Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vasavda, C., Zaccor, N. W., Scherer, P. C., Sumner, C. J., Snyder, S. H. Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding. J. Vis. Exp. (124), e55561, doi:10.3791/55561 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

G-Protein Bağlı Reseptörler ( GPCR ), normal hücre fizyolojisinde kritik rol oynayan ve analjezi, kan basıncı regülasyonu ve psikiyatrik hastalığın tedavisi de dahil olmak üzere çoklu endikasyonlar için önemli bir farmakolojik hedef oluşturan transmembran reseptörlerden oluşan geniş bir ailesidir. Ligand bağlama üzerine, GPCR'ler, guanozin trifosfat (GTP) 'nin dahil edilmesini uyararak hücre içi G proteinlerinin aktivasyonunu katalize eder. Aktive edilmiş G proteinleri daha sonra hücresel tepkileri ortaya çıkaran sinyal yollarını uyarırlar. GPCR sinyallemesi, GTP'ye, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPγS) radyo-etiketli ve hidrolize edilemez formunun G-proteinlerine dahil edilmesini ölçerek izlenebilir. Daha aşağı yönlü sinyal verme süreçlerini değerlendiren diğer yöntemlerin aksine [ 35 S] GTPγS bağlanması, GPCR sinyallemesinde proksimal bir olayı ölçer ve önemlisi, agonisTs, antagonistler ve ters agonistler. Bu protokol, bir arketipik GPCR'nin, μ-opioid reseptörünün (MOR1) ham membran preparatlarını kullanarak GPCR sinyalini incelemek için duyarlı ve spesifik bir yöntemi özetlemektedir. Hücre ve dokuları fraksiyon haline getirmek için alternatif yaklaşımlar mevcut olmakla birlikte, çoğu maliyet önleme, sıkıcı ve / veya standart olmayan laboratuar ekipmanları gerektirir. Mevcut yöntem, fonksiyonel ham membranları zenginleştiren basit bir prosedür sağlamaktadır. MOR1'in izole edilmesinden sonra, onun agonisti olan [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) ve antagonisti olan naloksonun çeşitli farmakolojik özellikleri belirlendi.

Introduction

G-Protein Bağlı Reseptörler (GPCR), analjezi, koku alma ve davranış gibi dikkate değer bir dizi fizyolojik sürecin sorumlu olduğu hücre yüzeyi reseptörlerinden oluşan geniş bir ailedir. GPCR'ler spesifik harici sinyalleri algılayarak ve daha sonra hücre içi sinyallemeyi uyararak hareket eder. Bu nedenle, bir hücrenin dış ve iç ortamları arasında önemli bir kavşağa işaret ediyorlar. GPCR'lerin biyolojide oynadığı kritik rol nedeniyle , hem temel araştırmalar hem de ilaç keşfi 2 , 3 için önemli hedefler haline gelmiştir.

Ayrı ligandları bağlayan diğer reseptör ailelerinden farklı olarak, GPCRler çok farklı molekül tiplerini bağlayabilir. Bir GPCR peptitlerle etkileşime geçebilirken, bir diğeri fotonları, küçük molekülleri veya iyonları 1 , 4'ü algılayabilir. Ligandları çeşitlidir, ancak GPCR'ler genel mimarında birleşirUre ve işlev. Bireysel GPCR'ler hücre dışı amino terminalleri ve hücre içi karboksil terminalleri 5 , 6 olan yedi adet α-sarmal transmembran proteinden oluşur. GPCR'ler, α, β ve γ alt birimlerinden oluşan heterotrimerik protein kompleksleri olan çeşitli sinyal yollarına aracılık eden hücre içi G proteinlerine bağlanırlar. G α altbirimi, guanozin difosfata (GDP) bağlandığında inaktif olan ve guanozin trifosfata (GTP) 8 , 9 bağlı olduğunda aktif olan bir guanin nükleotid bağlayıcı proteindir. GPCR'ler ligandlarına bağlandığında, Gα'nın Gβγ'dan ayrılmasına ve böylece Gα'nın GTP 7 için GSYİH'nın değişimine izin verecek şekilde konformasyonel bir değişime uğrarlar. Reseptörün kendisi karboksil terminalinde çeşitli serin / threon tarafından fosforile edilmiştirIne kinazlar 10 , 11 ve reseptör sinyalini zayıflatmak için içselleştirilmiş 12 , 13 , 14 . Bu arada aktive edilmiş G α monomeri ve G βγ dimeri belirgin sinyal yollarını aktive eder 7 . Her bir G-protein alt biriminin birkaç izoformu vardır ve her izoform belirli aşağı yönlü yolları ve ikincil haberci sistemlerini hedeflemektedir. Büyük G α izoformları, G s , G q , G i / o ve G 12-13'ü içerir . Genellikle, bireysel GPCR'ler belirli bir G α izoformuyla ilişkilendirilir, böylece bir dış uyaran belirli bir hücresel tepki 1'e bağlanır.

Bir GPCR-ligand etkileşimini karakterize etmek, reseptörün biyolojisini anlamak için kritik önem taşır. GSYİH / GTP değişimi en erken arifelerden biri olduğu içinLigand bağlanmasını takip eden, GTP bağlanmasını izleyen nts GPCR aktivasyonunu veya inhibisyonunu ölçebilir. GPCR sinyallemesinde daha aşağı olayların tahlil edilmesi genellikle niceliksel ya da stokiometrik değildir, tam agonistleri kısmi olanlardan ayırt etmeyebilir ve pahalı reaktifler gerektirebilir. Dahası, Gα proteinlerine GTP bağlanmasının artması, GPCR aktivasyonunu takiben hemen hemen evrensel bir olaydır; bu, GTP bağlanmasının ölçülmesinin, çoğu GPCR'nin aktivitesini izlemek için genel olarak geçerli bir deney olduğu anlamına gelir. GTP bağlanmasının ölçülmesi, ilgi reseptörünü aşırı ifade eden hücrelerde veya doğal dokuda GPCR sinyallemesinin izlenmesi için basit ve hızlı bir yaklaşımdır. Bu protokol, bir archetypal GPCR, μ-opioid reseptörü (MOR1) kullanarak bir agonist ve antagonist aktivitesini kantitatif olarak GPCR sinyallemesi üzerinde saptamak için kullanılan fonksiyonel bir GTP bağlanma testini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.

Bu protokol ilk önce ham membranların MOR1'i aşırı ifade eden hücrelerden nasıl izole edileceğini açıklar. Bunlara dikkat etBu protokol, aşırı sentezleme sistemleri ile sınırlı değildir ve doğal doku veya çoklu reseptörleri ve G proteinlerini ifade eden preparatlar da dahil olmak üzere, birçok membran kaynağına uygulanabilir 15 . Protokol daha sonra bir MOR1 agonisti ve antagonisti olan [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol] -enkefalin (DAMGO) veya naloksonun konsantrasyonlarına yanıt olarak bu zarlara bir radyoaktif GTP analoğunun bağlanmasının nasıl ölçüleceğini, sırasıyla. GTP analoğu [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfat ([35S] GTPyS), hidrolize edilemez. Bu özellik kritiktir çünkü Gα altbirimleri intrinsik GTPaz aktivitesi 7 gösterir ve hidrolize olabilen bir GTP radyokimyası üzerinde etiketli gama fosfatını ortadan kaldıracaktır. Membranlar daha sonra cam elyaf filtrelere bindirilir ve yıkanır, daha sonra radyoetiketlenmiş GTP sıvı sintilasyon sayımı ile nicelendirilir. Karakteristik olarak çoklu farmakolojik parametreler türetilebilirAntagonistler için agonistler için yarı maksimal tepki (EC 50 ) ve tepe katsayısı (n H ) ve yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonu (IC50) ve denge ayrılma sabiti (Kb) de dahil olmak üzere reseptör-ligand etkileşimi 16 , 17 , 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kültürlenmiş Hücrelerde Rekombinant HA-MOR1'in Ekspresyonu

NOT: Tüm hücre kültürü protokollerini steril bir tabakalı akış kaputunda izleyin.

  1. % 70 etanol ile hücre kültürü laminer akış davlumbaz sterilize edin ve hücre kültürü boyunca steril teknik korumak.
  2. 2 mM L-glutamin,% 1 penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş insan embriyonik böbrek hücreleri 293 (HEK293) hücre kültürü ortamı, eksiksiz Dulbecco's-modifiye Kartal Ortamı (DMEM) hazırlayın: DMEM, pH 7.4 ).
  3. Plaka 2.5 x 10 6 HEK293 hücreleri, 10 mL tamamlanmış DMEM'de 10 cm'lik bir doku kültürü plakası üzerine yerleştirin ve% 70-80'lik konfluansa erişilene kadar (O / N) 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
    NOT: Tam bir GTP-bağlama deneyi için yeterli protein toplamak için, hücrelerin en az 3 x 10 cm'lik plakasını yerleştirin.
  4. Hücreleri seçilen bir transfeksiyon reaktifi kullanarak HA-MOR1 ile transfekte edin ve üreticinin "Kuralları. 36-48 saat inkübe edin.
    NOT: İnsan MOR-1 cDNA'sı (NCBI Referans Dizisi: NM_000914.4) Gavril Pasternak'ın cömert bir armağanıydı ve pCMV-HA içine klonlandı.

2. Hücre Fraksiyonu ve Membran Toplama

  1. Aşağıdaki liziz tamponlarını hazırlayın:
    1. Tampon 1: 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4; 1 mM etilen glikol-bis (p-aminoetil eter) -N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA); % 10 sakaroz; Proteaz inhibitörü kokteyli; Ve 1 mM ditiyotreitol (DTT). Zar izolasyonunun yapıldığı gün DTT'yi taze ekleyin.
    2. Tampon 2: 10 mM HEPES, pH 7.4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCI2; Ve 1 mM DTT. Zar izolasyonunun yapıldığı gün DTT'yi taze ekleyin.
  2. Transfekte edilen hücreleri inkübatörden çıkarın (adım 1.4), ortamı aspire edin ve hücreleri 5 mL buz soğukluğundaki Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS) ile durulayın. PBS'yi ve aşırı sıvıyıtabak.
  3. Hücrelere 600 uL Tampon 1 ekleyin. Bir hücre sıyırıcı kullanarak, plakalı yüzey hücreleri çıkarın ve 1.6 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu pipetle.
  4. Sıvı nitrojende mikro santrifüj tüpünü derhal dondurun. Numuneler dondurulduktan sonra, lizatları buz üzerinde çözdürün veya uzun süre saklama için -80 ° C'ye yerleştirin.
  5. 2.3 ve 2.4 adımlarını hücrelerin tüm plakaları ile tekrarlayın.
  6. Lizatlar çözüldükten sonra, hücreleri kırmak için tek darbeli bir mikro tüp homojenleştirici kullanın. Homojenizatörü 10 saniye boyunca 3-5 kez püskürterek, püskürtüler arası 30 saniye süreyle tüpü buza geri koyun.
    1. Tüm hücre fraksiyonu olarak 20 μL toplayın.
  7. Kalan örneği 1000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve buz üzerinde yeni bir 1.6 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
  8. Pelet 100 uL Tampon 1 içinde süspansiyon haline getirin ve bir havanla kaynatın. Darbeli homoJenaratör, 5 saniye süreyle 3-5 kez, nabızlar arasında tüp 30 saniye boyunca buz üzerinde tekrar yerleştirilir.
    1. Numuneyi 1000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika ikinci kez santrifüjleyin. Süpernatantı, basamak 2.7'deki süpernatantla birleştirin.
      NOT: Geri kalan pellet nükleer ve membran proteinleri içerir.
  9. Birleştirilen süpernatantları 11,000 xg ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı (sitozolik fraksiyon) yeni bir 1.6 mL mikrosantrifüj tüpüne ayırın.
  10. Pelet 200 uL Tampon 2 içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 3-5 kez toz haline getirerek pelleti homojenize edin. Numuneyi, 21.100 xg ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı aspire. Ham membran fraksiyonunu içeren pelleti 50 uL Tampon 2'ye tekrar süspanse edin.
  11. Hemen GTPγS bağlanma deneylerine geçin (bölüm 3) veya sıvı nitrojende hızlıca dondurun ve -80 ° C'de saklayın.

3. [ 35 S] GTPγS Bağlama NOT: [ 35 S] GTPγS'yi tutarken ve [ 35 S] GTPγS bağlanma deneylerini iletirken standart radyokimyasal güvenlik protokolünü kullanın. Koruyucu eldiven giyin ve her zaman bir laboratuar önlüğü giyin. Paketleme materyalini sızıntı veya çatlak olup olmadığını kontrol edin. Atıkları ve fazla reaktifleri kurumsal protokollere uygun olarak imha edin.

  1. Tamamlanmamış Bağlama Tamponunu (IBB) 50 mM HEPES, pH 7.4'ü karıştırarak hazırlayın; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; Ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) damıtılmış su içinde.
  2. Stok [ 35 S] GTPγS'yi 10 mM Tris-HC1, pH 7.6 ve 10 mM DTT içinde 50 nM'ye seyreltin. 500 mcL alikotları olun ve -80 ° C'de saklayın. Deneyi başlatmadan hemen önce yeni eritilmiş bir kısım kullanın. Alikotları buz üzerinde çözdürün.
  3. 10 mM stok konsantrasyonu için 177.62 μL saf suda 1 mg GTPγS tozunu çözerek radyoaktif olmayan etiketli GTPγS hazırlayın. 10 μL'lik alikotlar yapın ve bunları-20 ° C.
  4. 1 mM DTT,% 0.1 (wt / hacim) sığır serum albümini (BSA), 10 uM GSDP ve 0.1 nM [ 35 S] GTPγS nihai konsantrasyonunu içerecek şekilde IBB'yi ilave ederek eksiksiz bağlama tamponunu (CBB) hazırlayın.
    NOT: CBB artık radyo-etiketli GTP içerir. Radyoaktif çözeltilerle çalışırken uygun güvenlik önlemlerini alın.
  5. Buz üzerinde adım 2.11'den membran fraksiyonunu çözün.
  6. 595 nm'de bir spektrofotometre kullanarak bir Bradford protein testi yoluyla membran fraksiyonunun protein konsantrasyonunu hesaplayın.
    1. 0, 250, 500, 750, 1,500, 2,500 ve 5,000 μg / mL nihai konsantrasyonlarında Tampon 2 ile BSA protein standartlarının seyreltme serisini hazırlayın.
    2. Bir küvette 1 mL Bradford reaktifine 2 μL'lik her standart veya zar ekleyin. Vorteksleme ile iyice karıştırın.
    3. Spektrofotometreyi 595 nm dalga boyuna ayarlayın ve küveti 0 μg / mL protein ile boşaltın.
    4. 5 dakikanızı bekleyin ve rStandartlardan her birini ve numunelerin her birini 595 nm dalga boyunda çözün.
    5. Konsantrasyona karşı standartların absorbansını çizin. Beer-Lambert Yasasını (A = εcl, burada ε = sönüm katsayısı, l = küvet uzunluğu ve c = konsantrasyon) kullanarak membran numunelerinin konsantrasyonunu hesaplayın.
  7. Membran fraksiyonlarını IBB'de 100 μg protein / mL'lik bir konsantrasyona kadar sulandırın.
    NOT: Bir adet 10 cm'lik HEK293 hücresi çanağı tipik olarak 1 ve 3 mg protein / mL arasında bir verim sağlar.
  8. Bireysel 1.6 mL mikrosantrifüj tüplerinde aşağıdaki deneysel koşulları hazırlayın: bir ligand seyreltme serisi, bazal GTP bağlanmayı ölçmek için bir bazal aktivite durumu ve nonspesifik GTP bağlanmasını ölçmek için nonspesifik bir bağlanma durumu.
    1. Ligand seyreltme serisi için, 100 uL CBB'lik nihai bir hacimde ilgi ligandı seyreltme serisini hazırlayın. Ligand serisini 2x istenen son konsantrasyonda hazırlayınons. Bir dizi yanıtları yeterince kapsayacak şekilde ligand konsantrasyonlarını boşaltın.
      1. DAMGO'nun MOR1 aracılığıyla GTP bağlanması üzerindeki etkisini test etmek için, CBB'de 2 mM, 200 uM, 20 uM, 2 uM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM ve 2 pM'lik DAMGO seyreltileri hazırlayın Hacim: 100 uL).
        NOT: Örneğin, eğer ilgilenilen ligand, 10 uM'lik bir beklenen EC 50 değerine sahipse, 200 nM, 2 uM, 20 uM, 200 uM ve 2 mM'lik ligand seyreltileri hazırlayın. Bu beş koşul, çok çeşitli konsantrasyonları kapsar ve tahlil için arzu edilen konsantrasyonun 2 katıdır.
    2. Bazal bağlama için sadece 100 uL CBB ile bir tüp hazırlayın.
    3. Spesifik olmayan bağlanma için, 1 mcL 2 mM nonradio etiketli GTPγS ile takviye edilmiş 99 uL CBB ile bir tüp hazırlayın.
  9. Her deneysel duruma 100 μL seyreltilmiş membran çözeltisi (adım 3.7) ekleyin.
  10. Zarları çeşitli deneylerle inkübe edin1.6 mL mikrosantrifüj tüplerindeki koşulları 25 ° C'de 30 dakika süre ile bir termomikser veya bir orbital çalkalayıcıda yıkayın.

4. Membran Filtrasyonu

  1. Yıkama tamponunu 50 mM Tris-HC1, pH 7.4; 5 mM MgCI2; Ve damıtılmış su içinde 50 mM NaCI ile yıkandı.
  2. Cam elyaf filtrelerini suda 10 dakika presoaklayın.
    NOT: Filtrelerin gözenek boyutu 1 μm, çapı 2.1 cm ve kalınlığı 675 μm'dir.
  3. Numuneleri termomikser veya orbital çalkalayıcıdan çıkarın (adım 3.10). Tüpün altındaki her numuneyi toplamak için numuneleri 5 saniye süreyle kısaca döndürün.
  4. Vakum filtrasyon cihazının kapağını çıkartın. Preslenmiş filtreler cihazın vakum bağlantı noktalarına yerleştirilir. Vakum contası oluşturmak için cihaz kapağını tekrar sabitleyin. Vakum açın.
  5. Tüpün duvarlarına adsorpsiyonu ve / veya pipetten gelen hatayı en aza indirgemek için filtrelere her 200 mcL deneysel koşuldan 195 μl pipetleyinting.
  6. Filtreleri üç kez 1 mL buz soğukluğunda yıkama tamponu ile yıkayın.

5. Sıvı Sintilasyon Sayımı

  1. 5 mL sintilasyon sayma flakonlarını sayma kabına yerleştirin. Her flakona 5 mL sintilasyon sıvısı ekleyin.
  2. Vakumu kapatın (adım 4.4). Vakum filtrasyon cihazının kapağını çıkartın. Cımızı kullanarak, filtreleri filtreleme cihazının vakum bağlantı noktalarından alın ve her filtreyi ayrı bir 5 mL'lik sintilasyon şişesine bırakın.
  3. Maksimum sinyali belirlemek için bir şişeyi 195 uL CBB ile hazırlayın.
  4. Her şişeyi sıkıca kapatın. Viyalleri, 25 ° C'de 10 dakika orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
  5. Sintilasyon sayacını açın. Standart ilintili sintilasyon programı kullanılarak numune başına 5 dakika boyunca 35 S izotop emisyonunu ölçmek için sintilasyon sayacını programlayın.
  6. Sayımı almak için "Başlat" a basın.
  7. Sayma işlemi tamamlandığında, sayılan şişeyi atınTehlikeli atık olarak kullanıyor.

6. Veri Analizi

  1. Verileri istatistik ve analiz yazılımına girin.
    1. Spesifik bağlanmayı belirlemek için spesifik olmayan bağlayıcıyı diğer ölçümlerin her birinden çıkartın.
      NOT: Spesifik olmayan bağlanma derecesi, radyoaktif etiketsiz GTPγS ile inkübe edilen numune (adım 3.8.3) tarafından belirlenir.
    2. İstatistikleri ve analiz yazılımını açın ve bir XY veri seti girişi seçin.
    3. [ 35 S] GTPγS-bağlayıcı deneylerindeki spesifik bağlanma verilerini istatistik ve analiz yazılımındaki bir veri tablosuna girin. Molar konsantrasyonlar olarak agonist konsantrasyonlarını "X" sütununa girin. İlişkili 35 S sayımlarını "Y" değerleri olarak girin.
  2. Verileri dönüştür.
    1. "Analiz Et" i tıklayarak X değerlerini kendi logaritmalarına çevirin. Dahili i'den "Transform" u seçinN analizleri.
    2. "Transform" iletişim kutusunda, "X değerleri dönüştürme" seçeneğini seçin ve "X = log (X)" işlevini seçin. Sonuçların yeni bir grafiği oluşturmayı seçin.
    3. "Tamam" ı tıklayın.
  3. Y-değerlerini normalize edin.
    1. Görüntülenen dönüştürülen sonuçlar ile "Analiz Et" i tıklayın. Yerleşik analizlerden "Normalleştir" i seçin.
    2. "Normalleştir" iletişim kutusunda, "her veri kümesindeki en küçük değer"% 0 ve "her veri kümesindeki en büyük değer" olarak tanımlamak için radyo düğmesini seçin. Sonuçları yüzdeler olarak sunmak için kutuyu seçin. Sonuçların yeni bir grafiği oluşturmak için kutuyu seçin.
    3. "Tamam" ı tıklayın.
  4. Çizilen verilere doğrusal olmayan regresyon eğrileri yerleştirin. Doğrusal Olmayan Regresyon Analizi yapın.
    1. Görüntülenen normalleştirilmiş sonuçlar ile "Analiz Et" i tıklayın. Dahili analizlerden, "Doğrusal Olmayan Regresyon (eğri uyması)" nı seçin.
    2. Bir agonist araştırıyorsanız, diyalog kutusundan "log (agonist) vs normalleştirilmiş yanıt - değişken eğim" i seçin.
    3. Bir antagonisti araştırırsanız, diyalog kutusundan "log (antagonist) ile normalleştirilmiş yanıt - değişken eğim" i seçin.
    4. "Tamam" ı tıklayın.
  5. Uygunluğun ve verilerin makul bir şekilde anlaşıldığından emin olmak için grafiği ve sonuçları inceleyin. Regresyonun çizilen verilerin genel paterniyle eşleştiğinden ve rezidülerin doz yanıt eğrisini düz hale getirecek kadar büyük olmamasına dikkat edin.
    NOT: Yazılım, doğrusal olmayan regresyonun sonuçlarını özetler ve yarı maksimal yanıtı (EC 50 ), tepe katsayısını (n H ) ve yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonunu (IC50) ortaya çıkaran konsantrasyonun ayrıntılarını verir.
  6. Agonist / antagonist parametre türevi türetin.
    1. Agonist ekini türetinAşağıdaki denemelerden 16 , 17 , 18 (bkz.) Gelen ilibrium ayrılma sabitleri (Kb)
      1. Belirli bir antagonist konsantrasyonu ile rekabet eden bir agonistin doz-yanıtındaki değişimi değerlendirin. Burada EC 50 '= EC 50 (1 + [antagonist] / antagonisti Kb ), burada EC 50 ' sağa kaymış EC 50'dir .
      2. [ 35 S] GTPγS bağlanmasının, sabit bir agonist konsantrasyonu ile rekabet halinde farklı konsantrasyonlarda antagonist ile değerlendirilmesi. Burada, K b = IC50 / (2 + ([agonist] / agonist EC 50 ) n ) 1 / n - 1, burada n agonistin tepe katsayısıdır.
  7. Verilerin değişkenliğine bağlı olarak, her bir ligand için yaklaşık 3-5 kez denemeyi tekrarlayın (adım 3.8-5.6) ve sonuçları bir istatistik ve analiz yazılımı kullanarak ortalayındır-dir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre fraksiyonasyonu, membrana bağlı proteinleri sitosolik ve nükleer proteinlerden izole etmek ve zenginleştirmek için kullanılabilir. Şekil 1 , subselüler fraksiyonasyon işlemi sırasında toplanabilen üç ana fraksiyonun içeriğini gösteren bir Western blotudur. Spesifik olarak, Şekil 1 , histon H2B ve gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH), nükleer proteinler ve sitozolik proteinlerden fraksiyonlamanın açıkça membran proteinlerini ( yani Na + / K + ATPaz, protein disülfid izomeraz (PDI) ve HA-MOR1) sırasıyla. Ek olarak, Şekil 1 , fraksiyonlamanın bir sonucu olarak proteinlerin zenginleştirilmesini (şerit 1 ile şerit 4'e kıyasla) sıralı hücre içi fraksiyonlarında göstermektedir. Temsili bir Ponceau boyası, her fraksiyonda eşit protein yüklemesini gösterir. Önemli olan bu kırılmanınOnation protokolü, farklı hücresel zarları ayırt etmez. PDI genellikle endoplazmik retikuluma (ER) lokalizedir, buna karşın Na + / K + ATPaz çoğunlukla plazma membranındadır. Bununla birlikte, her iki protein son ham membran fraksiyonunda bulunur ( Şekil 1 , şerit 4). Ek olarak, bu protokol, nükleer proteinleri sitosolik ve nihai membran fraksiyonundan sağlam bir şekilde ayırırken ( Şekil 1 , şerit 2-4), nükleer proteinler açısından zengin olan fraksiyon muhtemelen ER'den bazı membran proteinleri içerir ( Şekil 1 , şerit 2).

Bir GPCR-ligand etkileşimini GTP-bağlama deneyleri ile karakterize etmek için çoklu farmakolojik parametreler türetilebilir ( Tablo 1 ). Örneğin, bir agonistin yarı maksimum tepki (EC 50 ) ve tepe katsayısı (n H ), GTP bağlanmasını izleyerek türetilebilirAgonistin değişen dozlarına yanıt. Şekil 3A , DAMGO tedavisinden sonra MOR1'e bağlanan doza duyarlı GTP'yi göstermektedir. Veriler dört parametreli doğrusal olmayan bir regresyona uyduğunda fit, 185 ± 23 nM'lik bir EC 50 değeri ve 0.46 ± 0.06'lık Hill katsayısı ile bir reseptör-ligand etkileşimini tanımlamaktadır. DAMGO tedavisinden sonra gözlemlenen sığ GTP bağlanma eğrisi, DAMGO ve MOR1 arasındaki negatif işbirliğine işaret etmektedir. Bu yöntem ayrıca bir antagonistin farmakolojisini tanımlayabilir ve tarif edebilir. Şekil 3A ve B gösterildiği üzere, nalokson bir MOR1 antagonistidir. 97 ± 20 nM'lik nalokson agonist potensi (Kb), sabit bir DAMGO konsantrasyonu ile rekabet halinde nalokson konsantrasyonunun değiştirilmesi ile belirlendi ( Şekil 3A ). Naloxone 0.88 ± 0.06 Hill katsayısı sergiledi; bu da nalokson ve MOR1 arasında bağımsız bir bağlanma olduğunu düşündürdü. Ac varsaBir ligandın bilinmediği bilinmiyorsa, bu tahlil, bir agonist, antagonist ve inverse agonist arasında ayrım yapabilir. Ligand bir agonist ise, Şekil 3A'daki gibi DAMGO uygulamasından sonra GTP bağlanmasında bir artış olacaktır. Ligand ters bir agonist ise, bazal bağlanmaya göre GTP'nin azalmış bağlanması olur. Ligand bir antagonist ise, tek başına ligand ile işleme tabi tutulduğunda herhangi bir etki olmayacaktır. Bir agonist ile birlikte uygulandığı zaman, bir antagonist agonistin GTP bağlanma yeteneğini inhibe eder. Şekil 3A , agalist DAMGO'ya karşı naloksonun antagonist etkinliğini göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1: Hücresel Fraksiyonasyon, Membranla İlişkili, Nükleer ve Sitozolik Proteinleri Ayırır. ( Üstte ) Şerit 1,Tüm hücre içinde bulunan protein. Şerit 2, ilk santrifüj aşamaları sırasında ayrılan nükleer ve membrana bağlı proteinleri içerir. Şerit 3, 11,000 x g'de 20 dakika santrifüj işleminden sonra ayrılan sitozol fraksiyonudur. Şerit 4, [35S] GTPγS-bağlama deneyleri için uygun bir ham membran fraksiyonu ihtiva eder. ( Alt ) Bir Batılı zarın Ponceau lekesi, her hücresel fraksiyon için protein yüklemesini gösterir. Aşağıdaki antikorlar immünoblotlama için kullanıldı: fare anti-Na + / K + -ATPaz (1: 1,000), fare anti-GAPDH (1: 5,000), fare anti-H2B (1: 2,500), tavşan anti-PDI : 1.000) ve sıçan anti-HA (1: 2000). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
şekil 2: Fraksiyonasyon ve [ 35 S] GTPγS-bağlama Prosedürünü özetleyen Akış Şeması. Önce ilgilenilen GPCR'yi ifade etmek için hücrelere transfekte edin. 48 saat sonra, reseptörü (kırmızı) ve ilişkili G proteinlerini (yeşil = Gα, mor = Gβ ve turuncu = Gγ) izole etmek için hücreleri hasat edin ve fraksiyonlara ayırın. GTP-bağlama deneylerini gerçekleştirmek için [ 35 S] GTPγS'yi ekleyin ve membranları ilgili ligand ile inkübe edin. G-protein aktivitesini ölçmek için zarları herhangi bir bağlanmamış radyokimyasal maddeyi yıkamak için bir filtreye bağlayın ve sonra sıvı sintilasyon sayımı ile bağlı [ 35 S] GTPγS'yı ölçün. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Agonizma a[ 35 S] GTPγS bağlanması tarafından tanımlanan μ-opioid Reseptörlerinde Antagonizma. ( A ) [ 35 S] GTPγS doz-yanıt eğrisi, 2.5 μM DAMGO (yeşil) ile rekabet halinde tek başına DAMGO'ya (mavi) veya naloksona. [35S] GTPγS bağlanması, her deneyde maksimum uyarıma normalize edildi ve yüzde olarak ifade edildi. Gösterilen noktalamalar üçlü saptamanın ortalamasıdır ve DAMGO tarafından uyarılan [ 35 S] GTPγS'nin ortalama ± SEM ( B ) Antagonizması olarak ifade edilir Nalokson tarafından bağlanır. [35S] GTPγS Tek başına nalokson (100 uM), tek başına DAMGO (10 uM) veya nalokson (100 uM) ile rekabet halinde DAMGO (10 uM) ilave edildikten sonra bağlanma nicelendirildi. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. Lütfen tıklayınBu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için tekrar.

ligand EC 50 veya IC50 (nM) N H Kb (nM)
DAMGO 185 ± 23 0.46 ± 0.06
Nalokson 420 ± 87 0.88 ± 0.06 97 ± 20

Tablo 1: μ-opioid Reseptörlerinde DAMGO ve Nalokson Aktivitesinin Farmakolojik Parametreleri. DAMGO için yarı maksimal tepki (EC 50 ) ve tepe katsayısı (n H ), değişik dozlarda DAMGO'ya yanıt olarak [ 35 S] GTPγS bağlanmasından türetilmiştir. Yarı maksimal inhibitör konsantrasyon(IC50) ve nalokson için denge ayrılma sabiti (Kb), nalokson ile 2.5 uM DAMGO arasındaki rekabetin [ 35 S] GTPγS bağlanması üzerindeki etkisinden belirlendi. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, iki ayrı fakat birbirini tamamlayan yöntemleri açıklamaktadır: hücreleri ve dokuları geniş ama farklı bölmelere ayırmak için basit bir yaklaşım ve [ 35 S] GTPγS bağlanmasını ölçerek GPCR sinyalizasyonunu araştırmak için bir araç.

Etkili hücre fraksiyonlamanın, proteinlerin ekstraksiyonundan zenginleştirilmesine kadar, proteinlerin hücre altı lokalizasyonunun değerlendirilmesinden, reseptör farmakolojisi araştırmasına kadar geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir. Hücre ve dokuları fraksiyon haline getirmek için alternatif yaklaşımlar mevcut olsa da, burada sunulan protokol, göreceli olarak daha ucuz, daha hızlı ve basittir. Bununla birlikte, daha belirgin yöntemlerin aksine, bu yöntem plazma membran ile ilişkili proteinleri endozomlar veya ER gibi diğer membranöz bölmelerden temizleyemez. Ayrıca, yukarıdaki protokolün GPCR'sini içeren hücre zarlarını üretmek için geçici bir aşırı ekspresyon sistemi kullanmasına rağmenBu protokol dengeli aşırı ekspresyon sistemleri ile hem hayvan hem de insan dokusu 19 ile uyumludur.

Numune hazırlama, fraksiyon verimini ve saflığı maksimize etmek için kritiktir. Homojenizasyonun tam olarak sağlanması ve santrifüj adımları arasındaki geçiş süresinin en aza indirgenmesi özellikle önemlidir. Hücre zarını tamamen bozmak için bir pellet homojenizatörü / havanını kullanmak son hücre fraksiyonundaki ham membran verimini önemli ölçüde arttırır. Membran verimi çok düşükse, en basit iki çözüm ilk hücre kültürünü büyütmek ve / veya hücre pelletini birkaç kez daha homojenleştirmek olacaktır. Bireysel kesirler yüksek safsızlık derecesi gösteriyorsa, santrifüjleme ve ayırma arasındaki geçiş sürelerini azaltın. Proteinler numuneye yayılabilir ve fraksiyon saflığını azaltabileceğinden, numunelerin santrifügasyona tabi tutulmasına izin vermeyin.

Filtrasyona dayalı [ 35 S] GTPγS bağlanması, ilişkili reseptörü kullanarak G proteinlerinin aktivasyonunu ölçmek için hızlı ve kantitatif bir yöntemdir. GTP bağlanmasının ölçülmesi, aşağı akış süreçlerini izlerken genel olarak mümkün olana oranla GPCR aktivitesinin daha niceliksel bir şekilde ölçülmesine izin verir. Bununla birlikte, burada özetlenen yöntem için iki kritik sınırlama vardır. En önemlisi, filtrasyona dayalı [ 35 S] GTPγS nicelemesi, tüm G α izoformları 20 , 21 ile eşit derecede uygulanabilir değildir. Genel olarak, bu yöntem MOR1 22 gibi G / O ile birleştirilmiş GPCR'lerle sınırlandırılmıştır. G s - ve G q- bağlı reseptörler daha az duyarlı olma eğilimindedir. Bunun nedeni muhtemelen, Gs / Gq'nin daha düşük bolluğunun ve nispeten daha yavaş nükleotid değişim oranının birleşiminden dolayı gerçek [ 35 S] GTPγS bağlanmasını arka planın üstünde ayırmayı zorlaştırmaktadır. Bu kısıtlama ele alınmıştır. G-protein antikoru yakalama tekniklerini kullanan 20 . Bazı gruplar, reaksiyondan GSYİH'nın ortadan kaldırılmasının G s - veya G q- bağlı reseptörler 23 için sinyal-gürültü oranını geliştirdiğini bulmuştur. İkinci sınırlama lipofilik agonistlere veya yüzey aktif cisimlere zar duyarlığıdır. [35S] GTPγS tahlilleri fonksiyonel reseptör-G-protein kompleksleri gerektirir ve reaksiyon sistemine lipofilik moleküllerin eklenmesi zarların veya bu komplekslerin yapısını bozabilir. Eğer bu potansiyel bir mesele ise, ilgilenilen reaktifin, [ 35 S] GTPγS bağlanmasını, DAMGO aracılı MOR1 stimülasyonunda olduğu gibi iyi karakterize edilmiş bir sistemde bozup bozmadığını test etmek avantajlı olabilir. Optimize etmeyi düşünen diğer koşullar arasında bağlama tamponu pH'ı, Mg 2+ ve NaCl konsantrasyonları, protein konsantrasyonu ve inkübasyon süresi 23 ,Ef "> 24.

Bu protokol iyi tanımlanmış bir GPCR, MOR1 ve iyi tanımlanmış MOR1 üzerinde etkili olan DAMGO (agonist) ve nalokson (antagonist) ilaçlarına odaklanmıştır. Bununla birlikte, bu tekniğin avantajlarından biri, ligandın GTP bağlanmasını nasıl modüle ettiğine bağlı olarak bilinmeyen ligandları agonistler, antagonistler veya ters agonistler olarak karakterize etmek için kullanılabilir. Deneyler tasarlarken, ilgilenilen ligandın bir dizi konsantrasyonunun kullanılması ve sonuçların dağılımına dikkat etmek önemlidir: agonistler, bazal üzerinde GTP bağlanmasında bir artışa neden olur, ters agonistler ise GTP bağlanmasında bir artışa neden olur Bazal ve antagonistlerin başlangıçtaki GTP bağlanmasında izolasyona eklendiğinde çok az etkiye sahip olacağı düşünülmektedir.

Özetle bu protokol, alt hücreli fraksiyonlamanın gerçekleştirilmesi, ham membran preparatlarının toplanması ve [ 35 S] G ölçülerek GPCR aktivasyonunun araştırılması için bir teknik açıklanmaktadırTPγS bağlanması. Bu teknikler, alıcıların en önemli ailelerinden birinin farmakolojisini incelemek için çeşitli hücre kültürü ve doku modellerine kolayca adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri DA-000266 ve Tıbbi Bilim Eğitimi Eğitim Programı T32 hibe (CV, NWZ ve PCS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca Science and Medicine Illustrations Kütüphanesi için somersault18: 24 (somersault1824.com) olduğunu kabul etmek istiyorlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine Thermo Fisher Scientific 10313021 Warm in a 37°C water bath before use
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Warm in a 37°C water bath before use
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Warm in a 37°C water bath before use
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070 Warm in a 37°C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 16000044 Warm in a 37°C water bath before use
Cell culture 10 cm plate Sigma-Aldrich CLS430167
Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
1.6 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Trizma base) Thermo Fisher Scientific BP152-1
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884
Sucrose Sigma-Aldrich S5016
cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EASYpack Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 2900
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DO632
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific BP358-1
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M1028-1
Pellet pestles motor Sigma-Aldrich Z359971
Pestles Bel Art F19923-0001
Bovine serum albumin (BSA) Affymetrix 10857
[35S]guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTPγS)  Perkin Elmer NEG030H
nonradiolabeled guanosine-5’-O-(3-thio)triphosphate (GTPγS)  Sigma-Aldrich 89378
guanosine diphosphate (GDP) Sigma-Aldrich 51060
Bradford reagent Bio-Rad 5000006
UV/VIS spectrophotometer Beckman Coulter DU640
spectrophotometer cuvettes USA Scientific 9090-0460
orbital shaker Thermo Fisher Scientific 2314
thermomixer Eppendorf 535027903
glass fiber filters  GE Healthcare Life Sciences 1821-021
vacuum filtration apparatus Millipore Corporation XX2702550
desktop microcentrifuge Eppendorf 65717
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
scintillation fluid  Ecoscint A LS-273
scintillation counter vials Beckman Coulter 592690
scintillation vial lids Beckman Coulter 592928
Prism 6 GraphPad Software PRISM 6
ATP1A1 antibody Developmental Studies Hybridoma a6F 1:1000 in 3% BSA
GAPDH antibody EMD Millipore CB1001 1:5000 in 3% BSA
H2B antibody Cell Signaling 2934S 1:2500 in 3% BSA
PDI antibody Cell Signaling 3501S 1:1000 in 3% BSA
HA antibody Roche 11867423001 1:2000 in 3% BSA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kobilka, B. K. G protein coupled receptor structure and activation. Biochim. Biophys. Acta. 1768, (4), 794-807 (2007).
  2. Neubig, R. R., Siderovski, D. P. Regulators of G-protein signalling as new central nervous system drug targets. Nat. Rev. Drug Discov 1. (3), 187-197 (2002).
  3. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nat. Rev. Drug Discov. 5, (12), 993-996 (2006).
  4. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, (1), 175-187 (1991).
  5. Kobilka, B. K., et al. Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science. 238, (4827), New York, NY. 650-656 (1987).
  6. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289, (5480), New York, NY. 739-745 (2000).
  7. Neer, E. J. Heterotrimeric c proteins: organizers of transmembrane signals. Cell. 80, (2), 249-257 (1995).
  8. Londos, C., Salomon, Y. 5'-Guanylylimidodiphosphate, a Potent Activator of Adenylate Cyclase Systems in Eukaryotic Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, (8), 3087-3090 (1974).
  9. Ross, E. M., Gilman, A. G. Resolution of Some Components of Adenylate-Cyclase Necessary for Catalytic Activity. J. Biol. Chem. 252, (20), 6966-6969 (1977).
  10. Stadel, J. M., Nambi, P., Shorr, R., Sawyer, D. F., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. Catecholamine-Induced Desensitization of Turkey Erythrocyte Adenylate-Cyclase Is Associated with Phosphorylation of the Beta-Adrenergic-Receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, (11), 3173-3177 (1983).
  11. Wilden, U., Kuhn, H. Light-Dependent Phosphorylation of Rhodopsin - Number of Phosphorylation Sites. Biochemistry. 21, (12), 3014-3022 (1982).
  12. Lohse, M., Benovic, J., Codina, J., Caron, M., Lefkowitz, R. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248, (4962), New York, NY. 1547-1550 (1990).
  13. Leftowitz, R. J., Shenoy, S. K. Transduction of receptor signals by beta-arrestins. Science. 308, (5721), New York, NY. 512-517 (2005).
  14. Lefkowitz, R. J. Historical review: a brief history and personal retrospective of seven-transmembrane receptors. Trends Pharmacol. Sci. 25, (8), 413-422 (2004).
  15. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological assessment of m1 muscarinic acetylcholine receptor-gq/11 protein coupling in membranes prepared from postmortem human brain tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325, (3), 869-874 (2008).
  16. Yung-Chi, C., Prusoff, W. H. Relationship between the inhibition constant (K1) and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (I50) of an enzymatic reaction. Biochem. Pharmacol. 22, (23), 3099-3108 (1973).
  17. Lazareno, S., Birdsall, N. Estimation of competitive antagonist affinity from functional inhibition curves using the Gaddum, Schild and Cheng-Prusoíf equations. Br. J. Pharmacol. 109, (4), 1110-1119 (1993).
  18. Maréchal, E. Chapter 5, Measuring Bioactivity: KI, IC50 and EC50. Chemogenomics and Chemical Genetics. Springer. 55-65 (2011).
  19. Salah-Uddin, H., Thomas, D. R., et al. Pharmacological Assessment of M1 Muscarinic Acetylcholine Receptor-Gq/11 Protein Coupling in Membranes Prepared from Postmortem Human Brain Tissue. J. Pharm. Exp. Ther. 325, (3), 869-874 (2008).
  20. Milligan, G. Principles: extending the utility of [35S]GTP gamma S binding assays. Trends. Pharmacol. Sci. 24, (2), 87-90 (2003).
  21. Harrison, C., Traynor, J. R. The [35S]GTPgammaS binding assay: approaches and applications in pharmacology. Life Sci. 74, (4), 489-508 (2003).
  22. Traynor, J. R., Nahorski, S. R. Modulation by mu-opioid agonists of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47, (4), 848-854 (1995).
  23. GTPγS Binding Assays. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. (2004).
  24. Strange, P. G. Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors. Br. J. Pharmacol. 161, (6), 1238-1249 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics