए पामिटिक और स्टीयरिक) जबकि 13 सी को अलग करने में असमर्थ हैपर यौगिकों कि मछली के तेल में बहुत कम एकाग्रता में दिखाई देते हैं इस तरह के dodecanoic और Myristic एसिड के रूप में है, जो सभी संतृप्त वसा अम्ल के संकेतों के साथ ओवरलैप निर्धारित करने के लिए 173.24 और δ 172.82 δ सक्षम नहीं है। हालांकि नमूना है कि विश्लेषण किया जाता है की मात्रा बढ़ती संभव कुछ मामूली यौगिकों के विश्लेषण करता है, सावधानी उनके वर्धित चिपचिपाहट की वजह से बहुत केंद्रित नमूने के लिए आवश्यक है,। बहुत चिपचिपा तेल के 150 से अधिक मिलीग्राम से युक्त समाधान से बचा जाना चाहिए S / N में कमी कम स्पिन स्पिन टी 2 विश्राम बार की वजह से लाइन विस्तार की वजह से है क्योंकि वहाँ। इसके अलावा, दालों के बीच लंबा अंतराल अब टी 1 की वजह से आवश्यक हैं और वहाँ shimming में है और इस तरह के प्रस्ताव में कई मुद्दे हैं।

सभी यौगिकों एनएमआर के साथ मछली के तेल में विश्लेषण किसी भी जुदाई या शुद्धि चरणों का उपयोग कर के बिना एक स्नैपशॉट में एक साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। एनएमआर एकalysis तेजी के रूप में 1 एच स्पेक्ट्रम कम से कम एक मिनट में दर्ज किया जा सकता है, जबकि 13 सी एनएमआर अधिग्रहण 10 मिनट तक रहता है है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, वहाँ कुछ कारक है कि डाटा अधिग्रहण समय को प्रभावित कर रहा है। विशेष रूप से, 13 सी एनएमआर के लिए, 10 मिनट रन टाइम केवल आंतरिक मानकों के उपयोग के बिना प्राप्त किया जा सकता है, और cryogenically ठंडा जांच, जिसमें आरएफ का तार और पूर्व-प्रवर्धक ठंडा कर रहे हैं और इस प्रकार थर्मल शोर कम से कम है के उपयोग के साथ। प्रयोगात्मक समय में एक 10-15 गुना वृद्धि 13 सी एनएमआर विश्लेषण के लिए उम्मीद की जानी चाहिए जब कमरे के तापमान (पारंपरिक) जांच किया जाता है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी मछली के तेल की खुराक की संरचना के गुणात्मक और मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण साबित हुई, और एक विशाल नु के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए लागू किया जाना है, क्योंकि इसके द्रुतगति की यह क्षमता है मछली के तेल के नमूने की mber। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी परिभाषा के द्वारा एक मात्रात्मक पद्धति के बाद से संकेत क्षेत्र सीधे नाभिक कि संकेत के कारण की संख्या के अनुपात में होती है। तीव्रता से जहरीले रसायनों एनएमआर नमूने तैयार करने की आवश्यकता कर रहे हैं, इस विधि पर्यावरण के अनुकूल है क्योंकि इस रसायन (जैसे CDCl 3) के इस तरह के थोड़ी मात्रा का उपयोग किया जाता के रूप में अन्य तरीकों कि विलायक की बड़ी मात्रा में नमूने elute करने की आवश्यकता के लिए विरोध किया है। इसके अलावा, एनएमआर अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं। मानकों के साथ कोई अंशांकन के लिए आवश्यक है पूर्व विश्लेषण, और किसी भी जुदाई और शुद्धि चरणों के बिना एक न्यूनतम नमूना तैयारी आम तौर पर अपनाया है, जो एनएमआर एक बहुत तेज विश्लेषणात्मक उपकरण बना देता है। साथ ही, 13 सी एनएमआर ग्लिसरॉल कंकाल पर विभिन्न फैटी एसिड की स्थितीय वितरण का निर्धारण करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध पद्धति है। एंजाइमी हाइड्रोलिसिस एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया गया है, वहीं हमेशा विश्वसनीय नहीं है= "xref"> 24। क्योंकि खाद्य पदार्थों में विभिन्न फैटी एसिड की regiospecificity का अध्ययन करने में एक महत्वपूर्ण हित है वहाँ, के रूप में यह पाया गया है कि यह मानव आहार 25, 26 में उनके कार्य को प्रभावित करता है इस विशिष्ट महत्व का है।

भविष्य अनुप्रयोगों

एनएमआर विश्लेषण और उत्पाद 'लेबल के बीच हुए समझौते के बावजूद, साथ ही इस तथ्य कुछ जीसी और एनएमआर के बीच समझौते दिखा पढ़ाई देखते हैं कि के रूप में, हमें विश्वास है कि और अधिक कठोर और व्यापक अंतर प्रयोगशाला अध्ययनों एनएमआर और पारंपरिक के बीच समझौते की जांच करने के लिए आवश्यक हैं नमूने, अलग मूल के मछली के तेल उत्पादों की एक बड़ी संख्या का उपयोग कर मछली के तेल घटकों के विश्लेषण के लिए तरीके, और मानक समाधान प्रमाणित।

मछली के तेल विश्लेषण में एनएमआर का एक अन्य महत्वपूर्ण भविष्य आवेदन ऑक्सीकरण उत्पादों के निर्धारण किया जाएगा। दृढ़ संकल्प के अलावामछली के तेल में प्रमुख यौगिकों की, इस तरह के एल्डीहाइड और पेरोक्साइड के रूप में मछली के तेल में कई प्राथमिक और माध्यमिक ऑक्सीकरण उत्पादों,, मौजूद हैं। 1 एच एनएमआर संभवतः, के रूप में 3 चित्र में दिखाया मछली के तेल की खुराक में ऑक्सीकरण स्थिति के मूल्यांकन के लिए लागू किया जा सकता है, विभिन्न ऑक्सीकरण परिस्थितियों में। इस विश्लेषण में सबसे बड़ी चुनौती एनएमआर काम और व्यक्तिगत ऑक्सीकरण उत्पादों की पहचान के लिए किया जाएगा। एनएमआर हार्डवेयर की संवेदनशीलता के क्षेत्र में अग्रिम भी व्यक्ति 13 सी एनएमआर का उपयोग कर स्टेरोल्स की पहचान की अनुमति देगा। एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी भी स्पिनिंग (एचआर-मास) एनएमआर उच्च रिज़ॉल्यूशन जादू कोण का उपयोग करके भी किसी भी निकासी के बिना एक पूरे के रूप मछली ऊतक के विश्लेषण के लिए आवेदन किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

सबसे महत्वपूर्ण चरण हैं, जो मात्रात्मक एनएमआर स्पेक्ट्रा की सटीकता को प्रभावित के दो एक 90 डिग्री नाड़ी के चयन और पु के बीच भी विलंब के इस्तेमाल को शामिलlses ≥ 5 × टी 1। नाड़ी कोण पल्स चौड़ाई जो एक कैलिब्रेटेड एनएमआर पैरामीटर है कि उपकरण और नमूना पर निर्भर करता है के लिए आनुपातिक है। एक 90 ° नाड़ी नमूदार अनुप्रस्थ (xy) चुंबकन के अनुदैर्ध्य (z) चुंबकन का पूर्ण रूपांतरण के लिए आवश्यक है। यह ध्यान रखें कि नाड़ी अंशांकन से पहले, एनएमआर जांच की जरूरत है अच्छी तरह से देखते हैं और मिलान किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह नमूना करने के लिए आरएफ सत्ता का हस्तांतरण को अनुकूलित करेंगे और इस प्रकार S / N को अधिकतम करने और प्रभावी decoupling करता है। जांच ट्यूनिंग ज्यादातर नमूने के ढांकता हुआ निरंतर से प्रभावित होता है, इसलिए यदि वहाँ नमूने के बीच एकाग्रता में मतभेद हैं, हर एक के लिए ट्यूनिंग प्रक्रिया दोहराएं। 1 डी 13 सी एनएमआर प्रयोग दोनों 13 सी और 1 एच चैनलों तो स्वत: ट्यूनिंग शामिल है और मिलान दोनों नाभिक के लिए आवश्यक है।

5 × टी 1 से अधिक समय दालों के बीच एक देरी पूरा आरईसी सुनिश्चित करता हैअपनी प्रारंभिक मूल्य के लिए शुद्ध चुंबकन की ओवरी। स्पेक्ट्रम के सारे अनुनादों पूरी तरह से प्रत्येक नाड़ी से पहले आराम से नहीं किया है, संकेत आंशिक रूप से दबा दिया जाता है और इस एकीकरण में अशुद्धियों की ओर जाता है। टी 1 मूल्य एक महत्वपूर्ण कारक प्रयोग की लंबाई को प्रभावित करता है और यह चुंबकीय क्षेत्र ताकत के साथ ही नमूने की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है। यह देखते हुए कि नमूने के बीच चिपचिपाहट इसी तरह की है, टी 1 विश्राम बार केवल विश्लेषण सत्र की शुरुआत में प्रत्येक साधन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

13 सी एनएमआर के साथ मछली के तेल विश्लेषण का एक अन्य महत्वपूर्ण विशेषता उचित पल्स अनुक्रम का चयन है। मात्रात्मक 13 सी के विश्लेषण के लिए सबसे विश्वसनीय विधि उलटा decoupling प्रयोग, जहां ब्रॉडबैंड प्रोटॉन decoupling अधिग्रहण की अवधि के दौरान केवल लागू किया जाता है और इस प्रकार 13 करने के लिए एच 1 से कोई ध्रुवीकरण बदलाव होता है गेटेड हैपरमाणु Overhauser प्रभाव (NOE) के माध्यम से सी। हालांकि, जबकि पूरी तरह से decoupled एनएमआर प्रयोग मात्रात्मक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, सावधानी जब इस प्रयोग का उपयोग कर, क्योंकि वहाँ विभिन्न multiplicities और मिथाइल, methylene, मीथेन और कार्बोनिल कार्बन के बीच इसलिए अभिन्न तुलना के साथ कार्बन के बीच अलग अलग NOE कारकों से परहेज किया जाना चाहिए की आवश्यकता है। इस के बावजूद, जब इसी तरह की बहुलता और रासायनिक वातावरण का केवल कार्बन विश्लेषण में माना जाता है, पूरी तरह से decoupled विधि विश्वसनीय है। इस का एक उदाहरण फैटी एसिड 27 decoupling के बाद NOE कारकों में कोई महत्वपूर्ण अंतर है पाए गए हैं, जिनमें से कार्बोनिल कार्बन है। इसके अलावा, कार्बन असर प्रोटॉन के लिए, पूरी तरह से decoupled प्रयोग उच्च संवेदनशीलता एनएमआर संकेत तीव्रता पर NOE योगदान की वजह से प्रदान करता है। दो पल्स दृश्यों के साथ प्राप्त स्पेक्ट्रा के बीच एक तुलना चित्रा एस 1 में दिखाया गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम के ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में स्वास्थ्य डिस्कवरी विषय के लिए खाद्य पदार्थ और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में खाद्य विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में एनएमआर सुविधा और पेन स्टेट यूनिवर्सिटी में एनएमआर सुविधा का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

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