Спектроскопия ЯМР как надежный инструмент для быстрой оценки липидного профиля рыбьего жира добавки

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь, с высокой разрешающей способностью 1 Н и 13 С ЯМР (ЯМР) был использован в качестве быстрого и надежного инструмента для количественного и качественного анализа инкапсулированных добавок рыбьего жира.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Williamson, K., Hatzakis, E. NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements. J. Vis. Exp. (123), e55547, doi:10.3791/55547 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Западная диета бедна п -3 жирных кислот, поэтому потребление рыбьего жира рекомендуется увеличить потребление этих необходимых питательных веществ. Целью данной работы является демонстрация качественного и количественного анализа инкапсулированных добавок рыбьего жира с использованием высокой разрешающей способностью 1 Н и 13 С ЯМР - спектроскопии с использованием двух различных ЯМР инструментов; 500 МГц и инструмент 850 МГц. Оба протона (1 Н) и углерода (13 С) ЯМР - спектры могут быть использованы для количественного определения основных составляющих добавок рыбьего жира. Количественное липидов в добавок рыбьего жира достигается за счет интеграции соответствующих сигналов ЯМР в соответствующей 1D спектров. Результаты , полученные с помощью 1 Н и 13 С ЯМР находятся в хорошем согласии друг с другом, несмотря на разницу в разрешающей способности и чувствительности между двумя ядрами и двумя инструментами. 1 Н - ЯМР предложениеса более быстрый анализ по сравнению с 13 С - ЯМР, так как спектр может быть записан менее чем за 1 мин, в отличие от 13 С - ЯМР анализа, который длится от 10 мин до одного часа. Спектр ЯМР 13 С, однако, намного более информативным. Это может обеспечить количественные данные для большего числа индивидуальных жирных кислот и может быть использовано для определения позиционного распределения жирных кислот на цепи глицерина. Оба ядра могут обеспечить количественную информацию только в одном эксперименте без необходимости очистки или разделения шагов. Напряженность магнитного поля главным образом влияет на спектры ЯМР 1 Н в связи с его низким разрешением по отношению к 13 С - ЯМР, однако, даже более низкой стоимости ЯМР инструменты могут быть эффективно применены в качестве стандартного метода в пищевой промышленности и лабораторий по контролю качества.

Introduction

Потребление п -3 жирных кислот в рационе, оказалось полезным против нескольких условий , таких как сердечные расстройства 1, 2, 3, 4 воспалительных заболеваний и диабета 5. Западная диета считается бедной в п -3 жирных кислот и , следовательно , потребление рыбьего жира рекомендуется для улучшения п -6 / п -3 баланс в питании 1 потребителя. Несмотря на недавнее увеличение потребления рыбы нефти дополнения, остаются вопросы о безопасности, достоверности и качестве некоторых из этих продуктов. Быстрый и точный анализ состава добавка рыбьего жира имеет важное значение для правильной оценки качества этих коммерческих продуктов и обеспечения безопасности потребителей.

Наиболее распространенные методики оценки рыбьего жира добавкиы является газовой хроматографией (АЯ) и инфракрасная спектроскопия (ИК). Хотя эти высокочувствительные методы, они страдают от ряда недостатков 6. ГЙ - анализ занимает много времени (4-8 ч) , так как разделение и дериватизация отдельных соединений требуются 7 и окисление липидов может происходить во время анализа 8, 9. В то время как ИК - спектроскопия может быть количественным, модель прогнозирования должны быть построены с использованием частичной регрессии по методу наименьших квадратов (ПЛСР), хотя есть исключения , в которых ИК - полосы могут быть отнесены к одному соединению 10. ПЛСР требует анализа большого числа образцов, что увеличивает время анализа 11. По этой причине, существует растущий интерес к разработке новых аналитических методик, которые позволяют точно и быстро анализ большого количества образцов рыбьего жира. Такие организации, как OFFIв.п. Диетические добавки (СОД) в Национальных Институтов Здоровья (NIH) и по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) сотрудничали с Ассоциацией химиков - аналитиков (AOAC) для разработки этих новых методов 12, 13.

Одним из наиболее перспективных аналитических методов скрининга и оценки матриц многокомпонентных, таких как пищевые добавки, ядерно - магнитного резонанса (ЯМР) 14, 15. ЯМР-спектроскопия имеет несколько преимуществ: это неразрушающий и количественный метод, он требует, чтобы минимальный без подготовки образца, и оно характеризуется превосходной точностью и воспроизводимостью. Кроме того, ЯМР-спектроскопия является экологически чистой методологией, поскольку она использует только небольшие количества растворителей. Основной недостаток ЯМР-спектроскопия является его относительно низкой чувствительностью по сравнению с другими analytiческие методы, однако, последние технологические достижения в области измерительных приборов, таких как более сильных магнитных полей, криогенных зондов различного диаметра, передовые обработки данных и универсальных импульсных последовательностей и методов повысили чувствительность до диапазона нМ. В то время как ЯМР инструментовка высокая стоимость, длительный срок службы ЯМР-спектрометров и множество применений ЯМР снизить стоимость анализа в долгосрочной перспективе. Этот подробный протокол видео призвано помочь новым практиков в области избежать ошибок , связанных с 1 Н и 13 С ЯМР - спектроскопического анализа рыбий жир добавок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка образцов ЯМР

Примечание: Внимание, пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Дейтерированный хлороформ (CDCl 3) используется в приготовлении образца является токсичным. Пожалуйста, используйте все необходимые правила безопасности при проведении пробоподготовки, включая использование вытяжного шкафа и средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, закрытые носок обуви).

  1. Получение 1 Н и 13 С образцов
    1. Извлечение 120 мкл (~ 110 мг) рыбий жир из диетического капсулы с помощью шприца и поместить его в стеклянную пробирку емкостью 4 мл. Запишите вес рыбий жир.
    2. растворения образца
      1. Растворите приблизительно 120 мкл рыбий жир в 500 мкл CDCl 3 , содержащего 0,01% тетраметилсилана (TMS) , который используется в качестве эталона для 1 Н и 13 С химических сдвигов.
        Примечание: TMS является использованиеd только для химической калибровки сдвига (см номеров шагов 2.2.1.2.7 и 2.2.2.2.7), а не для количественной оценки (см номеров этапов 2.2.1.3 и 2.2.2.3) цели.
      2. Приготовьте 2,6-ди - трет - бутил-4-метилфенол (ВНТ) исходный раствор, если количественное определение, выраженные в мг / г желательно, путем растворения приблизительно 220 мг ВНТ и 15 мг хрома (III) ацетилацетонат (Cr ( асас) 3) в 20 мл CDCl 3 , содержащих 0,01% TMS. Используйте 500 мкл исходного раствора для растворения 100 мг (± 10 мг) рыбий жир.
    3. После растворения масла (это занимает несколько секунд), передать весь раствор непосредственно в ЯМР высокого качества трубки 5 мм, и прикрепить крышку. Анализ образцов в течение 24 ч после приготовления образцов.

Препарат 2. ЯМР Инструмент

Примечание: Осторожно, нужно учитывать, что наличие сильных магнитных полей, создаваемых с помощью ЯМР инструментов могут повлиять на медицинские устройства и осущмуравьев , такие как кардиостимуляторы и хирургические протезы, а также электронные элементы , такие как кредитные карты, часы и т.д. Дополнительная осторожность требуется , когда анализ выполняются с использованием не-экранирующие магнитов. Два ЯМР инструменты были использованы для приобретения 1 Н и 13 С ЯМР - спектров; спектрометр работает на 850.23 МГц и 213.81 МГц для 1 Н и ядер 13 С, соответственно, оснащен тройной резонансного с гелиевым охлаждением обратным (TCI) 5 мм зондом и спектрометром , работающим на 500.20 МГц и 125.77 МГц для 1 Н и 13 С ядра, соответственно, снабжены широкой полосой, наблюдаемой (ВВО) азот охлаждение 5 мм зонда. Все эксперименты проводились при температуре 25 ± 0,1 ° С и спектров были обработаны с помощью стандартного ЯМР сбора данных анализа и программного обеспечения обработки пакета (см списка материалов).

  1. Подготовка к приобретению спектров ЯМР
    Примечание: 1 H и C - ЯМР - спектры 13может быть получено, следовательно, не снимая пробы из прибора.
    1. Вставьте трубку ЯМР в вращаемой турбины (см список материалов).
    2. Поместите счетчик и трубу в верхней части градуированного глубиномера и осторожно нажмите на верхнюю часть трубы, пока его нижняя часть не коснется нижней части датчика.
    3. Поместите образец ЯМР в открытом месте на SampleCase. Обратите внимание на номер слота образец помещается в.
    4. Для того, чтобы загрузить образец в ЯМР, вернитесь к компьютеру и управления типа «Sx #», где # слот в SampleCase держит ваш образец.
    5. Дождитесь дейтерий сигнала CDCl 3 появится на экране окна блокировки. Если он не появляется автоматически, типа «lockdisp». Как только сигнал дейтерия виден, типа «замок» в командной строке и выбрать «CDCl из списка растворителя для того , чтобы зафиксировать образец с использованием дейтерия резонанса CDCl 3.
      Примечание: дейтерий signal может не отображаться, если предыдущий пользователь использовал другой растворитель. Пользователь должен ждать показатель того, что проба вниз, а затем зафиксировать.
    6. Тип «bsmsdisp» в командной строке, чтобы обеспечить вращение не является активным. Если кнопка «SPIN» зеленый цвет, нажмите на него, чтобы отключить вращение.
    7. Введите команду «новую», чтобы создать новый набор данных. Введите имя для набора данных на вкладке «NAME», и номер эксперимента на вкладке «EXPNO». Используйте номер «1» на вкладке «PROCNO». На вкладке «Эксперимент», нажмите кнопку «Выбрать» и выберите «ПРОТОН» файл параметров. Написать название эксперимента на вкладке «TITLE». Нажмите кнопку "OK".
    8. Тип «getprosol» в командной строке, чтобы получить стандартные параметры для текущего ЯМР-зонда и растворителя.
    9. Повторите шаг 2.1.7 для 13 C, выбирая «C13IG» последовательность импульсов на вкладке «Эксперимент» для 1D 13 C обратной гованный развязан эксперимент.
    10. Тип «getprosol» в командной строке, чтобы получить стандартные параметры для текущего ЯМР-зонда и растворителя.
    11. Введите команду «атма», чтобы выполнить автоматическую настройку и согласование зонда для обоих углерода и протонов ядер.
    12. Выполните одномерный градиент шиммирования для достижения высокой однородное магнитное поле, и, таким образом, оптимальную форму линии для сигналов ЯМР.
      1. Используйте стандартную автоматическую процедуру для 1D шиммирования, просто путем последовательного выполнения команд «Цюй topshim 1dfast сс», «Цюй topshim tuneb сс» и «Цюй topshim отчет» в командной строке.
  2. оптимизация параметров
    1. Калибровка 90 ° импульса
      1. Создать новый набор данных для 1 H (см шаги 2.1.7 и 2.1.8).
      2. Введите команду «paropt» в командной строке, чтобы запустить программу автоматизации для калибровки Пули 90 °как таковые. Выбор длительности импульса, р1, в качестве параметра должен быть изменен.
      3. Начнем с «2» мкс, как начальное значение p1, введите «2» мкс с шагом и выполнять «16» эксперименты.
      4. Создание нового набора данных для 13 C (смотри стадию 2.1.9) и повторить процесс для ядер 13 С (см шаги 2.2.1.2 и 2.2.1.3).
    2. Т 1 измерение , измеренное методом нулевых 16 для 1 H
      Примечание: Нулевой метод использует последовательность импульсов восстановления инверсии, состоящий из 180 ° импульса следовать путем задержки (тау), чтобы позволить релаксации вдоль оси и конечного 90 ° импульса , который создает наблюдаемую поперечную намагниченность.
      1. Создать новый набор данных для 1 H (см шаги 2.1.7 и 2.1.8).
      2. Тип «pulprog t1ir1d», чтобы изменить последовательность импульсов на эксперимент инверсии-восстановления.
      3. Введите следующие команды на Commanд линии, чтобы настроить ширину спектра в минуту, центр РЧ передатчика, количество сканирований числа фиктивных сканирования и число точек данных «SW 8», «o1p 3,8», «NS 2», «DS 2" и "тд 64K".
      4. Тип «p1 (значение)» и введите значение длительности 90 ° импульса, как определенно с помощью калибровки импульсов (см шага 2.2.1) и типа «р2 (значение)» для импульса 180 ° (значение длительности для 180 ° длительность импульса 90 ° импульса умножается на два).
      5. Установка задержки рецикла на очень большое значение, например, 10 с, набрав «d1 10».
      6. Набор тау к короткому значению, например, 10 мс, с помощью команды «D7 10ms» в командной строке.
      7. Установить усиление приемника (RG) к соответствующему значению, используя команду «RGA» для автоматического расчета RG.
      8. Запуск спектра, введя команду «ZG».
      9. Выполнить Фурье-преобразование, набрав «EFP»в командной строке.
      10. Выполнить автоматическую коррекцию фазы, введя команду «APK» в командной строке. Если дополнительные корректировки фазы необходимы для дальнейшего улучшения спектра, нажмите на вкладку «Process», а затем нажмите на значок «Настройка фазы», ​​чтобы войти в режим коррекции фазы.
        1. Использование нулевого порядка (0) и иконки первого порядка (1) фазовая коррекция с помощью мыши, пока все сигналы не находятся в режиме отрицательного поглощения. Применить и сохранить значение коррекции фазы, нажав на кнопку «Return и Сохранить», чтобы выйти из режима коррекции фазы.
      11. Увеличение тау , пока все вершины не являются положительными или обнуляются, повторяя шаги 2.2.2.6-2.2.2.9. Для определения значения T 1, просто разделить значение тау , где пик обнуляется с ln2.
    3. Т 1 измерение , измеренное методом нулевых 16 для 13 C
      1. Создать новый набор данных для 13 C (см шаг 2.1.9)
      2. Тип «pulprog t1irpg», чтобы изменить последовательность импульсов на эксперимент инверсии-восстановления для ядер углерода.
      3. Введите следующие команды в командной строке, чтобы настроить спектральную ширину в м.д., центр РЧ передатчика, количество сканирований, количество фиктивных сканирования и число точек данных: «SW 200», «o1p 98» , "8" нс "DS 2" и "TD 64K".
      4. Тип «p1 (значение)» и введите значение длительности 90 ° импульса, как определенно с помощью калибровки импульсов (см шага 2.2.1) и типа «p2 (значение)» для импульса 180 ° (значение длительности является 90 ° длительность импульса умножается на два).
      5. Установка задержки рецикла на очень большое значение, например, 100 с, набрав «d1 100».
      6. Набор тау на короткое значение, например 100 мс, набрав «D7 100мс» в командной строке.
      7. Установите ПРИЕМусиления эр (RG) к соответствующему значению, используя команду «RGA» для автоматического расчета RG.
      8. Запуск спектра, введя команду «ZG».
      9. Выполнить Фурье-преобразование, набрав «EFP» в командной строке.
      10. Выполнить Автоматическую коррекцию фазы, введя команду «APK» в командной строке. Если дополнительные корректировки фазы необходимы для дальнейшего улучшения спектра, нажмите на иконку «Настройка фазы» и значках коррекции фазы для нулевого порядка (0) и первого порядка фазы (1) коррекции.
        1. В то время как нажимая на иконки коррекции нулевого порядка и фазы первого порядка, перетащить мышь, пока все сигналы не находятся в режиме отрицательного поглощения. Применить и сохранить значение коррекции фазы, нажав на кнопку «Return и Сохранить», чтобы выйти из режима коррекции фазы.
      11. Увеличение тау , пока все вершины не являются положительными или обнуляются, повторяя шаги 2.2.3.6-2.2.3.9. Для того, чтобы определить,значение Т 1, просто разделить значение тау , где пик обнуляется с ln2.
  3. Одномерный (1D) Спектры ЯМР
    1. Спектры 1 H-ЯМР
      1. Приобретение данных ЯМР
        1. Перейти к набору данных 1 H , созданный на шаге 2.1.7 и использовать стандартную «импульсно-захватит» последовательность импульсов, «ZG», набрав «pulprog ZG» в командной строке.
        2. Введите следующие команды в командной строке, чтобы настроить ширину спектра в минуте, центр РЧ передатчика, количество сканирование, количество фиктивных сканирования, число точек данных и длительность импульса для угла 90 ° импульса : "SW 8", "o1p 3,8", "нс 2", "DS 2", "TD 64K" и "P1 (как было определено путем калибровки импульса)" (смотри стадию 2.2.1).
          Примечание: 32K точки данных могут быть использованы для инструмента 500 МГц.
        3. Установить задержку релаксации 7 с для инструмента с частотой 500 МГц или 9 с для инструмента 850 МГц, набрав «d1 7s» или «d1» 9s, соответственно, в командной строке.
        4. Установить усиление приемника (RG) к соответствующему значению, используя команду «RGA» для автоматического расчета RG.
        5. Тип «digmod baseopt», чтобы получить спектр с улучшенной базовой линией.
        6. Начало приобретения, введя команду «ZG» импульсно-овладевают в командной строке.
      2. Обработка данных ЯМР
        1. Тип «си 64К» в командной строке, чтобы применить нулевую начинку и установить размер реального спектра 64К.
        2. Установите параметр уширения линии 0,3 Гц, набрав «фунт 0,3» в командной строке, чтобы применить функцию взвешивания (экспоненциальное затухание) с линией расширения коэффициента 0,3 Гц до преобразования Фурье.
        3. Выполнить Фурье-преобразование, набрав «EFP» в команделиния.
        4. Выполнить Автоматическую коррекцию фазы, введя команду «APK» в командной строке. Если дополнительные корректировки фаз необходимы для дальнейшего улучшения спектра, нажмите на вкладке «Process», а затем нажмите на значке «Регулировка фазы» и значках коррекции фазы для нулевого порядка (0) и первый порядок (1) фазовой коррекции ,
          1. В то время как нажимая на иконки коррекции нулевого порядка и фазы первого порядка, перетащить мышь, пока все сигналы не находятся в режиме положительного поглощения. Применить и сохранить значение коррекции фазы, нажав на кнопку «Return и Сохранить», чтобы выйти из режима коррекции фазы.
        5. Нанести полиномиальную функцию четвертого порядка для коррекции базовой линии при интегрировании, введя команду «абс N».
          Примечание: Это обеспечивает плоскую спектральную базовую линию с минимальной интенсивностью.
        6. Отчет химические сдвиги в м.д. от ТМС = 0). Нажмите на калибровку ( "Calib. Axэто "значок), и поместить курсор с красной линией на верхней части сигнала ЯМР (ТМС пика ближе к 0). Левый щелчок и введите„0“.
      3. Анализ данных ЯМР
        1. Интеграция спектральной области от δ 1,1 до & delta ; 0,6, а также пики при & delta ; 4,98, δ 5,05 и & delta ; 5,81 , используя пиктограмму «интегрировать» (на вкладке «Process») и выделение ( «Определить новый регион») значок. Щелкните левой кнопкой мыши и перетащить через интегралы.
          Примечание: Если необходимо сосредоточить внимание на область, нажмите на значок выделения, чтобы отключить и щелкните левой кнопкой мыши и перетащите мышь, чтобы увеличить масштаб региона. Для регулировки интенсивности порога, используйте среднюю кнопку мыши, если это необходимо. Нажмите на значок выделения еще раз, чтобы сделать функцию интеграции активной, а затем перейти к следующему пику.
          1. Нормализация сумму выше интегралов до 100, щелкнув правой кнопкой мыши по интегральному значению, которые появляютсяs под сигнал и выберите «Нормализовать сумму интегралов». Введите значение «100» в поле и нажмите кнопку «Return и Сохранить», чтобы выйти из режима интеграции.
        2. При использовании BHT в качестве внутреннего стандарта, интегрировать пик при б 6,98 и установить интеграл равны миллимоли ВНТА в 0,5 мл исходного раствора.
        3. Интегрирование пиков, представляющих интерес (см шаг 2.3.1.3.1), проходящие 10 Гц с каждой стороны пика, когда это возможно.
        4. Продолжайте выполнять 13 С-ЯМР сбора и обработки спектров аналогичным образом.
    2. Спектры 13 С-ЯМР
      1. Приобретение данных ЯМР
        1. Перейти к набору данных 13 C и использовать обратную развязкой закрытого типа импульсной последовательности, «zgig», набрав «pulprog zgig» в командной строке.
          Примечание: Для запуска углерода эксперимента со стандартной широкополосной decouПСД последовательность импульсов, тип «pulprog zgpg» в командной строке.
        2. Введите следующие команды в командной строке, чтобы настроить ширину спектра в минуте, центр РЧ передатчика, количество сканирование, количество фиктивных сканирования, число точек данных и длительность импульса для угла 90 ° импульса : "SW 200", "o1p 95", "16 нс" "DS 2", "TD 64K" и "P1 (как было определено путем калибровки импульса)" (смотри стадию 2.2.1.4).
        3. Установить задержку релаксации 35 с для инструмента с частотой 500 МГц или 45 с для инструмента 850 МГц, набрав «d1 35s» или «d1» 45s, соответственно, в командной строке. При использовании BHT, задержка релаксации должна быть 50 с в приборе 500 МГц и 60 сек в приборе 850 МГц.
        4. Установить усиление приемника (RG) к соответствующему значению, используя команду «RGA» для автоматического расчета RG.
        5. Тип «digmod baseopt» в командной строке, чтобы получить спектр шIth улучшение базовой линии.
        6. Начало приобретения, введя команду «ZG» импульсно-овладевают в командной строке.
      2. Обработка данных ЯМР
        1. Тип «си 64К» в командной строке, чтобы применить нулевую начинку и установить размер реального спектра 64К.
        2. Установите параметр уширения линии до 1,0 Гц, набрав «фунт 1.0» в командной строке, чтобы применить функцию взвешивания (экспоненциальное затухание) с линией расширения коэффициента 1,0 Гц до преобразования Фурье.
        3. Выполнить Фурье-преобразование, набрав «EFP» в командной строке.
        4. Выполнить Автоматическую коррекцию фазы, введя команду «APK» в командной строке. Если дополнительные корректировки фазы необходимы для дальнейшего улучшения спектра, нажмите на вкладке «Process», а затем нажмите на значок «Регулировка фазы» и значков коррекции фазы для нулевого порядка (0) и первого порядка фазы (1) коррекции ,
            Примечание: Для получения спектров углерода, записанные на частоте ларморовских 214 МГц (850 МГц прибора) коррекция зависимых отклонений частоты (первый порядок) может быть сложными и требует много времени для менее опытных пользователей из-за большие внедорожным резонанс эффектов 90 ° импульса.
        5. Нанести полиномиальную функцию четвертого порядка для коррекции базовой линии при интегрировании, введя команду «абс п» в командной строке.
        6. Отчет химические сдвиги в м.д. от ТМС = 0). Нажмите на калибровку ( «Calib. Ось») значок и поместите курсор на красную линию на верхней части сигнала ЯМР будет ссылка. Щелкните левой кнопкой мыши и введите «0».
      3. Анализ данных ЯМР
        1. Интеграция спектральной области от 175 до δ & delta ; 171 , используя пиктограмму «Включить» (на вкладке «Process») и выделение ( «Определить новый регион») значок. Щелкните левой кнопкой мыши и перетащить через интегралы.
          Примечание: Если необходимо сосредоточить внимание на область, нажмите на значок выделения, чтобы отключить и щелкните левой кнопкой мыши и перетащите мышь, чтобы увеличить масштаб региона. Нажмите на значок выделения еще раз, чтобы сделать функцию интеграции активной, а затем перейти к следующему пику.
          1. Установите интеграл 100, делая правой кнопкой мыши на интегральное значение, которое появляется при сигнале и выберите «Калибровка тока Integral». Введите значение «100» в поле и нажмите кнопку «Return и сохранить» для выхода из режима интеграции.
        2. При использовании BHT в качестве внутреннего стандарта, интегрировать пик при б 151.45 и установить интеграл равенв миллимоле ВНТА в 0,5 мл исходного раствора.
        3. Интегрирование пиков, представляющих интерес, простирающейся от 5 Гц каждой стороне пика (см шаг 2.3.2.3.1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

1 Н и 13 С ЯМР - спектры были собраны для коммерчески доступных добавок рыбьего жира с использованием двух инструментов ЯМР; 850 МГц и спектрометр 500 МГц. Эти спектры могут быть использованы для количественного определения компонентов рыбьего жира, такие как докозагексаеновая кислота (DHA) и эйкозапентаеновая кислота (EPA), а также другие соединения , таких как п -1 ацильных цепи и питателен важный показатель , таких как п -6 / п -3 соотношение. Количественное определение может быть выполнено, даже без использования внутреннего стандарта, однако, количественные результаты должны быть выражены в относительных мольных процентах. Когда должны быть выражены в абсолютных значениях (мг / г) данные, требуется внутренний стандарт. Результаты , полученные с помощью ЯМР высокой воспроизводимостью при относительных стандартных отклонений (RSD) в пределах от 0,3% до 2% для анализа 13 С ЯМР и от 0,5% до 2,5% для анализа 1 Н - ЯМР, в зависимости от т он липида. Немного выше РСД в течение 1 H ЯМР часто наблюдается , поскольку спектры протонов , как правило, переполнены, что влияет на точность анализа, особенно для резонансов , которые имеют более низкий соотношение сигнал - шум (S / N). Очень хорошее согласие было обнаружено между 850 МГц и инструмента 500 МГц с РВД в пределах от 1% до 4%. Наблюдалась относительно высокой RSDS (до 8%) при сравнении результатов , полученных с помощью 1 Н и 13 С, особенно для соединений , которые появляются в более низких концентрациях , такие как N - 1 ацильных цепи. ЯМР-спектроскопия была подтверждена ранее в качестве инструмента для анализа липидов, в том числе определения некоторых компонентов рыбьего жира. Результаты показали , что он находится в хорошем согласии с традиционными методами, такими как GC 17, 18.

Анализ 1H - ЯМР

«Xfig»> На рисунке 1 сравниваются спектры 1 Н - ЯМР на приобретенную (а) 850 МГц и (В) 500 МГц прибора а. Спектр 850 МГц характеризуется более высоким разрешением, однако основные компоненты , включая рыбий жир DHA, EPA, и п -6 / п -3 соотношение также может быть определена из спектра на 500 МГц. 1 H-ЯМР сигналы , рыбий жир жирных кислот , которые могут быть использованы для целей количественного анализа представлены в таблице 1, в то время как полное назначение ЯМР спектра 1H - ЯМР рыбий жир может быть найден в другом месте 19.

1 Н - ЯМР дает надежные данные для количественного определения общего количества п -3, -6 п, ДГК, транс - жирных кислот, п - 1 ацильные цепи, и насыщенные жирные кислоты (SFA). Для анализа 1 Н - ЯМР, использование соответствующих отношений требуется потому , что в большинстве случаев сignals принадлежат к группам протонов, которые являются общими для различных жирных кислот и липидов. По этой причине в большинстве случаев концентрация жирных кислот в рыбьем жире может быть определена только с помощью комбинации различных 1H ЯМР сигналов, включенных в соответствующие отношения. Кроме того, эти уравнения содержат арифметические коэффициенты, которые нормализуют различное число протонов, ассоциированных с каждой группой. Когда внутренний стандарт используется следующее уравнение следует учитывать следующее : С = I / IS & times ; N IS / N × A × МВт / м (1), где С обозначает концентрацию аналита в мг / г рыбьего жира, Я быть_наст интеграл от резонанса , который однозначно отнести к липиду интереса, я IS является областью сигнала протона , который принадлежит однозначно к внутреннему стандарту, N есть число протонов функциональной группы , которая анализируется,П есть число протонов внутреннего стандарта, которые используются для анализа, А являются миллимолями внутреннего стандарта, МВт представляет собой молекулярная масса жирной кислоты (в метиловых эфирах), и М представляет собой количество рыбьего жира выраженный в граммах.

Пример 1, DHA: Доля DHA определяется уравнением С DHA = ¾ я ДГВ / S, где ДГК является интегралом сигнала при δ 2.39 , который принадлежит Н а и H & beta протонов DHA, и S это сумма интегралов метильных протонов SFA, п -6, -9 п, п -3, транс - жирных кислот плюс интегралы от пиков п -1 ацильных цепей при & delta ; 4,98, & delta ; 5,05 и 5,81 & delta ; . Интеграл I ДГ Normalized путем умножения на 3/4 , поскольку она соответствует четырем протонов, в то время как интеграл S соответствует трем протонов. 1 Н - ЯМР не способен давать информацию о позиционном распределении жирных кислот на глицериновой основной цепи и , следовательно , может быть использован только для количественного определения общего количества жирных кислот. 1 Н ЯМР - анализ инкапсулированного масла дополнения рыбы , показали , что он состоит из 10,5% DHA. Было обнаружено, что концентрация DHA в том же образце с использованием BHT, чтобы быть 105,23 мг / г. Эти значения очень близки к значениям , полученным с 13 С - ЯМР (смотри пример 2 для анализа 13 С).

Пример 2, п -1 ацильных цепей: Концентрация п -1 ацильных цепей задается соотношением C п-1 = 3 I N-1 / S, где N-1 представляет собой интеграл сигнала при δ 5.818. Этасигнал соответствует одного протона и, следовательно, должен быть нормализованы путем умножения на три. При использовании BHT, п -1 ацильных цепей определяются уравнением C N-1 = 2 I п-1 / I ВНТ. Результаты не могут быть выражены в мг / г , потому что МВт п -1 ацильных цепей неизвестно.

Пример 3, п -6 / п -3 соотношения: Этот важный показатель можно рассчитать из соотношения нормированных интенсивностей резонанса при δ 2,77, что соответствует бис-аллиловому протонову п -6 ацильных цепей (два протона) над триплет при δ 0,97 , что принадлежит к п -3 жирных кислот и соответствует трем протонов. Отношения С п-6 / С-п 3 = 3/2 I А / I B, где А и В являются я интегралы сигналовпри δ 2,77 и 0,97 & delta ; соответственно. п -6 жирные кислоты определяются из соотношения C N-6 = 3 / 2I п-6 / S, где п-6 является интегралом бис-аллильные протонов при δ 2.77.

Пример 4, транс - жирные кислоты: Транс - жирные кислоты можно рассчитать из уравнения С трансом = I транс / S, где транс представляет собой интеграл от сигнала на δ 0,91. Настоящий образец содержал 3,07% транс - жирных кислот, как определено с помощью 1 Н ЯМР с использованием прибора на 850 МГц. Был найден же образец анализировали в приборе 500 МГц, содержит 3,03% транс - жирных кислот.

Пример 5, насыщенные жирные кислоты (SFA): Концентрация SFA может быть Расчитатьованные из уравнения С SFA = S - C п-3 - С п-6 - С п-9 - С п-1 - С транс. п -9 жирных кислот (главным образом олеиновой кислоты) может быть количественно определено в соответствии с уравнением C п-9 = (3/4 Q - 3/2 I N-6) / S, где Q является интегралом аллильных протонов п -6 и -9 п при δ 2.01. было обнаружено количество SFA в коммерчески доступном образце рыбьего жира, чтобы быть 36.1%. Было обнаружено , что тот же образец анализировали с помощью 13 С - ЯМР, содержит 33,8% SFA. SFA представляют собой группу различных FA (например , стеариновой и пальмитиновой) с различными МВт и , следовательно , их концентрацию , если рыбий жир не могут быть выражены в мг / г.

Пример 6, всего стерины: Сумма общих стеринов (свободная и этерифицированная) может быть определена с помощью сигаNAL метильных протонов при угле 18 , который возникает при δ 0,68, используя уравнение C = I / S Ste. было обнаружено молярное отношение общего количества стеринов в коммерчески доступном образце рыбьего жира, чтобы быть 0,32%. ВНТ также может быть использован для определения абсолютной концентрации стеринов. Основные стеролы в рыбьем жире являются холестерин и витамин D (или его предшественник 7-дегидрохолестерина) и часто добавляют в добавке. Эти соединения имеют очень похожие МВт. Таким образом, результаты могут быть выражены в мг / г и вычисляют в соответствии с уравнением C = 2/3 я СТЭ / I IS A × МВт СТЭ / м, где МВт СТЭ представляет собой молекулярную массу (386) холестерина, который представляет собой большинство sterolic фракции в рыбьем жире 20. Количество стеринов в том же образце с использованием ВНТ составило 3,8 мг / г рыбьего жира. Индивидуальное определение холестерина (δ 0,678) осуществим на приборе 850 МГц после применения функции окна для повышения разрешения.

Анализ 13С ЯМР

Рисунок 2 иллюстрирует спектры 13 С ЯМР на приобретенные (а) 850 МГц и (В) 500 МГц приборы в области углерода карбонильной а. Два спектры очень похожи и могут обеспечить такое же количество информации. Спектр ЯМР 13 С успехом может быть использован для анализа дополнительных жирных кислот , такие , как стеаридоновые (SDA) и эйкозатетраеновые (ETA) кислоты, однако больше сканирование требуются для образцов , в которых эти кислоты находятся в более низких концентрациях. Спектры 13 С характеризуются высоким разрешением из-за большой ширины спектра и применения широкополосной развязки, котораяустраняет эффект скалярной связи и производит синглеты. По этой причине, существует ограниченное перекрытие даже при использовании инструмента на 500 МГц.

Спектр ЯМР 13 С гораздо более информативным по сравнению с H - ЯМР - спектр 1 и может обеспечить более полные количественные данные , потому что меньше перекрывание сигнал наблюдается (фиг.1 и 2). Наиболее полезная спектральная область спектра 13 C является областью углерода карбонила , поскольку она обеспечивает количественную информацию для большого количества жирных кислот, а также для их распределения по позиционному глицериновому скелету 19, 21, 22. Площадь метильной группы от δ 14,5 до 13,5 & delta ; может быть использована для быстрого определения общего количества п -3, -6 п, п -9 и насыщенной жирногокислоты (SFA), а также транс - жирные кислоты. Тем не менее, в 500 МГц ЯМР - спектрометре, происходит частичное перекрытие п -6 и -9 п насыщенные жирные кислоты (SFA). Применение оконной функции для повышения разрешения может решить эту проблему, хотя прибор 850 МГц по-прежнему считается более надежным вариантом. Олефиновый область спектра углерода может быть использован для общего количества п -3 и п -1 ацильные цепи, а также для определения индивидуальных жирных кислот , таких как DHA, EPA, арахидоновая кислота (АА), линоленовую (Ln) п -3 и олеиновая кислота (ПР) (смотрите таблицу 2). 13 С ЯМР может быть также применен для характеристики рыбий жир из других источников, таких как добавки , богатых этиловых эфиров (EE) с использованием углеродных сигналов при δ 14,31 (метил) и & delta ; 60,20 (метилен).

Для анализа углерода, жирные кислоты могут быть determINed путем деления интеграл соответствующих алифатических, олефиновых и карбонильных сигналов с общим интегралом от всех ацильных цепей, в соответствии с общим уравнением C = I / S (2), где С обозначает концентрацию аналита в молях (% ), я являюсь интегралом от резонанса , который однозначно отнести к липиду интереса, а S представляет общий интеграл сигнала (ов) , который представляет общее содержание липидов в образце. Полный интеграл S ацильных цепей может быть определена путем интегрирования области от 175 до δ & delta 171 и устанавливается в 100.

Количественное жирных кислот в мг / г рыбьего жира осуществляется с использованием внутреннего стандарта на основе следующего соотношения: С = I / IS × A × МВт / м (3), где С обозначает концентрацию аналита в мг / грыбий жир, я это интеграл от резонанса , который однозначно отнести к липиду интереса, я IS являюсь область сигнала углерода , который принадлежит исключительно к внутреннему стандарту, А является миллимолямом внутреннего стандарта, MW представляет собой молекулярный масса соединения , представляющего интерес (для жирных кислот , выраженных в метиловых эфиров), и м представляет собой количество рыбьего жира в г. 13 C-ЯМР сигналы , рыбий жир жирных кислот , которые могут быть использованы для целей количественного анализа представлены в таблице 2, в то время как полное назначение ЯМР С - ЯМР спектра 13 может быть найден в другом месте 19.

Пример 1, ЕРА в зп -2 позиции: Количество (%) ЭПК на позиции зп -2 рассчитывается путем деления интеграла сигнала при δ 172.56 с помощью S. Количество EPA в положении зп -2 в сотрудничествеmmercially доступен образец было установлено, что на 3,4% с помощью инструмента 850 МГц. Используя тот же спектрометр и BHT в качестве внутреннего стандарта, количество EPA в положении SN -2 , выраженные в мг / г рыбьего жира 29,73 мг / г. Был найден же образец анализировали в приборе 500 МГц, содержит 3,6% или 31,39 мг / г ЭПК в зп -2 положении. Аналогичные результаты могут быть получены при расчете относительных молекулярных соотношений EPA при зпе -2 с использованием полностью развязкой спектра. Это происходит потому, что карбонил углерода EPA зависит от протона расцепления к тому же ничтожной степени, что и другие карбонильные углероды, которые используются в качестве ссылки. Однако большие отклонения наблюдаются при использовании BHT, потому что углерод ВНТА при δ 151.45, который используется для количественной оценки, получить различное NOE усиления по сравнению с карбонильными атомами углерода жирных кислот. По этой причине полностью развязан спектру следует избегать при использовании внутренних стандартов или интеграции Carbons с различной кратностью.

Пример 2, общее количество DHA: Общее количество (%) ДГК просто рассчитывается путем добавления количества DHA в Sn -1,3 и -2 зп положении , как определено ЯМР - сигналов при δ 172.48 и 172.08 б, соответственно. Же образец анализировали с помощью 1 H - ЯМР (смотри пример 1 из 1 H анализа) было установлено, содержат 10,3% DHA , в соответствии с 13 С - ЯМР анализа. Количество DHA может быть также выражена в мг / г с использованием внутреннего стандарта и уравнение 3. общее количество DHA было 103,25 мг / г.

Пример 3, общий объем SDA: Общее количество (%) от SDA определяется путем сложения интегралов сигналов при δ 172.99 и δ 172,60 , которые принадлежат к карбонильные углероды SDA на позиции зп -1,3 изп -2, соответственно, с последующим делением суммы на S. был найден образец анализировали, чтобы содержать 3,93% SDA или 34,54 мг / г.

Пример 4, п -3 Ln: п -3 Ln (%) может быть определен путем деления интеграла сигнала при б 131.85 с интегралом S. Мольное отношение п -3 Ln в анализируемом образце рыбьего жира составило 0,7%. Абсолютная концентрация ВНТ использованием рассчитывали как 5,5 мг / г.

Пример 5, транс - жирных кислот: Мольное соотношение транс - жирных кислот определяется путем деления интеграла сигнала при δ 13.80 с S. Анализ одного и того же образца , который анализировали с помощью 1 Н ЯМР и было установлено, что 3,07% транс - ФА, также анализировали с помощью 13 С ЯМР и его содержание транс - жирных кислот , было установлено, что 3,42%. Tон 13 С - ЯМР - анализ одного и того же образца на приборе 500 МГц показал содержание 3,64% транс - жирных кислот. Количество транс - ФА в ммоль / г рыбьего жира может быть определена с использованием BHT в качестве внутреннего стандарта и уравнением C = I / IS × А / м, однако результаты не могут быть выражены в мг / г , потому что пик при δ 13,80 соответствует различным транс - жирных кислот, в основном транс DHA и EPA транс, с различными МВт.

Пример 6, Е.Е.: Концентрации ЭО в образце рыбьего жира рассчитывается путем деления интеграла от спектральной области от δ 60.50 до 60.00 & delta ; , что соответствует метиленовым углеродам в EE различных жирных кислот, с S. Анализ образца И Фиш жира показал, что он состоял из 100% EE. Следует отметить, что в образцах ЭЭ, EPA чп рассчитывается либо пика карбонила при δ 173.60 , или углеродом метилен EE при δ 60,20, тогда как DHA , может быть вычислена с использованием сигнала при δ 60,31 и / или сигнала при δ 173.09.

Полный перечень диагностических сигналов , которые могут быть использованы для целей количественного определения с 13 С и ЯМРОМ - анализом 1 H может быть найден в таблицах 1 и 2, соответственно, в то время как подробное описание уравнений , которые могут быть использованы для этого анализа можно найти в других местах 19.

ЯМР может быть дополнительно применен для оценки состояния окисления рыбьего жира. Рисунок 3 сравнивает 1 Н ЯМР спектры образца рыбьего жира при двух условиях окисления; воздействие нагрева и воздействия ультрафиолетового (УФ)легкий. Липидное окисление представляет собой сложный процесс, и состав продуктов окисления зависит от условий окисления. Основными продуктами окисления являются гидроперекиси (б), 8.0-8.8 сопряженных диенов гидропероксиды 5.4-6.7), и альдегиды 9.0- 10).

Рисунок 1
Рисунок 1. Анализ 1 Н - ЯМР. 850,23 (А) и 500,20 МГц (В) 1 Н-ЯМР - спектр добавки рыбьего жира в растворе 3 CDCl. Сигналы ЯМР ЭПК и ДГК, которые могут быть использованы для их определения приведены. Пик при & delta ; 0,97 может быть использован для определения общего количества п -3 жирных кислот. Конверт при б 1.39-1.20 обрезан, так как он принадлежит к метиленовым протонам все жирной цепис и не может быть использована для каких-либо идентификации или количественной оценки целей. Спектр 1 H - ЯМР характеризуется более узкой спектральной шириной (SW) по сравнению с С - ЯМР - спектр 13 и , таким образом , более низким спектральным разрешением. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Анализ 13 С ЯМР. 213,81 (А) и 125,77 МГц (В) 13 С-ЯМР - спектр добавки рыбьего жира в CDCl 3 раствора в области карбонила углерода. Сигналы ЯМР ЭПК и ДГК по зп -1,3 и зп -2 позиции показаны. Эти сигналы могут быть использованы для количественного определения ЭПК и ДГК. Хотя спCtra записан на 213.81 МГц характеризуется более высоким разрешением и чувствительностью, спектры 125,77 МГц могут также использоваться для определения основных соединений. Применение расцепления в С - ЯМР эксперимента 13 устраняет эффект скалярной связи между ядрами углерода и водорода и , таким образом , сигналы появляются как синглеты делает анализ проще по сравнению со спектром 1 Н - ЯМР. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Рыбий жир окисления. 1 Н - ЯМР - спектр окисленного рыбьего жира зависит от условий окисления. Резонансы , приписываемые гидропероксидов 8.0-8.8), Conjugated диенов гидропероксиды 5.4-6.7), и альдегиды показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

δ м.д. Протон Соединение
0,677 СН 3 (18) холестерин
0,678 СН 3 (18) 7-дегидрохолестерин
0,88 СН 2 СН 3 (т), J ω1, ω2 = 7,27 Гц п -9, SFA ацильных цепей
0,883 СН 2 СН 3 (т), J ω1, ω2 = 7,08 Гц п -6 ацильных цепей
0,911 СН 2 СН 3 (т), J ω; 1, ω2 = 7,65 Гц Транс - ацильных цепей
0,973 СН 2 СН 3 (т), J ω1, ω2 = 7,63 Гц п -3 ацильных цепей
1,25 СН 2 СН 3 (т), J = 7,20 Гц сложные эфиры этилового
1,697 OCOCH2CH 2 (т), J H α, Н & beta ; = Гц ЕРА ацильна цепь
2,391 ОСОСН 2 СН 2 (т) ДГК ацильна цепь
2,772 СН = СНСН 2 СН = СН п -6 ацильных цепей
2,81 СН = СНСН 2 СН = СН п -3 ацильных цепей
3,593 3'a-CH 2 OCO Глицерин 1-MAG
3,722 3'a, 3217, б-СН 2 OCO (ш) Глицерин 1,2-DAG
4,073 2'-СНОН (ш) Глицерин 1,3-DAG
4,121 СН 2 СН 3 мультиплет сложные эфиры этилового
4,173 1'b, 3'b-CH 2 OCO (дд) Глицерин 1,3-DAG
4,238 1'a-CH 2 OCO (дд) Глицерин 1,2-DAG
4,329 1'b-CH 2 OCO (дд) Глицерин 1,2-DAG
4,989 -CH = CH 2 цис (дд) N - 1 ацильных цепей
5,052 -СН = СН 2 транс (дд) N - 1 ацильных цепей
5,082 2'-CHOCO Глицерин 1,2-DAG
5,268 2'; -CHOCO Глицерин от TAG
5,436 СН = СНСН 2 СН = СН 2 N - 1 ацильных цепей
5,818 -СН = СН 2 N - 1 ацильных цепей

Таблица 1: Назначение спектра 1 Н - ЯМР. 1 представлены Н-ЯМР химических сдвигов сигналов рыбьего жира жирных кислот , которые могут быть использованы для целей количественного определения в растворе 3 CDCl. Химические сдвиги измерены в м.д. и предоставлять информацию о химическом окружении ядер.

δ м.д. углерод
173,24 C1 - SFA (SN -1,3)
172,21 С1 ПР, LO (SN -1,3)
С1 ЕТА (SN -1,3)
173,13 С1 Д (SN -1,3)
173,03 C1 - СД (SN -1,3)
172,97 C1 - ЭПК (SN -1,3)
172,73 С1 ЕТА (SN -2)
172,69 С1 Д (Sn - 2)
172,61 C1 - СД (SN -2)
172,56 C1 - ЭПК (Sn - 2)
172,48 C1 - DHA (SN -1,3)
172,08 С1 ДГК (Sn - 2)
136,8 Cω1, п -1
131,85 Cω3 Л.Н.
130,37 C15 А.А.
130,11 C9 Л.Н.
130,06 C13 LO
129,54 С5 ДГК зп -2
129,47 C5 DHA зп -1,3
128,94 C5 EPA
128,76 C6 EPA
128,45 С17 п -3
127,71 п -3
127,53 C4 - Д зп -2
127,5 C4 DHA зп -1,3
126,86 Cω4, все п -3
114,71 Cω2, п -1
60,08 Сложные эфиры ДГК, этиловый эфир
59,96 ЕРА, этиловый эфиры
59.95-59.85 Другие сложные эфиры FA, этиловый эфир
33,48 С2 ЕРА зп -2
33,32 C2 EPA SN -1,3
31,44 С3 п -1
27,05 Аллильный п -6
26,49 C4 EPA зп -1,3
26,47 С4 ЕРА зп -2
24,6 C3 EPA
24,48 С3 СДА зп -1,3
24,44 С3 СДА зп -2
14,27 Cω1, все п -3
14,13 Cω1, SFA
14,11 Cω1, OL
14,07 Cω1, LO
13,8 Cω1, транс Ф.А.

Таблица 2: Присвоение спектра 13 С ЯМР. В 13 С-ЯМР химические сдвиги сигналов рыбий жир жирных кислот , которые могут быть использованы для количественного Purp3 операционные системы в растворе CDCl представлены.

Справочная Рисунок S1: Сравнение между С - ЯМР спектров 13 получены с использованием стандартной широкополосной развязки (A) и обратное стробированием расцепления (В) последовательности импульсов. Спектры регистрировали для того же образца с одинаковым числом сканирование, обработанный с теми же параметрами обработки и показаны с тем же масштабным коэффициентом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту цифру.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Модификации и стратегии по устранению неполадок

Спектральный качество. Ширина линии сигнала ЯМР и, таким образом, разрешение спектра ЯМР сильно зависит от подкладок, который представляет собой процесс для оптимизации однородности магнитного поля. Для рутинного анализа, 1D Шиммирование адекватно и 3D Шиммирование не требуется, при условии, что она выполняется персоналом ЯМРА на регулярной основе. Если это не тот случай, 3D прокладки должны быть выполнены перед проведением анализа с использованием образца , содержащий 0,6 мл H 2 O: D 2 O (90:10). Для того, чтобы достигнуть лучше и быстрее прокладок, образец должен быть сосредоточен в области возбуждения / детектирования радиочастотной (РЧ) катушки, используя градуированную глубиномер, прежде чем он будет помещен в отверстие магнита. Другой фактор, который влияет на Шиммирование вращения образца при спиновой скорости 10-20 Гц. Хотя вращение образца при этой спиновой скорости улучшает радиальные прокладки (X, У, ХY, XZ, YZ, Х 2 -Y 2, и т.д.), то , как правило , не рекомендуется для того , чтобы избежать появления прядильных боковых полос первого или более высокого порядка. Тем не менее, при работе на приборах, работающих в Лармором частотах ниже 400 МГц, закручивая рекомендуется для экспериментов 1D ЯМР.

Разрешение, а также чувствительность, влияет на коэффициент усиления приемника значения (гк). Низкие значения коэффициента усиления приемника уменьшить чувствительность, тогда как значений выше, чем соответствующий переливом причиной аналого-цифрового преобразователя (АЦП). Результаты переполнения АЦПА в несимметричной линии-форме и сигналы не могут быть использованы для количественных целей, потому что первые точки свободной индукции (FID) могут быть потеряны. В большинстве случаев, команда «рг» вычисляет соответствующее значение Rg. Тем не менее, в некоторых случаях, значение гк рассчитывается с помощью программного обеспечения выше, чем идеальное значение, и происходит искажение в форме лоренцевского сигнала ЯМР. Втакой случай, пользователь должен вручную вводить меньшее значение гк, набрав «Rg (значение)» в командной строке. Типичное значение RG для образцов, которые анализировали с помощью этого протокола 8.

Часто при использовании криогенного охлаждения ЯМРА зондов с высокой добротностью (Q-фактор), большая задержкой (мертвое время)> 200uS между последним импульсом и периодом обнаружения требуется, чтобы избежать артефактов, такие как выпуклость вокруг частоты передатчика и прокатки в базовой линии спектра в. Однако такая длительная задержка вызывает большую отрицательную фазовую ошибку первого порядка, который также может ввести базовые прокатки и большие провалы вокруг основания сильных сигналов. В этих случаях, г-восстановлена последовательность импульсов спинового эха может быть использована для получения спектров ЯМРА со значительно улучшенными исходными линиями, хотя небольшое снижение чувствительности может произойти 23.

Фосфолипиды. В дополнении к анализу рыбьего жираОбразцы, богатые триглицеридами и этиловых эфиров, ЯМР может быть использован для анализа проб нефти рыбы, богатых фосфолипидами (БВР). Тем не менее, особый уход требуется для таких проб, поскольку PLs образуют агрегаты, которые могут вызвать значительное снижение спектральной разрешающей способности и чувствительности. Для анализа этих образцов, смесь растворителей дейтерированного хлороформа: метанол (CDCl3: CD3OD) в соотношении 70:30 требуется для получения спектров высокого качества.

Внутренний стандарт. ВНТ был выбран в качестве внутреннего стандарта в этом исследовании , поскольку она является очень симметричной молекулой с простой 1 H и 13 С ЯМР - спектров , и ни одна из его вершин не совпадают с теми , рыбий жир компонентов. ВНТ имеет сигнал в спектре 1 Н - ЯМР, который появляется в виде синглета при δ 6,97 и принадлежит к двум эквивалентным ароматических протонов (пара - положении по отношению к ОН - группе) и сигналом наδ 151,45 в С - ЯМР - спектр 13 , который принадлежит к ароматическим четвертичного атома углерода , несущего группу -ОН. Оба из этих сигналов не перекрываются с любым из компонентов в рыбьем жире, и, таким образом, может быть использован для целей количественного определения. Другие соединения , такие как 1,2,4,5-тетрахлор-3-нитробензол (TCNB) или хлорид этилена может быть также использованы в качестве альтернативных внутренних стандартов, однако, они характеризуются более длинными значениями T 1.

Ограничения техники

Количественная оценка различных жирных кислот и липидов в добавок рыбьего жира достигается за счет интеграции соответствующих диагностических сигналов ЯМР в спектрах 1D. Такие сигналы должны принадлежать только к конкретному компоненту образца и не должны иметь никакого вмешательства с сигналами от других соединений. Это может быть проблемой для анализа 1 Н - ЯМР поскольку спектр 1 Н - ЯМР характеризуется низким разрешением из - за короткий диапазон чеMICAL сдвиги. Кроме того, наличие скалярной связи (J) , производит мультиплеты и делает анализ более сложным. Так , например, этиловый эфиры (EE) может быть определена количественно с использованием 1 H ЯМР характерным триплет (J = 7,20 Гц) метильной группы при δ 1,25 и мультиплет при δ 4.12, который принадлежит к метиленовым протонам группы сложного эфира. Однако, при использовании ЯМР приборов , работающих в Лармором частотах ниже 850 МГц, анализ ЭЭ с использованием 1 H ЯМР следует избегать из-за частичного перекрытия пика при δ 4,12 с пиком при δ 4,14 ТГС, а перекрытие сигнал на & delta ; 1,25 с широким сигналом алифатических метиленовых протонов при δ 1.23-1.35. Большие отклонения также наблюдались между 1 H и 13 C анализа EPA в некоторых образцах, 13 С ЯМР был ближе к меченой композиции , представленной тон производитель. Это, вероятно , из - за перекрытия сигнала при б 1,69, который используется для анализа EPA, с сигналами других соединений , которые появляются в некоторых типах добавок рыбьего жира. Дополнительные ошибки в количественных могут возникнуть при использовании внутреннего стандарта в связи с неопределенной чистотой внутреннего стандарта, и из-за ошибки при взвешивании.

Композиционный анализ может быть выражен в относительных молярных концентрациях без использования внутреннего стандарта. Если результаты должны быть выражены в абсолютных концентрациях, например, в виде миллиграмма жирной кислоты на грамм масла (мг / г), использование внутреннего стандарта требуется. Однако в тех случаях, когда сигнал ЯМР интерес принадлежит к нескольким соединений с различными молекулярными массами, результаты не могут быть выражены в виде мг / г, даже при использовании внутреннего стандарта. Кроме того, использование внутреннего стандарта, как правило, увеличивает длину анализа, поскольку наиболее распространенных внутренние с tandards, такие как ВНТ, небольшие молекулы с высокой молекулярной симметрией, что приводит к длительному времени релаксации. Со времени повторения (задержка между импульсами + время сбора) устанавливается в соответствии с самым длинным временем релаксации T 1 в образце, использование внутреннего стандарта позволит увеличить продолжительность экспериментов , как более длительные задержки между импульсами требуется. Это является особенно важным фактором для анализа 13 С ЯМР , из - за исключительно длительный T 1 времени релаксации ядер углерода. Добавление парамагнитного соединения , такие как Cr (АРКГ) 3 может эффективно уменьшить время релаксации T 1. Рекомендуется концентрация Cr (асас) 3 составляет 0,75 мг / мл раствора. Более высокие концентрации Cr (асас) 3 могут быть рассмотрены для дальнейшего сокращения T 1, однако, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать уменьшается в S / N из - за расширения линии.

ntent "> Несмотря на то, 13 С ЯМР характеризуется гораздо более высоким спектральным разрешением по сравнению с 1 H, чувствительность эксперимента 13 С ЯМР значительно ниже из-за низкого естественного содержания (1,1%) и низкой гиромагнитное отношение (67,26 10 6 рад с -1 T - 1) из 13 ядер C. Кроме того, длинных Т 1 времена релаксации 13 с увеличить длину анализа. Это может быть проблемой , когда имеется масло для анализа ограниченно, так как повышенные количество сканирование должно быть использовано для достижения разумного отношения сигнала к шуму.

Ограничения в чувствительности и разрешающей способности спектров ЯМР предотвратить анализ многих второстепенных соединений в рыбьем жире, которые могут быть проанализированы с другими методами, такими как GC. Например, 1 Η ЯМР не может отделить отдельные стеролы или жирных кислот (например , пальмитиновой и стеариновой) , тогда как 13 Cне в состоянии определить , соединения , которые появляются в очень низкой концентрации в рыбьем жире , такие как додекановой и миристиновой кислоты, которые перекрываются с сигналами всех насыщенных жирных кислот при δ 173.24 и 172.82 б. Несмотря на то, увеличивая количество образца, который анализируют делает анализ некоторых незначительных соединений осуществимых, осторожность требуется для очень концентрированных проб, из-за их повышенной вязкости. Очень вязкие растворы , содержащие более 150 мг масла следует избегать , поскольку есть уменьшение S / N из - за уширения линии , вызванное сокращением спин-спиновой Т 2 времен релаксации. Кроме того, более длительные задержки между импульсами необходимы из-за более длительный T 1 и Есть несколько вопросов в шиммирования и , таким образом , в разрешении.

Все соединения, проанализированные в рыбьем жире с ЯМР может быть определена количественно одновременно в одном снимке без использования каких-либо разделения или очистки шаги. ЯМРalysis происходит быстро , как спектр 1 Н может быть записан менее чем за одну минуту, в то время как приобретение 13 С ЯМР длится 10 мин. Следует, однако, отметить, что существует несколько факторов, которые влияют на время сбора данных. В частности, для 13 С - ЯМР, 10 мин Время работы может быть достигнуто только без использования внутренних стандартов, а также с использованием криогенной охлаждаемых зондов, в которой РЧ - катушки и предусилитель охлаждаются и , следовательно, тепловой шум сведен к минимуму. 10-15 - кратное увеличение в экспериментальное время следует ожидать для 13 С ЯМР , когда температура в помещении используются (обычные) зонды.

Значение в отношении существующих методов

ЯМР-спектроскопия оказалась мощным инструментом для качественного и количественного определения состава рыбьего жира добавка, а также из-за его быстроту она имеет потенциал, который будет применяться для высокопроизводительного скрининга обширного NU mber образцов рыбьего жира. ЯМР-спектроскопии по определению количественной методологии, так как область сигнала прямо пропорциональна числу ядер, которые вызывают сигнал. В то время как остро токсичные химические вещества необходимы для получения образцов ЯМР, этот метод является экологически чистым , поскольку такие небольшие количества этих химических веществ (например , CDCl 3) используются в отличие от других способов , которые требуют большого количества растворителя для элюирования образцов. Кроме того, ЯМР имеет ряд преимуществ по сравнению с другими аналитическими методами. Нет калибровки со стандартами не требуется предварительного анализа, и минимальный подготовки образца без разделения и очистки ступеней обычно принимается, что делает ЯМР очень быстрый аналитический инструмент. Кроме того, 13 С ЯМР является наилучшей доступной методологией определения позиционного распределения различных жирных кислот на глицерин скелете. В то время как ферментативный гидролиз был использован в качестве альтернативы не всегда надежны= "Xref"> 24. Это имеет особое значение , поскольку существует значительный интерес к изучению региоспецифичности различных жирных кислот в пищевых продуктах, как это было установлено , что это влияет на их функцию в рационе человека 25, 26.

Будущие применения

Несмотря на соглашение между ЯМРАМИ-анализом и разметить продукции, а также тот факт, что есть некоторые исследования, показывающие, соглашение между ГМ и ЯМРОМ, мы считаем, что более строгие и всеобъемлющие внутрирегиональными лабораторные исследования необходимы для изучения соглашения между ЯМРАМИ и традиционным методологии для анализа рыбной составляющие нефти с использованием большего количества образцов, рыбьим жиром продуктов различного происхождения, а также сертифицированные стандартные растворы.

Другим важным будущее применение ЯМР в рыбьем анализа масла будет определение продуктов окисления. В дополнение к определениюиз основных соединений в рыбьем жире, несколько первичных и вторичные продукты окисления в рыбьем жире, такие как альдегиды и пероксиды, присутствуют. 1 Н - ЯМР потенциально может быть применен для оценки состояния окисления в добавок рыбьего жира, при различных условиях окисления, как показано на рисунке 3. Самая большая проблема в этом анализе будет присвоение ЯМРА и идентификация отдельных продуктов окисления. Прогресс в области чувствительности аппаратного ЯМР также позволит идентифицировать отдельные стеринов с помощью 13 С ЯМР. ЯМР-спектроскопии также может быть применен для анализа ткани рыбы в целом, даже без какой-либо экстракции с помощью высокой разрешающей способностью вращение под магическим углом (HR-MAS) ЯМР.

Критические шаги в рамках Протокола

Два из наиболее важных шагов, которые влияют на точность количественных спектров ЯМР включают отбор импульса 90 ° и использование задержки между о.е.LSES ≥ 5 × T 1. Угол импульса пропорциональна ширине импульса, который является откалиброван параметр ЯМР, который зависит от измерительных приборов и образца. 90 ° импульс имеет важное значение для полного превращения продольной (г) намагниченности в наблюдаемом поперечном (х) намагниченность. Важно отметить, что до калибровки импульсов, ЯМР зондировали должен быть хорошо настроен и согласован. Это позволит оптимизировать передачу ВЧ-мощности в образце и, таким образом, максимально S / N и обеспечить эффективную развязку. Настройки зонда в основном зависят от диэлектрической проницаемости образца, так что если существует различие в концентрации между образцами, повторить процесс настройки для каждого из них. ЯМР эксперимент 1D 13 включает в себя как 13 С и 1 Н каналы так , автоматическая настройка и согласование является необходимым для обоих ядер.

Задержка между импульсами больше , чем 5 × T 1 обеспечивает полную RECOvery чистой намагниченности к исходному значению. Если все резонансы в спектре не полностью расслаблены перед каждым импульсом, сигнал частично подавляются, и это приводит к неточности в интеграции. Т 1 значение является критическим фактором , который влияет на длину эксперимента , и это зависит от напряженности магнитного поля, а также вязкости образца. Принимая во внимание , что вязкость между образцами аналогична, времена релаксации T 1 должны быть определены для каждого инструмента только в начале сессии анализа.

Еще одной важной особенностью анализа рыбьего жира с 13 С - ЯМР является выбором соответствующей последовательности импульсов. Наиболее надежный метод количественного анализа 13 С является обратным закрытым типом развязки эксперимента, где широкополосной протонная развязка применяется только в период сбора данных и , следовательно , не существует никакой передачи поляризации от 1 до 13 НС помощью ядерного эффекта Оверхаузера (NOE). Тем не менее, в то время как полностью разъединены эксперимент ЯМР можно использовать для количественных целей, необходима осторожность при использовании этого эксперимента, так как существуют различные факторы NOE между атомами углерода, с различными кратностей и, следовательно, интегрального сравнения между метил, метилен, метана и карбонильные углероды следует избегать. Несмотря на это, когда только атомы углерода подобной множественности и химической среды, рассматриваются в анализе, полностью разъединены метод является надежным. Одним из примеров этого является карбонильные углероды жирных кислот , которые , как было установлено , не имеют каких - либо существенных различий в факторах NOE после расцепления 27. Кроме того, для атомов углерода, несущие протонов, полностью разъединены эксперимент обеспечивает более высокую чувствительность благодаря вкладу NOE по интенсивности сигнала ЯМР. Сравнение между спектрами , полученными с помощью двух последовательностей импульсов показано на рисунке S1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана пищевыми продуктами для здоровья Discovery Темы в Университете штата Огайо и Департамент пищевой науки и технологии в Университете штата Огайо. Авторы хотели бы поблагодарить ЯМР-центр в Университете штата Огайо и ЯМР-центр в Университете штата Пенсильвания.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avance III 850 NMR instrument Bruker
Avance III 500 NMR instrument Bruker
TCI 5 mm probe Bruker Helium cooled inverse (proton deetected) NMR probe featuring three independent channels (1H, 13C, 15N)
BBO prodigy 5 mm probe Bruker Nitrogen cooled observe (X-nuclei detected) probe, featuring two channels; one for 1H and 19F detectionand one for X-nuclei (covering from 15N to 31P)
Spinner turbin Bruker NMR spinners are made by polymer materials and they have a rubber o-ring to hold the NMR tube securely in place
Topspin 3.5 Bruker
deuterated chloroform Sigma-Aldrich  865-49-6 99.8 atom % D, contains 0.03 TMS
2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol Sigma-Aldrich  128-37-0 purity >99%
Fish oil samples
NMR tubes New Era NE-RG5-7 5mm OD Routine “R” Series NMR Sample Tube
BSMS Bruker Bruker Systems Management System; control system device

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simopoulos, A. P. The importance of the ratio of omega-6/omega-3 essential fatty acids. Biomed. Pharmacother. 56, (8), 365-379 (2002).
  2. Goodnight, S. H. Jr, Harris, W. S., Connor, W. E. The effects of dietary omega 3 fatty acids on platelet composition and function in man: a prospective, controlled study. Blood. 58, (5), 880-885 (1981).
  3. Harper, C., Jacobsen, T. Usefulness of omega-3 fatty acids and the prevention of coronary heart disease. Am. J. Cardiol. 96, (11), 1521-1529 (2005).
  4. Kremer, J. M., et al. Effects of high-dose fish oil on rheumatoid arthritis after stopping nonsteroidal antiinflammatory drugs. Clinical and immune correlates. Arthritis and Rheumatol. 38, (8), 1107-1114 (1995).
  5. Malasanos, T., Stackpoole, P. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus. Diabetes Care. 14, 1160-1179 (1991).
  6. Han, Y., Wen, Q., Chen, Z., Li, P. Review of Methods Used for Microalgal Lipid-Content Analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
  7. Guillén, M., Ruiz, A. 1H nuclear magnetic resonance as a fast tool for determining the composition of acyl chains in acylglycerol mixtures. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105, 502-507 (2003).
  8. Sacchi, R., Medina, I., Aubourg, S. P., Addeo, F., Paolillo, L. Proton nuclear magnetic resonance rapid and structure specific determination of ω-3 polyunsaturated fatty acids in fish lipids. J. Am Oil Chem Soc. 70, 225-228 (1993).
  9. Igarashi, T., Aursand, M., Hirata, Y., Gribbestad, I. S., Wada, S., Nonaka, M. Nondestructive quantitative acid and n-3 fatty acids in fish oils by high-resolution 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 77, 737-748 (2000).
  10. Plans, M., Wenstrup, M., Saona, L. Application of Infrared Spectroscopy for Characterization Dietary Omega-3 Oil Supplements. J. Am. Oil Chem. Soc. 92, 957-966 (2015).
  11. Jian-hua, C. I. A. Near-infrared Spectrum Detection of Fish Oil DHA Content Based on Empirical Mode Decomposition and Independent Component Analysis. J Food Nutr Res. 2, (2), 62-68 (2014).
  12. Millen, A. E., Dodd, K. W., Subar, A. F. Use of vitamin, mineral, nonvitamin, and nonmineral supplements in the United States: The 1987, 1992, and 2000 National Health Interview Survey results. J. of Am. Diet Assoc. 104, (6), 942-950 (2004).
  13. Dwyer, J. T., et al. Progress in developing analytical and label-based dietary supplement databases at the NIH office of dietary supplements. J. Food Compos. Anal. 21, S83-S93 (2008).
  14. Monakhova, Y. B., Ruge, I., Kuballa, T., Lerch, C., Lachenmeier, D. W. Rapid determination of coenzyme Q10 in food supplements using 1H NMR spectroscopy. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 83, (1), 67-72 (2013).
  15. Monakhova, Y. B., et al. Standardless 1H NMR determination of pharmacologically active substances in dietary supplements and medicines that have been illegally traded over the internet. Drug Test. Anal. 5, (6), 400-411 (2013).
  16. Berger, S., Braun, S. 200 and more NMR experiments: a practical course. Wiley-VCH. Weinheim. (2004).
  17. Knothe, G., Kenar, J. A. Determination of the fatty acid profile by 1H-NMRspectroscopy. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 106, 88-96 (2004).
  18. Sacchi, R., Medina, J. I., Aubourg, S. P., Paolillo, I. G. L., Addeo, F. Quantitative High-Resolution 13C NMR Analysis of Lipids Extracted from the White Muscle of Atlantic Tuna (Thunnus alalunga). J. Agric. Food Chem. 41, (8), 1247-1253 (1993).
  19. Dais, P., Misiak, M., Hatzakis, E. Analysis of marine dietary supplements using NMR spectroscopy. Anal. Methods. 7, (12), 5226-5238 (2015).
  20. Pickova, J., Dutta, P. C. Cholesterol Oxidation in Some Processed Fish Products. J. Anal. Oil Chem. Soc. 80, (10), 993-996 (2003).
  21. Siddiqui, N., Sim, J., Silwood, C. J. L., Toms, H., Iles, R. A., Grootveld, M. Multicomponent analysis of encapsulated marine oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR techniques. J. of Lipid Rsrch. 44, (12), 2406-2427 (2003).
  22. Sua´rez, E. R., Mugford, P. F., Rolle, A. J., Burton, I. W., Walter, J. A., Kralovec, J. A. 13C-NMR Regioisomeric Analysis of EPA and DHA in Fish Oil Derived Triacylglycerol Concentrates. J. Am. Oil Chem. Soc. 87, 1425-1433 (2010).
  23. Youlin, X. A., Moran, S., Nikonowiczband, E. P., Gao, X. Z-restored spin-echo 13C 1D spectrum of straight baseline free of hump, dip and roll. Magn. Reson. Chem. 46, 432-435 (2008).
  24. Tengku-Rozaina, T. M., Birch, E. J. Positional distribution of fatty acids on hoki and tuna oil triglycerides by pancreatic lipase and 13C NMR analysis. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 116, (3), 272-281 (2014).
  25. Berry, S. E. E. Triacylglycerol structure and interesterification of palmitic and stearic acid-rich fats:An overview and implications for cardiovascular disease. Nutr. Res. Rev. 22, (1), 3-17 (2009).
  26. Hunter, J. E. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides. Lipids. 36, 655-668 (2001).
  27. Vlahov, G. Regiospecific analysis of natural mixtures of triglycerides using quantitative 13C nuclear magnetic resonance of acyl chain carbonyl carbons. Magnetic Res. in Chem. 36, 359-362 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics