연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay

Developmental Biology

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Summary

우리는 5- 메틸 시토신 (5-mC) 도트 블롯을 기반으로 DNA 메틸화를 정량화하는 방법을 제시합니다. 우리는 연골 세포 탈분화 동안 5-mC 수준을 결정했다. 이 간단한 기술은 ACI 치료에서 연골 세포 표현형을 신속하게 결정하는데 사용될 수 있습니다.

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Jia, Z., Liang, Y., Ma, B., Xu, X., Xiong, J., Duan, L., Wang, D. A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro. J. Vis. Exp. (123), e55565, doi:10.3791/55565 (2017).

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Abstract

섬유 연골 성 연골 세포로의 유리질 연골 세포의 탈 분화는 종종 체외에서 연골 세포의 단층 확장을 수반한다. 연골 세포의 전체 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 표현형의 손실에 적합한 바이오 마커로 간주됩니다. 그러나 다른 실험 방법을 기반으로 한 결과가 일치하지 않을 수 있습니다. 그러므로 연골 세포의 탈분화 동안 전 세계적 DNA 메틸화 수준을 정량화하기위한 정확하고 간단하며 신속한 방법을 확립하는 것이 중요합니다.

현재의 게놈 전반의 메틸화 분석 기술은 주로 바이 설 파이트 게놈 시퀀싱에 의존합니다. 바이 설 파이트 전환 동안 DNA 분해로 인해, 이들 방법은 전형적으로 큰 샘플 체적을 필요로한다. 전반적인 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 데 사용되는 다른 방법으로는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 있습니다. 그러나, HPLC는 게놈 DNA의 완전한 소화가 필요합니다. 또한, HPLC의 비용이 엄청나게 높습니다.기구는 HPLC의 광범위한 적용을 제한합니다.

이 연구에서는 genomic DNA (gDNA)가 다양한 계대 배양으로 배양 된 인간 연골 세포로부터 추출되었다. gDNA 메틸화 수준은 메틸화 - 특이 적 도트 블롯 분석을 사용하여 검출되었다. 이 도트 블랏 접근법에서, 검출 될 메틸화 된 DNA를 함유하는 gDNA 혼합물을 이전에 그려진 원형 템플릿 패턴 내부의 도트로서 N + 막 상에 직접 점착시켰다. 다른 젤 전기 영동에 근거한 blotting 접근법과 다른 복잡한 blotting 절차와 비교하여, dot blot 방법은 상당한 시간을 절약합니다. 또한 도트 블랏은 상업적으로 이용 가능한 5-mC 항체를 사용하여 전체 DNA 메틸화 수준을 검출 할 수 있습니다. 우리는 DNA 메틸화 수준이 monolayer의 하위 문화 사이에 차이가 있음을 발견했으며, 따라서 연골 세포의 탈분화에 핵심적인 역할을 할 수있었습니다. 5-mC 도트 블랏은 일반 DNA 메틸화 수준을 평가하기위한 신뢰할 수 있고 간단하고 신속한 방법입니다e 연골 세포 표현형.

Introduction

Autologous chondrocyte implantation (ACI)은 관절 연골 결손을 치료하는 비교적 새로운 최첨단 절차입니다 1 , 2 . ACI의 중요한 단계 중 하나는 체외에서 단일 층 배양 통한 연골 세포의 증폭이다. 증폭 과정에서 유리 연골 세포는 쉽게 표현형을 잃어서 탈분화되어 ACI 치료에 바람직하지 못하다. ACI 치료의 결과를 최적화하기 위해, 연골 세포의 탈분화 정도를 재 접종 전에 결정해야합니다. 연골 세포의 상태를 결정하는 경제적이며 신속한 방법을 확립하는 것이 필수적입니다. 최근에 DNA 메틸화와 연골 세포 탈분극의 연관성이 주목을 받고있다 4 , 5 , 6 . DNA methylation은 wh의 과정이다.1 차 메틸기가 DNA에 추가되어 시토신 잔기가 5- 메틸 시토신 (5-mC)으로 전환됩니다.

연골 세포 탈분화의 DNA 메틸화 생물학을 밝히기 위해, 첫 번째 단계는 지금까지 도전적인 것으로 입증 된 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 평가하는 것입니다. Bisulfite 게놈 시퀀싱은 DNA 메틸화 분석에 가장 널리 사용되는 기술입니다 ( 7 , 8) . 이 분석에서 bisulfite 전환은 DNA 분해를 일으키므로 상당한 양의 시료를 분석에 제공해야합니다. 또한, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)가 전 지구 DNA 메틸화 수준 9 , 10 을 정량화하기 위해 사용되었습니다. 그러나 HPLC 분석에는 게놈 DNA 분해가 필요합니다. 또한, 고급 고비용 실험기구가 필요합니다. 따라서, 고비용 이외에, 이러한 실험 절차는 시간 단점음. 항 -m-5C 항체는 상업적으로 이용 가능하며, 복잡한 게놈으로부터의 5-mC- 함유 게놈 DNA의 면역 블 럿팅 가능성을 창출했다.

이 보고서에서 우리는 일련의 단층 배양에서 성장한 연골 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다. 우리는 구절의 다른 번호와 인간의 연골 세포의 5-mC 콘텐츠를 평가하는 도트 블랏 분석을 사용합니다. 우리는 5-mC 함량이 낮은 등급의 탈분화를 가진 연골 세포에 비해 고도로 탈분화 된 연골 세포에서 증가한다는 것을 발견했다. 또한, 우리는 탈 분화 상태와 5-mC 수준 사이의 관계를 확인했습니다. 마지막으로 우리는 5-mC 함량의 변화가 연골 세포의 표현형과 관련이 있다고보고했다. 따라서 5-mC 도트 얼럿 분석은 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 검출하기위한 신뢰할 수있는 간단하고 신속한 방법입니다.

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Protocol

이 연구는 심천 제 2 인민 병원 인간 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 인간 관절 연골 조직 수집 및 연골 세포 배양

  1. 재료 준비
    1. 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신이 보충 된 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM) 배지를 준비한다. 1 MG / ML collagenase II, 0.25 % 트립신 - EDTA, 인산 버퍼 식염수 (PBS), 셀 스트레이너 (40 μm 나일론)를 준비합니다.
  2. 인간 관절 연골 조직 수집
    1. 외상 후 기증자 환자의 무릎 관절에서 관절 연골을 분리합니다. 모든 참가자로부터 정보에 입각 한 동의를 얻습니다.
    2. 멸균 메스를 사용하여 1 ~ 2mm 3 조각에 연골 주사위를 주사하고 37에서 DMEM에 1 MG / ML collagenase II와 다진 연골에서 연골 세포를 소화 12 ~ 16 시간.
    3. 결과 cel 필터링세포 현탁액 (40 ㎛)을 통해 현탁시키고 PBS로 두 번 세척 하였다.
    4. 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (penicillin-streptomycin)이 보충 된 DMEM에서 20,000-30,000 세포 / cm2의 밀도로 혈구 계수계 및 종자로 세포를 계수한다.
    5. 37 ° C 배양기에서 배양.
  3. 단일 층 연골 세포 확장
    1. 0.25 % 트립신 - EDTA를 사용하여 하위 합류 세포를 수확하고 6,600 세포 / cm 2 의 밀도로 다시 플레이트. 일주일에 두 번 매체를 변경하십시오.
    2. 최대 6 개의 구절에 대해 단일 층에서 연골 세포를 배양하고 1, 2, 3, 4 및 5 번 구절에서 평가합니다.

2. 게놈 DNA (gDNA) 추출

  1. 100 만 세포 당 세포를 수집하고 500 μL 용해 버퍼 (15 MM 트리스 산도 8.0, 10 MM EDTA 산도 8.0, 0.5 % SDS, 200 μg / ML RNase A)에 resuspend. pipetting 및 빠른 반전으로 Resuspend 세포, 그리고 37 ° C에서 1 시간 품어.
  2. 에이dd 단백질 분해 효소 K를 세포 용 해물 160 μg / mL의 농도로 첨가하고 혼합물을 격렬히 뒤집는다. 55 ° C에서 6 시간 동안 배양하십시오.
  3. 샘플에 Tris pH 7.9 포화 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1) 1 부피를 첨가한다. 약 20 초 동안 시료를 완전히 휘저거나 흔들어주세요.
  4. 13,000 × g에서 5 분간 실온에서 시료를 원심 분리하십시오. 상부 수성 상을 제거하고 층을 새로운 튜브로 옮긴다.
  5. 동일한 양의 클로로포름으로 추출하여 페놀을 제거하고 상부 수 성상을 새로운 튜브로 옮긴다.
  6. 0.1M 샘플의 3M 아세트산 나트륨 pH 8.0과 2 부피의 100 % 에탄올을 가하여 DNA를 침전시킨다.
  7. 튜브를 -20 ° C에 밤새 보관하여 gDNA를 침전시킵니다.
  8. 샘플을 4 ℃에서 10 분 동안 16,000 xg에서 원심 분리하여 gDNA를 펠렛으로 만든다.
  9. 샘플을 70 % 에탄올로 3 번 씻고 4 ℃에서 2 분간 13,000 x g으로 원심 분리한다.
  10. supernatan을 제거하십시오조심스럽게 공기 건조시켜야합니다. 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA에 DNA를 Resuspend.

3. DNA 메틸화 프로파일 링

  1. 제조 업체의 프로토콜에 따라 총 500 NG의 게놈 DNA를 사용하여 bisulfite 전환 반응을 수행하는 DNA methylation 키트를 사용하십시오. 용리 완충액 (50 ng / μL) 10 μL로 용출시킨다.
  2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 DNA 메틸화 프로파일 링을 수행하십시오.

4. 점 얼룩 분석

  1. 95 ° C에서 10 분 동안 0.1 M NaOH에서 단리 된 DNA (시료 당 1 mg)를 변성시킨다. 얼음에서 1M NH 4 OAc로 DNA를 중화 한 다음 두 배 희석한다. N + 막에 연속 희석 된 게놈 DNA 2 μL를 띄웁니다.
  2. 멤브레인을 80 ℃에서 30 분 동안 블 럿팅하십시오.
  3. 1 시간 동안 TBS-T 중 5 % BSA에 N + 막을 담그어 비특이적 항체 결합 부위를 차단하십시오. 반응으로 10cm 페트리 접시를 사용하십시오이온 챔버를 실온에서 수행한다.
  4. TBST에서 5 분 3 회 세척 한 후 TBS-T 중 마우스 항 5- 메틸 시토신 (5-mC) 단클론 항체 (1 : 1,000)로 4 ℃에서 밤새 배양한다.
  5. TBS - T에서 3 분 동안 멤브레인을 3 번 씻은 다음 TBS-T 중 2 차 항체 인 HRP- 복합 형 마우스 면역 글로불린 -G (IgG) (1 : 5,000)을 실온에서 1 시간 동안 항온 배양합니다.
  6. 멤브레인을 TBS-T로 5 분간 세 번 씻으십시오.
  7. 멤브레인에 효소 기판을 추가하고 5-10 분 동안 품어. 제조 업체의 지침에 따라 chemiluminescence 키트를 사용하여 보조 항체 신호를 시각.

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Representative Results

연골 세포는 6 층까지 단일 층으로 배양되었다 (P6). 연골 세포는 단층 세포 배양을 연속적으로 진행하면서 점진적인 표현형 변화를 보였다. P0 연골 세포 형태는 둥글었지만 반면에 세포는 P6까지의 연속적인 통로로 매우 꼬집어지고 평평 해졌다 ( 그림 1 ). 이 형태 변화는 연골 세포 탈분화 과정의 전형적인 현상입니다. 한편, 히트 맵의 결과는 장기 계대 배양으로 CpG 부위의 일반적인 메틸화 수준이 증가 함을 나타냈다. 5-mC 도트 블럿 분석은 연골 세포 증식을 동반하는 높은 CpG 메틸화 수준을 보여 주었다 ( 그림 2 ). 이러한 결과는 일반적으로 증가 된 메틸화 수준과 연골 세포 탈분화 사이의 연관성을 제시한다.

그림 1
이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 연골 세포 gDNA의 5-mC 특이 적 도트 블랏 분석. 게놈 DNA는 계대 횟수를 변화시킨 후에 연골 세포로부터 분리되었다. 점진적으로 증가 된 5-mC 수준이 관찰되었습니다. 200ng, 100ng, 50ng 및 25ng의 gDNA가 도트 당 로딩되었다. ( A ) 5-mC 특이 적 도트 블랏의 이미지; ( B ) ImageJ에 의한 도트 강도 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

체외에서 연골 세포 의 탈분화는 연골 결손의 치료에서 ACI의 결과를 심각하게 손상시킵니다 11,12. ACI 결과를 최적화하기 위해서는 탈분극 된 연골 세포 13 의 사용을 피하는 것이 중요합니다. 연구에 따르면 일반적인 DNA 메틸화 수준은 연골 세포 탈분화의 정도와 관련이 있다고합니다. 따라서, 임상 적용 전에 연골 세포의 일반적인 DNA 메틸화 상태를 검출하는 신뢰성 있고 신속한 방법을 확립하는 것이 필수적이다.

탈분화 된 인간 연골 세포에서 일반적인 DNA 메틸화 수준을 검출하기 위해 우리는 연속적으로 계대 된 연골 세포에서 5-mC 수준을 측정 할 수 있었다. 5-mC는 bisulfite 처리에 의한 탈 아민에 내성이 있습니다. 이 특성은 t를 이용하여 DNA 시토신 메틸화 패턴을 분석하는데 이용되었다그는 bisulfite 시퀀싱 접근법 14 . Bisulfite 게놈 시퀀싱 및 메틸화 민감성 제한 효소 절단은 DNA 메틸화 검출을위한 금 표준 기술로 간주되어왔다. 이러한 접근법은 단일 기본 쌍 해상도로 5-mC를 식별 할 수 있습니다. 그러나, bisulfite 시퀀싱의 가장 큰 단점은 bisulfite 전환 중 DNA 저하입니다. 이 접근법이 연골 세포의 탈분화를 평가하는 데 사용된다면, 이는 ACI를 위해 전파 된 연골 세포를 낭비하게 만듭니다. HPLC는 세계적 DNA 메틸화 수준을 정량화 할 수있는 또 다른 실용적인 방법이지만 HPLC 장비가있는 실험실에만 적합합니다. 따라서 더 큰 샘플 볼륨 또는 현대 장비의 필요성은 이러한 접근법을 일반적인 임상 실험실에서 일상적인 5-mC 레벨 테스트에 비실용적으로 만듭니다.

5-mC 항체의 상업적 이용 가능성은도트 얼럿 분석을 사용하여 일반적인 DNA 메틸화 수준. 다른 blotting 기술과 비교하여, 5-mC dot blot은 많은 양의 gDNA 나 전기 영동을 필요로하지 않는보다 쉬운 절차입니다. 또한, 장비는 적당히 준비된 실험실에서 사용할 수 있습니다. 따라서 5-mC dot blot 방법은 DNA 메틸화 분석법의 대체 방법으로 적용 할 수 있어야한다.

이 보고서에서, 우리는 더 높은 5-mC 수준과 연골 세포 탈분화 사이의 연관성을 확인했습니다. 계통도가 증가함에 따라 5-mC 수준이 증가했습니다. 우리의 발견은 5-mC가 단층 연골 세포 팽대 조건에 의한 탈분화에 밀접하게 관련되어 있음을 제시한다. 중요한 것은 5mC 이상의 높은 수치가 연골 세포의 표현형 소실과 연관되어있어 연골 결손을 치료하기위한 ACI의 광범위한 적용을 방해한다는 것을 발견했습니다. 따라서 본 연구 결과는 5-mC dot blotting이특히 많은 수의 시료와 더 적은 양의 gDNA가 분석되어야 할 때 연골 세포의 탈분화를 일으 킵니다.

DNA 메틸화 분석에 도트 블럿 방법을 적용하기 위해서는 고려해야 할 중요한 문제는 DNA 샘플의 품질입니다. 따라서 dot blot을 통한 5-mC 검출의 중요한 단계는 게놈 gDNA 추출 단계입니다. 우리는 gDNA 농도와 순도를 극대화하기 위해 상업적으로 이용 가능한 gDNA 추출 키트를 연구원에게 제안합니다. 또한 DNA 샘플을 나일론 막에 올려 놓아야합니다. 또 다른 중요한 문제는 DNA 샘플이 고정되어 있고 나일론 막에 완전히 흡수되었는지 확인하는 것입니다.

여기에 기술 된 기술은 최저 비용으로 여러 가지 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 접근법의 또 다른 이점은 분석을 수행하고 결과를 해석하는 간단하고 저렴한 장비에 의존한다는 것입니다. 또한, 그것은 상대적으로 비교하는 데 사용할 수 있습니다2 개 이상의 표본 사이의 전 세계 메틸화 수준의 차이. 그러나이 분석법은 DNA 메틸화 수준의 정확한 정량화 또는 특정 DNA 서열의 CpG 메틸화 상태를 결정하는 데 사용할 수 없습니다. 또한이 방법은 50 ng 미만의 gDNA 샘플에서 메틸화 상태를 정확하게 검출 할 수 없기 때문에 제한된 감도를 가지고 있습니다. 이 방법은 범 지구적인 DNA 메틸화에 대한 정성 분석을 제공하지만 부적절하게 수행하면 위양성 결과를 초래할 수 있습니다.

요약하면, 5-mC 도트 블랏은 연골 세포 표현형을 평가하기 위해 일반적인 DNA 메틸화 수준을 검출하는 신뢰성 있고 간단하며 신속한 방법입니다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 다음과 같은 교부금에 의해 지원되었다 : 중국 자연 과학 재단 (No. 81572198; No. 81260161; No. 81000460); 광동성 자연 과학 재단, 중국 (No. 2015A030313772); 중국 박사후 연구 재단 기금 프로젝트 (No. 2013M530385); 중국 광동성의 의학 연구 재단 (No. A2016314); 심천 과학 기술 프로젝트 (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Gibco Inc. 11965–092 Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS) HyClone Inc. SH30256.01B D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
FBS Gibco Inc. 10099-141
0.25% Trypsin/EDTA Gibco Inc. 25200-056
1% Penicillin-Streptomycin Gibco Inc. 15140-122
Chloroform Mallinckrodt 4440
Isoamyl Alcohol Sigma I-3643
Phenol Gibco BRL 15513-039
Proteinase K Gibco BRL 24568-2
TAE buffer  Bio Whittaker 16-011V
Distilled Water Gibco BRL 15230-170
1 M Tris-HCl Biosharp Inc. BL514A
Tween20 Biotopped Inc. C58H114O26
BSA Proliant Inc. 68700
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hemocytometer ISOLAB Inc. 075.03.001
Falcon 100 mm dish Corning 353003
Centrifuge Tubes TPP AG 91050 Gamma-sterilized
High-speed centrifuge Eppendorf 5804R
ThermoMixer MIULAB MTH-100
Carbon dioxide cell incubator Thermo scientific 3111
Chemi-imaging Analyse System UVITEC Cambridge ALLIANCE

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References

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