Author Produced

En parret perle og Magnet Array for Molding Microwells med variabel konkave geometrier

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette manuskript introducerer en robust metode til at opdigte konkave microwells uden behov for komplekse høje omkostninger faciliteter. Ved hjælp af magnetisk kraft, stål perler og en gennem hullet array, blev flere hundrede microwells dannet i 3 cm x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) substrat.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, G. H., Suh, Y., Park, J. Y. A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries. J. Vis. Exp. (131), e55548, doi:10.3791/55548 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En klumpformet kultur er et nyttigt redskab for at forstå cellulære adfærd, fordi det giver en i vivo-som tre-dimensionelle miljø. Forskellige klumpformet produktionsmetoder stamceller såsom ikke-klæbende overflader, spinner kolber, hængende dråber og microwells har været anvendt i studier af celle til celle interaktion, immun-aktivering, stof screening, Celledifferentiering og organoid generation. Blandt disse metoder, har microwells med en tre-dimensionel konkave geometri fået opmærksomhed af videnskabsfolk og ingeniører, da deres fordele af ensartet størrelse klumpformet generation og den lethed, hvormed svar af individuelle spheroids kan være overvåges. Selv om omkostningseffektive metoder såsom brugen af fleksible membraner og ice litografi er blevet foreslået, disse teknikker pådrage sig alvorlige ulemper såsom vanskeligheden i at kontrollere mønster størrelser, opnåelse af høje skærmformater og produktion af større områder af microwells. For at overvinde disse problemer, foreslår vi en robust metode for at fabrikere konkave microwells uden behov for komplekse høje omkostninger faciliteter. Denne metode udnytter en 30 x 30 gennem hullet array, flere hundrede mikrometer-ordre stål perler og magnetiske kraft til at fabrikere 900 microwells i 3 cm x 3 cm Polydimethylsiloxan (PDMS) substrat. For at påvise anvendeligheden af vores metode til celle biologiske applikationer, vi kulturperler adipøst stamceller i 3 dage og med held fremstillet spheroids ved hjælp af vores microwell platform. Derudover udførte vi en magnetostatic simulering for at efterforske den mekanisme, hvorved magnetiske kraft blev brugt til at fælde de stål perler i gennem hullerne. Vi mener, at den foreslåede microwell fabrikation metode kunne anvendes til mange klumpformet-baserede cellular undersøgelser såsom narkotika screening, vævsregeneration, stamcelle differentiering og kræft metastaser.

Introduction

Celler dyrkes i en klumpformet form er mere ligner rigtige væv i kroppen end en to-dimensional plane kultur1. I betragtning af denne fordel, er brug af spheroids blevet vedtaget for at forbedre studie af celle til celle interaktion2,3, immun-aktivering4, stof screening5og differentiering6. Derudover er spheroids inkorporerer flere celletyper for nylig blevet anvendt til organoids (i nærheden af fysiologiske tredimensionale (3D) væv), som er meget nyttigt for at studere menneskelig udvikling og sygdom7. Flere metoder er blevet brugt til at producere spheroids. Den enkleste metode indebærer udnyttelse af en ikke-klæbende overflade, således at cellerne samle med hinanden og form spheroids. En petriskål kan behandles med bovin serum albumin, pluronic F-127 eller en hydrofobe polymer (fx poly 2-hydroxyethl methylmethacrylat) at gøre sin overflade ikke-klæbende89. Metoden spinner-kolbe er en anden velkendt middel til at producere store mængder af spheroids10,11. I denne metode afholdes celler i suspension ved omrøring for at forhindre dem i at blive fastgjort til underlaget. I stedet, den flydende celler aggregat til form spheroids. Både ikke-klæbende overflade metode og spinner kolbe metode kan producere store mængder af spheroids. De er dog underlagt begrænsninger herunder vanskeligheder i kontrollerende klumpformet størrelse samt sporing og overvågning af hver klumpformet. Som et middel for sådanne problemer, en anden klumpformet produktionsmetode, nemlig hængende drop metode kan være ansat12. Dette indebærer deponering celle suspension dråber på undersiden af låget af en kultur parabol. Disse dråber er normalt 15-30 µL i størrelse og indeholder ca 300 til 3000 celler13. Når låget er omvendt, er dråberne holdt på plads af overfladespænding. Vægtløshed miljø i hvert fald koncentrerer de celler, som derefter udgør enkelt spheroids på grænsefladen gratis væske-luft. Fordelene ved hængende slip-metoden er at den giver en velkontrollerede størrelse distribution, mens det er let at spore og overvåge hver sfæroide, i forhold til de ikke-klæbende overflade og spinner kolbe metoder. Men denne metode pådrager sig en ulempe i den massive produktion af spheroids og produktionsprocessen, selv er overdrevent labor intensiv.

En microwell array er en flad plade med mange mikro-størrelse wells, hver med en diameter, der spænder fra 100 til 1000 µm. Klumpformet produktion princippet ved brug af microwells er svarer til den ikke-klæbende overflade metode. Fordele omfatter det forhold, at microwells skaber mellemrum mellem microwells til at adskille celler eller spheroids, således at det er let at styre den sfæroide størrelse, mens også gør det let at overvåge hver enkelt klumpformet. Med et stort antal microwells er høj overførselshastighed klumpformet produktion også muligt. En anden fordel ved microwells er mulighed for at form brønde i forskellige former (hexahedral, cylindriske, trigonal prismatisk) afhængigt af brugernes unikke forsøgsformål. Generelt, dog en tredimensional (3D) konkave (eller halvkugleformet) figur betragtes som værende den mest egnet til fremstilling af ensartet størrelse enkelt spheroids. Derfor, nytten af konkave microwells er rapporteret for mange celle biologi undersøgelser som dem undersøge cardiomyocyte differentiering af embryonale stamceller14, insulin udskillelsen af islet celle klynger15, den enzymatisk aktivitet af hepatocytter16og lægemiddelresistens af tumor spheroids17.

Desværre, fabrikation af microwells ofte kræver specialiseret micropatterning faciliteter; konventionelle fotolitografi-baserede metoder kræver eksponering og udvikle faciliteter mens reaktive ion-ætsning-baserede metoder skal plasma og ion-beam udstyr. Sådant udstyr er dyrt som, sammen med de komplicerede fabrikationsproces, præsenterer en høj adgangsbarriere for biologer, der ikke har adgang til mikroteknologi. For at overvinde disse problemer, andre omkostningseffektive metoder såsom is litografi18 (ved hjælp af frosne vanddråber) og fleksibel membran metode14 (ved hjælp af en membran, gennem hullet substrat og et vakuum) har foreslået. Men disse metoder også pådrage sig alvorlige ulemper som det er vanskeligt at styre mønster størrelser, opnåelse af høje skærmformater og produktion af større område microwells.

For at overvinde ovennævnte spørgsmål, foreslår vi en roman konkave microwell fabrikationsanlæg metode udnytter gennem hullet substrat, stål perler og en magnet array. Brug denne metode, kan hundredvis af konkave sfæriske microwells fremstilles ved at drage fordel af mekanismen for magnetisk-kraft-hjalp selvlåsende metallisk perler (figur 1). Fabrikationsproces indebærer brug af meget få dyre og komplicerede faciliteter og kræver ikke mange avancerede færdigheder. Som sådan, kan selv ufaglærte personer nemt foretage denne fabrikation metode. For at demonstrere den foreslåede metode, kulturperler human-fedt-afledte stamceller i den konkave microwells at producere spheroids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af gennem hullet matrix aluminium plade og magnet matrix

  1. Forbered to 50 mm x 50 mm (eller større) aluminium plader. Tykkelsen af hver plade var 300 µm, som er halvdelen af perle diameter.
  2. Danne en 30 x 30 gennem hullet array på en af aluminium plader ved hjælp af en CNC roterende gravør med lidt Φ550-µm mikro boremaskine med 30 mm/s af springet sats og 8000 RPM spindel hastighed. Afstanden mellem hvert hul (midt til midt) var 1 mm (figur 1a og figur 2a, jeg).
  3. Danne en 30 x 30 matrix af Φ750-µm gennem huller på de andre aluminiumplade, ved hjælp af den samme procedure som beskrevet i punkt 1.2 (figur 1a og figur 2a, ii).
  4. Fastgør de to plader hinanden ved hjælp af en selvklæbende tape og danne Φ3 mm justering huller på hver af de fire hjørner af begge aluminium plader.
  5. Sættetid aluminium plader i 15% svovlsyre til 12 h til at rense deres overflader. Da det tynde lag af aluminiumoxid på overfladen af aluminium gør det korrosionsbestandig, er huldiameter og tykkelsen af pladen ikke ændret ved denne behandling.
  6. Danne en 30 × 30 matrix 1 x 1 x 1 mm neodymmagneter (med en magnetisk styrken af 0.363 N). Sikre, at hver magnet den modsatte polaritet på sin nabo. For at forhindre bruddet eller spredning af matrixen magnet, vedhæfte en 30 x 30 mm aluminiumplade til bunden af matrixen magnet bruge dobbeltklæbende tape (figur 2a, iii og indsatser i figur 2).

2. perle fældefangst proces

  1. Juster og stable de to aluminium plader (top plade: 750-µm-hole plate, bundplade: 550-µm-hole plate) ved hjælp af rede justering hullerne i de fire hjørner af hver tallerken (figur 1b).
  2. Låse de to plader sammen ved at indsætte M3 bolte i justering huller, og derefter sikre bolte med nødder (figur 1b).
  3. Stable aluminium plade samling på rede magnet array (figur 1b, 2bog 2 c). Juster array af magneter og array af gennem huller i aluminiumplade under stabling processen. Brug derefter en selvklæbende tape til at fastsætte placeringen af matrixen magnet.
  4. Sted et tilstrækkeligt antal Φ600 mm SUJ2 stål perler på plade samling og manipulere perlerne ved hjælp af en acryl (eller ikke-metalliske) plade sådan at en perle bliver fanget i hvert hul (figur 1 c, 1 dog 1e) mens samtidig at fjerne de overskydende perler, som ikke har indgivet i hullerne.
  5. Fjern forsigtigt den øverste plade for at undgå uønsket spredning og dislokation af de fangne perler (figur 1f).

3. konkave microwell fabrikation

  1. Flytte den konkave microwell skimmel, produceret i trin 2.1 til 2.5, ovenfor, at en petriskål.
  2. Bland Polydimethylsiloxan (PDMS) monomere og hærder ifølge producentens instruktioner19 med en PDMS monomer: hærdning agent forholdet 10:1.
  3. Nedtrapning gas PDMS blandingen ved hjælp af en ekssikkator og vakuumpumpe til at fjerne eventuelle bobler fanget i PDMS blanding.
  4. Hæld PDMS blandingen i den konkave microwell form og nedtrapning gas igen ved hjælp af den samme procedure som beskrevet i 3.3 (figur 1f).
  5. Bage PDMS blandingen på en kogeplade på 80 ° C i 2 timer til at danne en perle-embedded PDMS substrat (figur 1 g).
  6. Fjerne den hærdede PDMS substrat fra mold (figur 1 g). I forbindelse med fjernelse, spray metanol ved hjælp af vask flaske for at løsrive PDMS substrat fra formen.
  7. Bruger en Φ15 mm x 2 mm magnet, fjerne de fangne stål perler fra PDMS substrat (figur 1 h). For denne proces, kan en magnet, der er tilstrækkelig stærk til at udtrække perlerne fra PDMS substrat bruges.

4. klumpformet kultur

  1. Skæres konkave microwell-mønstrede PDMS underlaget ved hjælp af en Φ14 mm biopsi punch skal monteres i 24-godt plade i denne undersøgelse.
  2. Sterilisere den resulterende Φ14 mm PDMS substrat i en autoklave sterilizer ved 121 ° C og 15 psi.
  3. Placere steriliseret PDMS underlaget i en 24 godt plade.
  4. Frakke hele PDMS bærematerialet med 4% (w/v) pluronic F-127 løsning natten at forhindre cell vedhæftet fil til microwell overflade. Undervejs belægning Fjern eventuelle luftbobler fanget i den konkave microwells, pipettering eller ved hjælp af en ultralyds renere.
  5. Skyl F-127 løsning tre gange ved hjælp af fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
  6. Seed 1 mL af celle-medium (Dulbeccos modificerede Eagle Medium) løsning (som indeholder 2 x 106 celler) på PDMS substrat. Bemærk at seeding massefylden kan ændres efter mål klumpformet størrelse og/eller målet celletype. Her, blev fedt-afledte stamceller (ASC) brugt.
  7. Opsug 1 mL af medium ved hjælp af en 1000 µL pipette til at fjerne eventuelle overskydende celler, der ikke blev fanget i microwells (figur 3).
  8. Inkuber celler på 36,5 ° C, luftfugtighed af > 95% og 5% CO2 tilstand. I tilfælde af ASCs bruges i vores undersøgelse, cellerne samlede til en klumpformet i 48 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En konveks mug og microwell mønster blev med held fremstillet ved at følge trin 2.1 til 3.7. (Figur 4). De kommercielle stål perler blev fanget i matrixen 30 x 30 gennem hullet. Perlerne blev holdt stramt uden nogen huller mellem perlerne og de tilsvarende (figur 4a) gennem huller. Form af opdigtede konkave microwell er konkave halvkugleformet, med en diameter på 600 µm, som er den samme som den stål kugle (figur 4b). Et tværsnit af en konkav microwell (fig. 4 c) viser, at afstanden fra den nærliggende microwell var 1 mm (center til center), som var den samme som gennem hullerne. Φ14 mm konkave microwell substrat, som var placeret i de 24 godt plade, indeholdt over 120 microwells (figur 4 d).

Fedt-afledte stamceller var kulturperler i den konkave microwells. Vi seedet 2 x 106 celler på Φ14 mm konkave microwell array. Efter 24 timer, havde cellerne samles i spheroids, som vist i figur 4. Den gennemsnitlige diameter af spheroids dannet i vores microwell array var 185.68 ± 22.82 µm (dag 1, figur 5a, 5 c). På dag 3, var cellerne blevet mere aggregerede, med den gennemsnitlige diameter af spheroids falder til 147.00 ± 17.11 µm (figur 5b, 5 d).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk af fabrikationsproces. (a) at gøre 30 x 30 Φ550 og 750 µm gennem hullet array i aluminium plader ved hjælp af CNC gravør. b tilpasse to gennem plader ved hjælp af justering huller. Efterfølgende var justeret pladerne stablet på matrixen magnet. c såning en tilstrækkelig mængde af stål perler på pladerne. (d) skrabning perlerne ved hjælp af en acryl plade til at fælde perler i matrixen gennem hullet. (e) perler blev fanget i matrixen gennem hullet. (f) den øverste plade (Φ750-µm gennem hullet array) blev fjernet og uhærdet PDMS blandingen var hældes i formen. (g) efter PDMS blev bagt på 80 ˚C til 2 h, var den hærdede PDMS unmolded. (h) den hærdede PDMS griber de stål perler. Perlerne fjernes derefter ved hjælp af en neodymium magnet (Φ15 mm med en tykkelse af 2 mm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Fabrikationsproces. a udarbejde to gennem hul plader og magnet array. i) aluminium plade under 750 µm gennem hullet array. II) aluminium plade har 550 µm gennem hullet array. III) 30 x 30 array af 1 mm x 1 mm x 1 mm magneter. b ovenfra af stablet og tilpasset plader. (c) underside af stablet og tilpasset plader og magnet array. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Fjerner overdreven celler af vigende menisk. Af håbefulde medium, overfladespænding var forårsaget af air-liquid interface, så overfladespænding skrottet overdreven celler på overfladen af microwell substrat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Konvekse mug og fabrikerede microwell array. a fanget perler i gennem hullet array aluminiumplade. De fangne perler fungere som en støbeform til at fabrikere den konkave microwells. Perle størrelse var 600 µm. Skalalinjen er 1 mm. (b) og (c) SEM billeder af opdigtede microwells. Hver fabrikerede microwell har en halvkugleformet figur, 600 µm i diameter. (d) Φ14-mm microwell array i 24-godt plade. Arrayet indeholder over 120 konkave microwells. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Kultur spheroids i matrix, konkave microwell. Φ14-mm microwell array var seedet med 2 x 106 ASCs og kulturperler i 3 dage. a kulturperler spheroids på dag 1; cellerne er begyndt at form spheroids. Skalalinjen er 2 mm. (b) kulturperler spheroids på dag 3; de dannede spheroids er mere stramt struktureret, mens deres gennemsnitlige diameter er faldet fra 185.68 ± 22.82 µm på dag 1 til 147.00 ± 17.11 µm på dag 3. Skalalinjen er 2 mm. c forstørrelse billeder af klumpformet på dag 1. Skalalinjen er 500 µm. (d) forstørrelse billeder af klumpformet på dag 3. Skalalinjen er 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Simulation resultat for vektor af magnetisk fluxtæthed. Tætheden af magnetisk flux på matrixen magnet blev beregnet ved hjælp af modulet magnetostatic. Simulering resultatet viser, at den stærkeste magnetiske fluxtæthed på midten af hver magnet, forårsager perler at være fanget i midten af gennem huller hvor de blev sikkert fast. Skalalinjen er 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Magnetfelt distribution af magnet array. Hver magnet er af den modsatte polaritet på sin nabo. Den vandrette magnetfelt er dominerende på grænsefladen mellem tilstødende magneter, mens den lodrette magnetfelt er stærkest på midten af hver magnet. Disse retningsbestemt styrker guide en perle til midten af en magnet. a magnetfelt af magnet array. b vektor af magnetfelt som bestemt af magnetostatic simulering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Begrænsning ved hjælp af én stor magnet og perle størrelse. (a) i modsætning til ved hjælp af en række små magneter, når en stor magnet bruges, næsten alle perlerne har tendens til at flytte til kanten eller midten af magneten hvor høj densitet magnetfelt er dannet. Yderligere, perlerne er forbundet for at danne en kæde form. Skalalinjen er 10 mm. (b) SEM billede af sammenkædede microwell, som blev fremstillet ved hjælp af Φ800 µm perler med 1 mm x 1 mm x 1 mm magnet array. Ved hjælp af en perle, der er for store i størrelse i forhold til størrelsen af magneten kan oprette et lille hul i muren mellem tilstødende microwells. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 : Betydningen af at vælge den passende top plade tykkelse og hul størrelse i perle fældefangst proces. (a) hvis den øverste plade er for tyk, opstår der en dobbelt fælde. b omvendt, hvis den øverste plade er for tynd, er der en tendens til perler til at komme ud. c hvis størrelsen af gennem hullet er større end den perle diameter, kan både dobbelt fælde og perle dislokation forekomme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den store udfordring for denne fabrikation metode var sikre fastsættelse af perler i matrixen gennem hullet i aluminiumplade. For at løse denne udfordring, blev magnetisk kraft i form af en 30 x 30 magnet array brugt til at lave perlerne sikkert, som vist i tallene 6 og 7. Den magnetiske fluxtæthed af matrixen magnet, som har den modsatte polaritet, er stærkest på midten af hver magnet overflade. Fordi styrken af den magnetiske kraft afhænger fluxtæthed, blev perler guidet til midten af oversiden af hver magnet hvor de blev holdt i position. Hvis en enkelt store magnet (5 cm × 5 cm × 1 cm) blev brugt, perler, især dem, der ligger i ekstremt huller, har tendens til at blive tiltrukket af højere intensitet magnetfeltet skabt på magnet kant. Et andet problem med at bruge store magneter er, at perlerne holde sammen spontant at skabe små bead kæder (figur 8a).

Øverste plade (750 µm hul) rolle var at tjene pit geometri for at fælde perler. Denne pit struktur er det muligt at ridse perler med en akryl plade til at oprette et stort antal fangne perle arrays på én gang (protokol 2,4 og figur 1 c og 1 d). Hvis ikke bruger den øverste plade, hver perle skal indsættes manuelt i base (550 µm hul) én ad gangen.

Begrænsninger i vores metode omfatter behovet for en CNC gravør, som er den dyreste enhed, der bruges i metoden. Sådanne CNC maskiner er prissat fra omkring $3000. Dette er dog stadig langt billigere end de konventionelle bløde litografi. En anden iboende begrænsning af vores metode er behovet for små magneter, og kløften mellem microwells er afhængig af magnet-størrelse, der var 1 mm i den demonstration, der er beskrevet i denne hvidbog. Det ville være vanskeligt at reducere denne kløft, der er meget mere da magneter mindre end 500 µm ikke er let tilgængelige. Desuden var maksimale størrelse af perle også begrænset. De fangne perler blev magnetisk af magneter. Hvis kløften mellem magnetiske perler blev for snæver, er sandsynligheden for stikning sammen højere end nogle af microwells var forbundet med huller, som vist i figur 8b. Derfor, når 1 mm x 1 mm x 1 mm magneter bruges, perler med en diameter på 700 µm eller mere anbefales ikke

Sammenlignet med andre fabrikation metoder såsom fleksibel membran14, ice litografi18 og dybt reaktive ion ætsning20, denne fabrikation metode kræver ikke særlige litografi faciliteter, tillader microwell positionen til at være nemt kontrolleres, og kan producere en standardiseret konkave microwell figur. Derudover har våde ætsning af PDMS21, gråtoner litografi22og bagdel diffust lys litografi23 foreslået til produktion af konkave geometrier. Dog våd ætsning af PDMS kræver en rektangulær struktur første til at gøre en konkav og runde microwell, og er ikke egnet til at gøre en åben microwell. Gråtoner litografi metode har fordelen af at udnytte eksisterende foto litografi faciliteter, men behovet for højt prissat faciliteter og gråtoner foto maske er en ulempe. Bagside diffust lys litografi var en anden nylig rapporteret metode nyttigt at fabrikere konkave microwells med forskellige skærmformater, men kun med den lave opløsning på mønster tæthed.

Den kritiske trin i den konkave microwell fabrikation er udvælgelsen af tykkelsen af og gennem hul størrelse af topplade (trin 1.1 og 1.3). Hvis gennem-huls plade er for tyk, kan flere perler blive fanget i hver gennem-hul (figur 9a); Hvis det er for tynd, perlerne ikke fast i trin 2.4 og dermed forvredet fra gennem-hullerne (figur 9b). I tilfælde af større gennem-hullet, kan både flere fælde og dislokation forekomme (figur 9 c).

Som en retningslinje for at vælge størrelsen af magneten og tykkelsen af gennem-huls plade, anbefales det, at størrelsen af magneten og tykkelsen af "gennem hullet plade" baseres på størrelsen af Perlen. Af magnet skal være større end diameteren af kugle, og tykkelsen af gennem-huls plade bør ikke overstige diameteren af kugle. Men da valg af magneter og pladetykkelse er empirisk, mere detaljerede optimering og parametrisk undersøgelser medtages i fremtidige undersøgelser.

Fremtidige mål for vores metode omfatter fremstilling af stamceller niche-lignende microwells til biomimetiske i vitro hårsækkene24, tilpassede microwells for forskellige arrays af forskellige størrelser microwells for at studere og organoid generation25 afhængighed af kræftceller og immunceller klumpformet størrelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT og fremtidige planlægning (NRF-2014R1A1A2057527 og NRF-2016R1D1A1B03934418).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CNC rotary engraver Roland DGA EGX-350
Micro drill bit HAM Präzision 30-1301 TA Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98% Daejung 7683-4100 For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet Supermagnete W-01-N 1 x 1 x 1 mm
Bearing ball Agami Modeling SUJ2 Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dowcorning Sylgard 184
Pluronic F-127 Sigma Aldrich p2443 Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) ATCC 30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) ATCC 30-2200
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells ATCC ATCC PCS-500-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31, (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42, (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101, (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5, (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21, (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22, (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18, (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37, (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37, (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11, (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31, (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83, (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3, (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31, (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19, (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32, (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8, (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11, (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7, (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4, (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125, (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3, (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101, (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106, (3), 237-242 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics