قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

غوانوسين ثلاثي الفوسفات (غتب) ملزمة هي واحدة من الأحداث المبكرة في G- البروتينات مستقبلات (غر) تفعيل. يصف هذا البروتوكول كيفية وصف فارماكولوجيكال التفاعلات غر-يجند محددة عن طريق رصد ربط التناظرية غتب التناظرية، [ 35 S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ 35 S] غتبس)، في استجابة ل يجند من الفائدة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vasavda, C., Zaccor, N. W., Scherer, P. C., Sumner, C. J., Snyder, S. H. Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding. J. Vis. Exp. (124), e55561, doi:10.3791/55561 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

مستقبلات G- البروتين المقترنة (غكرز) هي عائلة كبيرة من مستقبلات الغشاء التي تلعب أدوارا حاسمة في علم وظائف الأعضاء الخلوية الطبيعية وتشكل هدفا رئيسيا الدوائية لعدة مؤشرات، بما في ذلك تسكين، وتنظيم ضغط الدم، وعلاج الأمراض النفسية. على يجند ملزمة، غكرز تحفيز تفعيل الخلايا G- البروتينات من خلال تحفيز دمج غوانوزين ثلاثي الفوسفات (غتب). تنشيط البروتينات G ثم تحفيز مسارات الإشارات التي تثير الاستجابات الخلوية. يمكن رصد إشارات غر عن طريق قياس دمج شكل راديولبلد وغير قابل للتحلل من غتب، [ 35 S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ 35 S] غتبس)، في G- البروتينات. وخلافا للأساليب الأخرى التي تقيم المزيد من عمليات التشوير المصب، [ 35 S] غتبس ملزمة يقيس حدث داني في إشارات غر، والأهم من ذلك، يمكن أن يميز أغونيستيسي، المضادات، و منبهات معكوس. ويوضح هذا البروتوكول طريقة حساسة ومحددة لدراسة إشارات غكر باستخدام الاستعدادات الغشاء الخام من غر نموذجية، مستقبلات μ- الأفيونية (MOR1). على الرغم من وجود نهج بديلة لكسر الخلايا والأنسجة موجودة، وكثير منها باهظة التكلفة، مملة، و / أو تتطلب معدات المختبرات غير القياسية. توفر الطريقة الحالية إجراء بسيط يثري الأغشية الخام الوظيفية. بعد عزل MOR1، تم تحديد الخصائص الدوائية المختلفة من ناهض لها، [D-ألا، N-ميف، غلي-أول] -enkephalin (دامجو)، ومضاد، نالوكسون.

Introduction

مستقبلات G- البروتين المقترنة (غكرز) هي عائلة كبيرة من مستقبلات سطح الخلية المسؤولة عن مجموعة ملحوظة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك تسكين، والشم، والسلوك 1 . غرس تعمل عن طريق الاستشعار عن إشارات خارجية محددة وتحفيز في وقت لاحق إشارات الخلايا. وبالتالي فإنها تمثل مفترقا رئيسيا بين البيئات الخارجية والداخلية للخلية. ونظرا للدور الحاسم الذي تلعبه غرس في علم الأحياء، فقد أصبحت أهدافا رئيسية لكل من البحث الأساسي واكتشاف العقاقير 2 ، 3 .

وخلافا لأسر المستقبلات الأخرى التي تربط بروابط منفصلة، ​​غرس يمكن ربط أنواع مختلفة جدا من الجزيئات. في حين أن واحد غر قد تتفاعل مع الببتيدات، وآخر قد يشعر الفوتونات، جزيئات صغيرة، أو الأيونات 1 ، 4 . في حين أن بروابطها متنوعة، غرس موحدة في معماريتها العامةأور وظيفة. تتكون غرس الفردية تتكون من سبعة البروتينات α حلزونية الغشاء مع المحطات الأمينية خارج الخلية ومحطات الكربوكسيل داخل الخلايا 5 ، 6 . يقترن غرس إلى البروتينات G- البروتينات-هيتيروتريمريك المجمعات البروتين تتألف من α، β، و γ الوحدات الفرعية التي تتوسط مسارات الإشارات المختلفة 7 . الوحدة الفرعية G α هو بروتين ملزم من النيوكليوتيدات غوانين وهو غير نشط عندما تكون ملزمة لغوسين ثنائي الفوسفات (غب) ونشطة عندما تكون ملزمة ل غوانوسين ثلاثي الفوسفات (غتب) 8 ، 9 . عندما ترتبط غكرز بروابطها، فإنها تخضع لتغيير تراكمي يسمح G α للفصل من G βγ ، مما يسمح G α لتبادل الناتج المحلي الإجمالي ل غتب 7 . فوسفهوريلاتد نفسها في محطة الكربوكسيل من قبل مختلف سيرين / ثريونفي كيناز 10 ، 11 واستيعابها لتخفيف إشارات مستقبلات 12 ، 13 ، 14 . وفي الوقت نفسه، يتم تنشيط المونومر G α و G βγ ديمر لتنشيط مسارات الإشارات المميزة 7 . هناك العديد من الأشكال الإسوية لكل وحدة فرعية من البروتينات G، ويهدف كل شكل إسوي مسارات معينة في اتجاه المصب ونظم رسول ثانوية. وتشمل الأشكال الشكلية G α الرئيسية G s و G q و G i / o و G 12-13 . عادة، غرس الفردية المرتبطة مع إيسوفورم G α معينة ، وبالتالي ربط حافز خارجي لاستجابة الخلوية محددة 1 .

توصيف التفاعل غر-يجند أمر بالغ الأهمية لفهم البيولوجيا للمستقبلات. كما الناتج المحلي الإجمالي / تبادل غتب هو واحد من عشية أقربنتس يلي يجند ملزمة، ورصد غتب ملزمة يمكن قياس تنشيط غر أو تثبيط. إن فحص المزيد من أحداث المصب في إشارات غكر غالبا ما لا يكون كمي أو متكافئ، قد لا يميز منبهات كاملة من تلك الجزئية، ويمكن أن يتطلب الكواشف باهظة الثمن. وعلاوة على ذلك، زيادة غتب ملزمة للبروتينات G α هو حدث شبه عالمي بعد تفعيل غر، وهذا يعني أن قياس غتب ملزمة هو مقايسة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لرصد نشاط معظم غرس. قياس غتب ملزمة هو نهج بسيط وسريع لرصد الإشارات غر في الخلايا أوفيركسريسينغ مستقبلات من الفائدة أو في الأنسجة المحلية. هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة ملزمة غتب وظيفية باستخدام غر النموذجية، مستقبلات μ- الأفيونية (MOR1)، لتحديد كميا نشاط ناهض ومضاد على إشارات غر.

يوضح هذا البروتوكول أولا كيفية عزل الأغشية الخام من الخلايا أوفيركسريسينغ MOR1. ملاحظة ثار هذا البروتوكول لا يقتصر على أنظمة أوفيركسريسيون ويمكن تطبيقها على العديد من مصادر الغشاء، بما في ذلك الأنسجة الأصلية أو الاستعدادات معربا عن مستقبلات متعددة والبروتينات G 15 . بروتوكول ثم تفاصيل كيفية قياس ملزم غتب التناظرية إلى هذه الأغشية ردا على تركيزات مختلفة من [D-ألا، N-ميف، غلي-أول] -enkephalin (دامجو) أو نالوكسون، ناهض MOR1 ومضاد، على التوالي. و غتب التناظرية، [ 35 S] غوانوسين-5'- O- (3-ثيو) ثلاثي الفوسفات ([ 35 S] غتبس)، غير قابلة للتحلل. هذه الخاصية أمر بالغ الأهمية لأن G α الوحدات الفرعية تظهر النشاط غتباس جوهري 7 ، والقضاء على فوسفات غاما المسمى على مادة كيميائية غتب هدروليزابل. ثم يتم حبس الأغشية على مرشحات الألياف الزجاجية وغسلها، وبعد ذلك يتم تحديد غتب راديولبلد بواسطة العد التلألؤ السائل. يمكن اشتقاق المعلمات الدوائية متعددة إلى تشاراكتريزه التفاعل المستقبلي-يجند، بما في ذلك الاستجابة نصف القصوى (إيك 50 ) ومعامل هيل (ن H ) للالمضادات والتركيز مثبط نصف القصوى (إيك 50 ) والتوازن التفكك ثابت (K ب ) للمضادات 16 و 17 ، 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التعبير عن ريكومبينانت ها-MOR1 في الخلايا المستزرعة

ملاحظة: اتبع جميع بروتوكولات ثقافة الخلية في غطاء تدفق الصفحي العقيمة.

  1. تعقيم ثقافة الخلية الصفحي تدفق غطاء محرك السيارة مع الايثانول 70٪ والحفاظ على تقنية معقمة في جميع أنحاء ثقافة الخلية.
  2. إعداد خلايا الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) خلية استزراع المتوسطة، كاملة دولبيكو المعدلة النسر المتوسطة (دمم): دمم، ودرجة الحموضة 7.4، تستكمل مع 2 ملي L- الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 10٪ مصل بقري الجنين (فبس ).
  3. لوحة 2.5 × 10 6 HEK293 الخلايا على 10 سم لوحة زراعة الأنسجة في 10 مل من دمم كاملة واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 حتى 70-80٪ يتم التوصل كونفلنسي (O / N).
    ملاحظة: لجمع ما يكفي من البروتين لتجربة كاملة ملزمة غتب، لوحة لا يقل عن 3 × 10 سم لوحات من الخلايا.
  4. ترانسفيكت الخلايا مع ها-MOR1 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن من الاختيار وباتباع الشركة المصنعة "؛ المبادئ التوجيهية. احتضان لمدة 36-48 ساعة.
    ملاحظة: الإنسان مور-1 [كدنا (نسبي مرجع تسلسل: NM_000914.4) كان هدية سخية من غافريل باسترناك واستنسخت في بمف-ها.

2. تجزئة الخلية وجمع الغشاء

  1. إعداد مخازن تحلل التالية:
    1. العازلة 1: 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثانسولفونيك حمض (هيبيس)، ودرجة الحموضة 7.4. 1 ملي إثيلين غليكول-بيس (β-أمينو إيثيل إيثر) -N، N، N '، N'-تيتراسيتيك أسيد (إغتا)؛ 10٪ السكروز. بروتيز المانع كوكتيل. و 1 ملي ديثيوثريتول (دت). إضافة دت جديدة في يوم العزلة الغشاء.
    2. العازلة 2: 10 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4. 1 ملي إغتا؛ 1 ملي مغكل 2 ؛ و 1 ملم دت. إضافة دت جديدة في يوم العزلة الغشاء.
  2. إزالة الخلايا ترانزفكتد من الحاضنة (الخطوة 1.4)، نضح المتوسطة، وشطف الخلايا مع 5 مل من الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (بس). نضح برنامج تلفزيوني والسائل الزائد منالطبق.
  3. إضافة 600 ميكرولتر من العازلة 1 إلى الخلايا. باستخدام مكشطة الخلية، طرد الخلايا من سطح اللوحة وماصة تعليق الخلية في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.6 مل.
  4. على الفور المفاجئة تجميد أنبوب ميكروسنتريفوج في النيتروجين السائل. مرة واحدة يتم تجميد العينات، ذوبان الجليد المحللة على الجليد أو وضعها في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  5. كرر الخطوات 2.3 و 2.4 مع جميع لوحات الخلايا.
  6. مرة واحدة قد ذوبان المحللات، واستخدام واحد النبض الجزئي أنبوب الخالط لكسر فتح الخلايا. نبض الخالط 3-5 مرات لمدة 10 ثانية، ووضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 30 ثانية بين البقول.
    1. جمع 20 ميكرولتر كما جزء خلية كاملة.
  7. الطرد المركزي العينة المتبقية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجة مئوية. جمع طاف ومكان في 1.6 مل أنبوب ميكروسنتريفوج جديد على الجليد.
  8. ريسوسبيند بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة 1 و ريهوموجينيز مع مدقة. نبض هوموجينيزر 3-5 مرات لمدة 5 ثوان، ووضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 30 ثانية بين البقول.
    1. أجهزة الطرد المركزي العينة مرة ثانية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجة مئوية. الجمع بين طاف مع طاف من الخطوة 2.7.
      ملاحظة: يحتوي على بيليه المتبقية النووية والبروتينات الغشاء.
  9. الطرد المركزي سوبيرناتانتس مجتمعة لمدة 20 دقيقة في 11000 x ج و 4 درجة مئوية. فصل طاف (جزء عصاري خلوي) إلى 1.6 مل أنبوب ميكروسنتريفوج جديد.
  10. ريسوسبيند بيليه في 200 ميكرولتر من العازلة 2. تجانس بيليه بواسطة تريتوراتينغ 3-5 مرات. الطرد المركزي العينة لمدة 20 دقيقة في 21،100 زغ و 4 درجة مئوية. نضح طاف. ريسوسبيند الكرية التي تحتوي على جزء غشاء الخام في 50 ميكرولتر من العازلة 2.
  11. انتقل فورا إلى التجارب ملزمة غتبس (القسم 3) أو المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. [ 35 S] غتبس ملزمة ملاحظة: استخدام بروتوكول السلامة الكيميائية الإشعاعية القياسية عند التعامل مع [ 35 S] غتبس وعند إجراء [ 35 S] غتبس ملزمة التجارب. ارتد القفازات الواقية ومعطف المختبر في جميع الأوقات. تحقق من مواد التعبئة والتغليف للتسرب أو الشقوق. التخلص من النفايات والكواشف الزائدة وفقا للبروتوكولات المؤسسية.

  1. إعداد غير ملزمة ملزمة ملزمة (إب) عن طريق خلط 50 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4. 5 ملي MgCl2؛ 100 ملي كلوريد الصوديوم؛ و 1 ملي إيثيلينديامينتيتراسيتيك حمض (إدتا) في الماء المقطر.
  2. تمييع الأسهم [ 35 S] غتبس إلى 50 نانومتر في 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6، و 10 ملي دت. جعل 500 أليكوتس ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية. استخدام فقط قسامة ذوبان حديثا مباشرة قبل بدء التجربة. ذوبان الجليد، أليكوتس، عن، إكتسى بالجليد.
  3. إعداد غتبس نونراديو المسمى عن طريق إذابة 1 ملغ من مسحوق غتبس في 177.62 ميكرولتر من الماء النقي لتركيز الأسهم من 10 ملم. جعل قسامة 10 ميكرولتر وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  4. إعداد عازلة ملزمة كاملة (مصرف البحرين المركزي) عن طريق تكملة إب لتشمل تركيز النهائي من 1 ملم دت، 0.1٪ (وزن / حجم) ألبومين المصل البقري (بسا)، 10 الناتج المحلي الإجمالي ميكرومتر، و 0.1 نانومتر [ 35 S] غتبس.
    ملاحظة: يحتوي مصرف البحرين المرکزي الآن علی غتب مشع من قبل راديولبلد. اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة أثناء العمل مع الحلول المشعة.
  5. ذوبان الجليد جزء الغشاء من الخطوة 2.11 على الجليد.
  6. تحديد تركيز البروتين من جزء غشاء عن طريق فحص البروتين برادفورد باستخدام الطيفي في 595 نانومتر.
    1. إعداد سلسلة التخفيف من معايير البروتين بسا مع العازلة 2، في تركيزات النهائية من 0، 250، 500، 750، 1،500، 2،500، و 5،000 ميكروغرام / مل.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من كل معيار أو غشاء إلى 1 مل من برادفورد كاشف في كوفيت. مزيج دقيق من قبل فورتيكسينغ.
    3. ضبط الطيف إلى الطول الموجي من 595 نانومتر وفراغ باستخدام كوفيت مع 0 ميكروغرام / مل من البروتين.
    4. انتظر 5 دقائق و rإيد كل من المعايير وكل من العينات في الطول الموجي 595 نانومتر.
    5. رسم الامتصاصية للمعايير مقابل التركيز. وباستخدام قانون بير لامبرت (A = εcl، حيث ε = معامل الانقراض، l = طول كوفيت، و c = تركيز)، احسب تركيز عينات الغشاء.
  7. تمييع الكسور الغشاء إلى تركيز 100 ميكروغرام من البروتين / مل في إب.
    ملاحظة: واحد 10 سم طبق من خلايا HEK293 ينتج عادة بين 1 و 3 ملغ بروتين / مل.
  8. إعداد الظروف التجريبية التالية في الفردية 1.6 مل أنابيب ميكروسنتريفوج: سلسلة التخفيف يجند، شرط النشاط القاعدي لقياس غتب القاعدية ملزمة، وحالة ملزمة غير محددة لقياس غير محددة غتب ملزمة.
    1. لسلسلة التخفيف يجند، وإعداد سلسلة التخفيف من يجند من الفائدة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي. إعداد سلسلة يجند في 2X كونسنتراتي النهائي المطلوبالإضافات. الفضاء تركيزات يجند لتغطية كافية مجموعة من الردود.
      1. لتقييم تأثير دامجو على غتب ملزمة عبر MOR1، وإعداد التخفيفات دامجو من 2 ملم، 200 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 2 ميكرومتر، 200 نانومتر، 20 نانومتر، 2 نانومتر، 200 ص / ب، 20 م، 2 م في مصرف البحرين المركزي (النهائي حجم: 100 ميكرولتر).
        ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان يجند الفائدة لديه قيمة إيك 50 المتوقعة من 10 ميكرومتر، وإعداد التخفيفات يجند من 200 نانومتر، 2 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 200 ميكرومتر، و 2 ملم. هذه الشروط الخمسة تغطي مجموعة واسعة من تركيزات و 2 X التركيز المطلوب للمقايسة.
    2. للالتزام القاعدي، وإعداد أنبوب مع 100 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي فقط.
    3. لملزم غير محدد، وإعداد أنبوب مع 99 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي تستكمل مع 1 ميكرولتر من 2 ملم غتبس نونراديو المسمى.
  9. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الغشاء المخفف (الخطوة 3.7) إلى كل حالة تجريبية.
  10. احتضان الأغشية مع مختلف إكسيريمالظروف في إنتال 1.6 مل أنابيب ميكروسنتريفوج لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية في ثيرموميكسر أو على شاكر المداري.

4. غشاء الترشيح

  1. إعداد غسل العازلة من خلال الجمع بين 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4. 5 ملي مغكل 2 ؛ و 50 ملي كلوريد الصوديوم في الماء المقطر.
  2. بريسواك مرشحات الألياف الزجاجية في الماء لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: مرشحات لها حجم المسام من 1 ميكرون، يبلغ قطرها 2.1 سم، وسمك 675 ميكرون.
  3. إزالة العينات من ثيرموميكسر أو شاكر المداري (الخطوة 3.10). لفترة وجيزة نبض تدور العينات لمدة 5 ثوان لجمع كل عينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. إزالة غطاء جهاز الترشيح الفراغ. وضع المرشحات بريسواكيد على منافذ فراغ الجهاز. أعد تأمين غطاء الجهاز لتشكيل ختم فراغ. بدوره على الفراغ.
  5. ماصة 195 ميكرولتر من كل 200 ميكرولتر حالة تجريبية على مرشحات لتقليل الخطأ من الامتزاز إلى جدران الأنبوب و / أو من الماصةتينغ.
  6. غسل المرشحات ثلاث مرات مع 1 مل من غسل الجليد العازلة الباردة.

5. التلألؤ السائل العد

  1. وضع 5 مل تلألؤ العد قارورة في رف العد. إضافة 5 مل من سائل التلألؤ إلى كل قارورة.
  2. إيقاف فراغ (الخطوة 4.4). إزالة غطاء جهاز الترشيح الفراغ. باستخدام ملاقط، والتقاط الفلاتر من الموانئ فراغ جهاز الترشيح وإسقاط كل مرشح إلى 5 مل قارورة التلألؤ الفردية.
  3. إعداد قارورة واحدة مع 195 ميكرولتر من مصرف البحرين المركزي لتحديد إشارة القصوى.
  4. كاب كل قارورة بشكل آمن. احتضان قارورة على شاكر المداري في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. قم بتشغيل عداد التلألؤ. برنامج عداد التلألؤ لقياس 35 S نظائر الانبعاثات لمدة 5 دقائق لكل عينة باستخدام برنامج التلألؤ القياسية المرتبطة.
  6. اضغط على "ابدأ" لاتخاذ العد.
  7. عندما يتم العد، والتخلص من قارورة عدهاك النفايات الخطرة.

6. تحليل البيانات

  1. أدخل البيانات في الإحصاءات وتحليل البرمجيات.
    1. طرح ملزمة غير محددة من كل من القياسات الأخرى لتحديد ملزمة محددة.
      ملاحظة: يتم تحديد درجة الارتباط غير محددة من قبل العينة المحتضنة مع غتبس غير راديولبلد (الخطوة 3.8.3).
    2. افتح الإحصاءات وتحليل البرمجيات وحدد إدخال مجموعة بيانات زي.
    3. أدخل بيانات الربط المحددة من تجارب ربط [ 35 S] غتبس في جدول بيانات في برنامج الإحصاءات والتحليل. أدخل تركيزات ناهض، وتركيزات المولي، في العمود "X". أدخل التهم 35 S المرتبطة كقيم "Y".
  2. تحويل البيانات.
    1. تحويل القيم X إلى لوغاريتم كل منها عن طريق النقر على "تحليل". حدد "تحويل" من المدمج في طn.
    2. ضمن مربع الحوار "تحويل"، حدد "تحويل القيم X باستخدام" وحدد الدالة "X = لوغ (X)". اختر إنشاء رسم بياني جديد للنتائج.
    3. انقر فوق موافق."
  3. تطبيع القيم Y.
    1. عند عرض النتائج المحولة، انقر على "تحليل". حدد "تطبيع" من التحليلات المضمنة.
    2. ضمن مربع الحوار "تطبيع"، حدد زر الاختيار لتحديد 0٪ ك "أصغر قيمة في كل مجموعة بيانات" و 100٪ ك "أكبر قيمة في كل مجموعة بيانات". حدد المربع لعرض النتائج كنسب مئوية. حدد المربع لإنشاء رسم بياني جديد للنتائج.
    3. انقر فوق موافق."
  4. تناسب منحنيات الانحدار غير الخطية للبيانات المخططة. إجراء تحليل الانحدار غير الخطية.
    1. مع عرض النتائج المطورة، انقر فوق "تحليل". من التحليلات المضمنة، حدد "الانحدار غير الخطية (منحنى مناسبا)."
    2. إذا كان التحقيق في ناهض، حدد "سجل (ناهض) مقابل استجابة طبيعية - المنحدر متغير" من مربع الحوار.
    3. إذا كان التحقيق في خصم، "حدد سجل (خصم) مقابل استجابة طبيعية - المنحدر متغير" من مربع الحوار.
    4. انقر فوق موافق."
  5. راجع الرسم البياني والنتائج لضمان توافق البيانات والبيانات بشكل معقول. تأكد من أن الانحدار يطابق النمط العام للبيانات المرسومة وأن البقايا ليست كبيرة بحيث تجعل منحنى الجرعة والاستجابة مسطح.
    ملاحظة: سيقوم البرنامج تلخيص نتائج الانحدار غير الخطية وتفاصيل التركيز الذي ينبع من استجابة نصف القصوى (إيك 50 )، ومعامل هيل (ن H )، والتركيز مثبط نصف القصوى (إيك 50 ).
  6. مشتق ناهض / مضاد المعلمة قوة.
    1. اشتقاق ناهض إك(K b ) من أي من التجارب التالية 16 ، 17 ، 18
      1. تقييم التحول في الجرعة والاستجابة من ناهض في المنافسة مع تركيز ثابت من الخصم. هنا، إيك 50 '= إيك 50 (1 + [مضاد] / خصم كب)، حيث إيك 50 ' هو التحول إيك 50 الصحيح.
      2. تقييم [ 35 S] غتبس ملزمة مع تركيزات مختلفة من خصم في المنافسة مع تركيز ثابت من ناهض. هنا، K b = إيك 50 / (2 + ([أغونيست] / أغونيست إيك 50 ) n ) 1 / n - 1، حيث n هو معامل هيل للناهض.
  7. اعتمادا على تباين البيانات، كرر التجربة (الخطوات 3،3-5،6) لكل يجند حوالي 3-5 مرات ومتوسط ​​النتائج باستخدام إحصاءات وتحليل سوفتول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن استخدام تجزئة الخلية لعزل وإثراء البروتينات المرتبطة بالغشاء من البروتينات الخلوية الخلوية والبروتينات النووية. الشكل 1 هو لطخة غربية مما يدل على محتويات الكسور الأولية الثلاثة التي يمكن جمعها خلال عملية تجزئة تحت الخلوية. على وجه التحديد، ويبين الشكل 1 أن تجزئة تفصل نظيفة البروتينات الغشاء ( أي نا + / K + أتباس، وثنائي كبريتيد ثنائي إيزوميراز (بدي)، و ها-MOR1) من هيستون H2B و غليسيرالدهيد 3-فوسفات نازعة (غابد) والبروتينات النووية، والبروتينات عصاري خلوي، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، يوضح الشكل 1 إثراء البروتينات (حارة 1 مقارنة حارة 4) في الكسور تحت الخلوية منها نتيجة للتجزئة. يظهر ممثل بونسو وصمة عار على تحميل البروتين متساوية في كل جزء. من المهم أن نلاحظ أن هذا فراكتشيبروتوكول التفريق لا يميز بين الأغشية الخلوية المختلفة. بدي عموما مترجمة إلى الشبكة إندوبلازميك (إير)، في حين نا + / K + أتباس هو في الغالب في غشاء البلازما. ومع ذلك، كل من البروتينات موجودة في الجزء الأخير من غشاء الخام ( الشكل 1 ، حارة 4). بالإضافة إلى ذلك، في حين أن هذا البروتوكول يفصل بقوة البروتينات النووية من عصاري خلوي والجزء النهائي الغشاء ( الشكل 1 ، الممرات 2-4)، وجزء المخصب للبروتينات النووية يحتوي على بعض البروتينات الغشائية ( الشكل 1 ، حارة 2)، وربما من إير.

يمكن اشتقاق المعلمات الدوائية متعددة لتوصيف التفاعل غر-يجند عن طريق التجارب ملزمة غتب ( الجدول 1 ). على سبيل المثال، يمكن استخلاص الاستجابة نصف القصوى (إيك 50 ) ومعامل هيل (ن H ) من ناهض عن طريق رصد غتب ملزمة فياستجابة لجرعات مختلفة من ناهض. يوضح الشكل 3A غتب تستجيب للجرعة ملزمة ل MOR1 بعد العلاج دامجو. عندما تكون البيانات مناسبة للانحدار غير الخطية أربعة المعلمة، يصف مناسبا تفاعلات مستقبلات يجند مع إيك 50 من 185 ± 23 نانومتر ومعامل هيل من 0.46 ± 0.06. المنحنى الملزم غتب ملزم لوحظ بعد العلاج دامجو تشير إلى التعاونية السلبية بين دامجو و MOR1. هذا الأسلوب يمكن أيضا تحديد ووصف الصيدلة من خصم. كما يوضح الشكل 3A و B ، النالوكسون هو مضاد MOR1. تم تحديد فعالية ناهض (K ب ) من نالوكسون، 97 ± 20 نانومتر عن طريق تغيير تركيز النالوكسون في المنافسة مع تركيز ثابت من دامجو ( الشكل 3A ). عرضت نالوكسون معامل هيل 0.88 ± 0.06، مما يشير إلى ارتباط مستقل بين النالوكسون و MOR1. إذا كان أسلا يمكن معرفة هذا المقايسة بين ناهض، خصم، وناهض معكوس. إذا يجند هو ناهض، سيكون هناك زيادة في غتب ملزمة، كما هو الحال في الشكل 3A ، بعد تطبيق دامجو. إذا كان يجند هو ناهض معكوس، سيكون هناك تقلص ملزمة من غتب نسبة إلى ملزمة القاعدية. إذا كان يجند هو مضاد، لن يكون هناك أي تأثير على العلاج مع يجند وحدها. إذا طبقت بالتزامن مع ناهض، ومضاد تمنع قدرة ناهض لتحفيز غتب ملزمة. يوضح الشكل 3A نشاط خصم النالوكسون ضد دامجو ناهض.

شكل 1
الشكل 1: تجزئة الخلوية يفصل البروتينات المرتبطة بالغشاء، النووية، و سايتوسوليك. ( أعلى ) لين 1 يمثلالبروتين الموجود في الخلية بأكملها. لين 2 يحتوي على البروتينات النووية والغشاء المرتبطة فصل خلال الخطوات الطرد المركزي الأولى. لين 3 هو جزء عصاري خلوي فصل بعد 20 دقيقة من الطرد المركزي في 11،000 x ز. لين 4 يحتوي على جزء غشاء الخام مناسبة ل [ 35 S] غتبس ملزمة التجارب. ( القاع ) وصمة عار بونسو من غشاء الغربية يوضح البروتين تحميل لكل جزء الخلوي. تم استخدام الأجسام المضادة التالية ل إمونوبلوتينغ: الماوس مكافحة نا + / K + -ATPase (1: 1،000)، والماوس مكافحة غابد (1: 5000)، والماوس المضادة H2B (1: 2500)، الأرنب المضادة بدي : 1،000)، ومكافحة الفئران ها (1: 2،000). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مخطط تدفق يوضح التجزئ و [ 35 S] إجراء ربط غتبس. أولا، ترانسفيكت الخلايا للتعبير عن غر من الفائدة. بعد 48 ساعة، حصاد وكسر الخلايا لعزل المستقبلات (الأحمر) والبروتينات G المرتبطة بها (الأخضر = G α ، الأرجواني = G β ، والبرتقالي = G γ ). لإجراء تجارب ملزمة غتب، إضافة [ 35 S] غتبس واحتضان الأغشية مع يجند من الفائدة. لقياس نشاط البروتين G، ربط الأغشية لمرشح لغسل أي مادة كيميائية كيميائية غير منضم ثم تحديد غتبس [ 35 S] ملزمة من قبل العد التلألؤ السائل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: أغونيسم aالعداء في مستقبلات μ- الأفيونية المحددة بواسطة [ 35 S] غتبس ملزمة. ( A ) [ 35 S] غتبس منحنى الاستجابة الجرعة ل دامجو وحدها (الأزرق) أو نالوكسون في منافسة مع 2.5 ميكرومتر دامجو (الأخضر). [ 35 S] تم تطبيع الارتباط غتبس إلى التحفيز القصوى في كل تجربة وأعرب عن كنسبة مئوية. النقاط المبينة هي متوسط ​​تحديد ثلاث نسخ ويتم التعبير عنها كمتوسط ​​+ سيم ( B ) عدائية دامجو المحفز [ 35 S] غتبس ملزمة بواسطة نالوكسون. [ 35 S] غتبس تم قياس كميا بعد إضافة نالوكسون وحدها (100 ميكرومتر)، دامجو وحدها (10 ميكرومتر)، أو دامجو (10 ميكرومتر) في المنافسة مع نالوكسون (100 ميكرومتر). وتعبر النتائج عن متوسط ​​± سيم من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر عليهإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يجند إيك 50 أو إيك 50 (نم) n ح K b (نم)
DAMGO 185 ± 23 0.46 ± 0.06
نالوكسون 420 ± 87 0.88 ± 0.06 97 ± 20

الجدول 1: معلمات الدوائية من دامجو ونالوكسون النشاط في مستقبلات μ- الأفيونية. استمدت الاستجابة نصف القصوى (إيك 50 ) ومعامل هيل (n H ) ل دامجو من [ 35 S] غتبس ملزمة استجابة لجرعات مختلفة من دامجو. تركيز المثبطة نصف القصوى(إيك 50 ) والتوازن التفكك ثابت (K ب ) ل نالوكسون تم تحديدها من تأثير المنافسة بين النالوكسون و 2.5 ميكرومتر دامجو على [ 35 S] غتبس ملزمة. وتعبر النتائج عن متوسط ​​± سيم من ثلاث تجارب مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول طريقتين منفصلتين ولكن تكميليتين: نهج بسيط لتجزئة الخلايا والأنسجة إلى مقصورات واسعة ولكنها متميزة ووسيلة للتحقيق في إشارات غر عن طريق قياس [ 35 S] غتبس ملزمة.

تجزئة الخلوية فعالة لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، بدءا من استخراج وإثراء البروتينات، لتقييم توطين الخلايا من البروتينات، لدراسة علم الصيدلة مستقبلات. على الرغم من وجود نهج بديلة لتجزئة الخلايا والأنسجة موجودة، والبروتوكول المقدمة هنا هو أرخص نسبيا وأسرع وأبسط. على عكس الأساليب الأكثر رسوخا، ومع ذلك، هذه الطريقة غير قادرة على فصل نظيفة البروتينات المرتبطة غشاء البلازما من مقصورات غشائية أخرى، مثل إندوسوميس أو إير. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه في حين أن البروتوكول أعلاه يستخدم نظام أوفيركسريسيون عابرة لتوليد أغشية الخلايا التي تحتوي على غكر منالفائدة، وهذا البروتوكول متوافق مع أنظمة أوفيركسريسيون مستقرة، وكذلك مع الحيوانات أو الأنسجة البشرية 19 .

إعداد العينة أمر بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من العائد جزء والنقاء. ومن المهم بصفة خاصة ضمان التجانس الكامل والتقليل إلى أدنى حد من أوقات الانتقال بين خطوات الطرد المركزي. استخدام الخالط بيليه / مدقة لتعطيل تماما غشاء الخلية يزيد بشكل كبير من غلة الغلة الخام في جزء الخلية النهائي. إذا كان غلة الغلة منخفضة جدا، فإن اثنين من أبسط الحلول يكون لتوسيع ثقافة الخلية الأولية و / أو تجانس بيليه الخلية بضع مرات أخرى. إذا كسور الفردية تظهر درجة عالية من النجاسة، والحد من أوقات الانتقال بين الطرد المركزي والفصل. لا تسمح العينات للجلوس بعد الطرد المركزي، والبروتينات قد تنتشر في العينة وتقليل نقاء جزء.

[ 35 S] غتبو القائم على الترشيحS هو طريقة سريعة وكمية لقياس تفعيل G- البروتينات باستخدام مستقبلات المرتبطة بها. قياس غتب ملزمة يسمح لقياس أكثر كمية من النشاط غكر مما هو ممكن عموما عند رصد العمليات المصب. ومع ذلك، هناك اثنين من القيود الحرجة على الطريقة الموضحة هنا. الأهم من ذلك، الكمي القائم على الترشيح [ 35 S] غتبس الكمي ليس ممكنا على قدم المساواة مع جميع الأشكال الإسوية G α 20 ، 21 . بشكل عام، يقتصر هذا الأسلوب على G i / o -Coupled غكرز مثل MOR1 22 . G s - و G مستقبلات q- كوبيلد تميل إلى أن تكون أقل حساسية. ويرجع ذلك على الأرجح إلى الجمع بين وفرة أقل من G / G س وأسعار الصرف النيوكلوتيد أبطأ نسبيا، مما يجعل من الصعب التمييز الحقيقي [ 35 S] غتبس ملزمة فوق الخلفية. وقد تم تناول هذا القيد إلس في مكان آخر باستخدام G- البروتين تقنيات التقاط الأجسام المضادة 20 . وقد وجدت بعض المجموعات أن القضاء على الناتج المحلي الإجمالي من رد فعل يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ل G ق - أو G مستقبلات q- كوبلد 23 . القيد الثاني هو حساسية الغشاء لناهضات محبة للدهون أو السطحي. [ 35 S] فحوصات غتبس تتطلب مجمعات وظيفية مستقبلات G- بروتين، وإضافة جزيئات محبة للدهون إلى نظام التفاعل قد تعطل هيكل الأغشية أو هذه المجمعات. إذا كان هذا هو مصدر قلق محتمل، قد يكون من المفيد اختبار ما إذا كان كاشف الفائدة يعطل [ 35 S] غتبس ملزمة في نظام يتميز بالفعل بالفعل، كما هو الحال في تحفيز MOR1 بوساطة دامجو. وتشمل الشروط الأخرى للنظر في تحسين الرقم الهيدروجيني العازلة ملزمة، وتركيزات مغ 2+ و كلوريد الصوديوم، وتركيز البروتين، ووقت الحضانة 23 ،إف "> 24.

ركز هذا البروتوكول على غر يتميز جيدا، و MOR1، والأدوية المميزة جيدا، دامجو (ناهض) و نالوكسون (خصم)، التي تعمل على MOR1. ومع ذلك، واحدة من مزايا هذه التقنية هو أنه يمكن استخدامها لتوصيف ليغاندس غير معروف كما ناهضات، مضادات، أو منبهات معكوس، اعتمادا على كيفية يجند ينظم غتب ملزمة. عند تصميم التجارب، فمن الأهمية بمكان استخدام مجموعة من تركيزات من يجند من الفائدة، وأن نأخذ في الاعتبار مجموعة من النتائج: منبهات سوف يسبب زيادة في غتب ملزمة على خط الأساس، سوف منبهات معكوس يسبب انخفاض في غتب ملزمة بالمقارنة مع وخط الأساس، والمضادات يكون لها تأثير يذكر إلى أي تأثير عندما تضاف في عزل على خط الأساس غتب ملزمة.

وباختصار، يصف هذا البروتوكول تقنية لأداء تجزئة تحت الخلوية، وجمع الاستعدادات الغشاء الخام، والتحقيق تفعيل غر عن طريق قياس [ 35 S] Gتبس ملزمة. هذه التقنيات يمكن تكييفها بسهولة لمجموعة متنوعة من زراعة الخلايا ونماذج الأنسجة لدراسة الصيدلة من واحدة من أهم الأسر من المستقبلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يعلن المؤلفون أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة دا-000266 وبرنامج التدريب الطبي T32 منحة الطبيب (كف، نوز، وأجهزة الكمبيوتر). ويود المؤلفون أيضا أن يعترفوا شققا 18: 24 (somersault1824.com) لمكتبة العلوم والطبية الرسوم التوضيحية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Thermo Fisher Scientific 10313021 Warm in a 37°C water bath before use
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Warm in a 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Warm in a 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Warm in a 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16000044 Warm in a 37°C water bath before use
Cell culture 10 cm plate Sigma-Aldrich CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) Thermo Fisher Scientific BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 2900
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DO632
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028-1
Pellet pestles motor Sigma-Aldrich Z359971
Pestles Bel Art F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA) Affymetrix 10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)  Perkin Elmer NEG030H
nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)  Sigma-Aldrich 89378
guanosine diphosphate (GDP) Sigma-Aldrich 51060
Bradford reagent Bio-Rad 5000006
UV/VIS spectrophotometer Beckman Coulter DU640
spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
orbital shaker Thermo Fisher Scientific 2314
thermomixer Eppendorf 535027903
glass fiber filters  GE Healthcare Life Sciences 1821-021
vacuum filtration apparatus Millipore Corporation XX2702550
desktop microcentrifuge Eppendorf 65717
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
scintillation fluid  Ecoscint A LS-273
scintillation counter vials Beckman Coulter 592690
scintillation vial lids Beckman Coulter 592928
Prism 6 GraphPad Software PRISM 6
ATP1A1 antibody Developmental Studies Hybridoma a6F 1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody EMD Millipore CB1001 1:5000 in 3% BSA
H2B antibody Cell Signaling 2934S 1:2500 in 3% BSA
PDI antibody Cell Signaling 3501S 1:1000 in 3% BSA
HA antibody Roche 11867423001 1:2000 in 3% BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768, (4), 794-807 (2007).
  2. Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
  3. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5, (12), 993-996 (2006).
  4. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  5. Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238, (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
  6. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
  7. Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80, (2), 249-257 (1995).
  8. Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, (8), 3087-3090 (1974).
  9. Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252, (20), 6966-6969 (1977).
  10. Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, (11), 3173-3177 (1983).
  11. Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21, (12), 3014-3022 (1982).
  12. Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248, (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
  13. Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308, (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
  14. Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25, (8), 413-422 (2004).
  15. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325, (3), 869-874 (2008).
  16. Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22, (23), 3099-3108 (1973).
  17. Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109, (4), 1110-1119 (1993).
  18. Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. Springer. 55-65 (2011).
  19. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325, (3), 869-874 (2008).
  20. Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24, (2), 87-90 (2003).
  21. Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74, (4), 489-508 (2003).
  22. Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47, (4), 848-854 (1995).
  23. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. (2004).
  24. Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161, (6), 1238-1249 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics