5-mC点印迹测定定量软骨细胞去分化的DNA甲基化水平

Developmental Biology

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Summary

我们提出了一种基于5-甲基胞嘧啶(5-mC)斑点印迹定量DNA甲基化的方法。我们在软骨细胞去分化中测定了5-mC的水平。这种简单的技术可用于快速测定ACI治疗中的软骨细胞表型。

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Jia, Z., Liang, Y., Ma, B., Xu, X., Xiong, J., Duan, L., Wang, D. A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro. J. Vis. Exp. (123), e55565, doi:10.3791/55565 (2017).

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Abstract

透明软骨细胞去分化成纤维细胞软骨细胞通常伴随体外软骨细胞的单层扩张。软骨细胞的全球DNA甲基化水平被认为是软骨细胞表型丧失的合适的生物标志物。然而,基于不同实验方法的结果可能不一致。因此,建立一种精确,简单,快速的方法来量化软骨细胞去分化中的全局DNA甲基化水平是非常重要的。

目前的全基因组甲基化分析技术主要依靠亚硫酸氢盐基因组测序。由于亚硫酸氢盐转化期间的DNA降解,这些方法通常需要较大的样品体积。用于定量全球DNA甲基化水平的其他方法包括高效液相色谱(HPLC)。然而,HPLC需要完全消化基因组DNA。另外,HPLC的成本高昂结构限制了HPLC的广泛应用。

在本研究中,从用不同数量传代培养的人软骨细胞中提取基因组DNA(gDNA)。使用甲基化特异性斑点印迹法检测gDNA甲基化水平。在该斑点印迹方法中,将含有待检测的甲基化DNA的gDNA混合物直接点在N +膜上,作为先前绘制的圆形模板图案内的点。与其他基于凝胶电泳的印迹方法和其他复杂印迹方法相比,斑点印迹法节省了大量时间。此外,斑点印迹可以使用市售的5-mC抗体检测总DNA甲基化水平。我们发现DNA甲基化水平在单层亚文化之间不同,因此可能在软骨细胞去分化中起关键作用。 5-mC斑点印迹是检测一般DNA甲基化水平进行评估的可靠,简单和快速的方法e软骨细胞表型。

Introduction

自体软骨细胞植入(ACI)是一种相对较新的,最先进的手术来治疗关节软骨缺损1,2 。 ACI的关键步骤之一是通过单层培养体外扩增软骨细胞 。在扩增期间,透明软骨细胞容易失去其表型并变得去分化,这对于ACI治疗3,4是不合需要的。为了优化ACI治疗的结果,软骨细胞去分化的程度应在再植之前确定。建立经济,快速的方法来确定软骨细胞的状态是至关重要的。最近,DNA甲基化与软骨细胞去分化之间的关联已经引起了很多关注4,5,6 。 DNA甲基化是一个过程将甲基添加到DNA中,导致胞嘧啶残基转化为5-甲基胞嘧啶(5-mC)。

为了阐明软骨细胞去分化中DNA甲基化的生物学,第一步是评估软骨细胞的DNA甲基化水平,迄今证明是有挑战性的。亚硫酸氢盐基因组测序是分析DNA甲基化最广泛使用的技术7,8 。在该测定中,亚硫酸氢盐转化引起DNA降解,因此必须提供大量的样品用于测定。此外,高效液相色谱(HPLC)已被用于量化全球DNA甲基化水平9,10 。然而,HPLC分析需要基因组DNA消化。此外,需要先进和昂贵的实验仪器。因此,除了高成本之外,这些实验程序是时间短的uming。抗-5-mC抗体现在已经成为可商购的,这已经产生了来自复杂基因组的含有5-mC的基因组DNA的免疫印迹的可能性。

在本报告中,我们从一系列单层培养物中生长的软骨细胞中提取基因组DNA。我们使用斑点印迹测定来评估具有不同数量通道的人软骨细胞中的5-mC含量。我们发现,与低级去分化的软骨细胞相比,高度去分化的软骨细胞中5-mC含量增加。此外,我们确定了去分化状态和5-mC水平之间的关系。最后,我们报道了5-mC含量的变化与软骨细胞表型有关。因此,5-mC斑点印迹测定是检测软骨细胞中DNA甲基化水平的可靠,简单和快速的方法。

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Protocol

本研究由深圳市第二人民医院人类伦理委员会批准。

人关节软骨组织收集和软骨细胞培养

  1. 材料的制备
    1. 制备补充有10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养基。制备1mg / mL胶原酶II,0.25%胰蛋白酶-EDTA,磷酸盐缓冲盐水(PBS)和细胞过滤器(40μm尼龙)。
  2. 人关节软骨组织收集
    1. 创伤后供体患者膝关节分离关节软骨。获得所有参与者的知情同意。
    2. 使用无菌手术刀将软骨切成1-2毫米3片,并在含有1毫克/毫升胶原酶II的软骨细胞中,在DMEM中于37℃消化软骨细胞12-16小时。
    3. 过滤所得的细胞l悬浮液通过细胞过滤器(40μm),并用PBS洗涤两次。
    4. 用补充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素 - 链霉素的DMEM中,用血细胞计数器和密度为20,000-30,000个细胞/ cm 2的细胞计数细胞。
    5. 培养在37℃的培养箱中。
  3. 单层软骨细胞扩张
    1. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收获亚汇合细胞,并以6,600个细胞/ cm 2的密度重新平板。每周更换培养基两次。
    2. 在单层中培养软骨细胞多达6代,并在第1,2,3,4和5代进行评估。

2.基因组DNA(gDNA)提取

  1. 收集细胞,每1000万个细胞重悬于500μL裂解缓冲液(15mM Tris pH 8.0,10mM EDTA pH 8.0,0.5%SDS,200μg/ mL RNA酶A)中。通过移液和快速反转重悬细胞,然后在37℃下孵育1小时。
  2. 一个dd蛋白酶K浓度为160μg/ mL的细胞裂解物,并剧烈反转混合物。在55℃下孵育6小时。
  3. 向样品中加入一倍体积的Tris pH 7.9饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)。旋转或用手彻底摇动样品约20秒。
  4. 将样品在室温下离心5分钟,时间为13,000×g。去除上层水相并将层转移到新管中。
  5. 用等体积的氯仿萃取以除去苯酚并将顶部水相转移到新鲜管中。
  6. 通过加入0.1体积的3M乙酸钠pH 8.0和2体积的100%乙醇沉淀DNA。
  7. 将试管置于-20℃过夜,沉淀出gDNA。
  8. 在4℃下将样品以16,000xg离心10分钟以沉淀gDNA。
  9. 用70%乙醇洗涤样品三次,并以13,000 x g在4℃离心2分钟。
  10. 取出上清液小心然后风干。将DNA重悬于10mM Tris pH 8.0,0.1mM EDTA中。

DNA甲基化分析

  1. 根据制造商的方案,使用DNA甲基化试剂盒使用总共500ng的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化反应。在10μL洗脱缓冲液(50 ng /μL)洗脱。
  2. 根据制造商的方案使用商业试剂盒进行DNA甲基化分析。

点斑分析

  1. 将分离的DNA(每个样品1mg)在95℃下在0.1M NaOH中变性10分钟。在冰上用1M NH 4 OAc中和DNA,然后稀释两倍。在N +膜上点2μL连续稀释的基因组DNA。
  2. 将膜在80℃下打印30分钟。
  3. 通过将N +膜在TBS-T中的5%BSA中浸泡1小时来阻断非特异性抗体结合位点。使用10厘米培养皿作为反应离子室。
  4. 在TBST中洗5分钟后,用TBS-T中的小鼠抗5-甲基胞嘧啶(5-mC)单克隆抗体(1:1,000)在4℃温育膜过夜。
  5. 在TBS-T中洗涤膜5分钟3次,然后在室温下与TBS-T中的第二抗体HRP-缀合的绵羊抗小鼠免疫球蛋白-G(IgG)(1:5,000)孵育1小时。
  6. 在TBS-T中将膜洗5分钟3次。
  7. 将酶底物加入到膜中并孵育5-10分钟。使用化学发光试剂盒根据制造商的说明书显示二抗信号。

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Representative Results

软骨细胞在单层培养直至第6代(P6)。软骨细胞随着单层培养物的连续传代显示进行性表型变化。 P0软骨细胞形态是圆形的,而细胞变成高度夹持和平坦化,连续传代直到P6( 图1 )。这种形态变化是软骨细胞去分化过程的典型。同时,热图的结果表明CpG位点的一般甲基化水平随着传代培养的增加而增加。 5-mC斑点印迹分析进一步表明,较高的CpG甲基化水平伴随着软骨细胞的繁殖( 图2 )。这些结果提示甲基化水平和软骨细胞去分化之间的关联。

图1
请点击此处查看此图的较大版本。

图2
图2:软骨细胞gDNA的5-mC特异性斑点印迹测定。在不同数量的传代后,从软骨细胞中分离基因组DNA。观察到逐渐升高的5-mC水平。每个点加载200ng,100ng,50ng和25ng的gDNA。 ( A )5-mC特异性斑点印迹的图像; ( B )ImageJ的点强度分析。 请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

软骨细胞去分化在体外严重损害ACI治疗软骨缺损修复的结果11,12 。为了优化ACI结果,避免使用去分化软骨细胞13至关重要。研究表明,一般的DNA甲基化水平与软骨细胞去分化的程度有关。因此,在临床应用前,建立可靠,快速的方法来检测软骨细胞的一般DNA甲基化状态。

为了检测去分化的人软骨细胞中的一般DNA甲基化水平,我们可以测量连续传代的软骨细胞中的5-mC水平。 5-mC耐亚硫酸氢盐处理脱氨。利用该特性分析DNA胞嘧啶甲基化模式他亚硫酸氢盐测序方法14 。亚硫酸氢盐基因组测序和甲基化敏感性限制性消化被认为是金标准技术,用于检测DNA甲基化15,16 。这些方法可以用单碱基对分辨率识别5-mC。然而,亚硫酸氢盐测序的最大缺点是亚硫酸氢盐转化过程中的DNA降解。如果这种方法用于评估软骨细胞去分化,则会导致ACI传播的软骨细胞的浪费。 HPLC是定量全球DNA甲基化水平的另一种可行方法,但仅适用于使用HPLC设备的实验室。因此,对于较大的样品量或现代设备的需求使得这些方法对典型的临床实验室的常规5-mC水平测试是不切实际的。

5-mC抗体的商业可用性提供了检测的可能性一般DNA甲基化水平使用斑点印迹测定。与其他印迹技术相比,5-mC斑点印迹是一个更容易的过程,既不需要大量的gDNA也不需要电泳。此外,仪器在中等设备的实验室可用。因此,5-mC斑点印迹法应适用于DNA甲基化检测的替代方法。

在本报告中,我们确定了较高的5-mC水平与软骨细胞去分化之间的联系;随着亚文化传代的增加,5-mC水平升高。我们的研究结果表明,5-mC可能密切参与由单层软骨细胞扩张条件引起的去分化。重要的是,我们发现更高的5-mC水平与软骨细胞表型的丧失相关,这阻止ACI广泛应用来修复软骨缺陷。因此,我们的研究结果表明,5-mC斑点印迹可以是测量程度的可靠方法软骨细胞去分化,特别是当需要分析较大数量的样品和较少量的gDNA时。

为了将斑点印迹法应用于DNA甲基化分析,必须考虑的关键问题是DNA样本的质量。因此,通过斑点印迹进行5-mC检测的关键步骤是基因组gDNA提取步骤。我们建议研究人员使用市售的gDNA提取试剂盒来最大化gDNA的浓度和纯度。此外,DNA样品应装载到尼龙膜上。另一个重要的问题是确保DNA样品已被固定并被尼龙膜完全吸收。

我们在这里描述的技术使我们有机会以最低的成本进行多个测定。这种方法的另一个优点是它依赖于简单和负担得起的设备来执行测定并解释结果。此外,它可以用来比较相对2个或更多个样品之间的全球甲基化水平差异。然而,该测定不能用于精确定量DNA甲基化水平或确定特定DNA序列的CpG甲基化状态。此外,该方法的灵敏度有限,因为低于50ng的gDNA样品中甲基化状态不能准确检测。虽然这种方法提供了全球DNA甲基化的定性分析,但如果不适当地进行,可能会产生假阳性结果。

总之,5-mC斑点印迹是检测一般DNA甲基化水平以评估软骨细胞表型的可靠,简单且快速的方法。

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Disclosures

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到以下赠款的支持:中国自然科学基金(No. 81572198; 81260161; No. 81000460);中国广东省自然科学基金(编号:2015A030313772);中国博士后科学基金资助项目(No. 2013M530385);中国广东省医学研究基金(No. A2016314);深圳市科技项目(No.JCYJ20160301111338144; No.JSGG20151030140325149; No.JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No.JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
DMEM Gibco Inc. 11965–092 Warm in 37 °C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS) HyClone Inc. SH30256.01B D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
FBS Gibco Inc. 10099-141
0.25% Trypsin/EDTA Gibco Inc. 25200-056
1% Penicillin-Streptomycin Gibco Inc. 15140-122
Chloroform Mallinckrodt 4440
Isoamyl Alcohol Sigma I-3643
Phenol Gibco BRL 15513-039
Proteinase K Gibco BRL 24568-2
TAE buffer  Bio Whittaker 16-011V
Distilled Water Gibco BRL 15230-170
1 M Tris-HCl Biosharp Inc. BL514A
Tween20 Biotopped Inc. C58H114O26
BSA Proliant Inc. 68700
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Hemocytometer ISOLAB Inc. 075.03.001
Falcon 100 mm dish Corning 353003
Centrifuge Tubes TPP AG 91050 Gamma-sterilized
High-speed centrifuge Eppendorf 5804R
ThermoMixer MIULAB MTH-100
Carbon dioxide cell incubator Thermo scientific 3111
Chemi-imaging Analyse System UVITEC Cambridge ALLIANCE

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References

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