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एक जोड़ी मनका और चर के साथ मोल्डिंग Microwells के लिए चुंबक सरणी Geometries

Bioengineering

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Summary

इस पांडुलिपि जटिल उच्च लागत सुविधाओं के लिए आवश्यकता के बिना गुफा microwells निर्माण की एक मजबूत विधि का परिचय । चुंबकीय बल, इस्पात मोतियों का प्रयोग, और एक के माध्यम से छेद सरणी, कई सौ microwells एक 3 सेमी x 3 सेमी polydimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट में गठन किया गया ।

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Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

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Abstract

एक अंडाकार संस्कृति में सेलुलर व्यवहार को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है कि यह एक vivo मेंतीन आयामी वातावरण की तरह प्रदान करता है । विभिन्न अंडाकार उत्पादन विधियों जैसे गैर चिपकने वाला सतहों, स्पिनर कुप्पी, हैंगिंग ड्रॉप, और microwells सेल-टू-सेल इंटरेक्शन, प्रतिरक्षा-सक्रियण, ड्रग स्क्रीनिंग, स्टेम सेल विभेद, और organoid पीढ़ी के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । इन तरीकों के अलावा, एक तीन आयामी गुफा ज्यामिति के साथ microwells वैज्ञानिकों और इंजीनियरों का ध्यान प्राप्त किया है, वर्दी के अपने लाभ-अंडाकार पीढ़ी आकार और आसानी के साथ जो व्यक्ति spheroids की प्रतिक्रियाएं हो सकता है दिया नजर. हालांकि लागत प्रभावी तरीकों जैसे लचीला झिल्ली और बर्फ लिथोग्राफी के उपयोग के रूप में प्रस्तावित किया गया है, इन तकनीकों पैटर्न आकार, उच्च पहलू अनुपात की उपलब्धि को नियंत्रित करने में कठिनाई जैसे गंभीर कमियां झेलना, और के उत्पादन microwells के बड़े क्षेत्रों । इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हम जटिल उच्च लागत की सुविधा के लिए आवश्यकता के बिना गुफा microwells निर्माण के लिए एक मजबूत विधि का प्रस्ताव । इस विधि एक 30 x 30 के माध्यम से छेद सरणी, कई सौ माइक्रोमीटर-आदेश इस्पात मोतियों का इस्तेमाल, और चुंबकीय बल के लिए एक 3 सेमी x 3 सेमी polydimethylsiloxane (PDMS) सब्सट्रेट में ९०० microwells बनाना । सेल जैविक अनुप्रयोगों के लिए हमारे विधि की प्रयोज्यता का प्रदर्शन करने के लिए, हम 3 दिनों के लिए वसा स्टेम कोशिकाओं को प्रसंस्कृत और सफलतापूर्वक हमारे microwell मंच का उपयोग spheroids का उत्पादन किया । इसके अलावा, हम तंत्र की जांच करने के लिए एक magnetostatic सिमुलेशन प्रदर्शन किया, जिससे चुंबकीय बल के माध्यम से छेद में स्टील मोती जाल के लिए इस्तेमाल किया गया था । हमें विश्वास है कि प्रस्तावित microwell निर्माण विधि कई अंडाकार आधारित सेलुलर अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है जैसे दवा स्क्रीनिंग, ऊतक पुनर्जनन, स्टेम सेल भेदभाव, और कैंसर मेटास्टेसिस ।

Introduction

एक अंडाकार रूप में विकसित कोशिकाओं को एक दो आयामी planar संस्कृति1से अधिक शरीर में असली ऊतक के समान हैं । इस लाभ को देखते हुए, spheroids के उपयोग के लिए सेल के अध्ययन में सुधार करने के लिए2,3, प्रतिरक्षा-सक्रियकरण4, दवा स्क्रीनिंग5, और भेदभाव6को अपनाया गया है । इसके अलावा, spheroids कई सेल प्रकार को शामिल हाल ही में organoids (के पास शारीरिक तीन आयामी (3 डी) ऊतक) है, जो मानव विकास और रोग के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है लागू किया गया है7। कई तरीकों spheroids उत्पादन किया गया है । सरलतम विधि एक गैर चिपकने वाला सतह, ऐसी है कि एक दूसरे और फार्म spheroids के साथ समग्र कोशिकाओं के उपयोग शामिल है । एक पेट्री डिश गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, pluronic एफ-१२७, या एक hydrophobic बहुलक के साथ इलाज किया जा सकता है (जैसे पाली 2-hydroxyethl methacrylate) अपनी सतह गैर चिपकने वाला8, 9बनाने के लिए । स्पिनर-कुप्पी विधि spheroids10,11की बड़ी मात्रा में उत्पादन का एक और प्रसिद्ध साधन है । इस विधि में, कोशिकाओं निलंबन में उन्हें सब्सट्रेट से जुड़ी बनने से रोकने के लिए आयोजित कर रहे हैं. इसके बजाय, फ़्लोटिंग कक्ष एकीकृत करने के लिए प्रपत्र spheroids । गैर चिपकने वाला सतह विधि और स्पिनर कुप्पी विधि दोनों ही बड़ी मात्रा में spheroids का उत्पादन कर सकते हैं । हालांकि, वे अंडाकार आकार को नियंत्रित करने में कठिनाइयों, साथ ही साथ ट्रैकिंग और प्रत्येक अंडाकार की निगरानी सहित सीमाओं के अधीन हैं । ऐसी समस्याओं के लिए एक उपाय के रूप में, एक और अंडाकार उत्पादन विधि, अर्थात्, फांसी छोड़ विधि12नियोजित किया जा सकता है । यह एक संस्कृति पकवान के ढक्कन के नीचे पर जमा सेल निलंबन बूंदें शामिल हैं । इन बूंदों आमतौर पर आकार में 15 से 30 µ एल रहे है और लगभग ३०० से ३००० कोशिकाओं को शामिल13। जब ढक्कन औंधा है, बूंदों जगह में सतह तनाव से आयोजित कर रहे हैं । प्रत्येक ड्रॉप में microgravity पर्यावरण कोशिकाओं है, जो नि: शुल्क तरल हवा अंतरफलक पर तो एक spheroids फार्म ध्यान केंद्रित । हैंगिंग ड्रॉप विधि का लाभ यह है कि यह एक अच्छी तरह से नियंत्रित आकार वितरण प्रदान करता है, जबकि यह पता लगाने और प्रत्येक अंडाकार, गैर चिपकने वाला सतह और स्पिनर कुप्पी तरीकों के सापेक्ष की निगरानी करने के लिए आसान है । हालांकि, इस विधि में एक नुकसान है कि spheroids के बड़े पैमाने पर उत्पादन और उत्पादन प्रक्रिया ही जरूरत से ज्यादा गहन श्रम है ।

एक microwell सरणी कई सूक्ष्म आकार के कुओं के साथ एक फ्लैट प्लेट, प्रत्येक १०० से १००० µm को लेकर व्यास है । अंडाकार उत्पादन सिद्धांत microwells का उपयोग करते समय गैर चिपकने वाला सतह विधि के समान है । लाभ तथ्य यह है कि microwells कोशिकाओं या spheroids, कि यह अंडाकार आकार को नियंत्रित करने के लिए आसान है, जबकि भी यह आसान प्रत्येक एकल अंडाकार की निगरानी करने के लिए बनाने के लिए microwells के बीच रिक्त स्थान प्रदान शामिल हैं । microwells की एक बड़ी संख्या के साथ, उच्च प्रवाह अंडाकार उत्पादन भी संभव है । microwells का एक अंय लाभ के लिए विभिंन आकारों के कुओं फार्म का विकल्प है (hexahedral, बेलनाकार, trigonal प्रिज्मीय) प्रयोक्ताओं की अनूठी प्रयोगात्मक प्रयोजनों पर निर्भर करता है । आम तौर पर, तथापि, एक तीन आयामी (3 डी) (या अर्धगोल) आकार के रूप में माना जाता है एक समान उत्पादन के लिए सबसे उपयुक्त आकार एकल spheroids जा रहा है । इसलिए, गुफा microwells की उपयोगिता कई सेल जीव विज्ञान अध्ययन के लिए सूचित किया गया है जैसे भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के cardiomyocyte भेदभाव की जांच उन14, टाप सेल क्लस्टर के इंसुलिन स्राव15, एंजाइमी गतिविधि के हेपैटोसाइट्स16, और ट्यूमर की दवा प्रतिरोध17spheroids ।

दुर्भाग्य से, microwells के निर्माण अक्सर विशेष micropatterning सुविधाओं की आवश्यकता है; पारंपरिक photolithography आधारित तरीकों जोखिम की आवश्यकता होती है और सुविधाओं के विकास जबकि प्रतिक्रियाशील आयन-नक़्क़ाशी आधारित तरीकों प्लाज्मा और आयन बीम उपकरणों की जरूरत है । इस तरह के उपकरण महंगा है, जो एक साथ जटिल निर्माण प्रक्रिया के साथ, जीव जो microtechnology तक पहुंच नहीं है के लिए प्रवेश के लिए एक उच्च बाधा प्रस्तुत करता है । इन समस्याओं को दूर करने के लिए, बर्फ लिथोग्राफी18 (जमे हुए पानी की बूंदों का उपयोग) और लचीला झिल्ली विधि14 (एक झिल्ली का उपयोग करते हुए, के माध्यम से छेद सब्सट्रेट, और एक वैक्यूम) के रूप में अन्य लागत प्रभावी तरीकों का सुझाव दिया गया है । हालांकि, इन तरीकों को भी गंभीर कमियां इस तरह यह पैटर्न आकार, उच्च पहलू अनुपात की प्राप्ति, और बड़े क्षेत्र microwells के उत्पादन को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल होने के रूप में झेलना ।

इसके बाद के संस्करण मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम एक उपंयास गुफा microwell निर्माण एक के माध्यम से छेद सब्सट्रेट, इस्पात मोती, और एक चुंबक सरणी का उपयोग विधि का प्रस्ताव कर रहे हैं । इस विधि का उपयोग, सैकड़ों गुफा गोलाकार microwells के तंत्र का लाभ लेने के द्वारा गढ़े जा सकता है चुंबकीय बल की सहायता आत्म ताला धातु मोती (चित्रा 1) । निर्माण प्रक्रिया बहुत कुछ महंगा और जटिल सुविधाओं का उपयोग शामिल है और कई उंनत कौशल की मांग नहीं है । जैसे, यहां तक कि अकुशल व्यक्तियों को आसानी से इस निर्माण विधि शुरू कर सकते हैं । प्रस्तावित विधि का प्रदर्शन करने के लिए, मानव-वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल spheroids का उत्पादन करने के लिए गुफा microwells में संस्कृति थे ।

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Protocol

1. के माध्यम से छेद सरणी एल्यूमीनियम प्लेट और चुंबक सरणी की तैयारी

  1. २ ५० मिमी x ५० मिमी (या बड़ा) एल्यूमीनियम प्लेटें तैयार करें । प्रत्येक थाली की मोटाई ३०० µm कि मनका व्यास का आधा है ।
  2. 30 मिमी के साथ एक सीएनसी रोटरी उत्कीर्णन का उपयोग करके एल्यूमीनियम प्लेटों में से एक पर छेद सरणी के रूप में एक φ ५५०-µm माइक्रो ड्रिल बिट 30 mm के साथ फार्म और डुबकी दर के ८००० RPM और धुरी गति की । प्रत्येक छेद (केंद्र के केंद्र) के बीच की दूरी 1 मिमी (आंकड़ा 1a और चित्रा 2a, मैं) था.
  3. φ ७५०-µm के माध्यम से एक 30 x 30 सरणी फार्म-अंय एल्यूमीनियम प्लेट पर छेद, एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर के रूप में है कि १.२ में वर्णित (आंकड़ा 1a और चित्रा 2a, द्वितीय) ।
  4. दोनों एल्यूमीनियम प्लेटों के चार कोनों में से प्रत्येक पर एक चिपचिपा टेप और फार्म Φ3 mm संरेखण छेद का उपयोग करके दो प्लेटें एक दूसरे को देते हैं ।
  5. अपनी सतहों को साफ करने के लिए 12 ज के लिए 15% सल्फर एसिड में एल्यूमीनियम प्लेटें भिगोएं । एल्यूमीनियम की सतह पर एल्यूमीनियम ऑक्साइड की पतली परत के बाद से यह जंग प्रतिरोधी, छेद व्यास और प्लेट की मोटाई इस एसिड उपचार द्वारा नहीं बदल रहे हैं ।
  6. 1 x 1 x 1 मिमी neodymium मैग्नेट के एक 30 × 30 सरणी फार्म (०.३६३ N की एक चुंबकीय शक्ति के साथ) । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चुंबक अपने पड़ोसी के विपरीत ध्रुवीयता है । को तोड़ने या चुंबक सरणी के बिखरने को रोकने के लिए, चुंबक सरणी के नीचे करने के लिए एक 30 x 30 मिमी एल्यूमीनियम की थाली संलग्न डबल पक्षीय टेप (चित्रा 2a, iii और इनसेट में चित्रा 2) का उपयोग कर ।

2. मनका फँसाने की प्रक्रिया

  1. संरेखित करें और दो एल्यूमीनियम प्लेटों स्टैक (टॉप प्लेट: ७५०-µm-होल प्लेट, नीचे प्लेट: ५५०-µm-होल प्लेट) प्रत्येक प्लेट के चार कोनों पर तैयार संरेखण छेद का उपयोग (आंकड़ा 1b) ।
  2. दो प्लेटों को एक साथ लॉक संरेखण छेद में एम 3 बोल्ट डालने के द्वारा, और फिर पागल (आंकड़ा 1b) के साथ बोल्ट सुरक्षित.
  3. तैयार चुंबक सरणी पर एल्यूमीनियम प्लेट विधानसभा ढेर (चित्र 1b, 2 बी, और 2c) । मैग्नेट की सरणी और स्टैकिंग प्रक्रिया के दौरान एल्यूमीनियम प्लेट में छेद के माध्यम से की सरणी संरेखित करें । तो चुंबक सरणी की स्थिति को ठीक करने के लिए एक चिपचिपा टेप का उपयोग करें ।
  4. थाली विधानसभा पर φ ६०० mm SUJ2 स्टील मोतियों की एक पर्याप्त संख्या प्लेस और एक acryl (या गैर धातु) प्लेट ऐसी है कि एक मनका एक छेद में फंस जाता है (चित्रा 1c, 1 डी, और 1e) का उपयोग कर मोतियों में हेरफेर जबकि एक साथ अतिरिक्त मोती जो छेद में दर्ज नहीं किया है हटाने ।
  5. सावधानी से फंसे मोतियों की अनचाहे कैटरिंग और विस्थापन से बचने के लिए ऊपर की प्लेट को हटा दें (फिगर 1f).

3. गुफा microwell निर्माण

  1. ऊपर, एक पेट्री डिश के लिए कदम २.१ से २.५ में उत्पादित, गुफा microwell मोल्ड हटो ।
  2. मिश्रण polydimethylsiloxane (PDMS) मोनोमर और इलाज एजेंट निर्माता के निर्देश के अनुसार19 एक PDMS मोनोमर के साथ: 10:1 के इलाज एजेंट अनुपात ।
  3. De-गैस PDMS मिश्रण में फंस किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए एक desiccator और वैक्यूम पंप का उपयोग करके PDMS मिश्रण ।
  4. गुफा microwell मोल्ड और de-गैस में PDMS मिश्रण डालो फिर उसी प्रक्रिया का उपयोग कर के रूप में है कि ३.३ में वर्णित (चित्रा 1f) ।
  5. एक चूल्हा पर PDMS मिश्रण 2 एच के लिए ८० ° c के लिए एक मनका-एंबेडेड PDMS सब्सट्रेट (चित्रा 1g) के रूप में बनाओ ।
  6. मोल्ड (चित्रा 1g) से ठीक PDMS सब्सट्रेट निकालें. हटाने की प्रक्रिया में, स्प्रे मेथनॉल धोने की बोतल का उपयोग करने के लिए मोल्ड से PDMS सब्सट्रेट अलग ।
  7. एक Φ15 मिमी x 2 मिमी चुंबक का प्रयोग, PDMS सब्सट्रेट (चित्रा1) से फंस इस्पात मोतियों को हटा दें । इस प्रक्रिया के लिए, PDMS सब्सट्रेट से मोतियों को निकालने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत है कि किसी भी चुंबक इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. अंडाकार कल्चर

  1. इस अध्ययन में 24 अच्छी तरह से थाली में फिट होने के लिए एक Φ14 mm बायोप्सी पंच का उपयोग करके गुफा microwell-नमूनों PDMS सब्सट्रेट कट.
  2. १२१ डिग्री सेल्सियस और 15 साई में एक आटोक्लेव नसबंदी में परिणामी Φ14 mm PDMS सब्सट्रेट निष्फल ।
  3. एक 24 अच्छी तरह से थाली में निष्फल PDMS सब्सट्रेट प्लेस ।
  4. कोट 4% (डब्ल्यू/वी) pluronic एफ-१२७ समाधान microwell सतह के लिए सेल लगाव को रोकने के लिए रात भर के साथ पूरे PDMS सब्सट्रेट । कोटिंग प्रक्रिया के दौरान, किसी भी हवा pipetting द्वारा microwells में फंस या एक अल्ट्रासोनिक क्लीनर का उपयोग करके बुलबुले को हटा दें ।
  5. F-१२७ समाधान फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) का उपयोग करके तीन बार फ्लश ।
  6. कोशिका के बीज 1 मिलीलीटर-मध्यम (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) समाधान (जो 2 x 106 कोशिकाओं शामिल है) PDMS सब्सट्रेट पर । ध्यान दें कि बीज का घनत्व लक्ष्य अंडाकार आकार और/या लक्ष्य सेल प्रकार के अनुसार बदला जा सकता है । यहां, वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (ए एस सी) का इस्तेमाल किया गया ।
  7. महाप्राण एक १००० µ एल पिपेट का उपयोग कर मध्यम के 1 मिलीलीटर के microwells (चित्रा 3) में फंसे नहीं थे कि किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए.
  8. ३६.५ डिग्री सेल्सियस, > 95% की आर्द्रता, और 5% सह2 शर्त पर कोशिकाओं को मशीन । हमारे अध्ययन में प्रयुक्त ASCs के मामले में, कोशिकाओं को एक अंडाकार में कुल ४८ ज ।

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Representative Results

एक उत्तल मोल्ड और microwell पैटर्न सफलतापूर्वक ३.७ के लिए २.१ कदम निंनलिखित द्वारा गढ़े गए थे । (चित्र 4) । वाणिज्यिक इस्पात मोती 30 x 30 के माध्यम से छेद सरणी में फंस गए थे । मोतियों की माला और इसी के माध्यम से छेद (चित्रा 4a) के बीच किसी भी अंतराल के बिना कसकर आयोजित किया गया । गढ़े हुए गुफा microwell के आकार ६०० µm है, जो स्टील मनका (चित्रा 4b) के रूप में एक ही है के एक व्यास के साथ, गुफा अर्धगोल है. एक पार एक गुफा microwell के अनुभाग (चित्र 4c) से पता चलता है कि पड़ोसी microwell से दूरी 1 मिमी (केंद्र के लिए केंद्र), जो के माध्यम से छेद के रूप में ही था । Φ14 mm गुफा microwell सब्सट्रेट, जो 24 वेल प्लेट में रखा गया था, १२० microwells (चित्रा 4d) पर निहित.

वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएँ गुफा microwells में कल्चर्ड थीं. हम Φ14 mm गुफा microwell सरणी पर 2 एक्स 106 कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त । 24 घंटे के बाद, कक्षों को spheroids में एकत्रित किया गया था, जैसा आरेख 4में दिखाया गया है । हमारे microwell सरणी में गठित spheroids का औसत व्यास १८५.६८ ± २२.८२ µm (दिन 1, चित्र 5 ए, 5c) था । 3 दिन में, कोशिकाओं को और अधिक एकत्रित हो गया था, १४७.०० ± १७.११ µm (चित्रा 5b, 5d) के लिए गिरने spheroids के औसत व्यास के साथ ।

Figure 1
चित्र 1 : निर्माण की प्रक्रिया की योजनाबद्ध । (क) सीएनसी नक्काशी का उपयोग कर एल्यूमीनियम प्लेटों में 30 x 30 φ ५५० और ७५० µm के माध्यम से छेद सरणी बनाना. (ख) संरेखण छेद का उपयोग करके दो प्लेटों के माध्यम से संरेखित । बाद में, गठबंधन प्लेटों चुंबक सरणी पर खड़ी थे । (ग) प्लेटों पर पर्याप्त मात्रा में स्टील के मोतियों का बीज बोने । (घ) मोतियों को नोच कर एक acryl प्लेट का उपयोग कर के माध्यम से छेद सरणी में मोतियों को जाल । (ङ) मोतियों के जरिए छेद सरणी में फँस गए थे. (च) शीर्ष प्लेट (φ ७५०-µm के माध्यम से छेद सरणी) हटा दिया गया था और खरीद PDMS मिश्रण मोल्ड में डाल दिया गया था । (छ) PDMS के बाद 2 ज के लिए ८० ˚ ग पर बेक किया गया था, ठीक PDMS को ढाला गया था । (ज) ठीक PDMS इस्पात मोतियों को पकड़ लेता है. मोती तो एक neodymium चुंबक (2 मिमी की मोटाई के साथ Φ15 mm) का उपयोग कर हटा रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : निर्माण प्रक्रिया । (क) दो के माध्यम से छेद प्लेटें और चुंबक सरणी की तैयारी । i) एल्यूमिनियम प्लेट वाले ७५० µm के माध्यम से छेद सरणी । ii) एल्यूमिनियम प्लेट वाले ५५० µm के माध्यम से छेद सरणी । iii) 30 x 30 सरणी के 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी मैग्नेट. (ख) स्टैक्ड और संरेखित पट्टियों का शीर्ष दृश्य । (ग) खड़ी और संरेखित प्लेटें और चुंबक सरणी के नीचे देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : meniscus घटता द्वारा अत्यधिक कोशिकाओं को हटाने. माध्यम आकांक्षी द्वारा, सतह तनाव हवा तरल अंतरफलक के कारण होता था, तो सतह तनाव microwell सब्सट्रेट की सतह पर अत्यधिक कोशिकाओं को रद्द कर दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : उत्तल मोल्ड और गढ़े microwell सरणी । (क) के माध्यम से छेद सरणी एल्यूमीनियम प्लेट में फंस मोती । फंस मोती एक सांचे में ढालना के रूप में कार्य करने के लिए गुफा microwells बनाना । मनका आकार ६०० µm था । स्केल बार 1 मिमी है । (ख) और (ग) गढ़े microwells की SEM छवियां । प्रत्येक गढ़े microwell एक अर्धगोल आकार, व्यास में ६०० µm है । (घ) Φ14-एमएम microwell सरणी में 24 वेल प्लेट. सरणी में १२० से अधिक गुफा microwells है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : संस्कृति spheroids में गुफा microwell सरणी । Φ14 मिमी microwell सरणी 2 एक्स 106 ASCs और 3 दिनों के लिए संस्कृति के साथ वरीयता प्राप्त किया गया था । (क) 1 दिन में कल्चर्ड spheroids; कक्षों को spheroids रूप देना प्रारंभ कर दिया है. स्केल बार 2 मिमी है । (ख) 3 दिन में कल्चर्ड spheroids; गठित spheroids अधिक कसकर संरचित कर रहे हैं, जबकि उनके औसत व्यास १८५.६८ ± २२.८२ µm दिन में 1 से गिर गया है 3 दिन में १४७.०० ± १७.११ µm । स्केल बार 2 मिमी है । (ग) 1 दिन में अंडाकार की आवर्धन छवियां । स्केल बार ५०० µm है । (घ) 3 दिन में अंडाकार के आवर्धन छवियां । स्केल बार ५०० µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : चुंबकीय प्रवाह घनत्व के वेक्टर के लिए सिमुलेशन परिणाम । चुंबक सरणी पर चुंबकीय प्रवाह का घनत्व magnetostatic मॉड्यूल का उपयोग कर गणना की गई थी । सिमुलेशन परिणाम से पता चलता है कि सबसे मजबूत चुंबकीय प्रवाह घनत्व प्रत्येक चुंबक के केंद्र में है, मोतियों के कारण के माध्यम से छेद के केंद्र में फंस सकता है, जहां वे सुरक्षित रूप से तय हो गया । स्केल बार 2 मिमी है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : चुंबक सरणी के चुंबकीय क्षेत्र वितरण । प्रत्येक चुंबक अपने पड़ोसी के विपरीत ध्रुवीकरण की है । ऊर्ध्वाधर चुंबकीय क्षेत्र प्रत्येक चुंबक के केंद्र में सबसे मजबूत है, जबकि क्षैतिज चुंबकीय क्षेत्र, पड़ोसी मैग्नेट के बीच इंटरफेस में प्रमुख है । ये दिशात्मक सेना एक चुंबक के केंद्र के लिए एक मनका गाइड । (क) चुंबक सरणी के चुंबकीय क्षेत्र । (ख) magnetostatic सिमुलेशन द्वारा निर्धारित के रूप में चुंबकीय क्षेत्र के वेक्टर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : सीमा एक बड़ा चुंबक और मनका आकार का उपयोग कर । (एक) छोटे मैग्नेट की एक सरणी का उपयोग कर के मामले के विपरीत, जब एक बड़े चुंबक का इस्तेमाल किया जाता है, लगभग सभी मोतियों की धार या चुंबक के केंद्र में स्थानांतरित करने के लिए करते हैं, जहां उच्च घनत्व चुंबकीय क्षेत्र बना है । इसके अलावा, मोती एक श्रृंखला आकार बनाने के लिए जुड़े हुए हैं । स्केल बार 10 मिमी है । (ख) से जुड़े microwell की SEM छवि जो 1 मिमी x 1 मिमी एक्स 1 मिमी चुंबक सरणी के साथ φ ८०० µm मोतियों का उपयोग करके गढ़े गया था. एक मनका कि चुंबक के आकार के सापेक्ष आकार में बहुत बड़ा है का उपयोग कर आसंन microwells के बीच दीवार में एक छोटा सा छेद बना सकते हैं । स्केल बार १०० µm है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9 : मनका फँसाने की प्रक्रिया में उपयुक्त शीर्ष प्लेट मोटाई और छेद आकार को चुनने का महत्व. (क) यदि ऊपर की प्लेट बहुत मोटी है, तो एक डबल ट्रैप हो जाएगा । (ख) इसके विपरीत यदि ऊपर की थाली बहुत पतली हो तो मोतियों की माला लेकर उतर आने की प्रवृत्ति होती है. (ग) यदि के माध्यम से छेद का आकार मनका व्यास से बड़ा है, दोनों डबल जाल और मनका विस्थापन हो सकती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

प्रमुख इस निर्माण विधि का सामना करना पड़ चुनौती के माध्यम से एल्यूमीनियम की थाली में छेद सरणी में मोतियों की फिक्सिंग सुरक्षित था । इस चुनौती को हल करने के लिए, एक 30 x 30 चुंबक सरणी के रूप में चुंबकीय बल के मोतियों को सुरक्षित रूप से ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में 6 और 7के आंकड़े में दिखाया गया है । चुंबक सरणी है, जो विपरीत ध्रुवीकरण है की चुंबकीय प्रवाह घनत्व, प्रत्येक चुंबक सतह के केंद्र में सबसे मजबूत है । क्योंकि चुंबकीय शक्ति की ताकत प्रवाह घनत्व पर निर्भर करता है, मोती प्रत्येक चुंबक जहां वे स्थिति में आयोजित किया गया के शीर्ष सतह के केंद्र के लिए निर्देशित किया गया । यदि एक भी बड़े-चुंबक आकार (5 cm × 5 cm × 1 cm), मोती, विशेष रूप से बाहर चरम छेद में स्थित लोगों का इस्तेमाल किया गया था, उच्च तीव्रता चुंबकीय चुंबक बढ़त पर बनाया क्षेत्र के लिए आकर्षित हो जाते हैं । बड़े मैग्नेट का उपयोग कर के साथ एक और समस्या यह है कि मोतियों को एक साथ छड़ी सहज छोटे मनका जंजीरों (चित्रा ८अ) बनाने के लिए ।

शीर्ष प्लेट की भूमिका (७५० µm छेद) को जाल मोतियों को गड्ढे ज्यामिति की सेवा थी । इस गड्ढे संरचना के कारण, यह एक एक्रिलिक प्लेट के साथ मोतियों खरोंच करने के लिए एक बार में फंस मनका arrays की एक बड़ी संख्या में बनाने के लिए संभव है (प्रोटोकॉल २.४ और चित्रा 1c और 1 डी) । यदि शीर्ष प्लेट का उपयोग नहीं, प्रत्येक मनका मैंयुअल रूप से आधार (५५० µm होल) एक समय में एक में डाला जाना चाहिए ।

हमारे विधि की सीमाएं एक सीएनसी उत्कीर्णन की जरूरत है कि सबसे महंगी विधि में इस्तेमाल किया डिवाइस है शामिल हैं । इस तरह के सीएनसी मशीनों की कीमत है चारों ओर से $३००० । यह, तथापि, अभी भी बहुत पारंपरिक नरम लिथोग्राफी सुविधाओं से सस्ता है । हमारे विधि की एक और अंतर्निहित सीमा छोटे मैग्नेट के लिए की जरूरत है, और microwells के बीच अंतर चुंबक आकार है, जो इस पत्र में वर्णित प्रदर्शन में 1 मिमी था पर निर्भर है । यह बहुत अधिक के बाद से मैग्नेट छोटे ५०० µm आसानी से उपलब्ध नहीं है इस अंतर को कम करने के लिए मुश्किल होगा । इसके अलावा, मनका का अधिकतम आकार भी सीमित था । फंस मोती मैग्नेट द्वारा चुंबकीय थे । चुंबकीय मोतियों के बीच की खाई भी संकीर्ण थे, एक साथ चिपके हुए की संभावना microwells में से कुछ से अधिक है छेद से जुड़े थे के रूप में चित्रा 8बीमें दिखाया गया है. 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी मैग्नेट का उपयोग किया जाता है, तो इसलिए, ७०० µm या अधिक की एक व्यास के साथ मोतियों की सिफारिश नहीं कर रहे हैं

लचीला झिल्ली14, बर्फ लिथोग्राफी18 और गहरी प्रतिक्रियाशील आयन20नक़्क़ाशी के रूप में अन्य निर्माण विधियों के साथ तुलना में, इस निर्माण विधि विशेष लिथोग्राफी सुविधाओं की आवश्यकता नहीं है, microwell स्थिति होने की अनुमति देता है आसानी से नियंत्रित है, और एक मानकीकृत गुफा microwell आकार का उत्पादन कर सकते हैं । इसके अलावा, गीला PDMS के नक़्क़ाशी21, ग्रेस्केल लिथोग्राफी22, और पीठ फैलाना प्रकाश लिथोग्राफी23 गुफा geometries के उत्पादन के लिए प्रस्तावित किया गया है । हालांकि, गीला PDMS के नक़्क़ाशी एक आयताकार संरचना पहले एक गुफा और गोल microwell बनाने के लिए, और एक खुला microwell बनाने के लिए उपयुक्त नहीं है की आवश्यकता है । greyscale लिथोग्राफी विधि मौजूदा फोटो लिथोग्राफी सुविधाओं का उपयोग करने का लाभ है, लेकिन उच्च कीमत सुविधाओं और greyscale फोटो मास्क की जरूरत है एक नुकसान है । पीठ फैलाना प्रकाश लिथोग्राफी एक और हाल ही में विभिंन पहलू अनुपात के साथ microwells के लिए गुफा बनाना उपयोगी विधि की सूचना थी, लेकिन केवल पैटर्न घनत्व के कम संकल्प पर ।

इस गुफा microwell निर्माण में महत्वपूर्ण कदम और शीर्ष प्लेट (चरण १.१ और १.३) के माध्यम से छेद आकार की मोटाई का चयन है । यदि के माध्यम से छेद प्लेट बहुत मोटी है, एकाधिक मोती प्रत्येक के माध्यम से छेद में फंस जा सकता है (चित्रा 9a); यदि यह बहुत पतली है, मोती कदम २.४ में तय नहीं किया जाएगा और इस तरह के माध्यम से छेद (चित्रा 9b) से परिस्थिती । बड़ा के माध्यम से छेद के मामले में, दोनों कई जाल और विस्थापन हो सकता है (चित्रा ९सी) ।

चुंबक के आकार और के माध्यम से छेद प्लेट की मोटाई के चयन के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में, यह अनुशंसित है कि चुंबक के आकार और "के माध्यम से छेद थाली" मनका के आकार पर आधारित हो की मोटाई । चुंबक का आकार मनका के व्यास से बड़ा होना चाहिए, और के माध्यम से छेद थाली की मोटाई मनका के व्यास से अधिक नहीं होना चाहिए । हालांकि, मैग्नेट और प्लेट मोटाई के विकल्प के बाद से अनुभवजंय है, और अधिक विस्तृत अनुकूलन और पैरामीट्रिक अध्ययन भविष्य के अध्ययन में शामिल किया जाएगा ।

हमारे विधि के भविष्य के लक्ष्यों को शामिल करने के लिए स्टेम सेल आला के निर्माण में biomimetic के लिए microwells की तरह-इन विट्रो बालों के रोम24, organoid जनरेशन के लिए अनुकूलित microwells25, और विभिंन arrays अलग के आकार का microwells के लिए अध्ययन अंडाकार आकार पर कैंसर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निर्भरता ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध को विज्ञान मंत्रालय, आईसीटी और फ्यूचर प्लानिंग (एनआरएफ-2014R1A1A2057527 और एनआरएफ-2016R1D1A1B03934418) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) के माध्यम से बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम द्वारा सपोर्ट किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

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References

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