Author Produced

En parkopplad pärla och Magnet matris för gjutning mikrobrunnar med variabel konkav geometrier

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Detta manuskript introducerar en robust metod för att fabricera konkav mikrobrunnar utan behov av komplexa hög kostnad anläggningar. Med hjälp av magnetkraft, stål pärlor, och en genomgående hål, bildades flera hundra mikrobrunnar ett 3 x 3 cm Polydimetylsiloxan (PDMS) substrat.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En sfäroid kultur är ett användbart verktyg för att förstå cellulära beteende genom att det ger en in-vivo-som tredimensionell miljö. Olika sfäroid produktionsmetoder stem som icke-häftande ytor, spinner kolvar, hängande droppar och mikrobrunnarna har använts i studier av cell-till-cell interaktioner, immun-aktivering, drug screening, celldifferentiering och organoid generation. Bland dessa metoder, har mikrobrunnar med en tredimensionell konkav geometri fått uppmärksamhet av forskare och ingenjörer, med tanke på deras fördelar med enhetlig storlek sfäroid generation och den lätthet med vilken svaren från enskilda spheroids kan vara övervakas. Även om kostnadseffektiva metoder såsom användning av flexibla membran och is litografi har föreslagits, medföra dessa tekniker allvarliga nackdelar såsom svårigheter att kontrollera de mönster storlekarna, uppnåendet av hög bildformat och produktion av större områden i mikrobrunnarna. För att övervinna dessa problem, föreslår vi en robust metod för att fabricera konkav mikrobrunnar utan behov av komplexa hög kostnad anläggningar. Den här metoden utnyttjar en 30 x 30 hålmontering array, flera hundra mikrometer-order stål pärlor och magnetisk kraft att fabricera 900 mikrobrunnar i ett 3 x 3 cm Polydimetylsiloxan (PDMS) substrat. För att demonstrera tillämpligheten av vår metod att cellen biologiska applikationer, vi odlade fett stamceller i 3 dagar och framgångsrikt producerat spheroids använder vår mikrobrunn plattform. Dessutom har vi utfört en magnetostatiska simulering för att undersöka mekanismen, whereby magnetisk kraft användes för att fälla stål pärlorna i de genomgående hål. Vi anser att den föreslagna mikrobrunn fabrication metoden kan tillämpas på många sfäroid-baserade cellulära studier såsom drogkontroll, vävnadsregeneration, stamcellers differentiering och cancer metastaser.

Introduction

Celler odlas till sfäroid form är mer lik riktig vävnad i kroppen än en tvådimensionell planar kultur1. Med tanke på denna fördel, har användning av spheroids antagits för att förbättra studien av celler interaktion2,3, immun-aktiveringen4, drug screening5och differentiering6. Spheroids införliva flera celltyper har dessutom nyligen tillämpats på organoids (nära-fysiologiska tredimensionella (3D) vävnad), som är mycket användbara för att studera människans utveckling och sjukdom7. Flera metoder har använts för att producera spheroids. Den enklaste metoden innebär användningen av en icke-häftande yta, så att cellerna samlade med varandra och bildar spheroids. En petriskål kan behandlas med bovint serumalbumin, pluronic F-127 eller en hydrofoba polymer (e.g. poly 2-hydroxyethl form) att göra dess yta icke-häftande89. Spinner-kolven metoden är ett annat välkänt sätt att producera stora mängder spheroids10,11. Den här metoden hålls celler i suspension genom omrörning för att förhindra dem från att bli kopplad till substratet. I stället celler den flytande aggregat till formuläret spheroids. Både icke-häftande yta metod och spinner kolven metoden kan producera stora mängder spheroids. De är dock begränsningar inklusive svårigheter att styra storleken sfäroid, samt spårning och övervakning av varje sfäroid. Som ett botemedel mot sådana problem, en annan sfäroid produktionsmetod, nämligen hängande släpp metoden kan vara sysselsatta12. Detta innebär att deponera cell suspension droppar på undersidan av locket på en kultur maträtt. Dessa droppar är vanligtvis 15 till 30 µL i storlek och innehåller ungefär 300 till 3000 celler13. När locket är inverterad, hålls dropparna på plats av ytspänning. Mikrogravitation miljö i varje droppe koncentrerar cellerna, som sedan utgör enda spheroids i fri vätska-luft-gränssnittet. Fördelarna med hängande droppe metod är att det erbjuder en väl kontrollerad storleksfördelning, medan det är lätt att spåra och övervaka varje sfäroid, i förhållande till de icke-häftande yta och spinner kolv metoderna. Men denna metod medför en nackdel i det massiva produktionen av spheroids och produktionsprocessen själv är överdrivet labor intensiv.

En mikrobrunn array är en platt tallrik med många mikro-storlek brunnar, vardera med en diameter som sträcker sig från 100 till 1000 µm. Sfäroid produktion principen när du använder mikrobrunnar är liknande till det av metoden icke-vidhäftande ytan. Fördelar inkluderar det faktum att mikrobrunnar ger blanksteg mellan mikrobrunnarna för att separera de celler eller spheroids, sådan att det är lätt att kontrollera sfäroid storlek, samtidigt som också gör det lätt att övervaka varje enda sfäroid. Med ett stort antal mikrobrunnar är hög genomströmning sfäroid produktion också möjligt. En annan fördel med mikrobrunnar är alternativet till formuläret brunnar i olika former (sexsidiga, cylindriska, Trigonala prismatiska) beroende på användarnas unika experimentella syften. Generellt dock anses en tredimensionell (3D) konkav (eller halvrunda) form vara den mest lämpliga för att producera enhetlig storlek enda spheroids. Därför, nyttan av konkava mikrobrunnarna har rapporterats för många cellbiologi studier som undersöker hjärtmuskelcellen differentieringen av stamceller14, insulinutsöndringen av islet cell kluster15, den enzymaktivitet av hepatocyter16och läkemedelsresistens av tumör spheroids17.

Tyvärr, tillverkning av mikrobrunnarna ofta kräver specialiserade micropatterning faciliteter; konventionella photolithography-baserade metoder kräver exponering och utveckla faciliteter medan reactive ion-etsning-baserade metoder behöver plasma och ion-beam utrustning. Sådan utrustning är dyrt som, tillsammans med komplicerade tillverkningsprocessen, presenterar ett höga inträdeshinder för biologer som inte har tillgång till Mikroteknologi. För att övervinna dessa problem, andra kostnadseffektiva metoder såsom is litografi18 (med frusna vattendroppar) och den flexibla membran metod14 (med ett membran, hålmontering substrat och vakuum) har föreslagits. Dock medföra dessa metoder också allvarliga nackdelar som det är svårt att styra mönster storlekarna, uppnåendet av hög bildformat och produktion av större-området mikrobrunnar.

För att lösa ovanstående frågor, föreslår vi en roman konkav mikrobrunn fabrication metod utnyttjar ett genomgående hål substrat, stål pärlor och en magnet-matris. Med den här metoden kan hundratals konkav sfäriska mikrobrunnar fabriceras genom att utnyttja mekanismen för magnetiska-kraft-assisted självlåsande metalliska pärlor (figur 1). Tillverkningsprocessen innebär användning av mycket få dyra och komplicerade faciliteter och kräver inte avancerade kunskaper i många. Som sådan, kan även outbildade personer enkelt genomföra denna tillverkning metod. För att demonstrera den föreslagna metoden, odlades mänskliga-adipose-härledda stamceller i konkava mikrobrunnarna att producera spheroids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av hålmontering matris aluminium plattan och magnet matris

  1. Förbered två 50 mm x 50 mm (eller större) aluminiumplattor. Tjockleken på varje platta var 300 µm som är hälften av pärla diameter.
  2. Bilda en 30 x 30 hålmontering matris på en av aluminium pläterar med en CNC-roterande gravör med en Φ550-µm micro borr med 30 mm/s dopp ränta och 8000 RPM spindel hastighet. Avståndet mellan varje hål (centrum till centrum) var 1 mm (figur 1a och figur 2a, jag).
  3. Bilda en 30 x 30 matris Φ750 µm genom-hål på andra aluminium plattan, med samma procedur som beskrivs i 1.2 (figur 1a och figur 2a, ii).
  4. Fäst de två plattorna varandra med hjälp av en tejp och bildar Φ3 mm justering hål vid varje av de fyra hörnen av båda aluminiumplattor.
  5. Blötlägg aluminium pläterar i 15% svavelsyra för 12 h att rengöra sina ytor. Eftersom det tunna lagret av aluminium oxid på ytan av aluminium gör det korrosionsbeständig, är håldiameter och tjocklek av plattan inte ändras av denna syra behandling.
  6. Bilda en 30 × 30 matris av 1 x 1 x 1 mm neodymiummagneter (med en magnetisk styrka av 0,363 N). Se till att varje magnet motsatt polaritet till sin granne. Förhindra att bryta eller spridning av matrisen magnet, bifoga ett 30 x 30 mm aluminiumplåt till botten av magnet matrisen med hjälp av dubbelhäftande tejp (figur 2a, iii och infällda i figur 2).

2. pärla svällning processen

  1. Justera och stack de två aluminium plattorna (Topplatta: 750-µm-håls platta, bottenplatta: 550-µm-håls platta) med förberedda justering hålen vid de fyra hörnen av varje platta (figur 1b).
  2. Låsa de två plattorna tillsammans genom att infoga M3 bultar in i anpassningen hål och fäst bultarna med nötter (figur 1b).
  3. Stack den aluminium platta församlingen på beredda magnet matrisen (figur 1b, 2boch 2 c). Justera mängd magneter och mängd genom hål i aluminium plattan under stapla. Använd sedan en tejp fixar positionen för arrayen magnet.
  4. Plats ett tillräckligt antal Φ600 mm SUJ2 stål pärlor på den platta församlingen och manipulera pärlor med en acryl (eller icke-metalliska) plattan så att en pärla blir instängd i varje hål (figur 1 c, 1 doch 1e) medan samtidigt ta bort de överflödiga pärlor som inte har lämnat in i hålen.
  5. Ta försiktigt bort den övre plattan för att undvika oönskad spridning och förskjutningar av fångade pärlor (figur 1f).

3. konkav mikrobrunn fabrication

  1. Flytta den konkava mikrobrunn mögel, produceras i steg 2.1 till 2.5, ovan, att en petriskål.
  2. Blanda monomerer Polydimetylsiloxan (PDMS) och härdare enligt tillverkarens instruktioner19 med en PDMS monomer: bota agent förhållandet 10:1.
  3. Avinstallation gas PDMS blandningen genom att använda en torkapparat och vakuumpump att ta bort eventuella bubblor som instängd i PDMS blandningen.
  4. Häll PDMS blandningen i konkava mikrobrunn mögel och avinstallation gas igen med samma procedur som beskrivs i punkt 3.3 (figur 1f).
  5. Grädda PDMS blandningen på en värmeplatta vid 80 ° C i 2 h att bilda en pärla-embedded PDMS substrat (figur 1 g).
  6. Ta bort härdad PDMS substratet från mögel (figur 1 g). I processen att ta bort spray metanol med tvätt flaska för att lossa PDMS substrat från mögel.
  7. Loss med en Φ15 mm x 2 mm magnet fångade stål pärlorna från PDMS substratet (figur 1 h). För denna process, kan någon magnet som är tillräckligt stark för att extrahera pärlorna från PDMS substratet användas.

4. sfäroid kultur

  1. Skär den konkava mikrobrunn-mönstrad PDMS substraten med hjälp av en Φ14 mm biopsi punch för att monteras i 24-väl plåt i denna studie.
  2. Sterilisera resulterande Φ14 mm PDMS substratet i en autoklav autoklav vid 121 ° C och 15 psi.
  3. Placera den steriliserade PDMS substraten i en 24 väl platta.
  4. Bestryk hela PDMS underlaget med 4% (w/v) pluronic F-127 lösning över natten för att förhindra cell fastsättning mikrobrunn ytan. Under beläggningsprocessen, avlägsna eventuella luftbubblor anhållna i konkava mikrobrunnarna genom pipettering eller använda ett ultraljud renare.
  5. Spola F-127 lösningen tre gånger med hjälp av fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  6. Frö 1 mL cell-medium (Dulbeccos modifierade Eagle Medium) lösning (som innehåller 2 x 106 celler) på PDMS substraten. Observera att sådd densiteten kan ändras enligt de sfäroid Målstorlek och/eller cell måltypen. Här, användes adipose-derived stamceller (ASC).
  7. Aspirera på 1 mL av medium med 1000 µL pipett ta bort överskjutande celler som inte blev instängda i mikrobrunnarna (figur 3).
  8. Inkubera cellerna vid 36.5 ° C, luftfuktighet på > 95% och 5% CO2 skick. När det gäller de ASCs används i vår studie, aggregera cellerna till en sfäroid i 48 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En konvex mögel och mikrobrunn mönster var framgångsrikt fabricerade genom att följa steg 2.1 till 3,7. (Figur 4). Kommersiella stål pärlorna var instängda i matrisen 30 x 30 genomgående hål. Pärlorna hölls tätt utan några luckor mellan pärlorna och de motsvarande genomgående hål (figur 4a). Form av påhittade konkav mikrobrunn är konkav halvrunda, med en diameter på 600 µm, vilket är detsamma som för stål pärla (figur 4b). Ett tvärsnitt av en konkav mikrobrunn (figur 4 c) visar att avståndet från den närliggande mikrobrunn 1 mm (centrum till centrum), vilket var samma som för de genomgående hål. Φ14 mm konkav mikrobrunn substratet, som placerades i 24 väl plattan, innehöll över 120 mikrobrunnar (figur 4 d).

Adipose-derived stamceller odlades i konkava mikrobrunnarna. Vi seedade 2 x 106 celler på Φ14 mm konkav mikrobrunn matrisen. Efter 24 h, hade cellerna aggregerade in spheroids, som visas i figur 4. Den genomsnittliga diametern av de spheroids bildades vår mikrobrunn array var 185.68 ± 22.82 µm (dag 1, figur 5a, 5 c). På dag 3, hade cellerna blivit mer aggregerade, med den genomsnittliga diametern av de spheroids faller till 147.00 ± 17.11 µm (Figur 5b, 5 d).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk av tillverkningsprocessen. (a) att göra 30 x 30 Φ550 och 750 µm hålmontering array i aluminiumplattor som använder CNC gravör. (b) anpassa två genom plattor med hjälp av justering hålen. Därefter var justerade plattorna staplade på magnet matrisen. (c) sådd en tillräcklig mängd stål pärlor på plattorna. (d) skrapning pärlor med en acryl plattan för att fälla pärlorna i matrisen genomgående hål. (e) pärlor var instängda i matrisen genomgående hål. (f) den övre plattan (Φ750-µm hålmontering array) togs bort och ohärdat PDMS blandningen hälldes i formen. (g) efter PDMS bakades vid 80 ˚C för 2 h, var den härdade PDMS unmolded. (h) botas PDMS griper stål pärlorna. Pärlorna är sedan bort med en neodymiummagnet (Φ15 mm med en tjocklek av 2 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Tillverkningsprocessen. (a) förbereder två hålmontering plattor och magnet array. i) aluminiumplåt med 750 µm hålmontering array. (II) aluminiumplåt med 550 µm hålmontering array. III) 30 x 30 matris med 1 x 1 x 1 mm magneter. (b) ovanifrån av staplade och justerad plattor. (c) underifrån av staplade och justerad plattor och magnet array. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Ta bort överdriven celler av vikande menisken. Av blivande medium, ytspänning orsakades av luft-vätska gränssnitt, då ytspänningen skrotas överdriven celler på ytan av mikrobrunn substrat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Konvex mögel och fabricerade mikrobrunn array. (a) fångade pärlor i hålmontering array aluminiumplåt. Fångade pärlorna fungerar som gjutform att fabricera konkav mikrobrunnarna. Pärla storlek var 600 µm. Skalstapeln är 1 mm. (b) och (c) SEM-bilder av påhittade mikrobrunnar. Varje fabricerade mikrobrunn har en halvsfärisk form, 600 µm i diameter. (d) Φ14-mm mikrobrunn array i plattan 24 brunnar. Matrisen innehåller över 120 konkav mikrobrunnar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Kultur spheroids i konkava mikrobrunn matris. Φ14-mm mikrobrunn matrisen var seedad med 2 x 106 ASCs och odlade i 3 dagar. (a) odlade spheroids dag 1; cellerna har börjat bilda spheroids. Skalstapeln är 2 mm. (b) odlade spheroids på dag 3. de bildade spheroids struktureras mer tätt, medan deras genomsnittliga diameter har minskat från 185.68 ± 22.82 µm dag 1 till 147.00 ± 17.11 µm på dag 3. Skalstapeln är 2 mm. (c) förstoring bilder sfäroid dag 1. Skalstapeln är 500 µm. (d) förstoring bilder sfäroid på dag 3. Skalstapeln är 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Simulering resultatet för vektor av magnetisk flödestäthet. Tätheten av magnetiska flux på magnet matrisen beräknades med hjälp av magnetostatiska modul. Simulering resultatet visar att den starkaste magnetisk flödestäthet är i mitten av varje magnet, orsakar pärlor för att bli instängd i mitten av de genomgående hål där de blev ordentligt fast. Skalstapeln är 2 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Magnetfält distribution av magnet array. Varje magnet är av motsatt polaritet till sin granne. Horisontella magnetfältet är dominerande i gränssnittet mellan angränsande magneter, medan det vertikala magnetfältet är starkast i mitten av varje magnet. Dessa riktade krafter guide en pärla till mitten av en magnet. (a) magnetfält av magnet matris. (b) vektor av magnetfält som bestäms av magnetostatiska simulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Begränsning med enda stora magneten och pärla storlek. (a) till skillnad från fallet med att använda en matris av små magneter, när en stor magnet används, nästan alla pärlorna tenderar att flytta till kanten eller centrera av magneten där hög densitet magnetfält bildas. Pärlorna är dessutom ansluten till att en kedja form. Skalstapeln är 10 mm. (b) SEM-bild av länkade mikrobrunn som var tillverkade med Φ800 µm pärlor med 1 x 1 mm och 1 mm magnet array. Använda en pärla som är för stor i storlek i förhållande till storleken på magneten kan skapa ett litet hål i väggen mellan intilliggande mikrobrunnar. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 : Vikten av att välja lämpliga topplattan tjocklek och hål storlek i processen pärla svällning. (a) om den övre plattan är för tjock, sker en dubbel trap. (b) omvänt, om den övre plattan är för tunn, det finns en tendens för pärlor för att lossna. (c) om storleken på genom-hålet är större än pärla diameter, kan både dubbel trap och pärla förskjutningar uppstå. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den stora utmaningen för denna tillverkning metod var säkert fastställande av pärlorna i matrisen genom hål i aluminium plattan. För att lösa denna utmaning, användes magnetisk kraft i form av en 30 x 30 magnet-matris fixar pärlorna ordentligt, som visas i figurerna 6 och 7. Den magnetisk flödestäthet i magnet matrisen, som har motsatt polaritet, är starkast i mitten av varje magnet yta. Eftersom styrkan i den magnetiska kraften beror på flödestäthet, vägleddes pärlorna i mitten av den övre ytan på varje magnet där de hölls i position. Om en enda stora magnet (5 × 5 cm × 1 cm) användes, tenderar pärlor, särskilt de som ligger i extremt utanför hål, att vara attraherad av högre intensitet magnetfältet skapat på magnet kanten. Ett annat problem med att använda stora magneter är att pärlorna håller ihop spontant att skapa liten pärla kedjor (figur 8a).

Rollen av topplattan (750 µm hål) var att tjäna grop geometri för trap-pärlor. Denna grop struktur är det möjligt att skrapa pärlor med en akrylplatta att skapa ett stort antal fångade pärla matriser på en gång (protokoll 2,4 och figur 1 c och 1 d). Om du inte använder den övre plattan, varje granulum manuellt måste införas i basen (550 µm hål) en i taget.

Begränsningarna av vår metod inkluderar behovet av en CNC-gravör som är den dyraste enheten används i metoden. Sådana CNC maskiner prissätts från runt $3000. Detta är dock fortfarande mycket billigare än konventionell mjuk litografi faciliteter. En annan inneboende begränsning av vår metod är behovet av små magneter, och klyftan mellan mikrobrunnarna är beroende på magnet storlek, vilket var 1 mm i den demonstration som beskrivs i detta dokument. Det skulle vara svårt att minska denna klyfta som är mycket mer eftersom magneter mindre än 500 µm inte är lätt tillgängliga. Dessutom begränsades också maximal storlek av pärla. Fångade pärlorna var magnetiseras av magneter. Om klyftan mellan magnetiska pärlor var för snäv, är sannolikheten för klibbar ihop högre än vissa av mikrobrunnarna förbands av hål som visas i figur 8b. Därför, när 1 x 1 mm och 1 mm magneter används, pärlor med en diameter på 700 µm eller mer rekommenderas inte

Jämfört med andra fabrication metoder såsom flexibla membran14, is litografi18 och djupt reactive ion etsning20, detta fabrication metod kräver inte särskilda litografi faciliteter, tillåter mikrobrunn positionen att vara lätt kontrolleras, och kan producera en standardiserad konkav mikrobrunn form. Dessutom har våta etsning av PDMS21, gråskala litografi22och baksidan diffust ljus litografi23 föreslagits för produktion av konkava geometrier. Dock wet etsning av PDMS kräver en rektangulär struktur först att göra en konkav och runda mikrobrunn och lämpar sig inte för att göra en öppen mikrobrunn. Gråskala litografi metoden har fördelen att utnyttja befintliga foto litografi anläggningar, men behovet av hög prissatta anläggningar och gråskala foto mask är en nackdel. Baksidan diffust ljus litografi var en annan nyligen rapporterade metod användbar att fabricera konkav mikrobrunnar med olika proportioner, men bara på den låga upplösningen av mönster densitet.

Det kritiska steget i konkava mikrobrunn tillverkning är valet av tjocklek och genomgående hål storlek av topplattan (steg 1.1 och 1.3). Om hålmontering plattan är för tjock, kan flera pärlor vara instängd i varje hålmontering (figur 9a); om det är för tunt, kommer pärlorna inte vara fast i steg 2,4 och således vrickat från de genomgående hål (figur 9b). Vid större genom-hål, kan både flera trap och förskjutningar uppstå (figur 9 c).

Som en riktlinje för att välja storleken på magneten och tjockleken på hålmontering plattan, rekommenderas det att storleken på magneten och tjockleken på ”hålmontering plattan” baseras på storleken på kornet. Storleken på magneten måste vara större än diametern på kornet, och tjockleken på hålmontering plattan bör inte överstiga diametern på kornet. Men eftersom valet av magneter och plåttjocklek är empirisk, mer detaljerad optimering och parametriska studier kommer att ingå i framtida studier.

Framtida mål med vår metod är tillverkning av stamceller nisch-liknande mikrobrunnarna för biomimetiska i vitro hårsäckar24, anpassade mikrobrunnarna för organoid generation25och olika matriser av olika storlek mikrobrunnarna för att studera beroende av cancerceller och immunceller sfäroid storlek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av grundläggande vetenskap forskningsprogrammet genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering (NRF-2014R1A1A2057527 och NRF-2016R1D1A1B03934418).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31, (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42, (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101, (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5, (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21, (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22, (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18, (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37, (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11, (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31, (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31, (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19, (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32, (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8, (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11, (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7, (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4, (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125, (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3, (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101, (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106, (3), 237-242 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics