חולדה גדילה לוח צמיחת דגם אפיון מנגנוני תיקון ולהעריך צמיחה צלחת רגנרציה אסטרטגיות

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

צלחת הצמיחה היא אזור סחוס בעצמות ארוכות של ילדים, שם מתרחשת צמיחה אורכית. כאשר נפגעים, רקמה גרמית יכולה ליצור ולפגוע בצמיחה. אנו מתארים מודל חולדה של פציעה צלחת הצמיחה המוביל לרקמות תיקון גרמי, המאפשר מחקר של מנגנוני תיקון וצמיחה גדילה אסטרטגיות התחדשות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies. J. Vis. Exp. (125), e55571, doi:10.3791/55571 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שליש מכל השברים בילדים כרוכים בצלחת הצמיחה ויכולים לגרום לצמיחת עצם. צלחת הצמיחה (או physis) היא רקמת הסחוס למצוא בסוף כל העצמות הארוכות בילדים כי הוא אחראי על צמיחה העצם האורך. לאחר פגום, רקמת סחוס בתוך צלחת הצמיחה יכול לעבור ousification מוקדמת ולהוביל לרקמת תיקון גרמית לא רצויות, אשר יוצר "גרמי בר". במקרים מסוימים, זה גרמי בר יכול לגרום לעיוותים הצמיחה העצמית, כגון עיוות זוויתי, או שזה יכול לעצור לחלוטין את צמיחת העצם האורך. אין כיום טיפול קליני שיכול לתקן לחלוטין את צלחת הצמיחה הפגועה. שימוש במודל חיה של פציעה צלחת הצמיחה כדי להבין טוב יותר את המנגנונים ביסודו של היווצרות בר גרמי כדי לזהות דרכים לעכב אותו היא הזדמנות מצוינת לפתח טיפולים טובים יותר עבור פציעות צלחת הצמיחה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשבש את צלחת הצמיחה טיבאלי פרוקסימלי עכברוש באמצעות פגם חור המקדח. זה smaLl מודל בעלי חיים אמין מייצר בר גרמי יכול לגרום לעיוותים הצמיחה דומה לאלה לראות ילדים. מודל זה מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים של היווצרות בר גרמי ומשמש כאמצעי לבחון אפשרויות טיפול פוטנציאליים עבור פציעות צלחת הצמיחה.

Introduction

פציעות גדילה בצמיחה הינן 30% מכלל השברים בילדים, ועלולות לגרום לפגיעה בצמיחת העצם. בנוסף לשברים, פציעות של צלחת גדילה עלולות להיגרם על ידי אטיולוגיות אחרות, כולל אוסטאומליטיס 2 , גידולי עצם ראשוניים 3 , קרינה וכימותרפיה 4 , ופגיעה באיטרוגניק 5 . צלחת הצמיחה (או physis) היא אזור הסחוס בסוף העצמות הארוכות של ילדים, כי הוא אחראי על הצמיחה העצמית האורך. זה כוננים התארכות העצם דרך ousification endochondral; Chondrocytes עוברים התפשטות היפרטרופיה והם משודרגים אז על ידי osteoblasts נכנסות ליצירת עצם trabecular 6 . צלחת הצמיחה היא גם שטח חלש של השלד המתפתח, מה שהופך אותו נוטה לפציעה. הדאגה העיקרית עם שברים צלחת הצמיחה או פציעות היא כי רקמה הסחוס פגום בתוך צלחת הצמיחה יכול bE החליף עם רקמת תיקון גרמי לא רצויות, הידוע גם בשם "בר גרמי". בהתאם לגודלו ומיקומו בתוך צלחת הצמיחה, הבר הגרמי יכול להוביל לעיוותים זוויתיים או למעצר גדילה מלא, משוררת הרסנית לילדים צעירים שטרם הגיעו לגובהם המלא.

אין כרגע טיפול שיכול לתקן לחלוטין את צלחת הצמיחה הפגועה. ברגע שהטופס הגרמי יוצר, על הקלינאי להחליט האם להסיר אותו באופן כירורגי 8 . חולים עם לפחות 2 שנים או 2 ס"מ של צמיחה השלד שנותר עם בר גרמי כי משתרע פחות מ 50% של אזור צלחת הצמיחה הם בדרך כלל מועמדים כריתה גרמית 8 . ניתוח כירורגי של הבר הגרמי הוא לעתים קרובות ואחריו interposition של שתל אוטולוגי שומן כדי למנוע רפורמציה של הרקמה הגרמית כדי לאפשר את צלחת הצמיחה uninjured שמסביב כדי להחזיר את הצמיחה. עם זאת, טכניקות אלה הם problEmatic ולעתים קרובות נכשל, המוביל הישנות בר גרמי והמשך השפעה שלילית על הצמיחה 9 . יש צורך קריטי לפתח טיפולים יעילים, כי לא רק למנוע היווצרות בר גרמי, אלא גם לחדש את הסחוס צלחת הצמיחה, ובכך להחזיר את התארכות העצם הנורמלית.

המנגנונים המולקולריים שבבסיס היווצרות הבר הגרמי עדיין לא הוסברו במלואם. הבנה טובה יותר של מנגנונים ביולוגיים אלה עלולה להוביל להתערבויות טיפוליות יעילות יותר עבור ילדים הסובלים מפציעה בצמיחה. מאז לומד מנגנונים אלה בבני אדם קשה, מודלים בעלי חיים שימשו, במיוחד את המודל חולדה של פציעה צלחת 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . השיטה המוצגת כאןנייר מתאר כיצד פגם חור לקדוח בצלחת הצמיחה חולדה tibial מוביל לרקמות תיקון צפוי לשחזור שמתחיל ousification מוקדם כמו 7 ימים לאחר הפציעה ואת טופס בר בוגרת מלאה עם שיפוץ ב 28 ימים לאחר הפציעה 10 . זה מספק חיה קטנה במודל vivo שבו ללמוד את המנגנונים הביולוגיים של היווצרות בר גרמי, כמו גם להעריך טיפולים חדשניים שיכולים למנוע את הבר הגרמי ו / או לחדש את הסחוס הצלחת הצלחת. לדוגמה, מודל זה יכול לשמש כדי לבדוק biomaterials chondrogenic שיכולים לצמוח מחדש סחוס הצלחת הצמח ולהציע טיפול בעל ערך עבור ילדים הסובלים פציעות צלחת הצמיחה. הטכניקות המובאות במאמר זה יתארו את השיטות הכירורגיות המשמשות לייצור הפציעה של צלחת הצמח ואת המשלוח הבא של biomaterials לאתר הפציעה. נדון גם בשיטות להערכת היווצרות בר גרמית ולתיקון רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל בעלי החיים נהלים חייב להיות מאושר על ידי המוסד המקומי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (IACUC). פרוטוקול בעלי חיים עבור ההליך הבא אושרה על ידי אוניברסיטת קולורדו דנבר IACUC.

1. להשיג חולדות

הערה: אם אין צורך בבעלי חיים מהונדסים גנטית, יש צורך בעכברושים של Sprague-Dawley, בני שישה שבועות, בזמן ניתוח. זנים אחרים עשויים לשמש; עם זאת, רוב המחקרים שפורסמו בוצעו על חולדות Sprague-Dawley.

2. הכנת אספקה ​​כירורגי

  1. אוטוקלאב אספקת חבילות ניתוח הכוללים אחד מכל אחד: # 3 אזמל ידית, מחזיק מחט, מלקחיים אדסון, ומספריים איריס.
  2. החיטוי chucks המקלדת keyless. צ 'אקים מקדחה עשוי להיות חרוז מעוקר בין ניתוחים בבעלי חיים בעת ההפעלה על בעלי חיים מרובים.
    הערה: הכללים המקומיים IACUC הנוגעים לשימוש של ניתוח סטריליכלים דתיים על בעלי חיים מרובים חייב להיות דבק. לדוגמה, אוניברסיטת קולורדו דנבר IACUC מאפשר לכלי אחד כירורגי להגדיר לשמש עד 5 בעלי חיים לפני ההפסקה שלהם. יתר על כן, כלי ניתוח חייב להיות מעוקרים בחום באמצעות מעקר חרוז בין בעלי חיים. חבילות ניתוח נוספות סטריליות יש להשתמש עבור כל בעלי חיים נוספים.
  3. החיטוי 5 ס"מ סטיינמן סיכות, אחד לכל חיה.
    הערה: כדי להפחית את הסיכון לזיהום, אסור להשתמש בסיכות של שטיינמן לבעלי חיים מרובים.
  4. החיטוי 1.8 מ"מ burs שיניים, אחד לכל חיה.
    הערה: על מנת להקטין את הסיכון לזיהום, אין להשתמש בבורות השיניים לבעלי חיים מרובים.
  5. החיטוי הפצע קליפ הפצע, אם רלוונטי. לחלופין, התפרים קבור ניתן להשתמש כדי לסגור את השכבה עורית. ראה שלב 7.3.
  6. אם אפשר, לעקר תרגיל סיבוב באמצעות קרינה או עיקור גז.
  7. אסוף את הציוד הנוסף הבא: מכונת גילוח חשמלית, סטיםריל 3-0 חומצות polyglycolic חומצה, גזה סטרילית, פובידון יוד, מלוחים סטריליים, סטרילי 10 מ"ל מזרקים, סטרילי 23 מד מחטים, ספוגי אלכוהול isopropyl, isoflurane, calipers, לאחר כירורגית משככי כאבים ( למשל, NSAIDs ו buprenorphine) וילונות כירורגי סטרילית, כפפות כירורגי סטרילית, סטרילי # 15 להבים אזמל, קליפים פצע סטרילית, מכונת הרדמה, מעקר חרוז, כרית התחממות, underpads סופג.

3. הרדמה והכנת בעלי חיים

  1. להרדים את החיה על ידי הצגתו בתא אינדוקציה 1- 2-L קבלת 1 ליטר / זרימת חמצן מינימלי עם 5% isoflurane ממערכת vaporizing עם מערכת scavenging פסיבית.
    הערה: חשיפה 5% isoflurane צריך להרדים חולדות בן שישה שבועות בתוך 5 דקות.
  2. להעביר את החיה לאתר כירורגית ולשמור על החיה תחת הרדמה עם isoflurane 2 - 3% באמצעות חרוט האף עבור שאר ההליך. מניחים את חזית החיה על כרית ההתחממות ואת לספוגחלונות.
    הערה: החיה לא צריך להיות קבוע לשולחן כירורגית. החזקת הרגל כמפורט בשלבים הבאים היא שיטה מספקת של ייצוב.
    הערה: כל ההליכים הבאים הם להיעשות עם החיה תחת הרדמה. 2 - 3% isoflurane צריך להיות מספיק כדי לשמור על הרדמה חולדות בגיל זה. זה יכול להיות מאושר על ידי בדיקת רפלקס נסיגה דו ביפדית.
  3. ניהול משככי כאבים תוך ניתוחיים בהתאם למדיניות שאושרה מוסדית ( למשל בופרנורפין ב 0.05 מ"ג / ק"ג ו carprofen ב 5 מ"ג / ק"ג).

הכנת הטיביה לכירורגיה

  1. לגלח את כל הרגל האחורי (ים) מן malleolus המדיאלי לאגן עם מכונת גילוח חשמלית.
  2. למדוד ולהקליט את אורך tibial מן הרמה tibial הקדמי אל הצד התחתון של malleolus המדיאלי באמצעות מחוגה. לחלופין, למדוד את אורך tibial כולו באמצעות רנטגן או microCT 11 Sup> , 12 , 14 . לחלופין, למדוד ממדי הצלחת הצמיחה לפני הניתוח באמצעות רנטגן או microCT.
  3. נקו את האתר כירורגית על ידי ניגוב כל הרגל (ים), הבטן, ואת אברי המין עם ספוגי אלכוהול ולאחר מכן עם גזה povidone- יוד ספוג.
    הערה: כדי למזער את הסיכון לזיהום, כל ההליכים הבאים, עד שהבעל יוסר מהרדמה (שלב 7.4), חייבים להיעשות בתנאים סטריליים. כל החומרים כירורגית יש לגשת באמצעות טכניקה סטרילית. השימוש של עוזר כירורגי מומלץ מאוד לשמור על סטריליות לאורך כל הניתוח.
  4. לובש כפפות כירורגי סטרילית, במקום וילון כירורגי סטרילי fenestrated על החיה, עוזב את הרגל (ים) חשוף דרך הנתיחה המרכזית.

5. הליך כירורגי כדי לגשת לצמיחה לוח

_upload / 55571 / 55571fig1.jpg "/>
איור 1: סקירה כללית של הנוהל הכירורגי.
א)
מיקום של כמה סמנים אנטומיים המשמשים ליצירת פגיעה מוצלחת בצלחת הצמיחה. הקפסולה בברך היא מיד אחורית לברך (לבן), המפריד בין השוקה לבין עצם הירך. צלחת הצמיחה השנתית (אדום כהה) נראית פחות נחותה לברך את הברך ולעקוף את השוקה. צלחת הצמיחה הפרוקסימלית היא מטוס שטוח בעיקר, למעט הרובע הקדמי היוצר מטוס אלכסוני. הצומת של שני מטוסים אלה יוצר את זווית צלחת הצמיחה, אשר משמש עבור זווית התרגיל המתאים. ההכנסה semitendinosus הוא שם שריר הארבעי מוסיף את השוקה האחורית. ב) חתך דרך ההיבט הקדמי-המדיאלי של רקמות רכות טיביאליות כדי לגשת עצם קליפת המוח. C) המיקום של החלון קליפת המוח באמצעות יישור עם הכניסה semitendinosus דיסטלי כנקודת התייחסות. ד) הערכהאת עומק הפגיעה על ידי יישור את שפוע על בור שיניים עם חלון קליפת המוח.

  1. לעשות חתך ~ 1 ס"מ דרך העור לאורך ההיבט המדיאלי הקדמי של tibia הפרוקסימלי באמצעות ידית אזמל # 3 ו להב 15 #, החל בקצה הדיסטלי של קונדייל הירך המדיאלי ( איור 1 א ).
    1. משוך את העור חזק כנגד העצם הבסיסית והחזק את הרגל בחוזקה תוך ביצוע החתך.
      הערה: זה ישמור על חתך העור במיקום הרצוי יסייע ביצירת חתך נקי. אל תלחץ חזק מדי עם מנתח כדי למנוע ניקוב הקפסולה הברך, אשר יוביל דימום פזרני יעשה את הצעדים הנותרים קשה.
  2. שים לב של סמנים אנטומיים חשובים, כולל: 1) צלחת הצמיחה, 2) זווית צלחת הצמיחה, 3) את הקפסולה הברך, ו 4) ההכנסה semitendinosus ( איור 1 א ).
  3. בעזרת איזמל, לעשות חתך ~ 0.5 ס"מ דרך thE fascia ורקמות רכות על ההיבט המדיאלי הקדמי של tibia הפרוקסימלי, מצלחת הצמיחה לתחתית החתך בעור ( איור 1 ב ).
  4. בעדינות לנתח או לגרד משם fascia ו רקמות רכות מן השוקה באמצעות אזמל ( איור 1 ב ).
    הערה: חשוב להסיר או לגרד כמו רקמות רכות מן tibia ככל האפשר, כדי לא להפריע הצעדים הקידוח.
  5. לקדוח חלון קליפת המוח באמצעות עצם קליפת המוח הטיביאלית בדיאפיזה עם סיכת שטיינמן מחוברת לכלי סיבוב ב -10,000 סל"ד (מהירות נמוכה של הכלי הסיבובי המצוין בסעיף החומרים). צור את החלון קליפת המוח כך שהוא יישור עם הכניסה semitendinosus דיסטלי ( איור 1C ).
    1. להחזיק את התרגיל בניצב לדיאפיזה הטיבאלית ולתחקר באיטיות, נזהר לא לקדוח דרך הצד השני של הדיאפיזה; את החלון קליפת המוח צריך להיות רק ~ 2 מ"מ לעומק ויהיה כאשר לאההתנגדות מורגשת.
    2. כנ"ל, להחזיק את הרגל בחוזקה ביד השנייה.
      הערה: ניתן להשתמש בבורר שיניים בשלב זה. עם זאת, אם נעשה שימוש בבור דנטלי, יש להחזיק את הרגל בחוזקה רבה כדי ליצור חלון קליפת המוח נקי ולהבטיח שהבור ייאסף ויחתוך את העצם במקום הרצוי. מומלץ לשלב זה סטיינמן, בהתחשב ביכולת החיתוך הגבוהה ביותר שלו.
  6. טבול את חלון קליפת המוח עם גזה, כמו דימום קל צפוי.

6. יצירת צלחת פליטה הצמיחה

  1. יצירת פציעה חור המקדח דרך צלחת הצמיחה המרכזית באמצעות 1.8 מ"מ שיניים שיניים מחוברת כלי סיבוב.
    הערה: עומק, זווית נכונה, כיוון הם קריטיים לשבש את צלחת הצמיחה המרכזית ( איור 1C ו- D ). הוראות להשגת עומק, זווית וכיוון מתאימים להלן.
    1. כדי למדוד את העומק המתאים באמצעות בור שיניים, בקתהN על ידי יישור הקצה של בור שיניים עם tibia הפרוקסימלי, שבו semitendinosus חוצה את הקפסולה הברך ( איור 1 ג ).
    2. עם קצה של קבור שיניים בקפסולת הברך, בצע את פיר פיר לאורך semitendinosus ולשים לב איפה בור יישור עם חלון קליפת המוח. זהו עומק המתאים עבור Bur כדי לשבש באופן מלא את צלחת הצמיחה מבלי לשבש את משטח המפרק ( איור 1 ג ).
      הערה: בור שיניים משמש למדידת העומק המתאים. הקוטר עשוי להיות מסומן עם סמן קבוע במקום שבו הוא יישור עם חלון קליפת המוח להפנות את עומק במהלך הקידוח. עם זאת, אם סמנים אנטומיים פרוטוקול לעיל הם הפניה מקרוב, שפוע הראשון על burs שיניים המפורטים כאן (FG6) יהיה ליישר כראוי עם חלון קליפת המוח (כפי שניתן לראות בתרשים 1C ).
    3. כדי להשיג את זווית המקדח המתאים, החזק את הכלי סיבוב בזווית של פחות tהאן 30 מעלות ביחס לדיאפיזה הטיבית.
      הערה: זהו קירוב חזותי.
    4. כדי להשיג את כיוון התרגיל המתאים, המטרה של זווית צלחת הצמיחה ( איור 1C ). צייר קו ויזואלי לאורך בור שיניים כדי זווית צלחת הצמיחה לסייע ביצירת פגם מרכזי.
    5. הפעל את הכלי הסיבובי ל -10,000 סל"ד (מהירות נמוכה של הכלי הסיבובי המצוין בסעיף החומרים) לפני הכניסה לחלון קליפת המוח.
    6. בעזרת הכלי הסיבובי בזווית ובכיוון המתאימים, היכנסו לחלון הקורטיקלי ודחפו את הכלי הסיבובי עד שיישור הסמן יתייצב עם החלון הקורטיקלי. לאחר העומק הנכון מושגת, להסיר את הכלי סיבוב.
      הערה: בצע את שיבוש צלחת הצמיחה בתנועה אחת מהירה, תוך שימוש מינימלי עם הזמן את הצלחת לצלחת על מנת ליצור פגיעה נקי. זה חשוב לניתוח נתונים.
  2. טבול את החלון קליפת המוח עם גזה עבור ~ 30 s, כמו דימום צפוי.
  3. ודא לעומק המתאים של הפציעה על ידי מדידה נוספת של אורך הבור (שלב 6.1.2).
    1. הכנס את הקופה לתוך המסלול המקדח (עם הכלי סיבובית) וליישר את המסומן מסומן עם חלון קליפת המוח ( איור 1D ).
  4. אם העומק אינו מספיק, סובבו את הכלי הסיבובי ולחצו על העומק הרצוי.
    הערה: למרות סבב השני של הקידוח אינו אידיאלי, משבש באופן מלא את צלחת הצמיחה הוא החשוב ביותר לפיתוח של הבר הגרמי.
  5. שוטפים את המסלול תרגיל עם ~ 3 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית באמצעות מזרק 10 מ"ל מחט 23-מד.
  6. יבש את הפצע עם גזה.

7. הליכים שלאחר פגיעה

  1. אם מעריכים טיפול ביומטרי המבוסס על גידול ביולוגי, הזרקו את החומר הביולוגי דרך מסלול הקידוח לאתר הפציעה באמצעות מחט בגודל מתאים (18 עד 26-מד, בהתאם לצמיגות הביולוגית).
    הערה: נפח הפגיעה צלחת הצמיחה הוא ~ 3 & #181; L, ואת נפח המסלול תרגיל הוא ~ 20 μL. נפח מרבי של חומר זה יכול להיות מוזרק לתוך הפצע צלחת פגיעה במסלול תרגיל הוא בין 20 ל 25 μL.
  2. סגור את הפצע על ידי suturing fascia עם 3-0 polyglycolic חומצות תפרים. החל שעווה העצם על החלון קליפת המוח כדי לבודד את העצם הבסיסית (אופציונלי).
  3. סגור את חתך העור עם התפרים קבור או קליפים הפצע.
    הערה: קליפים הפצע מומלץ, כמו החיה יהיה שריטה באתר הפציעה ועלול לפתוח את הפצע.
  4. הסר את החיה מן הרדמה isoflurane, למקם אותו על שמיכה ההתחממות, ולפקח על זה עד שהוא ער.
  5. כדי להפחית את הסיכון של זיהום, במקום החיה בכלוב חדש המכיל מצעים יבש, autoclaved.
  6. אפשר החיה לשאת משקל שלאחר הניתוח.
  7. לפקח על החיה כל 12 שעות עבור 72 שעות לאחר הניתוח כדי לבדוק סימנים של זיהום, כדי להבטיח את הפצע קליפים להישאר במקום, ולנהל postoperativ( למשל בופרנורפין ב 0.05 מ"ג / ק"ג כל 12 שעות במשך 36 שעות ו carprofen ב 5 מ"ג / ק"ג כל 24 שעות 72 שעות).
  8. הסר את קליפ הפצע 10 - 14 ימים לאחר הניתוח בהרדמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פציעה מוצלחת צלחת הצמיחה באמצעות שיטה זו כרוכה הפרעה במרכז צלחת הצמיחה הטיבאלית מבלי לשבש את משטח הסחוס המפרקי. רקמת תיקון גרמית דווחה להתחיל בערך 7 ימים לאחר הפציעה ואת מתפתח באופן מלא על ידי 28 ימים לאחר פציעה 13 , כפי דמיינו טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (מיקרו CT) ( איור 2 ). למרות שנקודות הזמן הללו נבחרו כאן כדי להציג את ההתחלה וההתבגרות של היווצרות העצם על סמך נתונים שפורסמו בעבר, ניתן להשתמש בנקודות זמן אחרות כדי לחקור את השלבים השונים של תהליך התיקון, מיום הניתוח לאחר 1 עד 6 חודשים לאחר הניתוח. טבלה 1 נותן סקירה כללית של היווצרות נפח העצם בתוך לוחיות גידול חולדה נפגע 28 ימים לאחר הניתוח משלושה ריצות עצמאיות על ידי מתן (1) את נפח נפח העצם בתוך צלחת הצמיחה כולה (2) את boNe נפח חלק בתוך רקמת תיקון רק 15 . הנתונים מדווחים כממוצע ± סטיית התקן ומראים כי תוצאות דומות התקבלו בין הרצים העצמאיים. השונות בין הריצות השונות נותחה על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ולא מראה הבדל מובהק סטטיסטית בין הריצות, דבר המצביע על שחזור המודל. Alcian כחול hematoxylin (ABH) עם כתום G / Eosin counterstain 18 שימש היסטולוגית להראות מגוון רחב של רקמות לתקן בשלבים שונים של היווצרות בר גרמי ( איור 2 ). באמצעות כתם היסטולוגית זה, סוגים שונים של רקמות לתקן, כולל mesenchymal, סחוס, trabeculae גרמית, מוח העצם, ניתן לזהות לכמת 16 .

מספר בעיות עשויות לנבוע באופן שגוי בעקבות ההליכים לעיל. חוסר יכולת עומק המקדח nt לא לשבש את צלחת הצמיחה, אשר יוביל להיווצרות בר גרמי מעט או לא. הפרעה של משטח הסחוס המפרק יוצר פגיעה גדולה יותר שיכולה להציג סחוס המפרק לתוך האתר פגיעה צלחת הצמיחה, מסבך את תהליך הריפוי ( איור 3 א ). לשבש את צלחת הצמיחה בזווית או בכיוון בלתי הולם פגיעה בלתי מרכזית ( איור 3 ב ). במקרה זה, היווצרות בר גרמי עדיין להתרחש, אם כי זה יהיה לרוחב או המדיאלי למיקום הרצוי. בסך הכל, רקמת תיקון שנוצר לאחר פגיעה צלחת הצמיחה ניתן לנתח במגוון דרכים, כולל microCT, PCR כמותי, מכתים היסטולוגית, אימונוהיסטוכימיה. בנוסף מדידות היסטולוגית ומולקולרית, אורך הגפיים ואת המדידות צלחת הצמיחה לספק מדד חשוב של צמיחת עצם שלם. הגפיים שנפגעו דווחו לחוות ירידה בצמיחה לעומת איברים שליטה uninjured> 13. אורך הלימב ניתן למדוד בנקודות זמן שונות במהלך המחקר תוך שימוש בתמונות microCT כדי לחקור אי התאמות אורך 14 . דוגמאות של נקודות זמן בשימוש בעבר כוללים 28 ימים 56 ימים לאחר הפציעה. גדילה צלחת המדידות, כולל גובה הכולל, גבהים אזוריים, היווצרות קשירת, יכול גם לספק מידע חשוב על תהליך תיקון רקמות 13 , 14 , 15 . באופן אידיאלי, יש לקחת אורכי אורך וצמיחת צלחת המדידות לפני הניתוח יש ערך הבסיס. כדי להבהיר עוד מנגנונים ביולוגיים או לבדוק את יעילות הטיפול, יש לקבוע את קבוצות הביקורת המתאימות ולכלול איברים ואיברים שלא עברו ניתוח שעברו ניתוח, אך הם נותרו ללא טיפול.

Biomaterials יכול להיות גם נבדק מודל זה פציעה הצלחת הצמיחה. כדוגמה, צ'י Tosan microgel 19 הוזרק לתוך הפצע צלחת אתר הצמיחה, כמתואר בשלב 7.1, וזה נראה בבירור באתר הפציעה באיור 4 . ניתוח לאחר מכן עשוי להיות כרוך בקביעת ההשפעות של biomaterial על הרכב רקמות לתקן, אורך הגפיים, ואת המדידה צלחת הצמיחה, כפי שנדון קודם לכן.

איור 2
איור 2. צמיחה מוצלחת צלחת פלייט ו גיבוש בר גרמי.
היווצרות בר גרמי נראה ב -7 ימים לאחר הפציעה עם microCT ואישר באמצעות מכתים hematoxylin Alcian כחול (ABH). הבר הגרמי הוא בוגר במלואו על ידי יום 28 שלאחר הפציעה, כפי שניתן לראות עם microCT ו מכתים ABH. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך הדף = "1"> איור 3
איור 3. תוצאות פוטנציאליות של קידוח שגוי.
א)
קידוח רחוק מדי דרך השוקה יכול לשבש את המשטח המפרקי, אשר מסבך את תהליך הריפוי עלול להוביל לתוצאות חד משמעיות. ב) זווית לא נכונה של התרגיל יכול להוביל לפציעה צלחת הלא מרכזית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. טיפול של צלחת פליטה פגיעה עם Biomaterial.
מכתים ABH מראה את microgel chitosan בצלחת הצמיחה הפגועה.

מֶטרִי הפעל 1 הפעל 2 הפעלה 3 ערך P
נפח העצם שבר בתוך כל צלחת הצמיחה 9.76 +/- 3.81% 10.52 +/- 4.06% 11.93 +/- 2.04% 0.5493
נפח עצמות השבר באזור לתיקון רקמות 41.5 +/- 8.33% 46.08 +/- 10.12% 46.77 +/- 8.14% 0.5128

טבלה 1. נתוני נפח השבר.
הנתונים היו תמונות מיקרו CT ב 28 ימים לאחר הפציעה על עכברים מטופלים משלושה ריצות עצמאיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פציעה הצמח פציעה הצמח גדל מאוד להבנתנו את המנגנונים הביולוגיים של פגיעה זו, ובכך פוטנציאל להוביל התערבויות טיפוליות יעיל יותר לילדים הסובלים מפציעה צלחת הצמיחה. כדי ליצור בהצלחה גרום גרמי כדי ללמוד את היווצרות in vivo באמצעות המודל המוצג בעבודה זו, חשוב כדי לשבש את צלחת הצמיחה על ידי קידוח לעומק מספיק, מבלי לשבש את הסחוס המפרקי. שינוי ביישום כירורגי בקרב בעלי חיים, ובמידה פחותה, שינוי בסמנים אנטומיים עלול להוביל לתוצאות בעייתיות. אנו ממליצים לתרגל את הפרוצדורות שתוארו לעיל על בעלי חיים cadaveric כדי להבטיח את הצלחת הצלחת הצלחת הצמח לפני ביצוע ההליך לחיות מחקרים בבעלי חיים. בעוד בעלי חיים cadaveric חוסר plapability רקמות ולא לדמם, את הצלחת צלחת תהליך ההליך ותכונות אנטומיים על בעלי חיים אלה יהיו דומים לאלה של בעלי חיים. פורטהרמור, גדילת הצמח tibial cadaveric ניתן לגזור בקלות, כמו epiphysis מפריד מן המטפיזה באמצעות היישום של כוח אור, ואת המיקום של חור המקדח ניתן להבחין. ניתוח מהיר זה מאפשר שינויים בטכניקה כדי ללמוד את עומק המקדח הנכון ואת הזווית על חיות cadaveric, ללא צורך הדמיה.

יש לציין כי מודלים אחרים של בעלי חיים פציעה צלחת הצמיחה קיימים. פגם transphyseal דומה בוצעה בעכבר והוביל להיווצרות בר גרמי 20 . למרות גודלו הקטן יותר, זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את המנגנונים המעורבים היווצרות בר גרמי. קולמן ואחרים . דיווח על מודל עכברוש תקף אחר של פציעת צלחת גדילה, שם נוצר פגם טרנספיזי מרכזי בירך הירך על ידי קידוח דרך הסחוס המפרקי 21 . גישה זו הובילה גם להיווצרותו של סרגל גרמי ואי-שוויון באורך איברים, כמו בהמודל המוצג כאן. מודלים אחרים של בעלי חיים של פציעה צלחת טיפול וטיפול כללו ארנבות 22 , חזירים 23 , כבשים 24 . בעוד מודלים גדולים יותר של פגיעה בבעלי חיים עשויים לייצג בצורה קרובה יותר פציעות קליניות, מודל החולדה שימושי למחקר על המנגנונים הביולוגיים של פציעות Physeal. לדוגמה, מודל החולדה המוצגת כאן נעשה שימוש נרחב לחקור מנגנונים מולקולריים של פגיעה Physeal ואת תהליך היווצרות בר גרמי 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . יתר על כן, המודל חולדה ניתן להשתמש כדי לבדוק טיפולים Physeal שונים לפני המעבר דגמים בעלי חיים גדולים יותר. עם זאת, האתגר של מודל חולדה זו של פגיעה צלחת הצמיחה היא כי הקידוח נעשה בתוך העצם, אמאהמלך אי אפשר לראות היכן חור החור ממוקם בתוך צלחת הצמיחה. לפיכך, הפרעה מוצלחת של צלחת הצמיחה על בעלי חיים יכולים רק להיות מאושרים באמצעות טכניקות הדמיה בזמן הניתוח או על ידי הערכת היווצרות בר גרמי בין 7 ל 28 ימים לאחר הניתוח. עם תרגול, רמה גבוהה של הצלחה בהשגת היווצרות בר גרמי ניתן להשיג, אבל מחקרים מוקדמים יכולים לגרום למספר בעלי חיים חסרים היווצרות של בר גרמי, בשל או לצלחת צמיחה uninjured או כדי הפרעה מספקת של הצמיחה צַלַחַת.

מגבלה נוספת של מודל זה היא כי פציעות חור לקדוח אינם מייצגים פציעות צלחת צמיחה נורמלית אצל ילדים, אשר בדרך כלל מתרחשים עקב שבר 25 . שברים בתוך צלחת הצמיחה ניתן לסווג באמצעות מערכת סלטר האריס סיווג 26 . סוג III וצמיחה IV שברים צלחת בדרך כלל לתרום פציעות physeal להוביללהיווצרות הבר הגרמי. פציעה הצמח סוג הפגיעה המוצגת כאן מקרוב מתייחס לצלחת סוג VI פציעה, סוג נדיר של פציעה שבה פיזיס מוסר על ידי טראומה או פצע פצע. עם זאת, מאז המנגנונים הפתופיזיולוגיים בבסיס היווצרות בר גרמי לאחר פציעה צלחת הצמיחה להישאר חמקמק, מודל חולדה נשאר חשוב לחשוף את התהליך הזה כדי לפתח אפשרויות טיפול חדש לילדים הסובלים מכל סוגי פציעות צלחת הצמיחה. השיטה המתוארת כאן באופן אמין יוצר סרגל גרמי וניתן להשתמש בו כדי ללמוד היבטים מרובים של תהליך תיקון פציעה צלחת ב vivo 17 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 . כמו כן, הוכח כי מודל חולדה זו מצמצמת את צמיחתו הצמחי לאחר צלחת הצמיחהחבר השופטים 13 , מה שהופך אותו מודל חיות מעניינת עוד יותר כדי לבחון אפשרויות טיפול חדשניים המביאים לצמיחה צלחת הצמיחה ואת שחזור פוטנציאלי של התארכות העצם.

לסיכום, מאמר זה מפרט את השיטות ליצור מודל פציעה הצלחת הצמיחה שבה לחקור את היווצרות בר גרמי וטיפולים פוטנציאליים לצמיחה פציעות הצמח in vivo. מודל עכברוש זה מאפשר מחקרים זולים יחסית, בהתחשב בכך בר גרמי הוא בוגרת לחלוטין 28 ימים לאחר פציעה צלחת. בנוסף לפיתוח ההבנה שלנו של המנגנונים המולקולריים של היווצרות בר גרמי in vivo , מודל זה עשוי לשמש כדי לבדוק biomaterials כי לעכב היווצרות בר גרמי לעודד התחדשות צמיחת הצלחת הצלחת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgements

המחברים מכירים בתמיכת המימון של המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות לב וכלי דם של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרסומים R03AR068087, קרן העשרה אקדמית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קולורדו ומרכז גייטס לרפואה רגנרטיבית . עבודה זו נתמכה גם על ידי NIH / NCATS קולורדו CTSA מענק מספר UL1 TR001082. התכנים הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח תצוגות NIH רשמיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scalpel handle McKesson MCK42332500
Needle holder Stoelting RS-7824
Adson tissue forceps Sklar 50-3048
Iris Scissors Sklar 47-1246
Rotary Tool Dremel 7700 Variable speed rotary tool 
Keyless Rotary Tool Chuck Dremel 4486
Dental Burs Dental Burs USA FG6 Round carbide bur, ≤2mm
Steinmann pins Simpex Medical T-078
Hair clippers Wahl  5537N
3-0 PGA surutes Oasis MV-J398-V
Sterile gauze 2 x 2" Covidien 441211
Povidone Iodine McKesson 922-00801
Sterile saline Vetone 510224
10 mL luer lock syringe Becton Dickinson 309604
23 gauge needle Becton Dickinson 305145
Isopropyl alcohol pads Dynarex 1113
Isoflurane IsoFlo 30125-2
Caliper Mitutoyo 500-196-30
Carprofen Rimadyl 27180
Buprenorphine Par Pharmaceuticals Inc NDC 42023-179
Fenestrated Surgical Drape McKesson 25-517
Surgical Gloves Uline S-20204
#15 Scalpel Blade Aven 44044
9 mm wound clips Fine Science Tools 12032-09
Reflex clip applier World Precision Instruments 500345
Absorbant underpads McKesson MON 43723110
Tec 3 Iso Vaporizer  VetEquip 911103 
Germinator 500 Braintree Scientific GER 5287-120V
Warm water recirculator Kent Scientific TP-700
Absorbent Underpads Medline Industries MSC281230

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. J Pediatr Orthop. 10, (6), 713-716 (1990).
  2. Browne, L. P., et al. Community-acquired staphylococcal musculoskeletal infection in infants and young children: necessity of contrast-enhanced MRI for the diagnosis of growth cartilage involvement. AJR Am J Roentgenol. 198, (1), 194-199 (2012).
  3. Weitao, Y., Qiqing, C., Songtao, G., Jiaqiang, W. Epiphysis preserving operations for the treatment of lower limb malignant bone tumors. Eur J Surg Oncol. 38, (12), 1165-1170 (2012).
  4. Butler, M. S., Robertson, W. W., Rate, W., D'Angio, G. J., Drummond, D. S. Skeletal sequelae of radiation therapy for malignant childhood tumors. Clin Orthop Relat Res. (251), 235-240 (1990).
  5. Shapiro, F. Longitudinal growth of the femur and tibia after diaphyseal lengthening. J Bone Joint Surg Am. 69, (5), 684-690 (1987).
  6. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, (6937), 332-336 (2003).
  7. Dodwell, E. R., Kelley, S. P. Physeal fractures: basic science, assessment and acute management. Orthopaedics and Trauma. 25, (5), 377-391 (2011).
  8. Khoshhal, K. I., Kiefer, G. N. Physeal bridge resection. J Am Acad Orthop Surg. 13, (1), 47-58 (2005).
  9. Hasler, C. C., Foster, B. K. Secondary tethers after physeal bar resection: a common source of failure. Clin Orthop Relat Res. (405), 242-249 (2002).
  10. Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22, (2), 417-426 (2004).
  11. Chen, J., et al. Formation of tethers linking the epiphysis and metaphysis is regulated by vitamin d receptor-mediated signaling. Calcif Tissue Int. 85, (2), 134-145 (2009).
  12. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19, (3-4), 475-483 (2013).
  13. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. The potential role of VEGF-induced vascularisation in the bony repair of injured growth plate cartilage. J Endocrinol. 221, (1), 63-75 (2014).
  14. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  15. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49, (4), 904-912 (2011).
  16. Su, Y. W., et al. Neurotrophin-3 Induces BMP-2 and VEGF Activities and Promotes the Bony Repair of Injured Growth Plate Cartilage and Bone in Rats. J Bone Miner Res. (2016).
  17. Zhou, F. H., Foster, B. K., Sander, G., Xian, C. J. Expression of proinflammatory cytokines and growth factors at the injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 35, (6), 1307-1315 (2004).
  18. Sayers, D., Volpin, G., Bentley, G. The demonstration of bone and cartilage remodelling using alcian blue and hematoxylin. Biotechnic & Histochemistry. 63, (1), 59-63 (1988).
  19. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  20. Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. J Pediatr Orthop. 20, (6), 802-806 (2000).
  21. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46, (6), 1555-1563 (2010).
  22. Lee, S. U., Lee, J. Y., Joo, S. Y., Lee, Y. S., Jeong, C. Transplantation of a Scaffold-Free Cartilage Tissue Analogue for the Treatment of Physeal Cartilage Injury of the Proximal Tibia in Rabbits. Yonsei Med J. 57, (2), 441-448 (2016).
  23. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156, (2), 128-134 (2012).
  24. Hansen, A. L., et al. Growth-plate chondrocyte cultures for reimplantation into growth-plate defects in sheep. Characterization of cultures. Clin Orthop Relat Res. (256), 286-298 (1990).
  25. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications In Brief: Salter-Harris Classification of Pediatric Physeal Fractures. Clin Orthop Relat Res. (2016).
  26. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries Involving the Epiphyseal Plate. The Journal of Bone & Joint Surgery. 83, (11), 1753 (2001).
  27. Chung, R., Foster, B. K., Zannettino, A. C., Xian, C. J. Potential roles of growth factor PDGF-BB in the bony repair of injured growth plate. Bone. 44, (5), 878-885 (2009).
  28. Fischerauer, E., Heidari, N., Neumayer, B., Deutsch, A., Weinberg, A. M. The spatial and temporal expression of VEGF and its receptors 1 and 2 in post-traumatic bone bridge formation of the growth plate. J Mol Histol. 42, (6), 513-522 (2011).
  29. Chung, R., Cool, J. C., Scherer, M. A., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of neutrophil-mediated inflammatory response in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. J Leukoc Biol. 80, (6), 1272-1280 (2006).
  30. Chung, R., et al. Roles of Wnt/beta-catenin signalling pathway in the bony repair of injured growth plate cartilage in young rats. Bone. 52, (2), 651-658 (2013).
  31. Zhou, F. H., Foster, B. K., Zhou, X. F., Cowin, A. J., Xian, C. J. TNF-alpha mediates p38 MAP kinase activation and negatively regulates bone formation at the injured growth plate in rats. J Bone Miner Res. 21, (7), 1075-1088 (2006).
  32. Arasapam, G., Scherer, M., Cool, J. C., Foster, B. K., Xian, C. J. Roles of COX-2 and iNOS in the bony repair of the injured growth plate cartilage. J Cell Biochem. 99, (2), 450-461 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics